DE3686148T2

DE3686148T2 - Lymphotoxin-gen, verfahren zu dessen herstellung und lymphotoxin.

Info

Publication number: DE3686148T2
Application number: DE19863686148
Authority: DE
Inventors: Yoshiyuki Ishii; Yoshiro Kobayashi; Masuo Obinata; Toshiaki Osawa
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1985-12-24
Filing date: 1986-12-23
Publication date: 1993-01-14
Anticipated expiration: 2006-12-24
Also published as: EP0230781A2; EP0230781B1; EP0230781A3; DE3686148D1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Gen, einen Teil davon, der ein Polypeptid mit einer Lymphotoxinaktivität kodiert, ein Verfahren zur Herstellung des Gens und ein humanes Lymphotoxin, das aus dem Gen unter Verwendung von gentechnologischen Methoden hergestellt wird.
Lymphotoxin (im folgenden als LT bezeichnet) ist als eine Art von Lymphokin bekannt, welches spezifisch oder nicntspezifisch aus Lymphozyten oder lymphoid-etablierten Zellinien freigesetzt wird, und das eine zytotoxische Aktivität besitzt. LT besitzt nicht nur eine zytotoxische Aktivität gegenüber verschiedenen Krebszellen, sondern auch eine Aktivität zur Verstärkung der zytotoxischen Aktivität bestimmter Arten von Karzinostatika oder Interferonen, und man nimmt an, daß es als Tumorheilmittel oder als anderes Heilmittel einsetzbar ist. (Siehe Granger G.A. et al., "International Congress of Chemotherapy", Kyoto, Japan, 23.-28. Juni, Zusammenfassungen, Seite 15; und Matsunage K. et al., ibid, Seite 352.)
Es sind eine Vielzahl von Verfahren zur Produktion von humanem LT bekannt, wobei aus dem Menschen stammende Zellen oder aus dem Menschen stammende Tumorzellen kultiviert, und der Kulturüberstand unter Erhalt des humanen LT gereinigt wird. Zum Beispiel kennt man ein Verfahren, worin Mandelzellen oder periphere Blutlymphozyten zusammen mit einem Phytohemagglutinin (im folgenden als PHA bezeichnet) kultiviert werden, und das humane LT aus dem Kulturüberstand isoliert wird (siehe Peter, T.B. et al. , J. Immunol., 111, 770 (1973); Walker, S.M. und Lucas, Z.J., J. Immunol., 109, 1233 (1972)) . Es ist ein weiteres Verfahren bekannt, worin Lymphoidtumorzellen kultiviert werden, und das humane LT aus dem Kulturüberstand isoliert wird (siehe Yamamoto, R.S. et al., J. Biol. Response Modifiers, 3, 76 (1984); europäische Patentanmeldung Nr. 0 100 641). Es ist noch ein weiteres Verfahren bekannt, worin T-Zellenhybridoma in Anwesenheit von Phorbolmyristatacetat (im folgenden als PMA bezeichnet) und/oder Concanavalin A (im folgenden als Con A bezeichnet) kultiviert werden, und das human LT aus dem Kulturüberstand isoliert wird (siehe Asada, M. et al., Cell. Immunol., 77, 150 (1983)).
Diese bekannten Verfahren zeigen jedoch Probleme darin, daß der Gehalt an LT im Kulturüberstand äußerst klein ist, und daß die Nährmittelquellen zur Verwendung bei der Kultivierung (z. B. fötales Kalbsserum) teuer sind. Daher ist eine ökonomische Produktion von LT von hoher Reinheit nach den bekannten Verfahren schwierig.
Zur Herstellung von humanem LT würde es erwünscht sein, ein Verfahren unter Einsatz von Gentechnologie einzusetzen, worin ein dem LT entsprechendes Gen in einem Vektor eingefügt wird, und das erhaltene rekombinante Plasmid repliziert, transkribiert und in Bakterien, Pilzen, Hefen oder Tierzellen translatiert wird, um das erwünschte humane LT, wie es in diesen Zellen produziert wird, zu erhalten.
Die Erfinder haben früher eine LT-produzierende, humane T-Zellenhybridomaklon-A-C5-8-Zellinie unter Verwendung einer humanen T-Zellenhybridisierungsmethode (Emetin/Actinomycin-D-Methode) erhalten. (Siehe Asada, M., et al., Cell Immunol., 77, 150 (1983)). Als jedoch die A-C5-8-Zellinie in Gegenwart von Con A und PMA unter optimalen LT-Produktionsbedingungen kultiviert wurde (Inkubationsperiode von 30 h oder mehr), konnte keine Messenger RNA (im folgenden als mRNA bezeichnet) entsprechend dem LT erhalten erden, und daher wurde das dem LT entsprechende Gen nicht erhalten. Es besteht daher ein andauerndes Bedürfnis nach einem Verfahren zur Herstellung von LT mittels der Gentechnologie.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Gen zur Verfügung zu stellen, das ein Polypeptid mit einer LT-Aktivität kodiert, wie es aus einer mRNA entsprechend dem LT hergestellt wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines LT-Genes zur Verfügung zu stellen, das ein Polypeptid mit LT-Aktivität kodiert.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, große Mengen an LT zur Verfügung zu stellen, die aus dem LT-Gen, welches ein Polypeptid mit LT-Aktivität kodiert, produziert werden.
Diese und andere erfindungsgemäßen Aufgaben, wie sie im folgenden verdeutlicht werden, wurden durch die Untersuchungen der Erfinder gelöst.
Die Erfinder haben die Bedingungen für den Erhalt von LT entsprechender mRNA untersucht, und gefunden, daß die LT entsprechende mRNA durch Inkubation der A-C5-8-Zellinie zusammen mit PMA und/oder Con A innerhalb 24 h, vorzugsweise innerhalb 4 h, erhalten werden kann, und es gelang ihnen ferner die Klonierung eines Cens, welches ein humanes LT-Polypeptid kodiert, durch Verwendung der mRNA mittels Gentechnologie, und es gelang ihnen zusätzlich die Herstellung eines neuen LT unter Verwendung des klonierten Gens, und sie gelangten auf diese Weise zur vorliegenden Erfindung.
Demzufolge stellt die Erfindung ein Gen zur Verfügung, das ein Polypeptid mit LT-Aktivität kodiert, ein Verfahren zur Herstellung desselben und ein neues LT, das durch die Verwendung des Gens erhalten wird.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Gen, das ein Polypeptid mit LT-Aktivität kodiert, das aus mRNA hergestellt wird, die aus einem lymphokinproduzierenden humanen T-Zellenhybridom isoliert wird, das durch Inkubation der A-C5-8-Zellinie in einer Mediumlösung mit PMA und/oder Con A innerhalb 24 h erhalten wird, wobei die mRNA als 12,6S- bis 14,6S-Fraktionen bei der Fraktionierung nach dem Saccharosedichtegradienten-Zentrifugationsverfahren erhalten wird, wie auch Mutanten des Gens, einschließlich alleler Mutanten durch Genkodierungsdegeneration oder teilweiser Modifikation, und ein Verfahren zur Herstellung des Gens und ein neues LT, das unter Verwendung des Gens hergestellt wird. Mutanten des LT-Gens, die innerhalb des Bereichs der Erfindung fallen, sind insbesondere solche, worin die Basensequenz aus Tabelle 1 in einer solchen Weise verändert ist, daß die kodierte Aminosäuresequenz nicht verändert ist. Ebenfalls innerhalb des Bereiches der Erfindung liegen die Gene einschließlich veränderter Codons, die Polypeptide kodieren, welche LT-Aktivität beibehalten. Solche veränderten Codons können konservative Substitutionen von Aminosauren sein, z. B. Ala für Gly, Ser für Thr, Leu für Val usw.) oder können eine kleine Anzahl (z. B. 1 bis 3) fehlender Codons sein.
Das vorliegende Gen hat eine Basensequenz, wie in Tabelle 1 dargestellt: Tabelle 1
Fig. 1 ist ein Diagramm, das eine Restriktionsendonukleasespaltungskarte des erfindungsgemäßen Arbeitsbeispieles zeigt.
Fig. 2 ist ein Diagramm, das die Restriktionsendonukleasenschnittstellen zeigt, die zur Bestimmung der Basensequenz und der Richtungen und Bereiche zur Bestimmung der Basensequenz im Arbeitsbeispiel der Erfindung verwendet werden.
In diesen Zeichnungen stellt B BamHI, E EcoRI und P PstI dar.
Fig. 3 zeigt die Schritte zur Bildung des tac-promotorhaltigen, phenotypischen Expressionsplasmids pLT13tac6 in Beispiel 5, worin die Pfeile die Arbeitsrichtung des Promotors angeben.
Fig. 4 zeigt die Schritte zur Bildung des tac-promotorhaltigen, phenotypischen Expressionsplasmids pDK10 in Beispiel 9, worin die Pfeile die Arbeitsrichtung des Promotors angeben.
Fig. 5 zeigt die Schritte zur Bildung des tac-promotorhaltigen, phenotypischen Expressionsplasmid pDK11 in Beispiel 9, worin die Beispiele die Arbeitsrichtung des Promotors angeben.
Fig. 6 zeigt die Schritte zur Bildung des tac-promotorhaltigen, phenotypischen Expressionsplasmids pDM12 in Beispiel 9, worin die Pfeile die Arbeitsrichtung des Promotors angeben.
Fig. 7 zeigt die Schritte zur Bildung des Plasmids pSV2-LT/MMTV-LTR zur Expression in tierischen Zellen in Beispiel 13, worin die Pfeile die Arbeitsrichtung des Promotors angeben.
Es liegen einige Berichte von Gray, P.W. et al vor (Nature, 312, 721 (1984)) und Nedwin, G.E. et al (Nucleic Acids Research, 13, 6361 (1985)) über die Basensequenz des Gens, das das Polypeptid mit humaner LT-Aktivität kodiert. Gray et al. bildeten LT-cDNA unter Verwendung von mRNA, die aus einkernigen humanen peripheren Blutzellen extrahiert und gereinigt wurde (im folgenden als PBMC bezeichnet), die mit PMA, Staphylokokkenenterotoxin-B und Thymosin-alpha&sub1; 48 h aktiviert wurden. Nedwin et al. erhielt ein PBMC-Gen, das mit dem Gen von Gray et al. hybridisiert werden konnte, durch Screenen einer rekombinanten humanen lambda-Bank mittels eines Hybridisationsverfahrens unter Verwendung von ³²P-markierter DNA, die die 34-Amino-terminalen Reste des LT von Greay et al. kodiert. Wie in der folgenden Tabelle 2 gezeigt, unterscheidet sich das vorliegende LT-Gen von der PBMC-cDNA von Gray et al durch 14 Nukleotide in vier Positionen, und unterscheidet sich von Nedwin's et al. PBMC-Gen durch 9 Nukleotide in zwei Positionen. Zusätzlich soll erwähnt werden, daß das PBMC-Gen von Nedwen et al ein Intron von 247 Nukleotiden zwischen der 267sten Base und 268sten Base enthält.
Im Hinblick auf das Verfahren zur Herstellung des Gens extrahierte und reinigte Gray et al die mRNA aus den Zellen, die durch Inkubation von nichtadhäsiven Zellen von humanperipheren Blutlymphozyten in Gegenwart von PMA, Staphylokokkenenterotoxin und Thymosin alpha&sub1; 48 h erhalten wurden, und stellte das Gen aus der erhaltenen mRNA her. Die Erfinder dagegen extrahierten und reinigten die mRNA aus den Zellen, die durch Inkubation von LT-produzierendem humanen T-Zellhybridom in Gegenwart von PMA und/oder Con A nach 0,5 bis 5 h erhalten wurden, und stellten das Gen aus der erhaltenen mRNA her. Tabelle 2 Vergleich der Basensequenzen im LT-Gen der vorliegenden Erfindung, dem PBMC-abgeleiteten LT-Gen und dem aus der rekombinanten humanen lambda-Bank abgeleiteten LT-Gen: (a) vorliegende Erfindung (b) Gray et al. (c) Nedwin et al.
Zur Bestätigung der LT-Aktivitätsexpression des Gens (A-C5-8 cDNA) der vorliegenden Erfindung wurde die klonierte DNA mit Restriktionsenzymen behandelt und anschließend in einen geeigneten phenotypischen Expressionsvektor unter Erhalt eines LT-produzierenden Plasmids eingefügt, das erhaltene Plasmid wurde in Escherichia coli und tierische Zellen zu seiner Transduktion eingeschleust, und die Produktion von LT durch diese Zellen wurde bestätigt.
LT mit jeweils der folgenden Aminosäureseguenz (I) oder (II) , kann wie im folgenden erwähnt erhalten werden. (Das LT mit der jeweiligen Aminosäuresequenz (I) oder (II) wird im folgenden als LT(I) oder LT(II) bezeichnet). Aminosäuresequenz (I): Aminosäuresequenz (II):
Die A-C5-8-cDNA (siehe obige Tabelle 1) wird mit Restriktionsenzymen gespalten. Andererseits, wird ein phenotypischer Expressionsvektor, in welchen eine Translationsinitiierungsstelle eingeführt wurde, mit denselben Restriktionsenzymen gespalten. Diese werden unter Erhalt eines phenotypischen Expressionsplasmids zur LT-Produktion ligatisiert, und das erhaltene Plasmid wird in einem geeigneten Wirt, wie z. B. Escherichia coli, unter Erhalt einer Transformante eingeschleust. Die erhalten Transformante wird kultiviert, und das Kulturmedium oder die Transformante werden extrahiert und gereinigt unter Erhalt des erwünschten LT, welches keine wesentlichen Menge an Verunreinigungen enthält.
Wie in der folgenden Tabelle 3 gezeigt, sind sowohl das erfindungsgemäße LT(I) und LT(II) vom bekannten LT (Gray, P.W. et al., Nature, 312, 721 (1984)) in ihren molekularen Strukturen, in der Weise verschieden, daß dem LT(I) 10 N-terminale Aminosäuren des bekannten LT fehlen, aber mit Met-Asp-Pro-Bindung verbunden ist, und daß dem LT(II) 19 N-terminale Aminosäuren des bekannten LT fehlen.
Im Vergleich mit einem verschiedenen LT (EP-Anmeldung 0 100 641), das durch Inkubation vom Lymphoidtumorzellen und anschließender Isolierung des Kulturüberstandes erhalten wurde, ist LT(I) überlegen, da es eine höhere pH-Stabilität aufweist und zusätzlich, weil es einen verschiedenen isoelektrischen Punkt hat. Tabelle 3 Vergleich zwischen erfindungsgemäßem LT und bekanntem LT hinsichtlich der N-terminalen Aminosäuresequenzen: Aminosäuresequenz (I) Aminosäuresequenz (II) Gray, et al. (N-Terminus)
Wenn im allgemeinen ein genetisches Produkt unter Verwendung von rekombinanten Mikroorganismen erhalten wird, hat das erhaltene Produkt eine Struktur, welche ein unnötiges Methionin am N-terminalen Ende des Produkts aus einem Gen von einem natürlichen Typ enthält. Da jedoch das erfindungsgemäße LT(II) kein unnötiges Methionin enthält, hat es daher eine Struktur, die sehr ähnlich dem natürlichen Produkt ist. Darüber hinaus kann LT(II) sehr sicher verwendet werden.
Die Erfindung wird im folgenden in Einzelheiten beschrieben.

(1) Auswahl von Zellen mit hoher LT-Produktivität:

Als LT-produzierende Zellen können normale humane Lymphozyten, humane T-Lymphoid-etablierte Zellinien wie CCRF-CEM, MOLT-4F und JURKAT und klonierte Zellinien davon, wie auch humane B-Lymphoid-etablierte Zellinien, wie RPMI-1788 verwendet werden. Insbesondere werden ein LT-produzierende humane T-Zellenhybridomas, die durch Zellfusion von normalen human T-Lymphozyten und humanen T-Lymphoid-etablierten Zellen erhalten werden, verwendet, da diese eine hohe LT-Produktivität aufweisen, und die Subkultivierung der Zellen möglich ist. Die LT-produzierenden humanen T-Zellenhybridomas haben eine höhere LT-Produktivität als die Elternzellen von humanen T-Lymphoid-etablierten Zellen, und daher können hohe Mengen von mRNA aus diesen Zellen extrahiert und isoliert werden.
Die Analyse zur Messung der LT-Aktivität wurde in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Kobayashi Y., et al. (J. Immunol., 122, 791 (1979)) durchgeführt. Bei dieser Messung wurde die zytotoxische Aktivität einer Probe aus einem Überstand von kultivierten Zellen oder eines Extrakts aus kultivierten Zellen gegenüber Maus L.P3-Zellen als Standard definiert (Sub-Linie von L-Zellen). Eine Einheit/ml LT wurde als die Konzentration festgesetzt, welche 50 % der Zellen abtötet.
Das LT-produzierende humane T-Zellenhybridom kann nach einem bekannten Verfahren erhalten werden (japanische Patentanmeldung (OPI) Nr. 72520/83). (Der Begriff "OPI" wie hierin verwendet, bedeutet eine ungeprüfte und veröffentlichte Anmeldung.)
Zum Beispiel werden humane T-Lymphoidtumorzellen mit einem Proteinsyntheseinhibitor oder mit einer Kombination des Inhibitors und einem RNA-Syntheseinhibitor behandelt, und andererseits werden humane T-Lymphozyten mit einem Mitogen oder einem Antigen stimuliert, und anschließend hybridisiert man beide in Gegenwart eines Hybridisierungsbeschleunigers (z. B. Polyethylenglykol) und die erhaltenen hybridisierten Zellen (humane T-Zellenhybridomazellen) werden isoliert. Die so erhaltenen humanen T-Zellenhybridomas werden in einem Kulturmedium inkubiert (zum Beispiel ein Kulturmedium, erhalten durch Zusatz von 10 %igem fötalem Kalbsserum; 5 x 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol und 2 mM Glutamin zu einem Minimalmedium von RPMI 1640, welches im folgenden als RPMI-Medium bezeichnet wird) bei 37ºC in CO&sub2;(5%)-Luft(95%)-Atmosphäre, und anschließend werden die oben erwähnten LT-produzierenden, humanen T-Zellenhybridomas durchmustert.

(2) Inkubation der Zellen:

Zum Erhalt von mRNA aus den LT-produzierenden humanen T-Zellenhybridomas sind mindestens 10&sup9; oder mehr Zellen erforderlich, und diese Zellen werden im allgemeinen durch Inkubation der erhaltenen Hybridomas gewonnen. Zum Beispiel werden die Zellen in ein Nährmedium in einer Menge von 10&sup5; bis 10&sup7; Zellen/ml gegeben, und diese in einer Laborschale inkubiert, die in einem Flaschenrotationsinkubator zur Gewebeinkubation (Drehflasche) bei 37ºC in einer Atmosphäre von CO&sub2;(5%)-Luft(95%) gestellt wird.
Die Inkubationszeit variiert in Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Mediums und der ursprünglichen Zellkonzentration, und liegt daher im allgemeinen bei 1 bis 5 Tagen. Nach der Inkubation wird die Kulturlösung zur Isolierung der Zellen zentrifugiert.
Das Nährmedium kann ausgewählt sein aus einem Minimalmedium, das einen oder mehr Bestandteile, ausgewählt aus Sacchariden, Aminosäuren, Vitaminen, Hormonen, Proteinen, Antibiotika, Wachstumsfaktoren und anorganischen Basen, enthält, oder einem Medium enthaltend das Minimalmedium und ein zugesetztes Tierserum.
Handelsübliches RPMI 1640-Medium, MEM-Medium, Dulbecco-modifiziertes Medium usw. können ebenfalls als Minimalmedium verwendet werden.
Betreffend das Tierserum, können fötales Kalbsserum, Kalbsserum, Pferdeserum, menschliches Serum oder ähnliches zum Minimalmedium in einer Menge von 1 bis 20 % des Mediums zugesetzt werden.
Zusätzlich können die Zellen in Nacktmäusen, Hamstern oder anderen Warmblütern mit Ausnahme des Menschen vermehrt werden.

(3) Vermehrung von mRNA:

Die in (2) erhaltenen LT-produzierenden humanen T-Zellenhybridomas werden in ein Nährmedium in einer Menge von 10&sup6;- bis 10&sup7;-Zellen/ml eingebracht, und PMA und/oder Con A wird (werden) zugegeben, wodurch die Zellen bei Inkubation eine größere Menge an LT entsprechende mRNA produzieren. Die bevorzugte Konzentration von PMA ist 20 bis 200 ng/ml und die bevorzugte Konzentration von Con A ist 5 bis 50 ug/ml.
Die Inkubationszeit liegt innerhalb 24 h, vorzugsweise innerhalb 8 h. Dies liegt daran, daß der Gehalt an LT-Aktivität entsprechender mRNA in den kultivierten Zellen mit Verlauf der Zeit abnimmt. Insbesondere, falls die Inkubationszeit 24 h übersteigt, ist der beste Zeitraum zur Gewinnung von LT aus dem Überstand des Kulturmediums nach Inkubation der LT-produzierenden, humanen T-Zellenhybridomas 24 bis 72 h, und die Menge der dem LT entsprechenden mRNA in den kultivierten Zellen wird in einem solchen Zeitraum äußerst klein, und daher ist die Gewinnung von mRNA schwierig. Das Verfahren zur Etablierung der Zellinie der LT-produzierenden, humanen T-Zellenhybridoma-A-C5-8-Zellinie zur erfindungsgemäßen Verwendung und ihre Eigenschaften sind in bekannten Publikationen beschrieben. (Siehe Asada, M. et al., Cellular Immunology, 77, 150 (1983)).

(4) Extraktion der gesamten zellulären RNA aus den Zellen:

Die Extraktion der gesamten zellulären RNA aus den unter (3) erhaltenen Zellen kann nach dem Guanidinhydrochloridverfahren durchgeführt werden (Deeley, R.G. et al., J. Biol. Chem., 252, 8310 (1977)), oder nach einem ähnlichen Verfahren.
Zum Beispiel werden die unter (3) erhaltenen Zellen (10&sup9; oder mehr Zellen) in einem Homogenatpuffer (enthaltend 8M Guanidinhydrochlorid, 5mM Dithiothreitol und 20mM Natriumacetat, mit NaOH auf einem pH von 7 eingestellt) suspendiert und in einem Homogenisator oder ähnlichem homogenisiert. Eine vollständige Nukleinsäurefraktion wird aus dem erhaltenen Homogenatmaterial durch Ethanolpräzipitation oder Phenolextraktion extrahiert, und anschließend wird die gesamte zelluläre RNA daraus durch Lithiumchloridpräzipitation gewonnen. Bei dem Extraktionsschritt ist es bevorzugt, daß die zu verwendenden Ausrüstungsgegenstände trockenerhitzt oder mit Diethylpyrocarbonat behandelt und anschließend in einem Autoklaven sterilisiert wurden, und daß die Laborkräfte während der Durchführung Vinylplastikhandschuhe an ihren Händen tragen, um Zersetzung der RNA mittels RNase zu verhindern.

(5) Isolierung von mRNA aus der gesamten zellulären RNA:

Die Isolierung der erwünschten mRNA aus der gesamten zellulären RNA kann mittels üblicher Verfahren, einschließlich dem Saccharosedichtegradienten-Zentrifugationsverfahren, dem Gelfiltrationsverfahren, dem Elektrophoreseverfahren, dem Membranfilterverfahren oder Oligo-dT-Cellulosechromatographieverfahren oder durch eine Kombination dieser Verfahren erfolgen.
Um zu bestätigen, daß die so erhaltene mRNA die erwünschte LT-kodierende mRNA ist, wird die mRNA in ein Protein translatiert und seine biologische Aktivität überprüft. Zum Beispiel wird die mRNA in ein geeignetes Proteinsynthesesystem injiziert oder zugegeben, z. B. Eizellen von Xenopus laevis, Retikulozytenlysaten oder Weizenkeimen, um dadurch in das Protein übersetzt zu werden, und das erhaltene Protein wird dahingehend überprüft, ob oder ob es keine zytotoxische Aktivität gegenüber Maus L.P3-Zellen hat. Insbesondere wird das Bestätigungsverfahren unter Verwendung von Eizellen von Xenopus laevis z. B. wie folgt durchgeführt:
Die mRNA wird in die Eizellen in einer Menge von ca. 50 bis 100 ng pro Eizelle durch ein Mikroinjektionsverfahren injiziert, und 20 Eizellen werden in 200 ul einer modifizierten Barth's Salzlösung (enthaltend 0,13 g Nacl, 0,075 g KCl, 0,2 g NaHCO&sub3;, 0,2 g MgSO&sub4;.7 H&sub2;O, 0,08 g Ca(NO&sub3;)&sub2;.4H&sub2;O, 0,09 g CaCl&sub2;.6H&sub2;O, 2,38 g HEPES, 100 mg Streptomycin und 100.000 Einheiten Penicillin G, gelöst in 1 l der Lösung bei einem pH von 7,4, wobei die Lösung im folgenden als MBS bezeichnet wird) bei 23ºC 48 h inkubiert. Der Kulturüberstand wird als Probe verwendet, und die LT-Aktivität der Probe wird, bezogen auf den Standard der L.P3-zytotoxischen Aktivität, gemessen.
Die LT-kodierende mRNA der vorliegenden Erfindung hat die folgenden Eigenschaften:
(i) sie hat einen S-Wert von 12,6S bis 14,6S;
(ii) sie ist an ihrem 3'-Ende polyadenyliert;
(iii) sie kodiert ein LT-Polypeptid.

(6) Klonierung der Lymphotoxin-cDNA:

Die in Schritt (5) erhaltene mRNA wird als Matrize verwendet, und Oligo (dT) wird als Primer verwendet, und eine einzelsträngige cDNA, die komplementär zur mRNA ist, wird mit einer reversen Transkriptase (z. B. Vogelmyeloblastosisvirus-abgeleitete reverse Transkriptase) in Gegenwart von dATP, dGTP, dCTP und dTTP synthetisiert, und die Matrizen-mRNA wird durch Hitzebehandlung denaturiert. Anschließend wird diese einzelsträngige cDNA als Matrize benutzt, und eine doppelsträngige DNA unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aus Escherichia coli wird synthetisiert. Diese doppelsträngige DNA wird aus der denaturierten mRNA und Protein durch Alkali-Behandlung und Phenolextraktion isoliert. Die doppelsträngige DNA wird mit reverser Transkriptase umgesetzt, wodurch eine komplettere doppelsträngige DNA erhalten wird. Die so erhaltene DNA hat eine Haarnadel-Schlaufenstruktur, und die Haarnadel-Schlaufenstruktur wird unter Verwendung von S&sub1;-Nuklease (Aspergillus oryzae-abgeleitete S&sub1;-Nuklease) unter Erhalt einer DNA mit einer kompletten doppelsträngigen Struktur gespalten. Die so erhaltene DNA wird z. B. in die Restriktionsenzym PstI-gespaltene Stelle des Plasmids pBR322 nach üblicher Weise eingefügt, wie z. B. nach dem poly(dG)-poly(dC)- oder poly(dA)-poly(dT)-Homopolymerextensionsverfahren (Noda, M. et al., Nature, 295, 202 (1982); Maniatis, T. et al., Molecular Cloning (a laboratory manual), 217 (1982) , Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Das erhaltene rekombinante Plasmid wird in einen Wirt, z. B. E. coli HB101-Stamm, zur Transformation nach dem Verfahren von Perbal, B. (A Practical Guide to Molecular Cloning, 268 (1984), John Wiley & Sons Inc., Canada) eingeschleust, ein Tetracyclin-resistenter Stamm wird selektiert und eine cDNA-Bank gebildet.
Die cDNA-Bank wird dem Koloniehybridisierungstest unter Verwendung einer synthetischen Sonde unterworfen (Montgomery, D.L. et al., Cell, 14, 673 (1978); Goeddel, D.V. et al., Nucleic Acids Res 8, 4057 (1980)), um nach dem erwünschten Klon zu screenen. Zum Beispiel werden zwei Nukleotide chemisch synthetisiert, die den 18 Basen von der 404ten bis 421sten Base bzw. den komplementären 18 Basen von der 500sten bis zur 517ten Base im Lymphotoxingen, wie von Gray et al in Nature, 312, 721 (1984) berichtet entsprechen, und Phosphorsäure von gamma-³²P-ATP wird auf die Hydroxylgruppe am 5'-Ende der Sonde mit einer Polynukleotidkinase (T4 phageninfizierte E. coli-abgeleitete T4-Polynukleotidkinase) übertragen, so daß zwei Arten von ³²P-markierten Sonden gebildet werden. Aus der oben erwähnten cDNA-Bank wird ein Klon ausgewählt, der zur starken Bindung mit beiden Sonden in der Lage ist. Die Plasmid DNA wird aus dem so erhaltenen Klon isoliert, und diese in eine einzelsträngige DNA durch Erhitzen oder alkalische Denaturierung umgewandelt, welche auf einem Nitrocellulosefilter fixiert wird. Zu dieser wird eine Lymphotoxin-mRNA-haltige mRNA-Fraktion zur Hybridisierung zugegeben, und anschließend wird die gebundene mRNA durch Elution gewonnen. Diese wird in Eizellen von Xenopus laevis eingeschleust, und die erhaltene mRNA wird überprüft, ob oder ob sie kein Lymphotoxin kodiert. (Dies wird im folgenden als "Hybridisierungs-Translationstest" bezeichnet). Nach dem obigen Verfahren kann eine klonierte DNA erhalten werden, in die ein DNA-Fragment mit einer Basensequenz eingeschleust wurde, die komplementär zur mRNA des Lymphotoxins ist.
Zusätzlich wird das klonierte DNA-Fragment des transformierten Stammes mit relevanten Restriktionsenzymen gespalten und mit ³²P markiert, und diese wird als Sonde zum re-screenen der oben erwähnten cDNA-Bank verwendet, so daß ein größeres cDNA-Fragment selektiert werden kann.
Eine Endonukleaserestriktionsschnittkarte des klonierten, so erhaltenen DNA-Fragments wird gebildet, das Fragment wird mit M13-Phagen kloniert, die Basensequenz davon wird nach dem Dideoxysequenzierungsverfahren von Sanger F. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 5463 (1977)) analysiert, die Basensequenz, die die Aminosäuresequenz des Lymphotoxins, welche bereits bestimmt wurde, wird aufgespürt, und schließlich wird die cDNA, welche die Basensequenz enthält (d. h. die Basensequenz von der 165sten bis 677sten Base der oben erwähnten Tabelle 1), welche dem kompletten Translationsbereich des Lymphotoxins entspricht, wird ausgewählt. Hierdurch kann die klonierte DNA (Tabelle 1) mit der Basensequenz, die das LT-Aminosäuresequenz enthaltende Polypeptid kodiert, erhalten werden.
Das Plasmid pBR322, in das die klonierte DNA eingefügt wurde, welche das Polypeptid mit der LT-Aminosäuresequenz wie in der Tabelle gezeigt, kodiert, wurde pLT13 genannt. E. coli HB101-Stamm wurde mit dem pLT13 unter Erhalt eines rekombinanten Stammes transfektiert, und dieser beim Fermentation Research Institute (Bikoken), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM-BP No. 1226 am 29. November 1986 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt.
Die in Tabelle 1 gezeigte cDNA, die erfindungsgemäß erhalten wurde, unterscheidet sich vom bekannten LT-Gen, wie in der oben erwähnten Tabelle 2 gezeigt, und es war zunächst nicht klar, ob das Produkt der erfindungsgemäßen cDNA (in Tabelle 1 gezeigt) LT-Aktivität aufwies oder ob nicht. Dies liegt daran, daß ein Unterschied von nur einer Aminosäure zwischen den Proteinen zu einem äußerst starken Unterschied in den Eigenschaften der beiden Proteinen führen kann.
Demzufolge unternahmen die Erfinder weitere Versuche, worin das pLT13 mit relevanten Restriktionsenzymen gespalten wurde, die gespaltenen Fragmente in einen phenotypischen Expressionsvektor eingefügt wurden, und das erhaltene rekombinante Plasmid in ein E. coli oder tierische Zellen zur Transfektion eingeschleust wurden, und diese überprüft wurden, ob oder ob sie keine LT-Aktivität exprimieren. Als Ergebnis wurde gefunden, daß sowohl die transfektierten Bakterien und Tierzellen LT-Aktivität exprimieren, woraus geschlossen wurde, daß die in Tabelle 1 gezeigte cDNA tatsächlich die cDNA ist, die die Aminosäuresequenz des LT kodiert, wie im folgenden (7) und in den Arbeitsbeispielen erwähnt.

(7) Herstellung des phenotypischen Expressionsvektors der die LT(I)-kodierende Basensequenz enthält:

(a) Spaltung der cDNA, die die Aminosäuresequenz des LT-Polypeptids kodiert, mit Restriktionsenzymen:

Zur Herstellung der die erfindungsgemäße Aminosäuresequenz kodierenden DNA wurde die komplette cDNA, wie in Tabelle 1 gezeigt, mit Restriktionsenzymen PvuII und EcoRI nach üblicher Weise gespalten, durch Agarosegelelektrophorese unter Extraktion des cDNA-Fragments, welches ca. 650 Basenpaare enthält (im folgenden als "bp" abgekürzt) extrahiert, und das cDNA-Fragment gewonnen. Dieses cDNA-Fragment enthält die 193ste bis 840ste Base der kompletten cDNA wie in Tabelle 1 gezeigt.

(b) Spaltung der Polylinkerstelle des phenotypischen Expressionsvektors mit Restriktionsenzymen:

Die Polylinkerstelle des phenotypischen Expressionsvektors pKK223-3 (von Pharmacia Co.) wurde zunächst vollständig mit EcoRI und anschließend teilweise mit BamHI gespalten, und sowohl der Vektor, der teilweise mit BamHI gespalten wurde und der Vektor, welcher nicht mit BamHI gespalten wurde, wurde durch Agarosegelelektrophorese gewonnen. Zusätzlich wurden gemischte Vektoren vollständig mit SmaI gespalten. Auf diese Weise wurden ein Vektor, bei dem die Spaltungsstelle eine EcoRI-BamHI-Stelle und der Vektor, bei dem die Spaltungsstelle eine EcoRI-SmaI-Stelle sind, gebildet.

(c) Ligatisierung der Translationsinitiierungsstelle und EcoRI-BamHI-Schnittstellen-gespaltenen pKK223-3:

Der an der EcoRI-BamHI-Schnittstelle gespaltete Vektor von pKK223-3, und die transportable Translations-Initiationsstelle mit der folgenden Struktur (die durch Hybridisierung einer eine terminale EcoRI-Stelle enthaltende Oberkette, und eine eine BamHI-schnittstellenhaltige Unterkette gebildet wurde, wobei beide Ketten kommerzielle Produkte der Pharmacia Co. sind) wurden in Gegenwart von T4 DNA-Ligase wiederum unter Erhalt eines Vektors mit einer zirkulären Struktur umgesetzt.
AATTTGGAGGAAAAAATTATG
ACCTCCTTTTTTAATACCTAG
Der so rückgebildete Vektor wird in E. coli zur Transformation eingeführt, und der den rückgebildeten Vektor enthaltende Stamm wird als Ampicillin-resistenter Stamm selektiert, und der rückgebildete Vektor aus den kultivierten Bakterien gewonnen.

(d) Insertion des LT-cDNA-Fragments, gebildet in (a), in den rückgebildeten Vektor, hergestellt in (c):

Der in (c) hergestellte rückgebildete Vektor wird teilweise mit BamHI gespalten, und anschließend wird sein 5'-Ende mit alkalischer Phosphatase aus Rinderdarmmukosa desphosphoriliert, und anschließend werden die kohäsiven Enden in glatte Enden mit DNA-Polymerase-I umgewandelt (Klenow-Fragment). Andererseits wird die PvuII-EcoRI-Schnittstelle der LT-cDNA, die unter (a) gebildet wurde, so modifiziert, daß sie ein glattes Ende aufwies, und diese einer Ligatisierung mit den glatten Enden mit dem oben erwähnten glatt endenden offenen zirkulären Vektor unterworfen. Nach der Reaktion wird er geschlossene zirkuläre Vektor nach üblicher Weise gewonnen und wird in E. coli zur Transformation eingeschleust.

(e) Screenen mit einer synthetischen Oligonukleotidsonde:

Die in (6) gezeigte ³²P-markierte synthetische Oligonukleosidsonde und der in (d) gebildete transformante E. coli-Stamm wurden einer Koloniehybridisierung unterworfen, und der Stamm, der zur Hybridisierung mit der synthetischen Oligonukleotidsonde in der Lage war, wurde selektiert. Anschließend wurde ein Vektor aus der Kolonie hergestellt und mit Restriktionsenzym gespalten, und auf diese Weise wurde der erwünschte Vektor, der cDNA-Fragmente von ca. 650 bp und ca. 250 bp enthielt, durch Agarosegelelektrophorese erhalten.

(8) Produktion von LT(I) in E. coli:

Die in (e) erhaltenen Transformanten E. coli werden in einem Medium mit Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (im folgenden als IPTG bezeichnet) inkubiert, bis die O.D. 550 nm ca. 1 erreicht.
Nachdem die inkubierten Bakterien geerntet sind, werden sie durch Ultraschallwellenbehandlung lysiert, mit Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) extrahiert, und unter keimfreien Bedingungen filtriert, und anschließend wird die LT-Aktivität gemessen, wobei der Transformantenstamm, der die größte Menge an LT-Polypeptid exprimiert, gescreent wird.

(9) Inkubation und Reinigung von LIT(I)-produzierenden E. coli:

Die in (8) erhaltenen Transformanten (LT-produzierende E. coli) werden in einem IPTG-haltigen Medium inkubiert, bis eine ausreichende Menge an LT-Polypeptid produziert wird. Anschließend wird das inkubierte Material nach einem Verfahren, wie dem Lysozymverdau- , Einfrier- und Auftauverfahren, Ultraschallaufschluß, French-Presse, Dinor-Mühle, usw. aufgeschlossen, und die Extraktlösung durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt. Die erhaltene Extraktlösung wird durch eine Kombination von Ammoniumsulfataussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, hydrophober Chromatographie, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidelektrophorese gereinigt, wodurch das LT-Polypeptid in Form eines im wesentlichen reinen Produktes erhalten werden kann.
(10) Das in (9) erhaltene LT(I) wurde analysiert, um die Aminosäurezusammensetzung und die N-terminale Aminosäuresequenz zu bestimmen, wobei als Ergebnis die gleichen Analysewerte gemessen wurden, wie jene, die aus der Aminosäuresequenz (I), wie im folgenden Arbeitsbeispiel gezeigt, angenommen wurden. Der isoelektrische Punkt war 7,6 ± 0,3.
Die DNA-kodierende Aminosäuresequenz (I) und seine entsprechende Basensequenz (I) sind im folgenden gezeigt: Aminosäuresequenz (I) : Basensequenz (I) :
(11) Das erfindungsgemäß LT(I) war stabil gegenüber pH-Veränderungen, und auch,wenn es in einer Britton-Robinson-Pufferlösung in einem breiten pH-Bereich von 4 - 10 über 24 h inkubiert wurde, blieb die LT-Aktivität bestehen.

(12) Herstellung des phenotypischen Expressionsvektors, der die Basensequenz zur Kodierung von LT(II) enthält:

(a) Spaltung von LT(II)-kodierender cDNA mit Restriktionsenzymen:

Zur Herstellung der DNA für die Kodierung der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenz wird die komplette cDNA wie in Tabelle 1 gezeigt mit den Restriktionsenzymen PvuII und EcoRI nach üblicher Weise gespalten und durch Agarosegelelektrophorese unter Extraktion des DNA-Fragments, welches ca. 650 Basenpaare (bp) enthält, aufgetrennt, und das cDNA-Fragment wird gewonnen. Dieses cDNA-Fragment enthält die 225ste bis 840ste Basen der kompletten cDNA, wie in Tabelle 1 gezeigt.

(b) Ligatisierung des synthetischen Oligonukleotids mit dem LT-cDNA-Fragment:

Das synthetische Oligonukleotid mit der folgenden Struktur:
AATTCTATGCA
GAT und das in (a) erhaltene LT-cDNA-Fragment werden ligatisiert und anschließend mit EcoRI verdaut, und das EcoRI-Fragment von 623 bp nach üblicher Weise gewonnen.

(c) Einfügen der LT-cDNA in den Expressionsvektor:

Der von Pharmacia Co. erhaltene Expressionsvektor pKK233-3 wird mit EcoRI verdaut, und anschließend wird das 5'-Ende mit alkalischer Phosphatase aus der Rinderdarmschleimhaut dephosphoryliert. Das in (b) erhaltene EcoRI-Fragment und der obige offene zirkuläre Vektor werden ligatisiert. Nach der Reaktion wird der geschlossene zirkuläre Vektor nach üblicher Weise gewonnen, und dieser in E. coli zur Transformation eingefügt.

(d) Screenen mit einer synthetischen Oligonukleotidsonde:

Die in (6) gezeigte ³²P-markierte, synthetische Oligonukleotidsonde und der transformante, in (c) gebildete E. coli-Stamm werden einer Koloniehybridisierung unterworfen, und der Stamm, der zur Hybridisierung mit der synthetischen Oligonukleotidsonde in der Lage ist, wird selektiert. Anschließend wird ein Vektor aus der Kolonie hergestellt und mit Restriktionsenzymen gespalten, und auf diese Weise wird der erwünschte Vektor mit einem cDNA-Fragment von 623 bp durch Agarosegelelektrophorese erhalten.

(13) Herstellung des Vektors, worin die 3'-terminale, nichtkodierende Region des LT-cDNA entfernt wurde:

(a) Entfernung der 3'-terminalen, nichtkodierenden Region der LT-cDNA:

Der in (12) erhaltene Vektor wird in eine lineare DNA unter Verwendung von HindIII umgewandelt, und anschließend wird die 3'-terminale, nichtkodierende Region der LT-cDNA mit BAL31-Nuklease entfernt. Anschließend wird das Ende mit DNA-Polymerase I glatt gemacht (Klenow-Fragment), und anschließend wird der Vektor mit EcoRI verdaut und danach durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter Erhalt eines Fragments von ca. 460 bp aufgetrennt.

(b) Ligatisierung der LT-cDNA und Linker:

Das in (a) erhaltene 460 bp-Fragment und ein HindIII-Linker (hergestellt von Takara Shuzo Co.) werden ligatisiert und anschließend mit HindIII verdaut.

(c) Ligatisierung von LT-cDNA und Expressionsvektor:

pKK223-3 wird mit EcoRI und HindIII unter Erhalt eines Fragmentes von 4555 bp verdaut. Anschließend wird das in (b) erhaltene EcoRI-HindIII-Fragment von ca. 465 bp mit dem Fragment verbunden, und das erhaltene Fragment in E. coli zur Transformation nach üblicher Weise unter Erhalt eines Vektors mit einem LT-cDNA-Fragment von ca. 465 bp eingeschleust.

(14) Bildung eines multiplen-Kopien-Expressionsvektors:

pAT153 (hergestellt von Amersham Co.) wird mit BamHI und PvuI verdaut und durch Agarosegelelektrophorese unter Erhalt eines Fragments von 2655 bp aufgetrennt. Andererseits wird der in (13) erhaltene Vektor ebenfalls mit BamHI und PvuI unter Erhalt eines Fragments von ca. 980 bp analog verdaut. Diese beiden BamHI-PvuI-Fragmente werden unter Erhalt eines Vektors mit einem LT-cDNA-Fragment ligatisiert.

(15) Expression von LT-cDNA in E. coli:

Die in (14) erhaltenen E. coli-Transformanten werden in einem Medium mit IPTG inkubiert, bis die O.D. 550 nm ca. 1 erreicht.
Danach werden die inkubierten Bakterien gesammelt, diese durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen, mit Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) extrahiert und unter keimfreien Bedingungen filtriert, und anschließend wird die LT-Aktivität gemessen, wobei nach dem Transformantenstamm, der die größte Menge an LT-Polypeptid exprimiert, durchmustert wird.

(16) Inkubation und Reinigung von LT-Polypeptid-produzierenden E. coli:

Die in (14) erhaltene Transformante (LT-produzierende E. coli) werden in einem IPTG-haltigen Medium inkubiert, bis eine ausreichende Menge an LT-Polypeptid gebildet wird. Anschließend wird das inkubierte Material durch ein Verfahren, wie Lysozymverdauung, Gefrieren und Auftauen, Ultraschallaufschluß, French-Presse, Dinor-Mühle, usw. aufgeschlossen, und die Extraktlösung durch Zentrifugation oder Filtration gesammelt. Die erhaltene Extraktlösung wird durch eine Kombination von einem Ammoniumsulfataussalzungsschritt, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, hydrophober Chromatographie, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidelektrophorese gereinigt, wobei LT-Polypeptid in Form eines wesentlichen reinen Produktes erhalten werden kann.
(17) Das in (16) erhaltene LT(II) wurde zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung und der N-terminalen Aminosäuresequenz analysiert, und die gemessenen Testergebnisse waren dieselben wie diejenigen, die für die Aminosäuresequenz (II), wie im folgenden Arbeitsbeispiel gezeigt, angenommen wurden.
Die die Aminosäuresequenz (II) kodierende DNA und ihre korrespondierende Basensequenz (II) sind im folgenden gezeigt: Aminosäuresequenz (II) Basensequenz (II)
Die Erfindung wird in Einzelheiten durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erläutert, die jedoch nicht als beschränkend für die Erfindung ausgelegt werden sollen.

Beispiel 1

(1) Herstellung eines Lymphotoxin-produzierenden, humanen T-Zellenhybridoms:

10&sup6;/ml humane, periphere Blutlymphozyten (im folgenden als PBL bezeichnet) wurden mit 20 ug/ml Con A in RPMI-Medium 2 Tage behandelt, und anschließend wurde das an die Zellen gebundene Con A so weit wie möglich unter Verwendung von 0,2 M alpha-Methyl-D-mannosid entfernt.
Andererseits wurden humane T-Lymphoidtumorzellen CCRF-CEM (im folgenden als CEM bezeichnet), die sich in einem Wachstumsstadium im RPMI-Medium befanden, durch Zentrifugation gesammelt, und diese in RPMI 1640/10 mM HEPES-Medium in einer Menge von 2 x 10&sup6; Zellen/ml suspendiert. Zu diesen wurde Emetinhydrochlorid (hergestellt von Nakarai Chemical Co.) und Actinomycin D (hegestellt von PL Biochemicals Co.) in einer Menge von 5 x 10&supmin;&sup5; M und 0,25 ug/ml zugegeben, und diese bei 37ºC 2 h behandelt. Anschließend wurde das Emetinhydrochlorid und das Actinomycin D in der Kulturlösung durch Zentrifugation entfernt.
Die so hergestellte PBL und CEM wurden in einem Verhältnis von 10:1 vermischt und unter Erhalt eines Zellpellets zentrifugiert, und zu diesem wurden 0,5 ml 46 %iges Polyethylenglykol (PEG-1540, hergestellt von Wako Junyaku KK), und MEM-Medium mit 5 ug/ml Poly-L-arginin und 15 %iges Dimethylsulfoxid zugegeben und langsam 45 s bei 37ºC zur Hybridisierung gerührt. Anschließend wurden 10 ml MEM-Medium, das mit 10 ml 25 mM HEPES (pH 7,2) gepuffert war, allmählich zugegeben, und die Mischung wurde zentrifugiert.
Zu den Zellpellets wurde RPMI-Medium gegeben, und die Zellanzahl auf 10&sup6;/ml eingestellt. 100 ul des erhaltenen zellhaltigen Mediums wurden mit 100 ul RPMI-Medium mit Mitomycin C-behandeltem CEM (4 x 10&sup5; Zellen/ml) als Partnerzellen vermischt, und die erhaltene Mischung wurde in eine Kulturplatte mit 96 Vertiefungen gegeben und bei 37ºC unter einer CO&sub2;(5%)-Luft(95%)-Atmosphäre für 3 bis 4 Wochen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die gewachsenen Hybridomazellen durch limitierende Verdünnungskulturverfahren unter Verwendung der oben erwähnten Mitomycin C-behandelten CEM als Partnerzellen geklont. Nach dem Wachstum eines jeden Klons wurde die Lymphotoxinaktivität gemessen.
Die anschließende Inkubation wurde unter einer CO&sub2;(5%)-Luft(95%)-Atmosphäre bei 37ºC durchgeführt, sofern nichts anderes angegeben.
Der erfindungsgemäße Lymphotoxin-produzierende, geklonte humane T-Zellenhybridom A-C5-8-Stamm, der in Form einer Lösung mit einer Zellkonzentration von 2,5 x 10&sup5; Zellen/ml vorlag, wurde mit 20 ug/ml Con A und 20 ng/ml PMA stimuliert und 24 h inkubiert, und als Ergebnis betrug die Lymphotoxin-Aktivität 250 Einheiten/ml. Andererseits zeigte ein nichtstimulierter A-C5-8-Stamm eine Lymphotoxinaktivität von 4 Einheiten/ml.

Beispiel 2

Isolierung und Reinigung der mRNA-Fraktion aus dem Lymphotoxin-produzierenden, humanen T-Zellenhybridom (A-C5-8):

(1) Inkubation von Lymphotoxin-produzierendem, humanen T-Zellenhybridom (A-C5-8):

Die A-C5-8-Zellinie, die in Form einer Suspension mit einer Zellkonzentration von 5 x 10&sup6; bis 10&sup7;/ml vorlag, wurde 2, 4, 8, 24 und 48 h inkubiert, wobei PMA und Con A in einer Endkonzentration von 100 ng/ml und 200 ug/ml zugegeben wurden.

(2) Präpration der gesamten zellulären RNA:

Die Extraktion der gesamten zellulären RNA der A-C5-8-Zellinie wurde im wesentlichen mit dem Guanidinhydrochloridverfahren durchgeführt. Insbesondere wurden die Zellen nach Inkubation der A-C5-8-Zellinie für denselben Zeitraum wie in (1) angegeben, durch Zentrifugation (1000 Upm, 5 min) gesammelt und in PBS (enthaltend 5 mM phosphatpuffer und 0,15 M NaCl mit einem pH von 7,4) suspendiert, und die erhaltene Lösung wurde weiter 5 min bei 1000 Upm zentrifugiert und die erhaltenen Zellen wurden gewaschen.
Die Zellen (in einer Menge von 4 x 10&sup8;, 6 x 10&sup8;, 3,2 x 10&sup8;, 1,8 x 10&sup9; und 2 x 10&sup9; in jedem Inkubationszeitraum im Schritt (1)) wurden in einem Homogenatpuffer suspendiert und darin homogenisiert. Zum erhaltenen Homogenat wurden 0,025 Äquivalente 1 M Essigsäure und die 1,5-fache Menge an kaltem Ethanol (bei -20ºC) zugegeben und miteinander vermischt. Hierauf wurde die erhaltene Mischung bei -20ºC 3 h oder mehr aufbewahrt. Hierauf wurde bei -10ºC 30 min bei 15000 Upm unter Verwendung eines Hitachi RPR 18-2-Rotors zentrifugiert. Zum erhaltenen Präzipitat wurde ein Waschpuffer zugegeben (hergestellt durch Zugabe von 20 mM EDTA.2Na zum Homogenatpuffer, der im folgenden als WB bezeichnet wurde) und homogen durch Pipettieren aufgelöst. Anschließend wurde 1 M Essigsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 5 und die 1,5-fache Menge an kaltem Ethanol zugegeben, und das Canze wurde bei -20ºC 3 h oder mehr aufbewahrt. Der Ansatz wurde bei -10ºC 30 min bei 15000 Upm zentrifugiert, das erhaltene Präzipitat im WB aufgelöst. Die pH-Einstellung mit 1 M Essigsäure und die kalte Ethanolausfällung wurde dreimal wiederholt.
Eine kleine Menge an 0,1 %igen SDS wurde zum Ethanolpräzipitat zugegeben, um eine Suspension herzustellen, und zu dieser wurden 1 Äquivalent eines Extraktionspuffers (enthaltend 0,5 % SDS, 0,1 M NaCl, 50 mM Natriumacetat und 5 mM EDTA.2Na mit einem pH-Wert von 5,2) zugegeben und zwei Äquivalente wassergesättigtes Phenol (enthaltend 0,1 % 8-Chinolinol und gesättigt mit 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0)/Chloroform/Isoamylalkohollösung (Volumenverhältnis 50:50:1) zugegeben. Die Mischung wurde 10 min geschüttelt, und anschließend wurde die erhaltene Mischung 10 min bei 3000 Upm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die Mischung in drei Schichten aufgeteilt und die unterste Schicht entfernt. Die äquivalente Menge an Chloroform/Isoamylalkohollösung (Volumenverbältnis 50:1) wurde jeweils zur Oberschicht und Mittelschicht zugegeben, und die Mischung wurde 10 min geschüttelt, und anschließend wurde die erhaltene Mischung 10 min bei 3000 Upm zentrifugiert, und die unterste Schicht wurde entfernt. Die Extraktion mit der Chloroform/Isoamylalkohollösung wurde dreimal wiederholt. 0,1 der äquivalenten Menge an 3 M Natriumacetat (pH 5,2) wurde zur oberen, DNA, RNA und Sacharide enthaltenden Schicht zugegeben, und anschließend wurden zwei Äquivalente an kaltem Methanol zugegeben und das Ganze bei -20ºC 3 h oder mehr aufbewahrt, und anschließend 30 min bei 15000 Upm (RPR 18-2-Rotor) zentrifugiert. Ein kleiner Teil an keimfreiem destillierten Wasser wurde zum erhaltenen Präzipitat zugegeben und dieses aufgelöst, anschließend wurde die äquivalente Menge an kaltem 4 M Lithiumchlorid zugegeben und bei 0ºC über Nacht stehen gelassen. Anschließend wurde die Mischung 30 min bei 15000 Upm zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurrde mit einer kleinen Menge an 2 H Lithiumchlorid gewaschen, und anschließend wurde keimfrei destilliertes Wasser zugegeben und gelöst und danach 1/10 der äquivalenten Menge an 3 M 3,2 x 10&sup8;, 1,8 x 10&sup9; und 2 x 10&sup9; in jedem Inkubationszeitraum im Schritt (1)) wurden in einem Homogenatpuffer suspendiert und darin homogenisiert. Zum erhaltenen Homogenat wurden 0,025 Äquivalente 1 M Essigsäure und die 1,5-fache Menge an kaltem Ethanol (bei -20ºC) zugegeben und miteinander vermischt. Hierauf wurde die erhaltene Mischung bei -20ºC 3 h oder mehr aufbewahrt. Hierauf wurde bei -10ºC 30 min bei 15000 Upm unter Verwendung eines Hitachi RPR 18-2-Rotors zentrifugiert. Zum erhaltenen Präzipitat wurde ein Waschpuffer zugegeben (hergestellt durch Zugabe von 20 mM EDTA.2Na zum Homogenatpuffer, der im folgenden als WB bezeichnet wurde) und homogen durch Pipettieren aufgelöst. Anschließend wurde 1 M Essigsäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 5 und die 1,5-fache Menge an kaltem Ethanol zugegeben, und das Canze wurde bei -20ºC 3 h oder mehr aufbewahrt. Der Ansatz wurde bei -10ºC 30 min bei 15000 Upm zentrifugiert, das erhaltene Präzipitat im WB aufgelöst. Die pH-Einstellung mit 1 M Essigsäure und die kalte Ethanolausfällung wurde dreimal wiederholt.
Eine kleine Menge an 0,1 %igen SDS wurde zum Ethanolpräzipitat zugegeben, um eine Suspension herzustellen, und zu dieser wurden 1 Äquivalent eines Extraktionspuffers (enthaltend 0,5 % SDS, 0,1 M NaCl, 50 mM Natriumacetat und 5 mM EDTA.2Na mit einem pH-Wert von 5,2) zugegeben und zwei Äquivalente wassergesättigtes Phenol (enthaltend 0,1 % 8-Chinolinol und gesättigt mit 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0)/Chloroform/Isoamylalkohollösung (Volumenverhältnis 50:50:1) zugegeben. Die Mischung wurde 10 min geschüttelt, und anschließend wurde die erhaltene Mischung 10 min bei 3000 Upm zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde die Mischung in drei Schichten aufgeteilt und die unterste Schicht entfernt. Die äquivalente Menge an Chloroform/Isoamylalkohollösung (Volumenverbältnis 50:1) wurde jeweils zur Oberschicht und Mittelschicht zugegeben, und die Mischung wurde 10 min geschüttelt, und anschließend wurde die erhaltene Mischung 10 min bei 3000 Upm zentrifugiert, und die unterste Schicht wurde entfernt. Die Extraktion mit der Chloroform/Isoamylalkohollösung wurde dreimal wiederholt. 0,1 der äquivalenten Menge an 3 M Natriumacetat (pH 5,2) wurde zur oberen, DNA, RNA und Sacharide enthaltenden Schicht zugegeben, und anschließend wurden zwei Äquivalente an kaltem Methanol zugegeben und das Ganze bei -20ºC 3 h oder mehr aufbewahrt, und anschließend 30 min bei 15000 Upm (RPR 18-2-Rotor) zentrifugiert. Ein kleiner Teil an keimfreiem destillierten Wasser wurde zum erhaltenen Präzipitat zugegeben und dieses aufgelöst, anschließend wurde die äquivalente Menge an kaltem 4 M Lithiumchlorid zugegeben und bei 0ºC über Nacht stehen gelassen. Anschließend wurde die Mischung 30 min bei 15000 Upm zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurrde mit einer kleinen Menge an 2 H Lithiumchlorid gewaschen, und anschließend wurde keimfrei destilliertes Wasser zugegeben und gelöst und danach 1/10 der äquivalenten Menge an 3 M Natriumacetat (pH 5,2) zugegeben, es wurden zwei Äquivalente an kaltem Ethanol zugegeben und das Ganze bei -20ºC 3 h oder länger aufbewahrt. Der Ansatz wurde 30 min bei 15000 Upm zentrifugiert, und das erhaltene Präzipitat in 0,01 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,5 M NaCl, 0,1 % SDS und 1 mM EDTA.3Na mit einem pH-Wert von 7,5) aufgelöst. Anschließend wurden 3 ml Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;-Cellulose (hergestellt von PL Biochemicals Co.), die zuvor mit demselben Pufer gepuffert worden war, in eine Säule mit einem Durchmesser von 1 cm gefüllt, und die gesamte zelluläre RNA-Fraktion wurde auf die Säule gegeben. Diese wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen bis die Absorption bei 260 nm 0,05 oder weniger erreichte, und anschließend begann man mit der Elution mit einem 0,01 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,5 M NaCl, 0,1 % SDS und 1 mM EDTA.3Na mit einem pH von 7,5), und die Säule wurde gewaschen bis die Absorption bei 260 nm 0,05 oder weniger erreichte. Am Ende wurden 0,01 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,1 % SDS und 1 mM EDTA.3Na mit einem pH von 7,5) durch die Säule zur Elution unter Ablösung der Polyadenylsäure-gebundenen RNA (mRNA) gegeben, welche mit einem Fraktionskollektor gesammelt wurde, wobei die Fraktion mit einer meßbaren Absorption bei 260 nm gesammelt wurde. Auf diese Weise wurden 58 ug, 130 ug, 180 ug, 120 ug und 258 ug mRNA aus den A-C5-8-Zellen die entsprechend 2, 4, 8, 24 und 48 h inkubiert wurden, gewonnen.

(3) Bestätigung der Translation der LT-entsprechenden mRNA in Eizellen:

Gonadotropin von einer schwangeren Mähre (veterinäre Peamexinjektion, von Sankyo Co.) wurde in einen ca. 2 Jahre alten Xenopus laevis (weiblich, Gewicht 50 g oder mehr, erhältlich von Japan Biological Material Center), durch intramuskuläre Injektion in die Hüfte injiziert, in einer Menge von 200 Einheiten/Tier. Am nächsten Tag wurden die Tiere durch Eintauchen in Eiswasser anästhetisiert, woraufhin der Unterleib aufgeschnitten und die Eizellen herausgenommen und in MBS isoliert wurden. Die in Schritt (2) erhaltene mRNA wurde in keimfreiem destillierten Wasser gelöst unter Bildung einer Lösung von 1 mg (mRNA)/ml, und die erhaltene Lösung wurde in die Eizellen mit einem Durchmesser von 1 mm oder mehr in einer Menge von 50 nl (50 ng) pro Eizelle unter Verwendung einer Mikrokapillare und eines Mikroinjektors (hergestellt von Seimo Scientific Instruments Co.) unter Beobachtung mit einem geeigneten Mikroskop injiziert. 20 so behandelte Eizellen wurden in 0,2 ml MBS bei 23ºC inkubiert. Für einen Kontrolltest wurden 20 Eizellen, die nur mit 50 nl keimfrei destillierten Wassers behandelt wurden, in analoger Weise in 0,2 ml MBS bei 23ºC inkubiert.
Nach 24-stündiger oder 48-stündiger Inkubation wurde die LT-Aktivität der überstehenden Flüssigkeit der Kulturlösung gemessen, und als Ergebnis wurde bestätigt, daß die 48-stündige Inkubation die optimalen Bedingungen für die Inkubation der Eizellen bietet. Im Hinblick auf die Inkubationszeit der A-C5-8-Zellen, die mit Con A und PMA stimuliert wurden, betrug die LT-Aktivität, die von der mRNA in den 7, 4, 8, 24 und 48 h inkubierten Zellen translatiert wurde, 7,8, 4,6, 4,1, 2,7 und 0 Einheiten/ml, und daher war die beste Inkubationszeit der A-C5-8-Zellen für den Erhalt der mRNA 2 h. Keine LT-Aktivität wurde im entsprechenden Kontrolltest nachgewiesen, und es wurde daher bestätigt, daß die mRNA des LT in den Eizellen translatiert wurde.

(4) Masseninkubation von A-C5-8-Zellen und Produktion von mRNA:

Die A-C5-8-Zellen wurden unter Optimal-Bedingungen (unter Stimulierung mit Con A und PMA) inkubiert, wie unter dem obigen Schritt (3) bestimmt, und 3 x 10&sup9; Zellen wurden gesammelt. Die mRNA wurde isoliert und aus diesen Zellen nach Schritt (2) unter Erhalt von 512 ug der mRNA-Fraktion gereinigt.

(5) Fraktionierung der mRNA durch Saccharosedichtegradientenzentrifugation und Bestimmung des LT-entsprechenden mRNA-Sedimentationskoeffizienten:

512 ug der kompletten mRNA wurden in 0,01 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,01 M EDTA.2Na und 0,2 % SDS mit einem pH-Wert von 7,5) gelöst, und der Ansatz wurde über 5 ml einer 5 bis 30 %igen Saccharosedichtegradientenlösung, gelöst im selben Puffer, gegeben, und anschließend 16 h bei 15ºC unter 28000 Upm unter Verwendung des RPR 40T-208-Rotors (Hitachi Co.) zentrifugiert. Anschließend wurde der Inhalt in 25 Probenröhrchen (jeweils mit einem Fassungsvermögen von 216 ul) aufgetrennt. 1/10 Äquivalent von 3 M Natriumacetat und zwei Äquivalente kalten Ethanols wurden zu jeder Fraktion zugegeben, und der Ansatz bei -20ºC über Nacht zur Gewinnung der mRNA aufbewahrt.
Die so gewonnene mRNA wurde in keimfreiem destillierten Wasser (0,5 mg/ml) gelöst, und 100 nl der erhaltenen Lösung wurden in 20 Eizellen auf dieselbe Weise wie in Schritt (3) injiziert. Die Eizellen wurden 48 h mit 0,2 ml MBS inkubiert, und anschließend wurde die LT-Aktivität im Kulturüberstand gemessen. Als Ergebnis fand man, daß Fraktion Nr. 13 die maximale LT-Aktivität zeigte. Entsprechend wurde der Sedimentationskoeffizient der dem LT entsprechenden mRNA zu 12,6S bis 14,6S, bezogen auf die unter Verwendung von Standardmarkierungen für die Sedimentationskoeffizienten (5S, 18S, 28S) ermittelten Kurve, bestimmt.
Die gereinigte mRNA, die in diesem Beispiel erhalten wurde, wurde in dem folgenden Experiment verwendet.

Beispiel 3

(1) Synthese von cDNA:

Um cDNA zu erhalten, wurde das reverse Transkriptasesystem [³²P] (von New England Nuclear Co.) unter Verwendung von 5 ug reiner mRNA teilweise modifiziert. Insbesondere wurde ein System, das 20 ul reverse Transkriptasereaktionspuffer, 10 ul Deoxynukleosid/Triphosphatmischung, 20 Einheiten Ribonuklease A-Inhibitor, 10 ug Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8;,-Primer, 5 ul 600 mM beta-Mercaptoethanol, [alpha-³²P]dCTP (relative Aktivität: 800 Ci/mMol (100 Ci)), 5 ug mRNA und 50 Einheiten reverser Transkriptase aus dem Affenmyeloblastosisvirus enthielt, in einem Volumen von 100 ul bei 42ºC 1 h umgesetzt, und anschließend wurde das Ganze mit Eis abgekühlt, um die Reaktion abzubrechen. Nach Zentrifugation wurden das Hybrid aus mRNA und cDNA in einem kochenenden Wasserbad 3 min zur Abtrennung erhitzt, anschließend rasch in einem Eisbad 5 min abgekühlt.
Das denaturierte Protein wurde einer Zentrifugation (12000 x g, 2 min) zur Bildung von Pellets unterworfen, die wiederum mit Eis gekühlt wurden. Zu 99 ul der Reaktionslösung wurden nach Abbruch der Reaktion 16,2 ul keimfreies destilliertes Wasser, 46,8 ul DNA-Polymerase I-Reaktionspuffer, 10,4 ul Deoxynukleosid/Triphosphatmischung [alpha-³²P]dCTP (800 Ci/mMol (100 uCi)) und 15,6 ul DNA-Polymerase I aus E. coli (8000 Einheiten/ml) zugesetzt, wobei mit Eis gekühlt wurde, um das Gesamtvolumen der erhaltenen Mischung auf 198 ul einzustellen. Der Ansatz wurde gut gerührt, zentrifugiert und anschließend 20 h bei 15ºC umgesetzt. Nach der Reaktion wurden 39,4 ul 0,2 M EDTA.2Na zu 197 ul der Reaktionslösung zugesetzt, um die Reaktion abzubrechen, und 1 N NaOH (49,25 ul wurden zur Alkalihitzebehandlung bei 65ºC für 1 h zugesetzt, um die mRNA zu zersetzen, und nach Eiskühlung und Zentrifugation wurde 1 M Tris-HCl-Puffer (49,25 ul, pH 8,0) und 1 N HCl (49,25 ul) zur Neutralisation zugegeben.
Der Ansatz wurde mit 1/2 Äquivalent von wassergesättigtem Phenol und 1/2 Äquivalent von Chloroform/Isoamylalkohol (50:1) extrahiert, und nach Zentrifugation wurde die obere gesättigte Lösung abgenommen. Eine äquivalente Menge von 10 mM-tris-HCl-Puffer (enthaltend 100 mM-NaCl und 1 mM-EDTA.2Na mit einem pH von 8,0) wurde zur unteren Phase für eine nochmalige Extraktion zugegeben, und die obere, abgetrennte Phase wurde ebenfalls abgenommen. Die beiden so abgenommenen oberen Phasen wurden miteinander vereinigt und mit einer äquivalenten Menge von Chloroform/Isoamylalkohol extrahiert und zentrifugiert, und die untere Phase (organische Phase), die sich abgeschieden hatte, wurde entfernt. Diese Extraktion wurde viermal wiederholt, und anschließend wurde der erhaltene Extrakt weiter mit einer äquivalenten Menge von wassergesättigtem Ethylether dreimal extrahiert, und die organische Phase wurde entfernt. Danach wurde der erhaltene Extrakt in einem heißem Wasserbad bei 60ºC zur Entfernung des Ethylethers erhitzt.
Die erhaltene wäßrige Lösung wurde mit sec.-Butanol konzentriert, MgCl&sub2; mit einer Endkonzentration von 0,01 M und zwei Äquivalente kalten Ethanols (-20ºC) wurden zugesetzt, und man ließ bei -80ºC über Nacht stehen. Die erhaltene Mischung wurde 10 min zentrifugiert (12000 x g) und das gewonnene Präzipitat unter vermindertem Druck getrocknet und in 50 ul keimfreien destillierten Wasser aufgelöst. Zur erhaltenen Lösung wurden 20 ul reverser Transkriptasepuffer, 5 ul 600 mM-beta-Mercaptoethanol, 10 ul Deoxynukleosid/Triphosphatmischung und [alpha-³²P]-dCTP (800 Ci/mMol (100 uCi)) zugegeben, und die Mischung wurde gut gerührt, und nach Zentrifugation wurden 5 ul der oben erwähnten reversen Transkriptase zugegeben und 1 h bei 42ºC umgesetzt. Die Reation wurde unter Eiskühlung abgebrochen, um die komplette DNA mit einer Haarnadel-Schlaufenstruktur zu erhalten.
Zu 99 ul der oben erwähnten Reaktionslösung wurden 92,1 ul keimfreies destilliertes Wasser, 23,4 ul des oben erwähnten DNA-Polymerase I-Reaktionspuffers, 55 ul S&sub1;-Nukleasereaktionspuffer und 5,5 ul S&sub1;-Nuklease aus Aspergillus oryzae (50 Einheiten/ml) zugegeben, und die Mischung wurde bei 39ºC 30 min unter Spaltung der Haarnadel-Schlaufenstruktur der cDNA umgesetzt, um doppelsträngige cDNA zu erhalten. Zu dieser Lösung wurden 46 ul 0,1 M Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,1 M EDTA.2Na und mit einem pH von 7,5) zugegeben, und die Lösung wurde auf eine Sephacryl S-200-Säule (Größe: 1,0x25cm) mit einer Bettkapazität von 200 ml gegeben, und mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 0,1 M NaCl und 1 mM-EDTA.2Na mit einem pH von 7,5) eluiert. Die Fraktionierung wurde unter Erhalt von Fraktionen mit je einem Volumen von 300 ul durchgeführt, und die Fraktion, die nahe dem Ausschlußvolumen eluierte, wurde mit sec.-Butanol konzentriert und wurde einer Ethanolpräzipitation zur Gewinnung der cDNA unterworfen.

(2) Herstellung von cDNA mit angeheftetem Oligo(dC)-Schwanz:

Zur doppelsträngigen cDNA, wie oben erhalten, wurden 160 ul eines Reaktionspuffers mit der folgenden Zusammensetzung zugesetzt, und die Mischung wurde 5 min bei 37ºC umgesetzt, wobei der Oligo(dC)-Schwanz an die doppelsträngige cDNA angeheftet wurde.
Der Reaktionspuffer ist 0,2 M Kaliumcacodylat/25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 6,9), enthaltend 2 mM DTT, 5 mM CoCl&sub2;, 0,25 mg/ml BSA, 5 uM dCTP, ³H-markiertes dCTP (25 Ci/mMol (15 uCi)) und 30 Einheiten terminaler Deoxynuklotidyltransferase.
Die Reaktion wurde durch Eiskühlen abgebrochen und ein Äquivalent wassergesättigten Phenol/Chloroform/Isoamylalkohols (50:50:1) wurde zur Reaktionslösung für die Extraktion zugegeben. Der erhaltene Extrakt wurde wieder mit Chloroform/Isoamylalkohol (50:1) extrahiert, und 40 ug von ribosomaler RNA aus E. coli und 1/50 Äquivalent 5 M NaCl wurden zum Extrakt zugegeben, und anschließend wurden 2 Äquivalente kalten Ethanols zugegeben und bei -80ºC über Nacht aufbewahrt. Die cDNA mit dem Oligo(dC)-Schwanz wurde durch Zentrifugation gewonnen und in keimfreiem, destillierten Wasser unter Erhalt einer Lösung mit einer Konzentration von 0,5 ng/ul gelöst.

(3) Bildung des rekombinanten Plasmids:

1,375 ng der cDNA mit dem Oligo(dC)-Schwanz und 10 ng pBR322 DNA mit einem Oligo(dG)&sub1;&sub0;&submin;&sub2;&sub0;-Schwanz, hergestellt von Amersham) wurden in 25 ul unter Hybridisierungsbedingungen (10 mM Tris-HCl-Puffer enthaltend 100 mM NaCl und 0,1 mM EDTA.2Na mit einem pH von 7,8) bei 65ºC 15 min hybridisiert, und anschließend wurde der Inkubator auf 45ºC eingestellt, und man inkubierte das Ganze weitere 2 h bei 45ºC. Anschließend wurde der Ansatz mit Eis zur Hybridisierung unter Erhalt einer rekombinanten plasmidhaltigen Lösung gekühlt.

(4) Selektion der Transformante:

Die Lösung mit dem rekombinanten Plasmid, wie oben erhalten, wurde zu einem E. coli HB101-Stamm zur Transformation gegeben. Speziell wurde der E. coli HB101-Stamm in 10 ml L-Medium mit 0,1 % Glukose bei 37ºC inkubiert, bis die Absorption des kultivierten Mediums (650 nm) 0,05 erreichte, und 5 ml der kultivierten Lösung wurden zu 500 ml 0,1 %iger Glukose-haltigem L-Medium gegeben und weiter inkubiert, bis die Absorption (650 nm) 0,3 erreichte. Nach Abkühlen mit Eis über 30 min wurde der Ansatz bei 4ºC 5 min bei 3000 Upm zentrifugiert (mit dem RPR 9-2-Rotor von Hitachi Co.), um die gewachsenen Bakterien zu sammeln. Die Bakterien wurden in 250 ml kaltem 50 mM-CaCl&sub2; dispergiert und 15 min mit Eis gekühlt. Der Ansatz wurde einer Zentrifugation unter Verwendung des RPR 9-2-Rotors unterworfen (4ºC, 5 min, 2500 Upm), und die gesammelten Bakterien wurden in 25 ml 50 mM CaCl&sub2; mit 20 %igem Glycerol dispergiert, und die erhaltene Dispersion wurde in zwei Probenröhrchen mit jeweils einem Inhalt von 1 ml aufgeteilt und mit Trockeneispulver gefriergetrocknet und anschließend bei -80ºC aufbewahrt. Die aufbewahrte Bakteriendispersion wurde unter Kühlung mit Eis aufgetaut, und 0,3 ml der so aufgetauten Bakteriendispersion wurde mit 0,15 ml der oben erwähnten Lösung mit dem rekombinanten Plasmid und 0,15 ml 20 mM CaCl&sub2;/60mM MnCl&sub2;/20 mM RbCl-Lösung vermischt, und bei 0ºC 20 min und anschließend bei Raumtemperatur für 10 min gehalten. Anschließend wurden 2,4 ml 0,1 %igen glukosehaltigen L-Mediums, das zuvor auf 37ºC erwärmt wurde, zugegeben und vermischt, und das Ganze wurde 1 h bei 37ºC unter Schütteln inkubiert. Ein Teil der so inkubierten Lösung wurde abgenommen, und diese wurde über L-Medium/Agarplatten mit 15 ug/ml Tetracyclin zusätzlich zu den obigen Komponenten ausgebreitet und bei 37ºC für ca. 12 h inkubiert, und die Tetracyclin-resistenten Bakterien wurden unter Bildung einer cDNA-Bank selektiert.

(5) Hybridisierungstest:

Um die Transformante mit dem Plasmid, das die LT-kodierende cDNA trug, zu screenen, wurde die oben erwähnte cDNA-Bank einem Koloniehybridisierungstest unter Verwendung von ³²P-markierter synthetischer cDNA-Sonden unterworfen. Zur Bildung der synthetischen cDNA-Sonden wurden 18 Basen (404te bis 421ste Base) (5'-GTCTACTCCCAGGTGGTC-3') und die komplementäre Basensequenz (5'-CACATGGAAGGGGTACTG-3') entsprechend den 18 Basen (500ste bis 517ste Base) in dem LT-Gen nach Gray et al. (Nature, 312, 721 (1984)) chemisch synthetisiert, und 16,6 pMol davon wurden mit 5 Einheiten Polynukleotidkinase aus T4-Phagen-infiziertem E. coli und [gamma-³²P]ATP (5 uCi/pMol (20 uCi)) in 50 mM Tris-HCl-Puffer (enthaltend 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT, 0,1 mM Spermidin und 0,1 mM EDTA.2Na und mit einem pH von 7,6) bei 37ºC 30 min umgesetzt.
Die Reaktion wurde durch Umsatz von EDTA-Lösung zur Reaktionslösung und Kühlen derselben mit Eis bei 0ºC abgebrochen. Diese beiden Arten von ³²P-markierter cDNA-Sonden wurden im Hybridisierungstest verwendet, und die Transformanten mit einem rekombinanten Plasmid, das zur Hybridisierung mit beiden Sonden unter schwachen Bedingungen in der Lage war, wurden selektiert. Auf diese Weise wurden 6 Kolonien aus ca. 10000 Kolonien selektiert.
Anschließend wurde das rekombinante Plasmid aus den so selektierten 6 Stämmen abgetrennt, und dieses wurde mit Restriktionsenzym HindIII gespalten, einer Agaroseelektrophorese unterworfen, auf Nitrocellulosefilter übertragen, und wiederum mit den ³²P-markierten synthetischen cDNA-Proben unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Als Ergebnis wurde ein Klon ausselektiert.
Anschließend wurde der auf diese Weise selektierte Stamm einem Hybridisierungstranslationstest unterworfen, nach dem Verfahren beschrieben bei Maniatis T. et al., Molecular Cloning, 329 (1980) (Cold Spring Harbor Laboratory). Die Plasmid DNA wurde aus dem transformanten Stamm extrahiert, und nach Erhitzen und Denaturierung wurde sie auf einem Nitrocellulosefilter fixiert, und die LT mRNA-haltige mRNA-Fraktion, erhalten aus dem vorigen Beispiel 2-(4) wurde zugegeben und 3 h bei 50ºC zur Hybridisierung umgesetzt. Die gebundene mRNA wurde durch Elution wiedergewonnen und anschließend in Eizellen auf dieselbe Weise wie im vorhergehenden Beispiel 2-(3) injiziert, und anschließend wurde die gewonnene mRNA überprüft, ob oder ob sie keine LT-mRNA war.
Als Ergebnis wurden 10 Einheiten/ml LT im Falle von pLT13 nachgewiesen, wogegen keine LT-Aktivität in der Kontrolle pBR322 nachgewiesen wurde.
Diese cDNA wurde mit Restriktionsenzym HindIII gespalten, und seine Größe wurde durch Agarosegelelektrophorese gemessen, und es wurde bestätigt, daß sie einen cDNA-Teil von ca 1,35 Kbp enthielt.
Die Transformante, enthaltend diese cDNA (Stamm Nummer: Lt 13, klonierte DNA Nummer: pLT 13), wurde zur Isolierung der klonierten DNA behandelt, und die Basensequenz davon wurde nach dem im folgenden beschriebenen Verfahren bestimmt.

Beispiel 4

Bestimmung der Basensequenz der klonierten DNA:

(1) Erstellung einer Restriktionsendonukleaseschnittstellenkarte:

Der Stamm (LT 13), erhalten aus dem vorhergehenden Beispiel 3-(5), wurde im L-Medium mit 0,1 % Glukose und 15 ug/ml Tetracyclin unter Erhalt von Bakterien inkubiert. Die Plasmid DNA wurde aus den Bakterien gewonnen, und ihre Restriktionsendonukleaseschnittstellenkarte mit den Restriktionsenzymen EcoRI, SmaI, BamHI, PstI, SalI und HindIII erstellt, die in M13mp 8, 9 eingeführt werden können, wie im folgenden erwähnt. (Siehe Fig. 1)

(2) Bestimmung der Basensequenz der klonierten DNA:

Zur Bestimmung der Basensequenz der klonierten DNA wurde das cDNA-Frament mit M13mp 8 oder mp 9 nach dem Verfahren von Messing et al. (Gene, 19, 269 (1982)) subkloniert, und anschließend nach dem Verfahren von Sanger et al., dem Dideoxykettenabbruchverfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977); J. Mol. Biol. , 162, 729 (1982)) zur Hybridisierung der Primer, Synthese der komplementären Kette mit Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I (markiert mit alpha-³²P-markiertem dCTP (800 Ci/mMol (20 uCi)), Gelelektrophorese und Autoradiographie weiterverarbeitet.
Fig. 2 zeigt die Restriktionsenzymschnittstellen, die zur Bestimmung der Basensequenz verwendet wurden, die Richtung zur Bestimmung der Basensequenz und ihren Bereich, der durch Pfeile angezeigt wird. Der Teil, der durch die Rechtecke gekennzeichnet ist, zeigt den Teil, der für den Translationsbereich von LT kodiert.
Die Basensequenz ist dieselbe wie in der vorhergehenden Tabelle 1 gezeigt. Es gibt einen 16 G-Verschnüpfungsschwanz stromaufwärts des ersten C und einen 18 C-Verknüpfungsschwanz stromabwärts des 1310ten T, und diese sind Homopolymere, die synthetisiert wurden, wenn sie dem Vektor zugefügt wurden. Die 63ste bis 677ste Base bilden eine Basensequenz, von der man annimmt, daß sie das notwendige Polypeptid zur Bildung des LT-Vorläufers kodiert.
Von diesen Basen nimmt man an, daß diejenigen ab der 165sten Base an LT kodieren, die Basensequenz unterscheidet sich von der des LT wie bei Gray P.W. et al. berichtet (Nature, 312, 721 (1984)) darin, daß die 26ste Aminosäure in der ersteren Asn(AAC) ist, wogegen die Aminosäure in der letzteren Thr(ACC) ist. Die vorliegende Sequenz hat ein terminales Codon (TAG), dem sich die C-terminale Aminosäure anschließt (Leucin). Zusätzlich ist die vorliegende Sequenz weiter unterschiedlich von der Gray et al.-Sequenz in nicht-peptidkodierenden Teilen, nämlich darin, daß die erste bis vierte Base CGGG anstelle von GGTC ist, daß die 862ste bis 865ste Base ACAC anstelle von CACA ist, und daß die 1306ste bis 1310te Base CCCCT anstelle von TGAAA ist.

Beispiel 5

(1) Spaltung des cDNA-Fragments von pLT 13 mit Restriktionsenzymen:

Aufgrund der Struktur der kompletten cDNA wurden die Restriktionsenzyme PvuII (190ste Base) und EcoRI (838ste Base) verwendet. pLT13 wurden mit den Restriktionsenzymen nach üblicher Weise gespalten und einer 1,5 %igen Agarosegelelektrophorese unterworfen, wobei ein cDNA-Fragment von ca. 650 bp anschließend aus dem Agarosegel extrahiert wurde. Dieses cDNA-Fragment wude einer wassergesättigten Phenolextraktion und einer Chloroform/Isoamylalkoholextraktion mit anschließender Ethanolpräzipitation unterworfen, um das cDNA-Fragment zu gewinnen. Diesem cDNA-Fragment fehlen 28 Basen an seinem n-terminalen Ende im Vergleich mit dem von C mit dem N-Terminus von LT, und daher enthält dieses Fragment bis zu 164 Basen im Stromabwärtsbereich des Stop-Codons.

(2) Spaltung der Polylinkerstelle des phenotypischen Expressionsvektors pKK223-3 (hergestellt von Pharmacia Co.) mit Restriktionsenzymen:

Die Polylinkerstelle von pKK223-3 (4585 bp) wurde ursprünglich komplett mit EcoRI gespalten und anschließend teilweise mit BamHI gespalten. Das DNA-Fragment des pKK223-3, welches komplett mit BamHI gespalten wurde, wurde durch 1,5 %ige Agaraosegelelektrophorese isoliert, und die übrigen Teile wurden einer Agarosegelextraktion, Phenolextraktion, Chloroform/Isoamylalkoholextraktion und Ethanolpräzipitation in dieser Reihenfolge unterworfen. Auf diese Weise wurde das Plasmid, das teilweise mit BamHI gespalten wurde, und der Vektor, der nicht mit BamHI gespalten wurde, gewonnen. Anschließend wurden diese Plasmide komplett mit SmaI unter Erhalt der gespaltenen EcoRI-BamHI-Schnittstelle und EcoRI-SmaI-Schnittstelle gespalten.

(3) Ligation der portablen Translation-Initiierungsstelle (PTIS: obere Kette (EcoRI): untere Kette (BamHI) von Pharmacia Co.) mit dem an der EcoRI-BamHI-Stelle gespaltenen pKK223-3:

Der an der EcoRI-BamHI-Stelle gespaltene Vektor pKK223-3, wie in (2) erhalten, und PTIS (bei dem die obere Kette und die untere Kette zuvor bei 65ºC 5 min in 0,01 M Tris-HCl-Puffer mit 0,1 M NaCl und 0,1 mM EDTA mit einem pH von 7,8 erhitzt worden waren, in ein Wasserbad bei 37ºC 1 h überführt wurden mit anschließender Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min zur Hybridisierung und anschließender Aufbewahrung bei -20ºC) wurden über Nacht bei 14ºC in 50 mM Tris-HCl-Puffer (mit 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol und 1 mM ATp, pH 7,6) mit DNA-Ligase aus T4-Phagen-infiziertem E. coli umgesetzt, um in einen Vektor mit zirkulärer Struktur umzubauen. Dieser umgebaute Vektor wurde in den E. coli-Stamm JM 105 nach üblicher Weise zur Transformation eingeführt, und die erhaltenen Transformantenstämme wurden auf Ampicillin-haltigem LB-Agarmedium ausgebreitet. Die Bakterien, die das so umgebaute Plasmid enthielten, wurden anschließend als Ampicillin-resistente Bakterien selektiert, und das Plasmid wurde anschließend nach üblicher Weise erhalten. Dieses Plasmid wurd PP-3 genannt.

(4) Spaltung von PP-3 mit Restriktionsenzymen und Ligatisierung der glatten Enden mit cDNA-Fragment:

Zunächst wurde PP-3, wie unter (3) oben erhalten, teilweise mit BamHI gespalten, und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus Rinderdarmschleimhaut (hergestellt von Pharmacia Co.) in 50 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; und 1 mM Spermidin, pH 9,0) bei 37ºC 30 min zur 5'-terminalen Dephosphorylierung umgesetzt. Es folgten Extraktionen mit wassergesättigtem Phenol und mit CIA (Chloroform/Isoamylalkohol). Es wurde anschließend mit Ethanol präzipitiert, um das geöffnete zirkuläre Plasmid zu gewinnen, und anschließend wurden die überlappenden Enden unter Verwendung von DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) glatt gemacht. Dieses Plasmid mit einem glatten Ende wurde anschließend durch Extraktion mit wassergesättigtem Phenol, Extraktion mit CIA und Präzipitation mit Ethanol gewonnen.
Das in (1) erhaltene EcoRI-PvuII-Fragment von pLT13 wurde mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) umgesetzt, welche ein glattes Ende lieferte, und das Fragment wurde anschließend durch Extraktion mit Phenol, Extraktion mit CIA und Präzipitation mit Ethanol in dieser Reihenfolge gewonnen. Das gewonnene Fragment wurde anschließend mit den glatten Enden enthaltenden, offenen zirkulären PP-3-Plasmid in Gegenwart von DNA-Ligase bei 16ºC 20 h ligatisiert. Nach der Reaktion wurde das geschlossene zirkuläre Plasmid durch Extraktion mit wassergesättigtem Phenol, Extraktion mit CIA und Präzipitation mit Ethanol in dieser Reihenfolge gewonnen, und das Plasmid wurde in den E. coli-Stamm JM 105 nach üblicher Weise zur Transformation eingeführt. Unter Verwendung eines Ampicillin-Resistenz-Mediums wurden 5300 Transformanten selektiert.

(5) Screenen mit synthetischer cDNA-Sonde:

Die in (4) erhaltenen Transformanten wurden durch den Koloniehybridisierungstest unter Verwendung einer ³²P-markierten synthetischen cDNA-Sonde in derselben Weise wie in Beispiel 3-(5) gescreent, wobei 100 Kolonien selektiert wurden. Es wurde ein Plasmid aus 20 Kolonien nach üblicher Weise hergestellt, und dieses Plasmid wurde mit Restriktionsenzymen (BamHI und HindIII) gespalten und anschließend einer Agarosegelelektrophorese unterworfen. Das erwünschte Plasmid mit den DNA-Fragmenten von ca. 650 bp und ca. 250 bp wurde lokalisiert. Als Ergebnis wurden drei erwünschte Kolonien selektiert.

(6) Expression des LT in E. coli:

Eine der drei in (5) erhaltenen Transformanten wurde zur LT-Expression verwendet. Der tac-Promotor des Plasmids, der in den Wirtsbakterien von E. coli-Stamm JM 105 eingefügt wurde, wurde in den Wirtsbakterien unterdrückt, die Unterdrückung kann jedoch durch Zugabe von IPTG eliminiert werden. Die Transformanten wurden im LB-Medium (Zusammensetzung: 10 g Bactotrypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt und 10 g NaCl in 1 l, pH 7,0 bis 7,5, enthaltend 25 mg Ampicillin), das 0 bis 1 mM IPTG enthiet, bis eine O.D. (550 nm) von 1,1 bis 1,2 erreicht wurde, inkubiert. Die so inkubierten Bakterien wurden durch Zentrifugation gesammelt und mit physiologischer Salzlösung, gepuffert mit einem Phosphatpuffer, im folgenden als PBS bezeichnet) gewaschen. Die Bakterien wurden wieder durch Zentrifugation gesammelt und anschließend im PBS in einer solchen Weise suspendiert, daß die O.D. (550 nm) 1,0 war. Die erhaltene Suspension wurde mit Ultraschall zum Aufschluß der Bakterien behandelt. Die Suspension wurde unter keimfreien Bedingungen filtriert, und die LT-Aktivität gemessen. Im Falle von keiner Zugabe von IPTG, betrug die LT-Aktivität 0,26 x 10&sup4; Einheiten/ml; bei Zugabe von IPTG bei Konzentrationen von 0,01 mM, 0,1 mM und 1 mM betrug die LT-Aktivität 11 x 10&sup4;, 10 x 10&sup4; udn 15 x 10&sup4; Einheiten/ml. Wenn jedoch derselbe Test unter Verwendung von Bakterien mit eingefügten pKK223-3 als Kontrolle durchgeführt wurde, konnte keine LT-Aktivität nachgewiesen werden. Auf diese Weise wurde gezeigt daß die Expression der LT-Aktivität von der Insertion des rekombinanten Plasmids in das Wirtsbakterium herrührt. Die Stammnummer der Transformante, wie hier verwendet, wurde LT13tac6 genannt, und das hierin eingefügte Plasmid wurde pLT13tac6 genannt. Fig. 3 zeigt das Verfahren zur Herstellung des pLT13tac6.

Beispiel 6

Der transformante LT13tac6-Stamm wurde in M9 Minimalmeidum, das 19 essentielle Aminosäuren (mit der Ausnahme von Prolin) enthielt, über Nacht inkubiert, und die Kulturlösung wurde in der 10-fachen Menge von LB-Medium angeimpft. Nach 2,5 h wurde IPTG zu einer Endkonzentration von 0,1 mM zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 3 h fortgesetzt. Die Bakterien wurden anschließend durch Ultrafiltration und Zentrifugation gesammelt. 90 g (Naßgewicht) an Bakterien wurden in 300 ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 30 mM NaCl und 0,01 mM p-APMSF (p-Aminophenylmethansulfonylfluoridhdyrochlorid, hergestellt von Wake Junyaku KK) suspendiert und wurden durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die erhaltene Suspension wurde einer Zentrifugation zur Entfernung der restlichen Bakterien unterworfen, und die Überstandsflüssigkeit war der Rohextrakt. Die gesamte LT-Aktivität von 347,5 ml Rohextrakt betrug 12,2 x 10&sup8; Einheiten, und die relative Aktivität davon war 9 x 10&sup4; Einheiten/mg (Protein).

Beispiel 7

Reinigung von LT-Polypeptid:

(1) Ammoniumsulfataussalzung:

Ammoniumsulfat wurde zu 347 ml des Rohextraktes zur Herstellung einer 40 %ig gesättigten Lösung bei 5ºC zugegeben. Nach Inkubation bei 5ºC für 30 min wurde die Lösung einer Zentrifugation unterworfen. Das gebildete Präzipitat wurde in 100 ml 5 mM Phosphatpuffer, (pH 7,4) (im folgenden als PB bezeichnet) gelöst, und die erhaltene Lösung wurde gegen 4 l PB unter vierfachem Austausch dialysiert. Nach der Dialyse wurde die Lösung als eine mit Ammoniumsulfat ausgesalzte Probe weiterverarbeitet. Die gesamte LT-Aktivität von 117 ml der Probe war 11,7 x 10&sup8; Einheiten, und die relative Aktivität davon war 4,6 x 10&sup5; Einheiten/mg (Protein).

(2) Anionenaustauschchromatographie:

116 ml der mit Ammoniumsulfat ausgesalzten Probe wurde auf eine Säule (2,6 x 34 cm) mit DEAE-Sepharose CL-6B (hergestellt von Pharmacia Co.) gegeben, die zuvor mit 50 mM PB (pH 7,4) equilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit 400 ml 5 mM PB (pH 7,4) gewaschen, und die Probe in der Säule wurde mit einem ansteigenden Salzgradienten eluiert, dessen Konzentration von 0 bis 0,3 M anstieg. Das erhaltene Eluat wurde in 25 ml Aliquots gesammelt, und die LT-Aktivität jeder Fraktion wurde gemessen. Auf diese Weise wurden Fraktionen mit der LT-Aktivität gewonnen. Ca. 1000 ml der gewonnenen Lösung wurden auf einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert (Fraktionierungsmolekulargewicht: 10000, hergestellt von Millipore Co.) auf 88 ml. Die konzentrierte Lösung wurde als DEAE-Fraktionslösung bezeichnet. Die gesamte LT-Aktivität der DEAE-Fraktionslösung war 4,4 x 10&sup8; Einheiten, und seine relative Aktivität war 8,27 x 10&sup6; Einheiten/mg (Protein).

(3) Hydrophobe Chromatographie:

85 ml der DEAE-Fraktionslösung wurden auf einer Säule (2,6 x 14 cm) mit Phenyl-Sepharose CL-6B (hergestellt von Pharmacia Co.) adsorbiert, die zuvor mit PBS equilibriert worden war, und anschließend mit 150 ml 10 mM PB (pH 7,4), enthaltend 30 % Ethylenglykol, gewaschen wurde. Die Säule wurde anschließend mit Ethylenglykol eluiert, die Konzentration des Ethylenglykoleluenten stieg kontinuierlich von 30 % auf 70 % an. Das erhaltene Eluat wurde in Aliquots zu 15 ml fraktioniert, die Fraktionen wurden anschließend gegen PBS dialysiert, und die LT-Aktivität jeder Fraktion wurde gemessen. Die Fraktionen mit LT-Aktivität wurden auf diese Weise gewonnen. 308 ml der gewonnenen Lösung wurden durch die oben erwähnte Ultrafiltration auf 9,4 ml konzentriert, und die so konzentrierte Lösung wurde als Phenyl-fraktionierte Lösung bezeichnet. Die gesamte LT-Aktivität der Phenyl-fraktionierten Lösung betrug 3,94 x 10&sup8; Einheiten, und die relative Aktivität davon betrug 5,63 x 10&sup7; Einheiten/mg (Protein).
Die erhaltene Fraktion wurde mit Britton-Robinson-Puffer in einem breiten Konzentrationsbereich behandelt (Britton and Robinson; J. Chem. Soc., 1931, 458, 1456), um den pH-Wert auf einen bestimmten Wert einzustellen, und anschließend 24 h bei 4ºC inkubiert. Die auf diese Weise inkubierte Lösung wurde gegen PBS 24 h dialysiert, und seine LT-Aktivität wurde gemessen, wobei die LT-Konzentration in jedem Puffer 4,6 ug/ml betrug. Als Ergebnis trat ein Verlust von 98 % oder mehr an LT-Aktivität bei pH 2 auf, wogegen keine Abnahme der LT-Aktivität in einem pH-Bereich von 4 bis 10 auftrat. Die Phenyl-fraktionierte Lösung wurde durch 0,1 %ige SDS-haltige Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert (SDS-PAGE). (Siehe U.K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)). Die LT-Aktivität erschien in einem Proteinpeak, entsprechend einem Molekulargewicht von ca. 17500, wie durch Silberfärbung bestimmt wurde. Die in der SDS-PAGE benutzten Molekulargewichtsmarker waren:
Phosphorylse B: MG 94000, RSA: MG 67000, Ovalbumin: MG 43000, Carbonsäureanhydrase: MG 30000, Sojabohnentrypsininhibitor: MG 20000, alpha-Lactalbumin: MG 14400.

Beispiel 8

Die Phenyl-fraktionierte Lösung wurde weiter auf 1/4 des ursprünglichen Volumens durch Ultrafiltration konzentriert, und 0,5 ml der konzentrierten Lösung wurden auf SDS-PAGE (Gelplatte: 1,5 mm x 16 cm x 14 cm) fraktioniert. Die einem Molekulargewicht von 17500 entsprechende Gelfraktion wurde ausgeschnitten und mit Tris-Acetatpuffer (pH 8,6) extrahiert. Dieses Verfahren wurde wiederholt, und die erhaltenen Extrakte vereinigt und durch Ultrafiltration auf einer Membran mit einem Frkationierungsmolekulargewicht von 5000 (hergestellt von Amicon Co.) konzentriert und anschließend dialysiert. Dieses ergab ein gereinigtes LT-Polypeptid LT(I) . Die Aminosäurezusammensetzung, N-terminale Aminosäuresequenz und der isoelektrische Punkt des gereinigten LT-Polypeptids LT(I) wurde wie folgt gemessen:

(1) Aminosäurezusammensetzung:

LT(I) wurde zu einem Festkörper unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurde 6 N HCl zu diesem Festkörper zugegeben, und die Mischung wurde bei 110ºC 6 h hydrolysiert. Anschließend wurde der Ansatz mit Phenylisothiocyanat unter Erhalt von PTC-Aminosäure umgesetzt und anschließend die Zusammensetzung durch Verwendung eines Aminosäureanalysators (Umkehrphasenverteilungsverfahren von Waters Co.) analysiert. Das Tryptophan und Cystein wurden quantitativ durch das Inglis-Verfahren bestimmt (Methods in Enzymology, Band 91, S. 26, herausgegeben von C.H.W. Hirs et al., Academic Press, 1983). Das Ergebnis ist in Tabelle 4 gezeigt.
Die analysierten Daten entsprechen gut der Aminosäurezusammensetzung, die als der Basensequenz der LT-Polypeptid-kodierenden DNA erhalten wurde. Tabelle 4 Aminosäurezusammensetzung von LT(I) Aminosäure Analysewerte (Mol) Aminosäurezusammensetzung, erhalten aus der Basensequenz (Mol)

(2) N-terminale Aminosäuresequenz:

Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde nach dem Edman-Verfahren bestimmt (P. Edman; Arch. Biochem. Biophys., 22, 475 (1949)).
LT(I) (ca. 100 ug) wurde mit Phenylisothiocyanat durch eine Kopplungsreaktion umgesetzt, und anschließend wurde die N-terminale Aminosäure in Form eines 2-Anilino-5-thiazolinonderivats abgespalten, das weiter in eine Phenylthiohydantoinaminosäure umgewandelt wurde. Diese wurde durch Verwendung von HPLC (hergestellt von Waters Co.) mit einer C18-Umkehrphasensäule zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäure identifiziert. Diese Operation wurde wiederholt, um die Aminosäuresequenz des N-terminalen Teiles zu bestimmen. Die erhaltene Aminosäuresequenz des N-terminalen Teils von LT(I) ist wie folgt:

(3) Messung des isoelektrischen Punktes:

Der isoelektrische Punkte von LT(I) wurde mittels einer Elektrophorese unter Verwendung eines flachen Gels, das Pharmalite (von Pharmacia Co.) und 5 % Polyacrylamid enthielt, mit einem pH-Bereich von 5,0 bis 8,0 gemessen. Der erhaltene isoelektrische Punkte von LT(I) war 7,6 ± 0,3.
Die Elektrophorese wurde bei 2000 V für 4,5 h durchgeführt. Das Gel wurde in 3 mm-Teilchen geschnitten und mit PBS (pH 7,4) extrahiert, und die LT-Aktivität wurde gemessen. Die LT-Aktivität trat im pH-Bereich von 7 6 ± 0,3 auf. Es wurde eine Kalibrierungskurve unter Verwendung von beta-Latoglobulin-A (pI 5,20), Rindercarbonsäureanhydrase-B (pI 5,85), humaner Carbonsäureanhydrase-B (pI 6,55), Pferdemyoglobinsäureseitenbande (pI 6,85) und Pferdemyoglobinbasenseitenbande (pI 7,35) als pH-Marker erstellt.

Beispiel 9

(1) Spaltung des cDNA-Fragments von pLT13 mit Restriktionsenzymen:

Von den Restriktionsenzymen, die zur Spaltung des cDNA-Fragments von pLT13 im Hinblick auf die Struktur seiner gesamten cDNA geeignet erschien, wurden NsiI (222ste Base) und EcoRI (838ste Base) ausgewählt, und das pLT13 wurde mit den so ausgewählten Restriktionsenzymen in üblicher Weise gespalten und einer 1,5 % Agarosegelelektrophorese unterzogen, und es wurde ein cDNA-Fragment von 616 pb aus dem Agarosegel extrahiert. Das cDNA-Fragment wurde nach üblicher Weise gereinigt. Diesem cDNA-Fragment fehlen 60 Basen, die 20 Aminosäureresten im N-terminalen Bereich von LT entsprechen.

(2) Ligation von synthetischem Oligonukleotid mit LT-cDNA:

Ein synthetisches Oligonukleotid mit der folgenden Struktur, hergestellt von Applied Biosystem Co., synthetisisert unter Verwendung eines 381A-DNA-Synthesizers) und das LT-cDNA-Fragment aus obigem Schritt (1) wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in 66 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DDT und 1 mM ATP bei 16ºC über Nacht umgesetzt, wodurch das synthetische Oligonukleotid mit dem LT-cDNA-Fragment verbunden wurde.

Struktur des synthetischen Oligonukleotids:

AATTCTATGCA
GAT
Das Reaktionsprodukt wurde nach üblicher Weise gereinigt und anschließend mit EcoRI unter Erhalt des EcoRI-Fragments von 623 bp verdaut.

(3) Einführung des LT-cDNA-Fragments in einen Expressionsvektor:

Der Expressionsvektor pKK223-3 (erhalten von Pharmacia Co.) wurde mit EcoRI verdaut und anschließend mit alkalischer Phosphatase aus der Rinderdarmschleimhaut (hergestellt von Pharmacia Co.) in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0), 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; und 1 mM Spermidin bei 37ºC 30 min zur 5'-terminalen Dephosphorylierung umgesetzt und anschließend in üblicher Weise gereinigt. Der so behandelte Vektor wurde mit dem EcoRI-Fragment von 623 bp, erhalten aus obigem Schritt (2), verbunden, und anschließend wurde das erhaltene Produkt in den E. coli-Stamm JM 105 nach üblicher Weise zur Transformation eingeschleust. Unter Verwendung eines Ampicillin-Resistenz-Mediums, wurden 8700 Transformanten erhalten.

(4) Screening mit synthetischer cDNA-Sonde:

Die in (3) erhaltenen Transformanten wurden durch Koloniehybridisierungstests unter Verwendung einer ³²P-markierter synthetischer cDNA-Sonde in derselben Weise wie im vorhergehenden Beispiel 3-(5) gescreent, wobei 150 Kolonien selektiert wurden. 24 Kolonien wurden aus diesen Kolonien zufällig ausgewählt, und ein Plasmid wurde nach üblicher Weise daraus hergestellt. Das Plasmid wurde mit relevanten Restriktionsenzymen gespalten und wurde anschließend einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, wobei das erwünschte Fragment und seine Richtung festgestellt wurden. Als Ergebnis wurden sieben erwünschte Kolonien selektiert, und das Plasmid wurde pDK 10 genannt. Der Schritt zur Bildung von pDK 10 ist in Fig. 4 gezeigt.

(5) Entfernung der 3'-terminalen, nichtkodierenden Region von LT-cDNA:

Das in (4) erhaltene Plasmid pDK10 wurde mit HindIII verdaut und anschließend mit BAL31-Nuklease, hergestellt von Takara Shuzo Co.), in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 12 mM CaCl&sub2;, 12 mM MgCl&sub2;, 1 mM EDTA und 600 mM NaCl für 10 bis 60 min bei 30ºC umgesetzt, um das DNA-Terminal zu entfernen. Anschließend wurde dieses Plasmid mit DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) behandelt, um das terminale Ende glattzumachen, und anschließend mit EcoRI verdaut und durch 5 %ige Polyarylamidgelelektrophorese unter Erhalt des Fragments von ca. 480 bp oder so (vorzugsweise 460 bp) aufgetrennt.

(6) Ligation der LT-cDNA mit dem Linker:

Das in (5) erhaltene DNA-Fragment wurde mit dem HindIII-Linker (hergestellt von Takara Shuzo Co.) verbunden und anschließend mit HindIII verdaut und nach üblicher Weise gereinigt.

(7) Ligation von LT-cDNA mit dem Expressionsvektor:

pKK223-3 wurde mit EcoRI und HindIII verdaut und anschließend wurde das Fragment von 4555 bp durch 0,7 %ige Agarosegelelektrophorese isoliert und nach üblicher Weise gereinigt. Diese wurde mit dem in (6) erhaltenen EcoRI-HindIII-DNA-Fragment unter Bildung eines Vektors mit dem LT-cDNA-Fragment verbunden. (Dieses Plasmid wurde pDK 11 genannt). Der Schritt der Bildung des pDK11 ist in Fig. 5 gezeigt.

(8) Einführung von LT-cDNA in einen Multi-Copy-Vektor:

Das in (7) erhaltene Plasmid wurde mit BamHI und PvuI verdaut, und anschließend wurde das Fragment mit der LT-cDNA isoliert und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt. Ein Plasmid pAT153 (handelsübliches Produkt von Amersham Co.) wurde ebenfalls mit BamHI und PvuI auf die gleiche Weise verdaut, und anschließend wurde ein Fragment, das einen DNA-Replikationsinitiierungspunkt enthielt, fraktioniert und gereinigt. Diese beide Arten von BamHI-PvuI-Fragmenten wurden ligatisiert und anschließend in E. coli JM 105 nach üblicher Weise zur Transformation eingeführt. Unter Verwendung des Ampicillin-Resistenz-Mediums, wurden 4300 Transformanten selektiert. 24 Kolonien wurden zufällig aus diesen ausgewählt, und eine Plasmid-DNA wurde nach üblicher Weise gereinigt. Das Plasmid wurde mit relevanten Restriktionsenzymen gespalten, wodurch die Anzahl der erwünschten LT-cDNA-Fragmente und ihre Richtung bestimmt wurden. Als Ergebnis wurden 24 gewünschte Kolonien ausgewählt. (Das Plasmid wurde pDK 12 genannt). Der Schritt zur Herstellung des Plasmids pDK 12 ist in Fig. 6 gezeigt.

Beispiel 10

Mit pDK12 transformierte E. coli JM 105 wurden in M9-Medium, das 50 ug/ml Ampicillin und 19 Aminosäuren (mit der Ausnahme von Prolin) über Nacht vorinkubiert. Am nächsten Tag wurde die vorinkubierte Lösung im LB-Medium (enthaltend 10 g Bactotrypton, 5 g Bactohefeextrakt und 10 g NaCl in 1 l, pH 7 bis 7,5), enthaltend 25 ug/ml Ampicillin, angeimpft, wobei das Medium auf eine Konzentration von 1/10 durch die Zugabe der vorinkubierten Lösung verdünnt wurde. Nachdem eine O.D.550 nm von 0,3 erreicht wurde, wurde IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und anschließend wurden die Bakterien weiter inkubiert, bis eine O.D.550 nm von 1 erreicht wurde. Das kultivierte Material wurde durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen, und die LT-Aktivität des Zellextraktes wurde gemessen. die LT-Aktivität betrug ca. 3,5 x 10&sup5; Einheiten/ml kultivierten Materials.

Beispiel 11

E. coli JM 105, transformiert mit pDK12, wurde in M9-Medium, das 50 ug/ml Ampicillin und 19 Aminosäuren (mit der Ausnahme von Prolin) enthielt, über Nacht inkubiert, anschließend wurde die kultivierte Lösung weiter in 20-fachem Volumen eines Mediums, das die folgende Zusammensetzung enthielt, inkubiert. Bestandteile Natriumcitrat Glukose Casaminsäure Hefeextrakt Thiamin Ampicillin
Nach dem die O.D. &sub5;&sub5;&sub0; des Mediums ca. 10 erreicht hatte, wurde IPTG zum Medium in einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben, und anschließend wurden die Bakterien weiter inkubiert, bis die O.D.550 nm 30 erreichte. Die Kulturlösung wurde durch Ultrafiltration und Zentrifugation gewonnen, und auf diese Weise wurden 750 g (Naßgewicht) Bakterien erhalten. Die Bakterien wurden in 2000 ml einer Mischung, enthaltend 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 30 mM NaCl und 0,01 mM (p-Amidinophenyl)methansulfonylfluoridhydrochlorid (hergestellt von Wako Junyaku Co.), suspendiert und unter Verwendung einer Dinor-Mühle aufgeschlossen und anschließend einer Zentrifugation unter Erhalt einer Rohextraktlösung unterworfen. Die gesamte LT-Aktivität der Rohextraktlösung (3700 ml) betrug 6,0 x 10¹² Einheiten, und die relative Aktivität war 5 x 10&sup5; Einheiten/mg (Protein).

Beispiel 12

(1) Ammoniumsulfatfraktionierung:

Zu 3700 ml der in Beispiel 11 erhaltenen Rohextraktlösung wurde Ammoniumsulfat bis zu einer 40 %igen Sättigung bei 5ºC zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 5ºC wurde die Lösung zentrifugiert. Das gebildete Präzipitat wurde in 500 ml 5 mM Phosphatpuffer (PH 7,8), der im folgenden als PB bezeichnet wird) aufgelöst, und die erhaltene Lösung wurde wiederholt zentrifugiert, worauf sich Verdünnung zur Entfernung des Salzes anschloß, und eine ammoniumsulfatausgesalzte Probe erhalten wurde. Die Gesamt-LT-Aktivität von 185 ml der Probe betrug 5,2 x 10¹² Einheiten und die relative Aktivität war 3,7 x 10&sup6; Einheiten/mg (Protein).

(2) Anionenaustauschchromatographie:

184 ml der Ammoniumsulfat-ausgesalzten Probe wurde auf eine Säule (4,5 cm x 50 cm) mit DEAE-Sepharose CL-6B (hergestellt von Pharmacia Co.) gegeben, die zuvor mit 5 mM MPB (pH 7,8) equilibriert wurde. Die Säule wurde mit 3,0 l 5 mM PB gewaschen, und die Probe wurde mit einem eluiert, wobei die Konzentration des Eluaten kontinuierlich von 0 bis 0,3 M anstieg. Das erhaltene Eluat wurde in 100 ml Aliquots fraktioniert, und die LT-Aktivität einer jeden Fraktion wurde gemessen. Die erhaltenen Fraktionen mit der LT-Aktivität wurden vereinigt. Ca. 3,0 l der erhaltenen Lösung wurde über eine Ultrafiltrationsmembran konzentriert (Fraktionierungsmolekulargewicht 10000, hergestellt von Millipore Co.) auf 170 ml. Die konzentrierte Lösung wurde DEAE-fraktionierte Lösung genannte. Die gesamte LT-Aktivität der DEAE-fraktionierten Lösung war 2,9 x 10¹² Einheiten und die relative Aktivität war 2,4 x 10&sup7; Einheiten/mg (Protein).

(3) Hdyrophobe Chromatographie:

169 ml der DEAE-fraktionierten Lösung wurden auf eine Säule (5,0 cm x 15 cm) mit Phenyl-Sepharose CL-6B (hergestellt von Pharmacia Co.) adsorbiert, die zuvor mit einer physiologischen Salzlösung, die mit PB gepuffert wurde, equilibriert worden war, und anschließend mit 600 ml 10 mM PB (pH 7,8), enthaltend 30 % Ethylenglykol, gewaschen. Die Säule wurde mit Ethylenglykol eluiert, die Konzentration des Ethylenglykoleluats stieg dabei kontinuierlich auf 70 % an. Das Ethylenglykol wurde aus der erhaltenen Lösung durch Ultrafiltration entfernt. Die Eluatlösung wurde anschließend auf 63 ml konzentriert, und die konzentrierte Lösung wurde Phenyl-fraktionierte Lösung genannt. Die Gesamt-LT-Aktivität der Phenyl-fraktionierten Lösung betrug 2,3 x 10¹² Einheiten, und die relative Aktivität war 7,3 x 10&sup7; Einheiten/mg (Protein). Die Phenyl-fraktionierte Lösung wurde mittels 0,1 % SDS-enthaltenden Polyacrylamidgelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert (siehe U.K. Laemmli, Nature, 227, 680 (1970)). Als Ergebnis wurde eine Bande an der Stelle mit einem Molekulargewicht von 17000 durch Silberfärbung identifiziert. Die Molekulargewichtmarker der SDS-PAGE waren wie folgt:
Phosphorylase B: MG 94000; RSA: MG 67000; Ovalbumin: MG 43000; Carbonsäureanhydrase: MG 30000; Sojabohnentrypsininhibitor: MG 20000; alpha-Lactalbumin: MG 14400.

Beispiel 13

Die Phenyl-fraktionierte Lösung wurde weiter auf 1/3 durch Ultrafiltration konzentriert, und 0,5 ml der konzentrierten Lösung wurden mittels SDS-PAGE (Gelplatte 1,5 mm x 16 cm x 14 cm) aufgetrennt, und anschließend wurde das Gelfragment, das einem Molekulargewicht von 17000 entsprach, ausgeschnitten und mit Tris-Acetatpuffer, (pH 8,6) extrahiert. Diese Operation wurde wiederholt, und die erhaltenen Extrakte miteinander vereinigt und mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Fraktionierungsmolekulargewicht von 5000 (hergestellt von der Amicon Co.) konzentriert und anschließend dialysiert. Dieses ergab gereinigtes LT-Polypeptid LT(II). Die Aminosäurezusammensetzung und die N-terminale Aminosäuresequenz des gereinigten LT-Polypeptids LT(II) wurden wie folgt bestimmt:

(1) Aminosäurezusammensetzung:

Das gereinigte LT(II) wurde zu einem Festkörper unter vermindertem Druck getrocknet. Es wurde 6 N HCl zugegeben, und die Mischung bei 110ºC 6 h hydrolysiert. Diese Mischung wurde anschließend mit Phenylisothiocyanat unter Erhalt der PTC-Aminosäure umgesetzt, und seine Zusammensetzung wurde durch einen Aminosäureanalysator (Umkehrphasenverteilungsverfahren von Waters Co.) analysiert. Das Tryptophan und Cystein wurden quantitativ nach dem Verfahren von A.S. Inglis (Methods in Enzymology, Band. 91, S. 26, herausgegeben von C.H.W. Hirs et al., Academic Press, 1983) bestimmt. Das Ergebnis ist in Tabelle 5 gezeigt.
Die Analysewerte entsprechen gut der Aminosäurezusammensetzung, die aus der Basensequenz der LT-Polypeptid-kodierten DNA bestimmt wurde. Tabelle 5 Aminosäurezusammensetzung von LT(II) Aminosäure Analysewerte (Mol) Aminosäurezusammensetzung, erhalten aus der Basensequenz (Mol)

(2) N-terminale Aminosäuresequenz:

Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde nach dem Edman-Verfahren bestimmt (P. Edman; Arch. Biochem. Biophys., 22, 475 (1949)).
LT(II) (ca. 100 ug) wurden mit Phenylisothiocyanat durch Kopplungsreaktion umgesetzt, und anschließend wurde die N-terminale Aminosäure in Form eines 2-Anilino-5-thiazolinonderivats abgespalten, und wurde ferner in eine Phenylthiohydantoin-Aminosäure umgewandelt. Diese wurde unter Verwendung von HPLC (hergestellt von Waters Co.) mit einer C18-Umkehrphasensäule zur Bestimmung der N-terminalen Aminosäure identifiziert. Diese Operation wurde wiederholt, und die Aminosäuresequenz des N-terminalen Teiles wurde auf diese Weise bestimmt. Die erhaltene Aminosäuresequenz des N-terminalen Teiles von LT(II) war wie folgt:

Beispiel 14

Expression des LT-Gens in tierischen Zellen:

(1) Herstellung des cDNA-Fragments:

Der in dem vorhergehenden Beispiel 3-(5) erhaltene Stamm LT13 wurde in einem L-Medium unter Erhalt gewachsener Bakterien inkubiert. Plasmid DNA (pLT13) wurde aus den Bakterien gewonnen und mit Restriktionsenzym XhoII gespalten und einer 1,5 %igen Agarosegelelektrophorese unter Erhalt eines DNA-Fragments von ca. 940 bp auf dieselbe Weise wie im vorhergehenden Beispiel 5-(1) unterworfen. Dieses DNA-Fragment enthält die 24ste bis 969ste Base der cDNA in Tabelle 1.
Die überlappenden Enden dieses DNA-Fragments wurden in glatte Enden unter Verwendung einer DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) umgewandelt, und das Fragment wurde durch Phenolextraktion und CIA-Extraktion und anschließender Ethanolpräzipitation gewonnen. Dieses DNA-Fragment wurde mit BamHI-Linker d(CGGATCCG) (hergestellt von Takara Shuzo Co.) ligatisiert, und auf diese Weise wurde die DNA durch Phenol/CIA-Extraktion, CIA-Extraktion mit anschließender Ethanolpräzipitation gewonnen. Diese DNA wurde mit Restriktionsenzym BamHI gespalten und einer 0,8 %igen Agarosegelelektrophorese unter Erhalt von DNA-Fragmenten von ca. 940 bp auf dieselbe Weise wie in Beispiel 5-(1) unterworfen. Man nahm an, daß diese ein DNA-Fragment mit einem BamHI-Linker-abgeleiteten BamHI-gespalteten Ende und ein DNA-Fragment, welches dieses nicht aufwies, enthielten.

(2) Herstellung des Expressionsvektors (pSV2-Ecogpt-MMTV-LTR) :

Die Klonierung von MMTV-LTR wurde nach dem Verfahren von J.E. Majors und H.E. Varmus (Science, 289, 253 (1981)) oder dem Verfahren von N. Fesel (EMBO J, 1, 3 (1982)) durchgeführt.
Zunächst wurde ein Gen, das Ecogpt in dem lambda-Phagen enthielt, in Form eines EcoRI-Fragments von ca. 9 kb kloniert, und anschließend wurde das PstI-Fragment, das ein Fragment mit ca. 1,3 kb war, in die Pst-Stelle des pBR322 subkloniert. Nach der Subklonierung wurde das pBR322-MMTVLTR teilweise mit PstI verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unter Erhalt des linearen Plasmids von ca. 6 kb in üblicher Weise unterworfen. Das so erhaltene Plasmid wurde einer S1-Nukleaseverdauung unterzogen, und seine überlappenden Enden wurde in glatte Enden überführt, und diese wurden wiederum durch Agarosegelelektrophorese gewonnen. Anschließend wurde der Ansatz mit einem BamHI-Linker ligatisiert und dann vollständig mit BamHI und PstI verdaut. Danach wurden Fragmente von ca. 1,3 kb isoliert und durch Agarosegelelektrophorese gewonnen. Man nimmt an, daß die so isolierte Fraktion zwei Arten von DNA mit überlappendem Ende des PstI-BamHI enthält.
Das pSV2-Ecogpt wurde nach dem Verfahren von R.C. Mulligan und P. Berg (Science, 209, 1422 (1980); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981)) hergestellt. Dieses Plasmid enthält ein Fragment von 2,3 kb, welches den Replikationsursprung aus dem pBR322 und das Amp -Gen und die frühen Bereichspromotor-Polyadenylierungsstelle aus dem SV40 und ein kleines Antigenintron und das XGPRT-Gen von E. coli (Ecogpt) enthält. Dieses pSV2-Ecogpt wurde teilweise mit PstI verdaut und vollständig mit BamHI verdaut und anschließend einer Gelelektrophorese unter Erhalt eines Fragments von ca. 4,9 kb unterworfen. Dieses Fragment und das oben erwähnte MMTV-LTR-haltige PstI-BamHI-Fragment wurden nach üblicher Weise ligatisiert und anschließend in HB101 transfektiert. Diesen wudren unter Amp -Bedingung unter Erhalt der erwünschten Transformante selektiert. Aus der Transformante wurde nach üblicher Weise ein Plasmid gewonnen, und dieses mit HindIII und SstI verdaut, und die erhaltenen Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese unter Erhalt des erwünschten Plasmids pSV2-Ecogpt-MMTV-LTR analysiert, das zur Bildung von Fragmenten von ca. 4 kb und ca. 2,2 kb in der Lage war.

(3) Herstellung von pSV2-MMTV-LTR mit LT-cDNA-Fragment:

Das im Schritt (3) erhaltene cDNA-Fragment wurde mit dem pSV2-MMTV-LTR, erhalten im Schritt (2), mit den glatten Enden von BamHI in Gegenwart von DNA-Ligase aus T4-Phagen-infizierten E. coli zur Transfektion in den E. coli HB101-Stamm ligatisiert. Die Bakterien wurden auf Ampicillin-haltige L-Medium-Agar-Platten unter Erhalt von 300 Transformantenkolonien angeimpft. Von diesen wurden 20 Kolonien zufällig ausgewählt, und diese wurden in 1 ml L-Medium vorinkubiert, Glycerin wurde zugegeben und die so inkubierten Bakterien bei -20ºC aufbewahrt. Von diesen 20 Grundstämmen wurden sieben in 10 ml L-Medium inokuliert, und über Nacht bei 37ºC inkubiert, und anschließend wurden die Plasmide hieraus nach üblicher Weise gewonnen. Als Ergebnis der 0,8 %igen Agarosegelelektrophorese fand man, daß drei Kolonien das LT-cDNA-Fragment enthielten. Diese Plasmide wurden weiter mit Restriktionsenzym EcoRI gespalten, und als Ergebnis wurden zwei Klone, die ein LT-Fragment enthielten, das normalerweise in den niedrigeren Fluß von MMTV-LTR in der 5'- zur 3'-Richtung eingefügt ist, und ein Klon, der das Fragment in umgekehrter Richtung eingefügt enthielt, erhalten. Das erstere Plasmid wurde pSV2-LT/MMTV-LTR genannt. Der Schritt zur Bildung des Plasmids ist in Fig. 7 gezeigt.

(4) Transfektion des pSV2-LT/MMTV-LTR in Cos 1-Zellen und LT-Expression:

Die Transfektion wurde nach der DNA-Kalziumphosphatcopräzipitationsmethode wie folgt durchgeführt:
24 h vor Transfektion wurden Cos 1-Zellen (0,5 x 10&sup6; Zellen/5 ml (MEM-10 % FCS-Medium)) in Einwegpetrischalen mit einem Durchmesser von 6 cm gegeben und bei 37ºC unter einer 5 %igen (CO&sub2;)-95%(Luft)-Atmosphäre inkubiert. 4 h vor der Transfektion wurde das Medium ausgetauscht und die Zellen weiter inkubiert. Lösung (A) (enthaltend 500 ul 2 x HBS (enthaltend 10 g/l HEPES und 16 g/l NaCl pH 7,10) und 10 ul 100 x PO&sub4; (enthaltend eine äquivalente Mischung von 70 mM Na&sub2;HPO&sub4; und 70 mM NaH&sub2;PO&sub4;)) wurde hergestellt, während Luft zugeführt wurde, Lösung (B), enthaltend 60 ul 2 M CaCl&sub2; und 440 ul Träger DNA (Lachsspermien DNA)-enthaltende wäßrige Plasmidlösung mit einer Endkonzentration von 20 ug/ml)) wurde zugetropft, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 20 min zur Kopräzipitation aufbewahrt, 500 ul der copräzipitierten Abscheidung wurden zu der oben erwähnten Cos 1-Zellen-inkubierten Lösung zugegeben, und die Zellen wurden weiter 16 h bei 37ºC unter 5 %iger (CO&sub2;)-95%(Luft)-Atmosphäre inkubiert. Das Medium wurde ausgetauscht und Dexamethason wurde in einer Endkonzentration von 1 x 10&sup6; M zugegeben, die Inkubation wurde bei 37ºC unter 5 %iger (CO&sub2;)-95%-iger(Luft) 24 und 48 h fortgesetzt. Nach Inkubation wurden die Überstände jeweils gesammelt. Im vorliegenden Test lieferte die Verwendung des Plasmid-DNA-haltigen LT-cDNA-Fragments in der normalen Richtung in einer Menge von 2 ug, 1 ug und 200 ng zur Transfektion eine Ausbeute an LT-Aktivität von 5,5, 2,3 und 1,9 Einheiten/ml. Andererseits zeigte die Verwendung des anderen Plasmid-DNA-haltigen Fragments in der umgekehrten Richtung keine Ausbeute an LT-Aktivität. Diese Ergebnisse bestätigten die Expression von LT-cDNA in tierischen Zellen.
Aus der vollständig beschriebenen Erfindung geht hervor, daß für den Fachmann viele Veränderungen und Modifikationen möglich sind, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung, wie hierin dargelegt, abzuweichen.

Claims

1. Gen mit der folgenden Basensequenz

worin ein Teil der Basensequenz ein Polypeptid mit einer Lymphotoxinaktivitat codiert.

2. Gen nach Anspruch 1, das hergestellt wird aus einer Messenger-RNA, welche aus einem Lymphotoxin produzierenden humanen T-Zellen-Hybridom isoliert wird und in den 12.6S- bis 14.6S-Fraktionen durch Fraktionierung nach einem Saccharose-Dichtegradienten- Zentrifugationsverfahren erhalten wird.

3. Verfahren zur Produktion eines Gens nach Anspruch 1, das umfasst:

Inkubation von Lymphotoxin produzierenden T-Zellen-Hybridoma in einem Phorbolmyristatacetat, Concanavalin A oder eine Mischung davon enthaltendem Medium für 24 Stunden,

Fraktionierung der erhaltenen Zellen nach einem Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugationsverfahren,

Isolierung einer Messenger-RNA in den 12.6S- bis 14.6S-Fraktionen, und Herstellen eines Gens aus dieser Messenger-RNA.

4. Lymphotoxin mit der folgenden Aminosäuresequenz (I):

5. DNA, die ein Lymphotoxin mit der Aminosäuresequenz (I) aus Anspruch 4 codiert.

6. Lymphotoxin mit der folgenden Aminosäuresequenz (II):

7. DNA, die ein Lymphotoxin mit der Aminosäuresequenz (II) aus Anspruch 6 codiert.