DD297840A5 - Verfahren zur herstellung eines vektors mit einer dna-sequenz, die ein protein mit wirkung einer interferon-regulatorsequenz (irf-1) codiert und dessen verwendung - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vektors mit einer DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-1) hat, gekennzeichnet dadurch, dasz es die Spaltung eines Vektors mit einem geeigneten Restriktionsenzym und die Bindung einer DNA-Sequenz, die das genannte Protein codiert, an die Spaltstelle umfaszt.{Vektorherstellung; DNA-Sequenz codiert Protein mit Interferon-Regulatorsequenz *}
Description
+213 +225
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-13, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz, die ein strukturelles Gen für ein gewünschtes, pharmazeutisch wirksames Protein umfaßt, an eine Spaltstelle des Vektors gebunden ist, wodurch in dem resultierenden Vektor das genannte Gen unter der Kontrolle des IRF-1-Proteins durch die entsprechende DNA-Sequenz codiert wurde.
15. Verfahren gemäß den Ansprüchen 3 und 14, gekennzeichnet dadurch, daß in dem resultierender. Vektor das Gen, das das IRF-1-aktive Protein codiert, unter Kontrolle des konstitution oder des induziblen Promotors ist.
16. Verfahren gemäß Anspruch 14 odor 15, gekennzeichnet dadurch, daß das Gen für das gewünschte, pharmazeutisch wirksame Protein eine IRF-1-Bindungsstelle umfaßt, die eine Vielzahl von sich wiederholenden AAGTGA-Sequenzen enthält.
17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 14—16, gekennzeichnet dadurch, daß das gewünschte, pharmazeutisch wirksame Protein ein Cytokin- oder Plasmogen-Aktivator ist.
18. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor ein Plasmid ist.
19. Verwendung eines Vektors, wie er in einem der vorstehenden Ansprüche definiert ist, gekennzeichnet dadurch, daß er zur Transformation einer Wirtszelle eingesetzt wird.
20. Verwendung gemäß Anspruch 19, gekennzeichnet dadurch, daß die Wirtszelle mit einem Plasmid transformiert wird, das eine DNA-Sequenz enthält, die ein Protein mit der Aktivität eines IRF-I codiert, und durch ein separates DNA-Molekül mit einem Gen, das ein gewünschtes pharmazeutisch wirksames Protein unter der Kontrolle des IRF-I-Protein-Codes für das genannte Plasmid codiert.
21. Verwendung gemäß Anspruch 20, gekennzeichnet dadurch, daß das Gen, das das IRF-1-aktive Molekül codiert, unter Kontrolle eines konstitutiven oder eines indiziblen Promotors ist.
22. Verwendung gemäß Anspruch 20 oder 21, gekennzeichnet dadurch, daß das Gen für das gewünschte, pharmazeutisch wirksame Protein eine Bindungsstelle für das IRF-1-aktive Protein umfaßt, die eine Vielzahl von sich wiederholenden AAGTGA-Sequenzen einschließt.
23. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 19-22, gekennzeichnet dadurch, daß die Wirtszelle eine Bakterien-, Hefe- oder Säugetierzelle ist.
24. Verfahren gemäß Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß der Vektor ein Plasmid ist, und das resultierende Plasmid ist
PHIRF31
pIRF-Loder
plRF2-5.
Hierzu 16 Seiten Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Regulation der Genexpression. Insbesondere betrifft die Herstellung eines rekombinanten DNA-Molekül, das für ein Protein codiert, das die Aktivität eines lnterferon-Regulationsfaktors-1 (IRF-I) besitzt; sowie die Verwendung derartiger DNA Moleküle zur Transformation von Wirtszellen, die auch durch DNA-Moleküle transformiert werden, die für ein gewünschtes Protein unter der Kontrolle dieses IRF-l-aktivsn Proteins codieren.
-12- 297 840 Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Die Transkription von Genen in Säugetierzellen wird durch komplexe Mechanismen reguliert, in denen die Wechselwirkungen der Regulations-DNA-Sequenzen mit den trans-wirkenden DNA-Bindungsproteinen eine zentrale Rolle spielen. Im Zusammenhang mit der Regulation der Transkription stellen die für Interferone (IFN) codierenden Gene ein Merkmai dar, das vielen Cytokingenen eigen ist; die Transkription dieser Gene wird in einem transienten Zustand nach verschiedenen extrazellulären Signalen induziert. Es ist bereits gut dokumentiert worden, daß die Transkription der Gene für IFN-a und IFN-ß in einer Vielzahl von Zellen durch Viren wirksam induziert wird, während die Transkription des für IFN-γ codierenden Gens in T-Lymphozyten (T-Zellen) nach mitogener Stimulierung induziert wird (siehe Weissmann und Weber, 1986; Taniguchi, 1988). IFN-ß,-ein Cytokin, das ursprünglich wegen seiner potenten antiviralen Wirksamkeit identifiziert wurde, scheint auch eine wichtige Rolle bei der Steuerung des Zellwachstums und der Zelldifferenzierung zu spielen. In diesem Zusammenhang scheinen neben Viren und poly(rl):poly(rC), die die bekannten Induktoren des IFN-ß-Gens sind, auch viele Cytokine wie der koloniestimulierende Faktor-1 (CSF-1) (Moore u. a., 1984; Warren und Ralf, 1986; Resnitzky u. a., 1986), der Tumornekrose-Faktor (TNF) (Onozaki u.a., 1988); der plättchenstämmige Wachstumsfaktor (FDGF) (ZuIIo u.a„ 1985) und die IFN (Kohase u.a., 1987) IFN-ß in bestimmten Zellen zu induzieren, was vermuten läßt, daß sie ähnliche oder identische Signale in die Zielzellen übertragen können.
Es wurde auch gezeigt, daß die IFN-ß-Geninduktion durch Viren und poly(rl):poly(rC) auf der Transkriptionsebene stattfindet (Raji und Pitham 1983; Ohno und Taniguchi, 1983; Dinteru.a., 1983; Zinn u.a., 1983). So wurden cis-wirkende DNA-Sequenzen, die als induzierbare Verstärker fungieren, in der 5'-Flankenregion des Human-IFN-ß-Gens identifiziert (Fujita u.a., 1985,1987; Goodbourn u.a., 1985; Dinter und Hauser, 1987). Die induzierbare Verstärkerregion (d.h. -65 bis -105 in bezug auf die CAP-Stelle) enthält sich wiederholende Hexanucleotideinheiten, von denen einige tatsächlich in der induzierten Aktivierung der Transkription bei der Muitimerisierung wirken (Fujita u.a., 1987). In Säugetierzellen wie z. B. Maus-L929-Zellen und Human-Zellen wurden ein Faktor, IRF-1, der spezifisch an die IFN-ß-Regulationssequenzen bindet, sowie die funktioneilen, sich wiederholenden Hexanucleotidsequenzen, (AAGTGA)4, identifiziert. Es wurde festgestellt, daß der IHF-1 eine wesentliche Rolle bei der virusinduzierten Aktivierung der IFN-ß-Gentranskription durch Wechselwirkung mit den identifizierten cis-Elementen spielt.
Ziel der Erfindung
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird ein pharmazeutisch wertvoller Vektor mit einer DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das die Wirkung einer Interferon - Regulatorsequenz (IRF-1) hat, zur Verfügung gestellt.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Molekü!s zur Verfügung zu stellen, das für ein Protein codiert, das als ein Interferon-Regulationsfaktor-1 (IRF-1) wirkt.
Entsprechend dem breiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA-Moleküls zur Verfugung gestellt, dao für ein Protein codiert, das als ein Interferon-Regulationsfaktor-1 (IRF-1) wirkt.
Vorzugsweise codiert das DNA-Molekül für oder ist hybridisierbar an das DNA-Molekül, das für Human-IRF-1 oder Maus-IRF-1 codiert.
Das DNA-Molekül ist vorzugsweise eines, das für ein Protein codiert, das an die wiederholte Oligomersequenz AAGTGA und die „upstream"-Regulationselemente des Human-IFN-ß-Gens bindet.
Das DNA-Molekül kann eine Promotorregion enthalten, die konstitutiv oder induzierbar ist, beispielsweise virusinduzierbar z. B.
durch das Newcastle-Virus oder durch mitogene Stimulierung, z. B. mittels Concanavalin A, induzierbar.
Ein bevorzugtes DNA-Molekül (das für Human-IRF-I codiert) ist durch ein Strukturgen gekennzeichnet, das die folgende Formel I
Formel I
10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT
110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGÄTTCCAGCCCTGATACCTTCTCTC'T
460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970 CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG
oder eine degenerierte Variante davon.
CGAGCCCCGCCGAACCGAGGCCACCCGGAGCCGTGCCCAGTCCACGC
cggccgtgcccggcggccttaagaaccaggcaaccactgccttcttccct cttccactcggagtcgcgcttcgcgcgccctcactgcagcccctgcgtcg ccgggaccctcgcgcgcgaccagccgaatcgctcctgcagcagagccaac
10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
60 70 80 90 100
TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATC1 110 120 130 140 150
TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAÄAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCÄCTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
5^0 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCACTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750
ctgaggacatcatgaagctcttggagcagtcggagtggcagccaacaaac ;
760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 900 ; GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
catccaggccattccctgtgcaccgtagcagggcccctgggcccctctta ttcctctaggcaagcaggacctggcatcatggtggatatggtgcagagaa
• gctggacttctgtggocccctcaacagccaagtgtgaccccactgccaag tggggatgggcctccctcctt^ggtcattgacctctcagggcctggcagg CCAGTGTCTGGGTTTTTCTTGTGGTGTAAAGCTGGCCCTGCCTCCTGGGA AGATGAGGTTCTGAGACCAGTGTATCAGGTCAGGGACTTGGACAGGAGTC AGTGTCTGGCTTTTTCCTCTGAGCCCAGCTGCCTGGAGAGCJGTCTCGCTG tcactggctggctcctaggggaacagaccagtgaccccagaaaagcataa caccaatcccagggctggctctgcactaagagaaaattgcactaaatgaa tctcgttccaaagaactaccccttttcagctgagccctggggactgttcc aaagccagtgaatgtgaaggaaagtggggtccttcggggcaatgctccct cagcctcagaggagctctaccctgctccctgctttggctgaggggcttgg gaaaaaaacttcgcactttttcgtgtggatcttgccacatttctgatcag aggtgtacactaacatttcccccgagctcttggcctttgcatttatttat acagtgccttgctcggggcccaccaccccctcaagccccagcagccctca acaggcccagggagggaagtgtgagcgccttggtatgacttaaaattgga aatgtcatctaaccattaagtcatgtgtgaacacataaggacgtgtgtaa atatgtacatttgtctttttataaaaagtaaaattgtt
oder eine degenerierte Variante davon.
Ein weiteres bevorzugtes DNA-Molekül (das für Maus-IRF-I codiert) ist durch ein Strukturgen der folgenden Formel I
gekennzeichnet:
Formel III
ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ATT AAT TCC AAC CAA ATC CCA GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CGG GTG TAC CGG ATG CTG CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG
AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTG TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTn CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATC GAT GGC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG
oder eine degenerierte Variante davon.
Ein derartiges wie im vorhergehenden Absatz genanntes DNA-Molekül kann beispielsweise durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"· und „downstreanV'-Flankensequenzen wie in der folgenden Formel IV hat:
Formel IV
1 GGACGTGCTTTCACaGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCC
6 0 GAGTTGCGCCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATCTTTCG
119 CTTCGTGCGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTC
178 TGCGAATCGCTCCTGCAGCAA AGCCACC ATG CCA ATC ACT CGA ATG CGG 22 7 ATG AGA CCC TGG CTA GAG ATG CAG ΛΤΤ AAT TCC AAC CAA ATC CCA 2 72 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AAA GAA GAG ATG ATC TTC CAG ATT CCA 317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAC GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC 362 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA 407 GGA GAA AAA GAG CCA 3AT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT 452 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG 497 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG 542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC bS7 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT 632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA 677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG 722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT 767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT 812 ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC 857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG 902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG
947 CAG CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG GGA TAC TTG CTC AAT GAG CCA
992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG
1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA
1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG
1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT
1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC
1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC 1281 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC 1340 TTGGGTCAGTGGGCTwTCAGGGCTTAGGAGGCAGAGTCTGAGTTTTCTTGTGAGGTGAA 1399 GCTGGCCCTGACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT 1458 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG 1576 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 1635 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA 1694 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 1,53 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCAOTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGCATTTÄTTTATA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG
1930 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC 1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT 2048 TTTTATMAA^TTtXaGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2082
oder eine degenerierte Variante davon.
Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die für Proteine codieren, die IRF-l-Aktivität besitzen, schließen DNA-Sequenzen eukaryontischen Ursprungs ein, und zwar nicht nur Human- und Maus-, sondern auch Kücken-, Frosch- und Hefe-DNA-Sequenzen, die mit den DNA-Sequenzen des vorgenannten Human- oder Maus-IRF-I (Fig. I bis IV) hybridisieren und die für ein Protein mit IRF-l-Aktivität codieren.
Ein derartiges cDNA-Molekül, das an diecDNA von Maus-IRF-I nach der Definition in Fig.4A hybridisiert, wird im folgenden in Formel III a vorgestellt.
Formel HIa
10 20 30 40 ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG
50 60 70 80 90 ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG
100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA
140 150 160 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC
190 200 210 220 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA
230 240 250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC
280 290 300 310 ATTGAGGAAÜTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC
320 330 340 350 360 TTCAGAGTCT δ CCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG
370 380 390 40.0 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC.
410 420 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTÄGTAATGGA
460 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA
500 510 520 530 540 AAAAATGAAÜTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGT AGGACAG
550 560 570 580 TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC
590 600 610 620 630 CCCCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT
640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT
680 690 700 710 720 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC
730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG
770 780 790 800 810 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC
820 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG
860 870 880 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT
910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC
950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC
1000 1010 102c 1030
CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT
1040 GTCAAGAGCTGT
oder eine degenerierte Variante davon.
Dieses DNA-Molekül kann beispielsweise durch ein Strukturgen gekennzeichnet sein, das die im vorangegangenen erläuterte Formel sowie „upstream"- und „downstream"-Flankensequenzen wie in der folgenden Formel IVa hat.
CTAACTTTTAGTTTTGCTCCTGCGATTATTCA.ACTGACGGGCTTT CATTTCCATTTTACACACCCTAACAACACTCACACCTTGCGGGAT
TGTATTGGTAGCGTGGAAAAAAAAAAAGCACATTGAGAGGGTACC
10 20 30 40
ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG
50 60 70 80 90
ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG
100 110 120 130
AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA
140 150 160 170 180
TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTGGGCGATC
190 200 210 20
CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGAfCCAAAA
230 240 250 260 270
ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC
280 290 300 310
ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC
320 330 340 350 360
TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG
370 3SO 390 400
AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC
410 420 _ 430 440 450
ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA
460 470 480 490
GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA
500 510 520 530 540
AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG
550 560 570 580
TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC
590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT
640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT
680 690 700 710 720 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC
730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG
770 780 790 800 810 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC
820 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG
860 870 830 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT
910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC
950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC
1000 1010 1020 10.30 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT
1040 .GTCAAGAGCTGTT AAGCCTTTGACTCTCCCTGGTGGTIGTTGGGA
tttcttagctttgtgttgttctttgtttgtattatattatttttt
ttctctatgatacctatcttagacacatctaagggagaaagcctt
tcttcttaactcaggactccagccccccccccccctcggtagatg
-21- 297 CGTATCTCTAGAACCTGCTGGATCTGCCAGGGCTACTCCCTCAAG TTCAAGGACCAACAGCCACACGGGCAGTGGAGGTGCfGCGTTGCC TACGGTCAAGGCCAGCATGGTGGAGTGGATGCCTCAGAACGGAGG AGAAAATGTGAACTAGCTGG.AATTTTTTTATTCTTGTGAATATGT ACATAGGGCAGTACGAGCAATGTCGCGGGCTGCTTCTGCACCTTA TCTTGAAGCACTTACAATAGGCCTTCTTGTAATCTTGCTCTCCTT CACAGCACACTCGGCGACCCCTTCTGTGTCCACTACCCCACTACC
CACCCCTCCCTCCTCAACCCCTCCATCCCGGTCCTCTATGCGCCC CTTCCCCCCAACCAATCCCATCACAACCTCTTACCTATCCTTTCC CTCCCAACCCCTTCTATCCCAGCCCACCACCTACCCCACTCCTCC CCAACTCCTCCATTCTAGCCCATTACCCACGCCTCTCTCCTCAGC
CCAGCCTACCCCATCCCACCCTGTTCCTTTCCTCCAGTTTCCTCT CCTCAAAGGCAAGGCTCTACATCTTGGAGGAGGAGGAGGAGAAGA AAATGAGTTTCTTCACCGCTGTCCCATTTTAAGACTGCTTGAATA ATAAAAAAAAATCTTTCTAATCTGCTATGCTTGAATGGCACGCGG TACAAAGGAAAACTGTCATGGAAATATTATGCAAATTCCCAGATC
tgaagacggaaaatactctaattctaaccagagcaagctttttta tttttttatacaaggggaatattttattcaaggtaaaaaaattct
• aaataaaatataattgttttttatcttttctacagcaaatttata
attttaagattccttttcctgttcatcagcagttgttattacatc ccttgtggcacattttttttttaattttgtaaaggtgaaaaaaaa
acttttatgagctcatgtagcaatcaaattatcctgtggattgat
oder eine degenerierte Variante davon.
Formel V
PStI
CTGCAGAAAGAGGGGGACGGTCTCGGCTTTCCAAGACAGGCAAGGGGG -299
GC Box 1 GC Box 2
CAGGGGAGTGGAGTGGAGCAAÖGGGCGqGCCCGCGGTAGCCCC^GGGCGGlrGGCGCGG -251
GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCCGCTTAGCTCTAC 193
CAAT BOX
AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTGiGGCCA-ATlGGGCGCGCAGGAGCG -135
kleine CAP-Stelle
GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC -77 -21
große CAP-Stelle
plRF-L
M "r (—
TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT -19 +1
TTCACAGTCTAAGCCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGAACCGGGCCGAGTTGCG +39
CCGAGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACCCCAGCATCTCGGGCATC1ΓTTCGCTTCGTG + 97
CGCGCATCGCGTACCTACACCGCAACTCCGTGCCTCGCTCTCCGGCACCCTCTGCGAA +155
Pstl
TCGCTCCTGCAG . +213 +225
oder eine degenerierte Variante davon.
Das rekombinante DNA-Molekül kann auch für die Expression eines pharmazeutisch aktiven Proteins wie beispielsweise eines Cytokins oder eines Plasminogenaktivators vorgesehen sein und wird in dieser Form vorzugsweise ein Strukturgen für ein pharmazeutisch aktives Protein operabel gebunden an eine Promotorregion des Gens für dieses Protein einschließlich einer Bindungsstelle für das IRF-l-aktive Molekül enthalten.
Somit kann ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Molekül eine wie im vorangegangenen erläuterte DNA-Sequenz und ein Strukturgen für ein gewünschtes pharmazeutisch aktives Protein unter der Kontrolle des IRF-l-aktiven Proteins, für das diese DNA-Sequenz codiert, enthalten. In einem derartigen rekombinanten DNA-Molekül befindet sich das für das IRF-l-aktive Molekül codierende Gen vorzugsweise unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors oder noch besser eines induzierbaren Promotors. Vorzugsweise schließt das Gen für das gewünschte pharmazeutisch aktive Protein eine IRF-Bindungsstelle ein, die repetitive AAGTGA-Sequenzen enthält.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Wirtszelle, z. B. eine Bakterienzelle z. B. E. coli, oder eine Hefezelle oder eine Säugetierzelle ζ. B. eine CHO-ZeIIe oder eine Mauszelle z. B. L929, die durch ein rekombinantes DNA-Molekül nach der im vorangegangenen erläuterten Bedeutung transformiert wurden. Idealerweise wird die Wirtszelle aus einer Zellinie ausgewählt, die keine oder im wesentlichen keine endogene IRF-I-Aktivität zeigt.
Alternativ für die Produktion eines pharmazeutisch aktiven Proteins kann eine Wirtszelle transformiert sein durch ein erstes DNA-Molekül, das eine für ein Protein mit IRF-I-Aktivität cocierende Sequenz enthält, und durch ein zweites separates DNA-Molekül, das ein Gen enthält, das unter der Kontrolle des IRF-l-aktiven Proteins, für das das erste DNA-Molekül codiert., für ein gewünschtes, pharmazeutisch aktives Protein codiert. Vorzugsweise umfaßt das erste, für das IRF-l-aktive Molekül codierende DNA-Molekül einen konstitutiven Promotor oder am besten eine induzierbare Promotorsequenz, die operabel an das für die IRF-l-aktive Verbindung codierende Gen gebunden ist. Das zweite DNA-Molekül enthält vorzugsweise auch eine Bindungsstelle für das die repetitiven AAGTGA-Sequenzen enthaltende IRF-l-aktive Protein.
Das IRF-l-aktive Protein oder das pharmazeutisch aktive Protein kann durch Kultivierung der transformierten Zelle und Isolierung des erzeugten Proteins auf herkömmliche Weise hergestellt werden.
Die Wirtszellen werden geeigneterweise durch Behandlung in einer Art und Weise, die dem Promotor entspricht, der operabel an das für den IRF-I codierende Gen gebunden ist, induziert, wie im folgenden erläutert wird.
Die Erfindung umfaßt auch ein Protein, das die Aktivität eines IRF-I besitzt, das durch die Kultivierung eines Wirts gewonnen wurde, der mit einem DNA-Molekül transformiert wurde, wie im vorangegangenen beschrieben wurde. 5in bevorzugtes Protein mit einer IRF-I-Aktivität hat die folgende Formel Vl:
Formel Vl
Met Pro He Thr Arg Met Arg Met Arg pro Trp Leu GIu Met Gin He Asn Ser Asn Gin He Pro GIy Leu He Trp He Asn Lys GIu GIu Met He Phe Gin He Pro Trp Lys His Ala Ala Lys His GIy Trp Asp He Asn Lys Asp Ala Cys Leu Phe Arg Ser Trp Ala He His Thr GIy Arg Tyr Lys Ala GIy GIu Lys GIu Pro Asp Pro Lys Thr Trp Lys AIa Asn Phe Arg Cys AIa Met Asn Ser Leu Pro Asp Ale GIu GIu VaI Lys Asp Gin Ser Arg Asn Lys GIy Ser Ser Ala VaI Arg VaI Tyr Arg Met Leu
Pro Pro Leu Thr Arg Asn GIn Arg Lys GIu Arg Lys Ser Lys Ser Ser Arg Asp Thr Lys Ser Lys Thr Lys Arg Lys Leu Cys GIy Asp VaI Ser Pro Asp Thr Phe S^r Asp GIy Leu Ser Ser Ser Thr Leu Pro Asp Asp His Ser Ser Tyr Thr Thr Gin GIy Tyr Leu GIy Gin Asp Leu Asp Met GIu Arg Asp He Thr Pro AIa Leu Ser Pro Cys VaI VaI Ser Ser Ser Leu Ser GIu Trp Hi£ Met GIn Met Asp He He ^ro Asp Ser Thr Thr Asp Leu Tvr Asn Leu GIN VaI Ser Pro Met Pro Ser Thr Ser GIu AIa AIa Thr Asp GIu Asp GIu GIu GIy Lys He Ala GIu Asp Leu Met Lys Leu Phe GIu Gin Ser GIu Trp GIn Pro Thr His He Asp GIy Lys GIy
Tyr Leu Leu Asn GIu Pro GIy Thr GlN Leu Ser Ser VaI Tyr GIy Asp Phe Ser Cys Lys GIu GIu Pro GIu lie Asp Ser Pro Arg GIy Asp He GIy He GIy He Gin His VaI Phe Thr GIu Met Lys Asn Met Asp Ser He Met Trp Met Asp Ser Leu Leu GIy Asn Ser VaI Arg Leu Pro Pro Ser He Gin Ala He Pro Cys AIa pro !
Ein weiteres bevorzugtes Protein mit einer IRF-1-Aktivität hat die folgende Formel VII: Formol VII
MetProIleThrTrpMetArgMetArgProTrpLeuGluMet
GlnneAsnSerAsnGlnlleProGlyLeuIleTrpHeAsnLysGluGluMetlleLeu GluIleProTrpLysHisAlaAlaLysHisGlyTrpAspileAsnLysAspAlaCysLeu PheArgSerTrpAlalleHisThrGlyArgTyrLysAlaGlyGluLysGluProAspPro LysTlirTrpLysAlaAsnPheArgCysAlaMetAsnSerLeuProAsplleGluGluVal LysAspGlnSerArgAsnLysGlySerSerAlaValArgValTryArgrtatLeuProPro LeuThrLysAsnGlnArglysGluArgLysSerLysSerSerArgAspAlaLysSerLys AlaLysArgLysSerCysGlyAspSerSerProAspThrPheSerAspGlyLeuSerSer SerThrLeuProAspAspHisSerSerTyrThrValProGlyTyrMetGlnAspLeuGlu ValGluGlnAlaLcuThrProAlaLeuSerProCysAlaValSerSerThrLeuProAsp TrpHisIleProValGluValValProAspSerThrSerAspLeuTyrAsnPheGlnVal SerProMetProSerlleSerisxuAlaThrThrAspGluAspGluGluGlyLysLeuPro GluAspHeMetLysLeuLeuGluGlnSerGluTrpGlnProThrAsnValAspGlyLys GlyTryLeuLeuAsnGluProGlyValGlnProThrSorValTyrGlyAspPheSerCys
LysGluGluProGlulleAspSerProGlyGlyAsplleGlyLeuSerLeuGlnArgValPheThrAspLeuLysAsnMetAspAlaThrTrp LeuAspSerLeuLeuThrProValArgLeuProSerlleGlnAlalleProCysAlaPro
AspGlnProValSerMetSerGluLeuTyrProLeuGlnlleSer
ProValSerSerTyrAlaGluSerGluThrThrAspSerValAla
SerAspGluGluAsnAlaGluGlyArgProHisTrpArgLysArg
SerlleGluGlyLysGlnTyrLeuSerAsnMetGlyThrArgAsn
ThrTyrLeuLeuProSerMetAlaThrPheValThrSerAsnLys
ProAspLeuGlnValThrlleLysGluAspSerCysProMetPro
TyrAsnSerSerTrpProProPheThrAspLeuProLeuProAla
ProValThrProThrProSerSerSerArgProAspArgGluThr
ArgAlaSerVallleLysLysThrSerAsplleThrGlnAlaArg
ValLysSerCys
Im folgenden wird die molekulare Clonierung und Charakterisierung von Maus- und Human-cDNA, die für DNA-bindende Proteine, die die IRF-I -Aktivität besitzen, codieren, beschrieben.
Eine bemerkenswerte Sequenzerhaltung ist zwischen den Maus- und Human-IRF-1-Molekülen ersichtlich, wie sich aus der Analyse der clonierten cDNAs ergab. Weiterhin zeigt sich, daß die Expression des für IRF-1 codierenden Gens durch das Newcastle-Virus (NVD) und durch Concanavalin A (ConA) in Maus-L929-Zellen bzw. Milzlymphozyten induziert wird.
Ausführungsbelsplele
1. Clonierung und Expression von IRF-I-DNA in E. coil
A. PoIy(A)+ RNA wurde aus nichtinduzierten Maus-L929-Zellen isoliert und für die Synthese von cDNA (nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987) verwendet. Die entstandene cDNA wurde anschließend in einen EcoRI-geschnittenen Agtll-Vektor cloniert, und eine cDNA-Bibliothek wurde nach dem Slandardverfahren von Huynh u.a., 1985, mittels E. coli Y1090 als Wirtsstamm konstruiert.
Die entstandene Xgtll-Bibliothek wurde anschließend mittols der multimerisierten (4mal) AAGTGA-Sequenz (im folgenden als das Cl-Oligomer bezeichnet; Fujita u.a., 1987) als Sonde gescreent.
Bei diesem Screening-Verfahren wurde E. coil Y1090, durch die rekombinanten AgtM -Phagen infiziert, auf rechteckige Platten von 10cm χ 13cm ausgestrichen. Die Platten wurden dann bei 12°C 4 bis 5 Stunden, wenn ungefähr 20000 Plaques/Platte zu sehen waren, inkubiert.
Die Membranfilter zum Screenen waren entweder aus Nyion (Nytran; Schleicher & Schnell) oder Nitrocellulose (Schleicher & Schnell). Die Filter wurden in 1OmM IPTG (zur Induktion der LacZ-Genexpression in Jen entsprechenden Phagenplaques) getaucht und an der Luft getrocknet, dann über die Platten gelegt und 2,5 Stunden bei 370C inkubiert.
Die Plaques werden nur ein Protein erzeugen, für das die cDNA codiert, wenn die cDNA mit dem LacZ-Gen im Rahmen ist.
Die Filter werden entfernt, 20 Minuten bei 4°C gekühlt und dann ohne Trocknen gescreent.
Die Membranfilter wurden dann wie folgt für den Test vorbereitet: Aus Maus-I.929-Zelle wurde der Kernextrakt hergestellt und auf die Membranen getüpfelt (in einer Menge, die etwa 10pg Protein entsprach).
Vor der DNA-Bindung wurde ein Bindungspuffer, der aus 1OmM Hepes, pH 7,5,5,OmM NaCI, 1mM DTT, 1mM EDTA, 5% Glycerol bestand, zugesetzt. 5% fettfreies Milchpulver (Yukijurishi Inc.) wurde zu dem Puffer gegeben, und die Filter wurden in diesem Gemisch 1 Stunde lang bei 40C inkubiert und anschließend 1 Minute im gleichen Puffer, der jedoch kein Milchpulver enthielt, gespült.
Die Filter wurden dann in Bindungspuffer (1 ml) inkubiert, der 350pg/ml Lachssperma-DNA mit einer durchschnittlichen Länge von etwa 300bp und die "P-markierte Sonde aus C1-Oligomer-DNA (108cpm/ml; spezifische Aktivität 2000cpm/f Mol) enthielt (siehe Fujita u. a„ 1987). Die Sonden-DNA wurde mit T4-Kinase an den 5'-Termini [γ-32Ρ)ΑΤΡ endmarkiert.
Nach der Bindung wurden die Filter bei Raumtemperatur mit dem Bindungspuffer 1 bis 2 Stunden lang gewaschen (10 ml Filter), wobei der Bindungspuffer mehrere Male gewechselt wurde. Die Filter wurden dann an der Luft getrocknet und autoradiographisch untersucht. Bei diesem Test ergaben die Nylonmembranen, jedoch nicht die Nitrocellulosemembranen, ein positives Signal, was durch Zugabe von überschüssigem nichtmarkiertem C1-Oligomer spezifisch inhibiert wurde.
Auf diese Weise wurden etwa 1,4 x 10e Rekombinanten gescreent. Unter den 32 positiven Phagenclonen, die beim ersten Screenen identifiziert wurden, war ein Clon (der als λί28-8 bezeichnet wurde), der wiederholt in aufeinanderfolgenden Screeningdurchgängen an die Sonden-DNA band.
2. Herstellung und Reinigung von Protein In transferiertem E. coil
Lysogene Bakterienclone wurden durch Transfektion von E coli Y1089 mit XL28-8 hergestellt. Die über Nacht stehengelassenen Lysogene, die AL28-8 enthielten, wurden zu 1 % in 400ml L- Brühe eingeimpft. Die Bakterien wurden bei 310C gezüchtet, bis OD600 gleich 1 war. Die Temperatur wurde dann für 20 Minuten auf 420C erhöht. IPTG wurde dann zu 1OmM zugegeben, und nach weiterer SOminütiger Inkubation bei 380C wurden die Kulturen schnell pelletiert und in 10ml Lysispuffer suspendiert, der aus 2OmM Hepes pH 7,9,0,2mM EDTA, 0,5mM Spermidin, 0,15mM Spermin, 0,1 mM DTT, 10% Glycerol, 0,5mM Phenylmethyonylsulfonylfluorid (PMSF), 1 Mg/ml Pepstatin A, 1 \ig/m\ Leupeptin, 500μΜ L-l-Tosylamid-2-phenylethylchloromethylbenzamidin, 1OmM Natriummolybdat, 2mM Natriumpyrophosphat und 2mM Natriumorthovanadat bestand. Die Zellsuspensionen wurden drei schnellen Gefrier/Auftau-Zyklen ausgesetzt und anschließend bei 30000 U min"1
1 Stunde lang bei 40C mittels eines Beckman 5OTi Rotors zentrifugiert. Der Überstand wurde entweder direkt für einen Gelverzögerungstest (siehe unten) verwendet oder weiter gereinigt.
Die weitere Reinigung wurde folgendermaßen ausgeführt:
Etwa 4ml Überstand wurden auf eine poly(di-C):poly(di-C)-S8ule mit einem Bettvolumen von 2 ml und mit Lysepuffer äquilibriert, aufgegeben. Das Durchflußmaterial (4ml) wurde dann auf eine DE 52 (Whatman) Säule mit einem Bettvolumen von
2 ml und mit Puffer Z (25mM Hepes, pH 7,8,12,5mM MgCI2,1 mM DTT, 20% Glycerol, 0,1 % NP-40,0,5mM PMSr) äquilibriert, aufgegeben. Die DNA-Bindungsaktivität wurde durch den 0,1 m KCI enthaltenden Puffer Z eluiert. Das Eluat (etwa 4ml) wurde weiter mit Centricon-10 (Amicon) eingeengt.
Die Endkonzentration des Proteins betrug 28mg/ml.
3. Charakterisierung des Proteinprodukts des Clons XL28-8
(1) Gelverzögerungstest
Lysogene Bakterienclone, die λΙ.28-8 enthielten, wurden durch Transfektion von E. coli Y1089 hergestellt und wurden induziert, um die clonierte cDNA in großen Mengen mittels des Verfahrens von Huynh u. a., 1985, zu exprimieren. Lysogene Clone, die in der gleichen Art und Weise hergestellt und behandelt worden waren, denen das cDNA-lnsert (als λ6 bezeichnet) fehlt, wurden als Kontrolle benutzt.
Aus den induzierten Lysogenkulturen wurden Extrakte hergestellt, die je 3μg Protein enthielten (vier Präparate, die als XL28-8a, XL28-8b und A6a und X6b bezeichnet wurden).
Kernextrakte (3pg Protein) wurde ebenfalls aus Maus-L929-Zellen hergestellt.
Die Extrakte wurden mit 1 f mol gekennzeichneter C1-Oligomer Sonde nach obiger Beschreibung mit einer spezifischen Aktivität von 8000cpm/f mol inkubiert.
Jeder Extrakt wurde auch einem Vergleichstest unterzogen, in dem eine kompetitive DNA in verschiedenen Konzentrationen zu der Inkubationskultur gegeben wurde.
Die Ergebnisse des Tests sind in Fig. 1 dargestellt, in der die verschiedenen Bahnen folgendem entsprechen:
Bahn Extrakt
1 nichts
2 A6a
3 Aöb
4 X6b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C1-Oligomer
5 X6b mit 10OOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer*
6 XL28-8a
7 XL28-8b
8 XL28-8b mit lOOOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem CVOligomer
9 XL28-8b mit lOOOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer*
10 L929-Zelle
11 L929-Zelle mit lOOOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C1-Oligomer
12 L929-Zelle mit lOOOfachem molarem Überschuß an nichtmarkiertem C5A-Oligomer* * Das In Fujita u.a., 1985 beschriebene C5A-Oligomer ist eine 6mal wiederholte GAAA-Sequenz.
Aus Fig. 1 wird ersichtlich, daß gebundene Sonden in den Bahnen 6,7,9,10 und 12 nachweisbar sind.
Wie in Fig. 1 gezeigt wird, ergaben Proteinextrakte aus den AL28-8-Lysogenen verschobene Bahnen (Bahnen 6 und 7), deren
Erscheinen durch den Überschuß an nichtmarkierter C1 -Oligomer-DNA inhibiert war, jedoch nicht in dam gleichen Maße wie bei C5A-Oligomer (Bahnen 8 und 9).
Im Gegensatz zu den XL28-8-stämmigen Proteinen ergaben diejenigen, die aus den induzierten X6-stämmigen Lysogenen hergestellt worden waren, keine derartigen verschobenen Banden (Bahnen 2-5). Die verschobenen Banden sind dicht bei denen von natürlichem IRF-I aus Maus-L929-Zellen (Bahnen 10 und 12) zu sehen. Die in den beiden Reihen der verschobenen Banden existierenden Unterschiede sind als eine Folge der unterschiedlichen Mengen an Protein, das an die Sonden-DNA gebunden ist, zu sehen.
Weiter wird festgestellt, daß die verschobenen Banden nur bei den Proteinen aus IPTG-induzierten Y1089-Zellen, die mit XL28-8 transferiert waren, nachweisbar waren.
(Ii) DNAase-Fußspurenanalyse
Die Fußspurenanalyse wurde durchgeführt, um die Bindungseigenschaften des durch XL28-8-cDNA codierten Proteins an eine DNA, die für die IFN-ß-Gen-„upstream"-Region codiert, zu testen.
Das durch XL28-8-cDNA codierte Protein wurde aus dem induzierten Lysogen extrahiert und teilweise durch Säulenchromatographie wie oben beschrieben gereinigt und auf seine Bindungseigenschaften an eine DNA, die die IFN-ß-Gen-„upstream"-Region enthält, geprüft.
Die Sonden-DNAs wurden als Sall-Hindlll-Fragmente hergestellt, die aus p-125cat (das das Wildtyp IFN-ß-Gen enthält) und p-125DPcat (das ein mutiertes IFN-ß-Gen enthält) isoliert wurden. Das Plasmid p-125cat wurde als p-105cat konstruiert (Fujita u.a., 1987), mit der Ausnahme, daß das Fragment BamHI (-125)-Tagl (+19) aus pSE-125 (Fujita u.a., Cell, Bd. 41, S. 489-496,
1985) verwendet wurde. Das Plasmid p-125DPcat, das Punktmutationen innerhalb der IFN-ß-Regulationselemente trägt, wurde durch synthetische ortsspezifische Oligonucleotidmutagenese an p-125cat wie bei Hatakeyama u.a., Proc. Natl. Aced. Sei. USA, Bd. 83, S. 9^0-9654,1986) beschrieben, gewonnen. Beide DNAs wurden durch [γ-32Ρ]ΑΤΡ mittels T4-Kinase an der Hindlll-Stelle markiert.
4f Mol Sonden-DNA (spezifische Aktivität 3000cpm/f Mol) wurden in 20μΙ Reaktionsgemisch, das 25mM Tris-HCI, pH 7,9, 6,25mM MgCI2,5OmM KCI, 1 mM EDTA, 0,5mM DTT, 10% Glycerol, 2% Polyvinylalkohol enthielt, mit oder ohne 280pg gereinigtes Protein inkubiert.
In dem Test wurden 5 x 10"4 Einheiten DNAase I (Worthington) zugefügt und 1 Minute bei 250C inkubiert.
Fig. 2 zeigt Autoradiogramme der aus den Proben gewonnenen DNA-Fragmente, die während der folgenden Verfahren
gewonnen wurden. Auf der linken Seite von Fig. 2 ist der Teil der DNA-Sequenz der Wildtyp-IFN-ß-Sonde dargestellt, und auf der rechten Seite der Teil der DNA-Sequenz der mutierten IFN-ß-Sonde.
1. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonden wurde durch A+G-Reaktionen geschnitten (siehe Methods in Enzymology, Bd. 65, S. 499-560) das Ergebnis wird in Bahn 1 gezeigt.
2. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde teilweise durch DNAase I ohne Schutz digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 2 gezeigt.
3. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und dann mit DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 3 gezeigt.
4. Die Wildtyp-IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein in Gegenwart eines lOOOfachen molaren Überschusses an nichtmarkiertem C1-Oligomer umgesetzt und anschließend mit DNAase I digeriert- das Ergebnis wird in Bahn 4 gezeigt.
5. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde mit dem Protein umgesetzt und anschließend durch DNAase I digeriert - das Ergebnis wird in Bahn 5 gezeigt.
6. Die mutierte IFN-ß-Sonde wurde durch A+G-Reaktionen geschnitten - das Ergebnis wird in Bahn 6 gezeigt.
In Fig. 2 werden die in den Bahnen 3 und 5 gefundenen geschützten Regionen entsprechend den auf der linken bzw. rechten Seite des Autoradiogramms dargestellten Sequenzen gezeigt. Die Hexamermotive sind eingerahmt.
Aus den Ergebnissen in Fig.2 ist ersichtlich, daß die geschützte Region den Nucleotiden -100 bis -64 entspricht und dies die Region ist, die durch aus L929-Zellen gewonnene IRF-1 geschützt wird. Der Schutz wurde durch die Verwendung von überschüssigem nichtmarkiertem C1-Oligomer (Bahn 4) aufgehoben. Bei Verwendung geringerer Proteinkonzentration wurde auch festgestellt, daß die das AAGTGA-Motiv (-80 bis -70) enthaltende Region bevorzugt geschützt war.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Protein eine höhere Affinität zu der das AAGTGA-Motiv enthaltenden Reyici- und eine geringere Affinität zu der Nachbarr^gion hat.
Das mutierte IFN-ß-Gensegmentträgt T-G-Mutationen an den Positionen -106, -100, -73 und -67. In den Vergleichsbahnen 5 und 2 unter den gleichen Testbedingungen erscheint der durch die rekombinanten Proteine gewährte Schutz an der nichtmutierten Region eingeschränkt (Bahn 2). Diese Beobachtung stimmt mit der Beobachtung überein, daß die Einführung dieser Mutationen zu einer drastischen Reduzierung (20fach) der Induzierbarkeit der Transkription durch NDV in L929-Zellen führt und daß die In vitro Bindung IRF-1 an das mutierte IFN-ß-Gen nur in der nichtmutierten Region feststellbar war.
Weiter zeigt die Verwendung des C1-Oligomers, daß das Protein spezifisch die Region schützt, die die Oligomersequenzen enthält. Dieser Schutz entspricht vollkommen dem, der durch nativen IRF-1, der aus L-929-Zollen stammt, gewährt wird.
3. DNA-Konkurrenztest
Dieser Test wird ausgeführt, um die Affinität des rekombinanten Proteins zu verschiedenen DNA-Sequenzen einschließlich einigen bekannten Transkriptionsregulations-DNA-Sequenzen zu untersuchen. Das Verfahren wird folgenderweise durchgeführt:
Das Hindlll-Sall-Fragment der IFN-ß-Sonde wurde aus p-125cat isoliert (siehe Fujita u.a., 1987); dieses Fragment enthält die Human-IFN-ß-Gensequenz von +19 bis -125. Die DNA wurde an den 3'-Termini durch Füllen beider Enden mit [a-32P) dCTP mittels Klenow-Fragment markiert.
Die spezifische Aktivität der Sonden-DNA betrug 8000cpm/f Mol.
Die Gelverzögerungstests wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
In den Durchläufen des Konkurrenztests wurde, wie in Fig.3 gezeigt, die DNA mit dem Protein in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Konkurrenz-DNAs in dem Bindungsgemisch umgesetzt.
Der Bildungswert des Komplexes wurde durch densitometrische Analyse des Autoradiogramms quantitativ bestimmt. Die Komplexbildung in Abwesenheit von Konkurrenz-DNA wurde als 100% angenommen.
Die Struktur der Konkurrenz-DNAs sah folgendermaßen aus:
a) AP-1: eine synthetische DNA mit folgender Sequenz
5'CTAGA(TGACtCA)6G 3' 3'T(ACTGAGT)6CCTAg 5'
b) TNF: 37 bp lange synthetische DNA, die von +1162 bis +2116 (siehe Nedwin u.a., 1985) des ersten TNF-a-lntrons reicht;
c) Maus-H2-Dd: 37 bp lange synthetische DNA, die das von Korber u.a., 1988 beschriebene IRS-Element (-159 bis -123) umfaßt;
d) Human-IFN-a: 46bp lange synthetische DNA, die dem Virus-Antwortelement (Virus Response Element) entspricht (siehe Ryals u.a., 1985).
e) Hexamersequenzen C1, C2, C3, C4 und C5A.
Die Sequenzen C1 und C5A sind die oben beschriebenen. Die Sequenzen C2, C3 und C4 sind die in Cell, 49,352-367 (1987) beschriebenen. Sie stellen die Sequenzen
AAATGA | - C2 |
AAGGGA | - C3und |
AAAGGA | - C4 |
dar
f) dielFN-ß-Gensequenzvon+19bis-66.
Die linke Tafel in Fig. 3 zeigt die Ergebnisse, dio erhalten wurden, wenn dio Hexamerwiederholungen als Konkurrenten verwendet wurden. Die mittlere Tafel zeigt die Ergebnisse, wenn Human-iFN-Gensegmente als Konkurrenten eingesetzt wurden, und die rechte Tafel zeigt die entsprechenden Ergebnisse, wenn die in der Tafel angegebenen unterschiedlichen DNA-Segmente verwendet wurden.
Aus den Ergebnissen in Fig. 3 ist ersichtlich, daß das Erscheinen der verschobenen Bande durch die Hexamersequenzen in dieser Reihenfolge der Wirksamkeit C1-C2-C3-C4 verdrängt wurde, jedoch signifikant nicht verdrängt wurde durch C5A.
Es kann auch beobachtet werden, daß die synthetischen DNA-Segmente, die die Regulationselemente von entweder Human-IFN-a 1 oder Maus-H-2 Od-Genen umfassen, zu einer kompetitiven Aktivität Anlaß geben. Dies ist insbesondere interessant, da das DNA-Segment des H-2 Dd-Gens die sogenannte IFN-Antwortsequenz (IRS) enthält, die als ein Verstärker fungiert, wenn die Zellen auf IFN reagieren (Sugitau.a., 1987; Israel u.a., 1986; Korber u.a., 1988).
Tatsächlich werden ähnliche oder gleiche Sequenzmotive wie auf dem IFN-ß-Gen in vielen Promotorsequenzen der IFN-induzierbaren Gene gefunden, wo Kernfaktoren spezifisch zu binden scheinen (Korber u.a., 1988; Lery u.a., 1988).
Die in Fig. 3 gegebenen Ergebnisse ähneln sehr denen, die gewonnen werden, wenn der Test unter gleichen Bedingungen unter Verwendung von natürlichem, aus L929-Zellen produziertem Protein wiederholt wird.
Struktur der für Maus-IRF-I codierenden cDNA
Die DNA-Sequenz der clonierten DNAs wurde entweder durch die Didesoxymethode (SEQUENASE; United States Biochemical, Inc.) oder durch das Standardverfahren von Maxam und Gilbert, 1980) bestimmt.
Das XL28-8-lnsert in E. coli Y1089 wurde folgendermaßen isoliert: Die Phagen-DNA wurde durch das Standardverfahren hergestellt und die DNA wurde durch EcoRI digeriert, dann wurde die aus der Phagen-DNA ausgeschnittene cDNA mit Hilfe der Didesoxymethode (Sequenase: United States Biochemical Inc.) isoliert und sequenziert. Die Länge des cDNA-lnserts in XL28-8 betrug 1,8kb. Die Nucleotidsequenzanalyse zeigte einen großen offenen Leserahmen in Phase mit dem ß-Galactosidgen.
Zum Screenen von Clonen, die größere cDNA-lnserts enthalten, wurde doppelsträngige cDNA synthetisiert mit L929-Zellenstämmiger poly(A)+RNA und in den Vektor CDM8 cloniert nach dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Bd.84, S.8573,1987) und Seed (Nature, Bd.329, S.840-842,1987).
Die rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli Stamm MC 1061 /p 3 eingeführt (nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, siehe oben), und die Clone der cDNA wurden mittels XL28-8-stämmiger (3aP-markierter)-cDNA-Sonde unter strengen Bedingungen für DNA-DNA-Hybridisierung gescreent (Kashima u.a., Nature, Vol.313, S.402-404,1985), und ein Clon plRF-L wurde zur weiteren Untersuchung selektioniert.
Das gewünschte cDNA-lnsert von plRF-L wurde durch Digestion mit Hindlll und Xbal gewonnen und durch die oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Sequenz wird in Formel IV und in Fig. 4 gezeigt.
Es stellte sich heraus, daß die cDNA-Sequenz aus XL 28-8 eine identische Sequenz in der überlappenden Region enthielt, mit der Ausnahme, daß ein Α-Rest zwischen den Nucleotiden 1773 und 1781 fehlte.
Die 5'- und 3'-Termini der XL28-8-stämmigen cDNA sind durch Pfeile in Fig. 4 gekennzeichnet. Die Sequenzen ATTTATTTA und ATTTA, die möglicherweise die mRNA-lnstabilität übertragen, sind eingerahmt.
Wie aus Fig. 4 A ersichtlich wird, war die cDNA der Maus-cDNA, die von plRF-L abgeleitet war, 198 bp lang und damit 20 bp langer als die von XL28-8-cDNA in den 5'- bzw. 3'-Regionen.
Die Analyse der Genom-DNA-Sequenz, die die Promotorregion dieses Gens enthält, zeigt, daß die cDNA von plRF-L etwa 30 bp von der größeren CAP-Stelle fehlt, siehe unten und Formel V und Fig. 7.
Die unmittelbare „upstream"-Sequenz des ersten ATG-Codons, GGACCATGC, paßt gut in die Kozaksche Consensus-Sequenz GCCqCCATGG für die Translationsinitationsstelle.
Eine ATG-Sequenz im Rahmen wurde in der „upstream"-Sequenz von der oben erwähnten ATG-Sequenz aus nicht gefunden, was bestätigt, daß dies tatsächlich das Initationscodon für die IRF-l-mRNA ist.
Wie bereits erwähnt, wurde in der Nucleotidsequenz keine Differenz zwischen den cDNAs von XL28-8 und plRF-L innerhalb der überlappenden Regionen gefunden, mit Ausnahme eines Nucleotids in der 3'-nichtcodierenden Region.
Die Maus-IRF-I bestand damit aus 329 Aminosäuren mit einer berechneten relativen Molekülmasse von 37,3KD. Kanonische N-Glycosylierungsstellen erscheinen nicht in der Sequenz.
Zu anderen bekannten Proteinen wurde bei Recherchen in Protein Sequence Database (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D. C.) und bei erst kürzlich veröffentlichten Sequenzen keine signifikante Homologie nachgewiesen.
Die Hydropathieanalyse nach Kyte und Doolittle, 1982, zeigt, daß das Protein als Ganzes hoch hydrophil ist (Fig.4B).
Die Untersuchung der abgeleiteten Primärsequenz des Maus-IRF-I zeigt die folgenden Merkmale:
Die endständige Aminohälfte, zur Aminosäure 140 verlängert, ist reich an Lysin (Lys) und Arginin (Arg). Tatsächlich sind 31 der 39 Lys- und Arg-Reste in dieser Region lokalisiert. Im unteren Teil von Fig.4B ist im Diagramm eine Zusammenfassung der Lokalisierung der basischen Aminosäuren (Arg, Lys) (nach oben gerichtete Säulen) und der sauren Aminosäuren (Asp, GIu) (nach unten gerichtete Säulen) dargestellt.
Wie in Fig. 4 B gezeigt, weist diese Region eine starke Hydrophilie auf und wird als die Region angesehen, die hauptsächlich für die IRF-I-Bindung an die spezifischen DNA-Sequenzen verantwortlich ist.
In diesem Zusammenhang waren die für viele DNA-bindenden Proteine charakteristischen Motive wie Zinkfinger und Helix/ Helix-Motive (Pabo und Sauer, 1984, Evans und Hollenberg, 1988) in dem IRF-I-Protein nicht nachweisbar.
Im Gegensatz dazu zeigt der Rest des Moleküls (d.h. die endständige Carboxylhälfte einen relativen Überfluß an Asparaginsäure (Asp), Glutaminsäure (GIu), Serin (Ser) und Threonin (Thr). Von 189 Aminosäuren (von Aminosäure 140 bis 329) sind 33 (17 %) saure Aminosäuren und 36 (19%) sind Ser und Thr. Beachtenswert ist, daß ein Cluster von 5 aufeinanderfolgenden sauren Aminosäuren in den Aminosäuren 227 bis 231 gefunden wurde. Ser und Thr scheinen viele Cluster zu bilden (Aminosäureregion bei 153-1B6,190-192,206-208,220-222; die hier als die S-T-Regionen bezeichnet werden). Die S-T-Regionen werden durch kleine offene Rechtecke in der unteren Tafel von Fig.4 B dargestellt.
Struktur der Human-IRF-I codierenden cDNA
Nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise für Maus-IRF-I wurde Human-IRF-l-cDNA cloniert und sequenziert.
Eine Human-cDNA-Bibliothek wurde durch Synthotisierung von cDNA mittels poly(A)+RNA aus einer Human-T-Zellinie Jurkat hergestellt. Die doppelsträngige cDNA-Synthese und anschließende Clonierung in den Plasmidvektor CDM 8 wurde entsprechend dem Verfahren von Aruffo und Seed (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, Bd.84, S.8573-8577,1987) und Seed (Nature, Bd.329, S. 840-842,1987) durchgeführt.
Die rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli Stamm MC 1061/p 3 mittels des Verfahrens von Aruffo und Seed (siehe oben) eingeführt.
Die Clone, die mit Maus-IRF-l-cDNA kreuzhybridisieren, wurden zum Screenen mit XL28-8-cDNA (32P-markiert) als Sonde unter
wenig strengen Bedingungen für die DNA-DNA-Hybridisierung verwendet. Die angewandten Bedingungen waren genau die gleichen wie bei Kashima u.a. (Nature, Bd.313, S.402-404,1985) beschrieben.
Aus den positiven Clonen wurde Clon pHIRF31, der das längste cDNA-lnsert enthielt, selektioniert.
Die gewünschte cDNA-Sequenz von Clon pHIRF31 wurde durch Digestion der Plasmid-DNA durch Xhol isoliert und dan ich durch die oben beschriebenen Methoden sequenziert. Die Struktur des Human-IRF-I-Gens wird in Formel Il und Fig.8 gezeigt.
Die Sequenzen für das abgeleitete Maus- und Human-IRF-I sind zum Vergleich in Fig. 5 untereinander dargestellt.
Die Analyse der Human-DNA zeigte, daß diese IRF-I um vier Aminosäuren kürzer ist als die Maus-IRF-I.
Die starke Erhaltung der Aminosäurosequenzen läßt sich zwischen den beiden IRF-I-Molekülen erkennen. Insbesondere 133 der 140 Aminosäuren (95%) der Aminoendhälften können als gleich angesehen werden.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die obigen Beobachtungen zeigen, daß IRF-I eine neue Klasse von DNA-bindendem Protein ist.
Es sei auch darauf hingewiesen, daß die Sequenzen ATTTATTTA und ATJTA, die in vielen Cytokin- und Protoonkogen-mRNAs gefunden werden, in der 3'-nichttranslatierten Region der Maus-IRF-l-cDNA vorhanden sind und daß auch die Sequenz ATTTA in der entsprechenden Region der Human-lRF-l-cDNA gefunden wird. Von diesen Sequenzen nimmt man an, daß sie in der posttranskriptionalen Regulation der Genexpression eine Rolle spielen, indem sie der mRNA Instabilität übertragen (Shaw und Kamen, 1986; Caput u.a., 1986).
Das Plasmid plRF-L wurde in E. coli MC 1061/p3 transferiert, das als E. coli MC 106/p3 (plRF-L) am Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology (FRI), 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305. Japan, entsprechend den Bedingungen des Budapester Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Ferm BP-2005 hinterlegt wurde.
Das Plasmid plRF31 wurde in gleicher Weise in E. coli MC 1061/p3 transferiert, das als E. coli MC 106/p3 (plRF-31) am rRI entsprechend den Bedingunger; des Budapester Vertrages am 19. August 1988 unter Nr. Ferm BP-2006 hinterlegt wurde.
1. Expression der IRF-l-mRNA
In Anbetracht der Tatsache, daß ΙΠ F-I Affinitäten zu Regulationssequenzen von anderen Genen als dem IFN-ß-Gen beweist und somit an der Regulation einer Reihe von Genen in verschiedenen Zelltypen beteiligt ist, wurde die Expression der IRF-l-mRNA in Mauszellen, die aus verschiedenen Geweben und Organen stammten, mit Maus-cDNA als Sonde untersucht. Zur Herstellung dieser Sonde wurde M13 mp10 Phagen-DNA (siehe unten), die den codierenden Strang von IRF-I-Gen-Pstl-Fragment enthielt, als Matrize zur Synthetisierung der 32P-markierten „anti-sense" DNA verwendet. Das Produkt wurde durch EcoRI digeriert, und die Sonden-DNA wurde wie bei Fujita u. a. (1985) beschrieben isoliert.
Die gesamte RNA wurde nach dem bewährten Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, isoliert.
Die Blot-Analyse wurde dann im wesentlichen wie bei Thomas (1980) beschrieben durchgeführt, der Röntgenfilm wurde 3 Tage belichtet, und die Ergebnisse sind in Fig.6A gezeigt. Die verschiedenen Bahnen stellen die Ergebnisse der Durchgänge dar, bei denen Ganzzell-RNA aus den folgenden Geweben verwendet wurde:
Bahn | 1 | Hirn |
Bahn | 2 | Herz |
Bahn | 3 | Leber |
Bahn | 4 | Lunge- |
Bahn | 5 | Milz (nicht stimuliert) |
Bahn | 6 | Thymus |
Bahn | 7 | Niere |
Bahn | 8 | Muskel |
Bahn | 9 | Darm |
Bahn 10 | Milz (nicht stimuliert) | |
Bahn 11 | ConA-stimulierteMilz |
In den Durchgängen für jede Bahn wurden 5μς der Ganzzell-RNA verwendet, mit Ausnahme von Bahn 8, bei der nur 1,2pg RNA verwendet wurden.
Aus Fig.6A ist ersichtlich, daß eine Bande, die etwa 2,0kb entsprach, in den meisten RNA-Proben durch diese Blot-Analyse nachgewiesen wurde, obwohl der mRNA-Expressionswert niedrig zu sein schien. Es ist bemerkenswert, daß der Expressionswert von mRNA in den Lymphozyten aus der Milz nach der Stimulierung durch ConA (Bahn 11) drastisch zunahm.
In einem weiteren Test wurden Maus-L929-Zellen durch NDV induziert wie im vorangegangenen beschrieben (Fujita u. a., 1985), und die Zytoplasma-RNA wurde nach dem Verfahren von Aruffo und Seed, 1987, alle drei Stunden nach der Infektion extrahiert.
Sonden-DNAs wurden aus den folgenden verschiedenen Sequenzen hergestellt und durch die „multiprime"-Markierungsreaktion (Amersham) markiert, und zwar
(i) ein 1,8kbEcoRI-Fragment aus AL28-8 (spezifische Aktivität 2 χ 108cpm/Mg); (ii) ein 0,5kb BamHI-Bglll-Fragment aus einem Maus-IFN-ß-Genomclon (spezifische Aktivität 5 χ 108cpm^g) und (iii) ein 2,0kb BamHI-Pvull-Fragment eines Clons, das ein Human-ß-Actinpseudogen enthält (spezifische Aktivität 5 χ 108cpm/
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 B dargestellt. Die Blot-Analyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei das Verfahren von Thomas (1980) angewandt wurde.
Jede Bahn erhielt 10pg Zytoplasma-RNA. Der Röntgenfilm wurde 3 Stunden belichtet. Die densitometrische Analyse zeigte, daß die IRF-l-mRNA 9-12 Stunden nach der NDV-Infektion um das 25fache zunahm.
Obwohl die Zunahme an mRNA drastisch ist, ist es ein transientes Ergebnis, es erreicht seinen Höhepunkt bei 9 bis 12 Stunden und gleicht sich 12 Stunden nach der Induktion aus. Die mRNA-Anreicherung geht der Anreicherung an IFN-ß-mRNA voraus; wie aus Fig. 6B ersichtlich ist, läßt sich die Induktion von IRF-l-mRNA bereits 3 Stunden nach der NDV-Infektion beobachten, während die IFN-ß-mRNA bei gleichen Blot-Bedingungen für beide RNAs erst 6 Stunden danach nachweisbar ist.
„multimembered" ist.
enthalten, wobei die gleiche AL28-8-stämmige cDNA-Sonde wie oben verwendet wurde. Es wurden vier positive Cloneidentifiziert, von denen bei allen die gleiche Genom-DNA festgeston. wurde und eine davon für die weitere Analyse verwendetwurde,(Xg 14-2). Ein Pstl-Fragment wurde in die Pst-I-Stelle von pUC 19 subcloniert, um p19IRFP zu konstruieren.
ausgezeichnet zu der von plRF-L abgeleiteten cDNA.
20 Nucleotide „downstream" von der kleineren Stelle befindet. Typische TATA-Boxsequenzen oind in der „upstream"-Regiondes Gens nicht vorhanden. In Anbetracht der ungewöhnlichen Fülle an CpG-Sequenzen, stellt diese Region wahrscheinlich eine„HTF-Insel" dar (Bird, 1986).
u a., 1986) und die letzteren CP-1 oder CP-2 (Chodosh u.a., 1988).
auf extrazelluläre Signale, z. B. Virusinduzierbarkeit, getestet.
oben) durch BamHI und Hindlll und Clonierung des erhaltenen Fragmentes in das Bglll-Hindlll-Rückgratfragment von pA|0cat2(Rosenthal u.a., 1983), um plRFcat herzustellen.
plRFAcat wurde durch Digerieren des ρ 19IRFP-stämmigen BamHI-Hindlll-Fragmentes mit Haelll hergestellt, dessen einzelne Erkennungsstelle bei -30 bis -35 von der größeren CAP-Stelle (Fig. 5 A) liegt. Das entstandene Haelll-Hindlll-Fragment wurde mit BGIII-Hindlll-Rückgratfragment von pA)ocat2 und der folgenden synthetischen DNA ligiert:
5'GATCCTAGATTTCTTCGCGGCGC 3' 3'GATCTAAAGAAGCGc 5'
p-125cat enthält die Promotorsequenz des Human-IFN-ß-Gens wie bei Fujita u.a., 1987, beschrieben.
pSV2cat ist in Gorman u.a., Science, Bd.221, S.551-553 beschrieben.
5 x 10e Zellen wurden mit 7,B[ig des das CAT-Reportergen und 2,5μρ pRSVgpt enthaltenden Testplasmids transferiert. Die
beschrieben unterzogen.
transferiert waren, als 100% angenommen. Jede CAT-Aktivität wurde durch Ecogpt der entsprechenden Proben normalisiert(Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 78, S. 2072-2076). Die Proben, in dcr.an CAT unter dem Hintergrundwert lag,wurden mit b.b. (below background level) gekennzeichnet.
verursachte. Der CAT-Expressionswert wurde erhöht, wenn die transferierten Zellen durch NDV stimuliert wurden. Die Deletionder 300-bp-„upstream"-Sequenz des IRF-I-Gens (plRF Δ cat) hob faktisch sowohl die konstitutive als auch die induzierte
virusinduzierbar ist.
1. Phagen-DNA von Clon XL28-8 wurde durch EcoRI digeriert, und das Insert wurde gewonnen. Die ecoRI-Stellen der cDNAwurden durch T4-DNA-Polymerase geglättet und anschließend mit synthetischen Adaptor-DNAs, die die SequenzpGATCCATTGTGCTGG und pCCAGCACAATG besaßen, ligiert, s. Aruffo und Seed 1987.
wurde die IRF-l-cDNA mit den an beide Enden geknüpften Adaptor-DNAs mit BstXI-geschnittener CDM8-Vektor-DNA ligiert(Seed, B, Nature, Bd. 329, S. 840-842,1987). Die Plasmide plRF-S und plRF-A, die die IRF-l-cDNA in der „sense"- und„antisense"-Ausrichtung in bezug auf den CMV-Promotor enthielten, wurden isoliert.
plRF-S - < 1 %
p-55cat
plRF-S - 50%
P-55CIB
p-55cat plRF-A - < 1 %
plRF-S - 1,7%
P-65CIB
plRF-S + 3,6%
P-55CIB
P-55CIB
plRF-A + < 0,1 % P-55CIB
Die DNA-Transfektionseffizienz hängt vom Zustand der Rezipientenzellen (in diesem Fall Maus-L929-Zellen) ab. Die Effizienz war in Experiment 2 viel niedriger als in Experiment 1, der CAT-Expressionswert ist daher vergleichsweise niedrigor als in Exper'inent 2.
Wie cus der obigen Tabelle ersichtlich ist, war die signifikante CAT-Aktivität nur in durch p-55C!ü und p-IRF-S transferierten Zellen nachweisbar. Sie zeigen- daß der IRF-I an die wiederholten (8mal) AAGTGA-Sequenzen, die „upstream" des CAT-Gens in P-55CIB vorhanden sind, bindet und daher die Transkription des distalen CAT-Gens fördert.
Die Ergebnisse zeigen weiterhin, daß der CAT-Expressionswert durch Infektion der transferierten Zellen mit NDV (Tabelle 1) erhöht wird (um mehr als das doppelte), wcs zeigt, daß die Kontrolle der Genexpression durch unterschiedliche Stimuli wie beispielsweise Viren möglich ist.
2. Ein Expressionsplasmid für die Produktion eines Proteins, das aus IRF-I-DNA bindender Domäne und Transkriptionsaktivierungsdomäne von Hefe-GAL4 bestand, wurde folgendermaßen konstruiert:
Das Plasmid plRF-S wurde durch Hindill und Pstl digeriert, und das cDNA-lnsert wurde isoliert. Die cDNA wurde durch Dralll digeriert, und das Hindlll-Dralll-Fragment (etwa 550 bp) wurde gewonnen und als Fragment A bezeichnet. Der Expressionsvektor CDM 8 wurde durch Hindill und Xbal digeriert, und die Rückgrat-DNA wurde isoliert und als Fragment B bezeichnet.
Die für die Hefe-GAL4-Transkriptionsaktivierungsdomäne codierende DNA wurde aus Plasmid pRB968 folgendermaßen isoliert (Ma und Ptashne, 1987):
Die pRB968-C NA wurde zuerst mit Hindill digeriert, und die Enden wurden durch T4-DNA-Polymerase geglättet. Synthetische Xba-I-Linker-ONA wurde zu der DNA gegeben, und die DNA wurde dann durch Pvull und Xbal digeriert. Das entstandene ca. 600bp lange Pvull-Xbal-DNA-Fragment wurde gewonnen und als Fragment C bezeichnet. Zusätzlich wurG3 eine synthetische DNA mit der folgenden Sequenz hergestellt:
'51IGTGTCGTCCAGO') (3 )GCACACAGCAGGTC(5')
und als Fragment D bezeichnet.
Ein Expressionsvektor plRFGAL4 wurde durch Ligation der Fragmente A, B, C und D konstruiert. Als Kontrollplasmid wurde Plasmid plRFAGAL4 durch Ligation der Fragmente A, B, C und einer synthetischen DNA mit der folgenden Sequenz konstruiert:
(5'IGTGTCTGACAGO') O')GCACACAGACTGTC(5')
Da ein Terminatortriplett, TGA, im Rahmen zwischen den IRF-I und GAL4-Sequenzen in plRFAGAL4 vorhanden ist, müßte dem exprimierten Protein die GAL4-Aktivierungsdomäne fehlen.
Um die funktioneilen Eigenschaften des Plasmids zu testen, das für den Chimären Transkriptionsfaktor codiert, wurden plRFGAL4 und plRFAGAL4 beide mit D-55CIB in L929-Zellen cotransfektiert, und die CAT-Expression wurde überwacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 unten dargestellt.
plRF-S 2,0%
P-55CIB
plRF-4 <0,2%
P-55CIB
plRFGAL 1,4%
P-55CIB
PIRFGAL4 <0,2%
P-55CIB
und γ), einen plasminogenen Aktivator, Erythropoietin, Granulozytkolonie-stimulierenden Faktor, Insulin, Human-
z. B. t-PA pro-Urokinase oder Urokinase usw. können auch wirkungsvoller exprimiert werden, indem Promotoren eingeführtwerden, die mit unterschiedlich langen Erkennungssequenzen für IRF-I, z. B. AAGTGA, verschmolzen sind.
einen frühen SV40-Virus-Promotor angrenzen. Ein Zielgen z. B. ein t-PA-Gen oder IFN-ß-Gen kann „downstream" eines solchen
(AAGTGA)x (Promotor) (Zielgen z.B. t-PA-Ge.i)
(Uilaub und Chasin, Proc. Natl., Acad. Sei., USA, Bd.77, S.4216-4220,1980).
einer endogenen IRF-I-Aktivität aufweist, gewählt. Das IRF-I-Gen, vorzugsweise entweder mit einem starken Promotor wie einem
und das Zielgen getrennt in die Wirtszelle eingeführt werden.
z. B. des Metallothionein-Promotors wird durch zweiwertige Metalle wie Zink induziert) hergestellt werden. Der exprimierte IRF-Ibindet an die AAGTGA-Wiederholungen und verstärkt das distale Zielgen, z. B. das t-PA-Gen oder das IFN-Gen.
Eine Maus-cDNA-Bibliothek wurde nach der im vorangegangenen beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Die cDNA wurde durch das Standardverfahren synthetisiert. Dabei wurde Maus-L929-Zellen-stämmige mRNA verwendet, und die cDNA wurde durch das Standardverfahren in den Agtll-Vektor inseriert. Die entstandene Agtll-Bibliothek wurde dann zur Isolierung der cDNA-Clone gescreent, deren Inserte mit der oben beschriebenen Maus-IRF-l-cDNA folgendermaßen kreuzhybridisieren: Nitrocellulosefilter, die die Phagen-Plaque-DNAs enthalten, wurden in den folgenden Stufen inkubiert
(1) in 3 χ SCC bei 650C 30 Minuten lang und anschließend
(2) eOminütige Inkubation in 3 x SSC, das Denhartsche Lösung enthält (0,2% Rinderserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% Polyfinylpyrrolidon 25), und anschließend
(3) eine vor-Hybridisierungsstufe, die aus der 12stündigen Inkubation bet 650C in einer Lösung, die 1 M NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH 8,0,1OmM EDTA, 0,1 % SDS, 50pg/ml einzelsträngigeTräger-DNA (z. B. Lacksperma-DNA) und Denhartsche Lösung enthält, besteht und
(4) die Inkubation der Stufe 3 wurde wiederholt, wobei 32P-markierte Maus-IRF-l-cDNA als Sonde eingeführt wurde. Diese cDNA-Sonde wurde als das von EcoRI geschnittene Insert aus XL-28-8 hergestellt und durch das Multiprime-Markierungssystem (siehe oben) translated. Die Inkubation wurde 12 Stunden lang bei 650C durchgeführt.
30 Minuten lang bei 650C gewaschen. Diese Prozedur wurde zweimal wiederholt.
einen Teil der Codiersequenz für einen IRF abdeckte.
im vorangegangenen unter der Überschrift „Struktur der für Maus-IRF-I codierenden cDNA" für die Herstellung von plRF-Lbeschrieben wurde.
vorangegangenen für Maus-IRF-I beschriebene Verfahren angewandt wurde. Die komplette hybridisierende cDNA-Sequenzwird in Formel IVa gezeigt, und die Aminosäuresequenz des entsprechenden IRF-Proteins wird in Formel VIII dargestellt.
22. November 1988 unter der Nr. FERM BP-2157 hinterlegt wurde.
cDNA aus dem Hefegenom, die mit Human-IRF-l-cDNA-Sequenz hybridisiert
radioaktive Sonde war die aus pHIRF31 durch Digestion des Plasmids mit Xhol isolierte Human-IRF-l-cDNA, wobei diese Sondewie im vorangegangenen Beispiel für Maus-IRF-I beschrieben markiert wurde. Das Filter wurde bei 550C in 2 χ SSC gewaschen.
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Claims (13)
1. Verfahren zur Herstellung eines Vektors mit einer DNA-Sequenz, die ein Protein codiert, das die Wirkung einer Interferon-Regulatorsequenz (IRF-I) hat, gekennzeichnet dadurch, daß es die Spaltung eines Vektors mit einem geeigneten Restriktionsenzym und die Bindung einer DNA-Sequenz, die das genannte Protein codiert, an die Spaltstelle umfaßt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte DNA-Sequenz ein pienschliches oder Mäuse-IRF-1 codiert.
3. Verfahren gemäß den Ansprüchen 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz ein Protein codiert, das zur Bindung an die sich wiederholende Oligomersequenz AAGTGA (Cl-Sequenz) und das „Stromaufwärts-Regulator-Element" des menschlichen IFN-ß-Gens fähig ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-3, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz mit der Promotor-Region an eine Spaltstelle in dem Vektor gebunden ist, wodurch sie in dem resultierenden Vektor operabel an die DNA-Sequenz, die das IRF-1-aktive Protein codiert, gebunden ist.
5. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß der Promotor ein konstitutiver Promotor oder ein induzibler Promotor ist.
6. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß worin die genannte DNA-Sequenz, die ein IRF-1 -aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante davon ist.
10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCCTGGCTAGAGATGCAGATTAA
60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT
110 120 130 140 150 TGGAGATCCCATGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
160 170 180 190 200 GATGCCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAA^GC
210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300 CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340 340 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550 AGGCTACATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCCAGCACTGT
560 570 580 590 600 CGCCATGTGCTGTCAGCAGCÄCTCTCCCCGACTGGCACATCCCAGTGGAA
610 620 630 640 650 GTTGTGCCGGACAGCACCAGTGATCTGTACAACTTCCAGGTGTCACCCAT
660 670 680 690 700 GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750 CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 790 800 GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850 TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 880 890 900 GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930 940 950 ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG
CATCCAGGCCATTCCCTGTGCACCG
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte DNA-Sequenz, die ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante davon ist.
CGAGCCCCGCCGAACCGAGGCCACCCGGAGCCGTGCCCAGTCCACGC CGGCCGTGCCCGGCGGCCTTAAGAACCAGGCAACCACTGCCTTCTTCCCT
cttccactcggagtcgcgcttcgcgcgccctcactgcagcccctgcgtcg ccgggaccctcgcgcgcgaccagccgaatcgctcctgcagcagagccaac
10 20 30 40 50 ATGCCCATCACTTGGATGCGCATGAGACCGTGGCTAGAGATGCAGATTAA
60 70 80 90 100 TTCCAACCAAATCCCGGGGCTCATCTGGATTAATAAAGAGGAGATGATCT
110 12ü 130 140 150 TGGAGATCCHTGGAAGCATGCTGCCAAGCATGGCTGGGACATCAACAAG
160 170 180 190 200
GATGQCTGTTTGTTCCGGAGCTGGGCCATTCACACAGGCCGATACAAAGC
210 220 230 240 250 AGGGGAAAAGGAGCCAGATCCCAAGACGTGGAAGGCCAACTTTCGCTGTG
260 270 280 290 300
CCATGAACTCCCTGCCAGATATCGAGGAGGTGAAAGACCAGAGCAGGAAC
310 320 340 34ü 350 AAGGGCAGCTCAGCTGTGCGAGTGTACCGGATGCTTCCACCTCTCACCAA
360 370 380 390 400 GAACCAGAGAAAAGAAAGAAAGTCGAAGTCCAGCCGAGATGCTAAGAGCA
410 420 430 440 450 AGGCCAAGAGGAAGTCATGTGGGGATTCCAGCCCTGATACCTTCTCTGAT
460 470 480 490 500 GGACTCAGCAGCTCCACTCTGCCTGATGACCACAGCAGCTACACAGTTCC
510 520 530 540 550
AGGCTAGATGCAGGACTTGGAGGTGGAGCAGGCCCTGACTCGAGGACTGT
560 570 580 590
GGCGATGTGCTGTGAGCAGCACTCTGGCGGACTGGGAGATCCGAGTGGAA
610 620 630 64O
GTTGTGCCGGAGAGCACCAGTGATGTGTACAACTTGCAGGTGTGAGCCAT
660 570 680 690 700
GCCCTCCATCTCTGAAGCTACAACAGATGAGGATGAGGAAGGGAAATTAC
710 720 730 740 750
CTGAGGACATCATGAAGCTCTTGGAGCAGTCGGAGTGGCAGCCAACAAAC
760 770 780 790 800
GTGGATGGGAAGGGGTACCTACTCAATGAACCTGGAGTCCAGCCCACCTC
810 820 830 840 850
TGTCTATGGAGACTTTAGCTGTAAGGAGGAGCCAGAAATTGACAGCCCAG
860 870 8BO 890 900
GGGGGGATATTGGGCTGAGTCTACAGCGTGTCTTCACAGATCTGAAGAAC
910 920 930 940 950
ATGGATGCCACCTGGCTGGACAGCCTGCTGACCCCAGTCCGGTTGCCCTC
960 970
catccaggccattccctgtgcaccgtagcagggcccctgggcccctctta ttcctctaggcaagcaggacctggcatcatggtggatatggtgcagagaa gctggacttctgtgggcccctcaacagccaagtgtgaccccactgccaag tggggatgggcctccctccttgggtcattgacctctcagggcctggcagg ccagtgtctgggtttttcttgtggtgtaaagctggccctgcctcctggga agatgaggttctgagaccagtgtatcaggtcagggacttggacaggagtc agtgtctggctttttcctctgagcccagctgcctggagagggtctcgctg tcactggctggctcctaggggaacagaccagtgaccccagaaaagcataa caccaatcccagggctggctctgcactaagagaaaattgcactaaatgaa tctcgttccaaagaactaccccttttcagctgagccctggggactgttcc aaagccagtgaatgtgaaggaaagtggggtccttcggggcaatgctccct cagcctcagaggagctctaccctgctccctgctttggctgaggggcttgg gaaaaaaacttggcactttttcgtgtggatcttgccacatttctgatcag aggtgtacactaacatttcccccgagctcttggcctttgcatttatttat acagtgccttgctcggggcccaccaccccctcaagccccagcagccctca acaggcccagggagggaagtgtgagcgccttggtatgacttaaaattgga aatgtcatctaaccattaagtcatgtgtgaacacataaggacgtgtgtaa ATATGTACATTTGTCTTTTTATAAAAAGTAAAATTGTT
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz, die ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante davon ist.
ATG COA ATO ACT CGA ATG CGG ATG AGA GCC TGG CTA GAG ATG GAG ATT AAT TCO AAC CAA ATC COA GGG CTG ATC TGG ATG AAT AAA GAA GAG ATG ATO TTG CAG ATT CGA TGG AAG CAC GCT GGT AGG CAO GGC TGG GAC ATC AAC AAG GAT GCC TGT GTG TTC CGG AGC TGG GCC ATT CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA GGA GAA ΑΛΑ GAG CCA GAT GCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT TGT GOG ATG AAC TCC CTG GCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG AGT AGG AAC AAG GGC AGC TGTGCT GTG GGG CTG TAC CGG ATG GTG CCA OCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TOC AAG TCC AGC CGA GAC ACT AAG AGO AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT GTT AGC OGG GAC ACT TTC TCT GAT GGA GTO AGO AGC TCT ACC CTA CCT GAT GAG CAC AGC AGT TAC ACC ACT GAG GGC TAC CTG GGT CAG GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAG ATA ACT CGA GOA GTG TGA CGG TGT GTC GTC AGC AGC AGT CTG TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAG CTA CAG GTG TCA CCC ATG CCT TCC ACC TCO GAa GCC GOA AOA GAC GAG GAT GAG GAA GGG AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG OTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG CAG CCG ACA CAC ATG GAT GGC AAG GGA TAG TTG OTC AAT GAG CGA GGG ACC CAG CTC TOT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGO AAA GAG GAA GCA GAG ATT GAC AGC GOT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA CAA CAT GTO TTG ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCG ATC ATG TGG ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT GAG GGC ATT GOT TGT GCA OCA TAG
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte DNA-Sequenz, die ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante
davon ist.
davon ist.
1 GGACGTGCTTTCACAGTCTAAGGCGAACGGAACOGAAGCGAAGGGAACCGAACCGGGCC 60 GAGTTGCGCCGAGGTOAGCCGAGGTGGCCAGAGGAGCCOAGCATCTCGGGCATCTTTCG 119,OTTCGTGOGGGCATGGCGTAGCTAGACGGCAACTCGGTGCCTGGCTCTCCGGCACCCTC 178 TGGGAATCGOTOCTGCAGOAA AGCCAGC ATG CCA ATC ACT CGA ATG OGG 227 ATG AGA OCG TGG CTA GAG ATG OAG ATT AAT TCC AAO CAA ATC CCA 272 GGG CTG ATC TGG ATC AAT AM GAA GAG ATG ATC TTO CAG ATT CCA 317 TGG AAG CAC GCT GCT AAG CAG GGC TGG GAC ATG AAG AAG GAT GCC 362 TGT CTG TTC CGG AGC TGG GCC AT1T CAC ACA GGC CGA TAC AAA GCA
407 GGA GAA AAA GAG CCA GAT CCC AAG ACA TGG AAG GCA AAC TTC CGT 452 TGT GCC ATG AAC TCC CTG CCA GAC ATC GAG GAA GTG AAG GAT CAG 497 AGT AGG AAC AAG GGC AGC TCT GCT GTG CCG GTG TAC CGG ATG CTG 542 CCA CCC CTC ACC AGG AAC CAG AGG AAA GAG AGA AAG TCC AAG TCC 587 AGC CGA GAC ACT AAG AGC AAA ACC AAG AGG AAG CTG TGT GGA GAT
632 GTT AGC CCG GAC ACT TTC TCT GAT GGA CTC AGC AGC TCT ACC CTA
677 CCT GAT GAC CAC AGC AGT TAC ACC ACT CAG GGC TAC CTG GGT CAG
722 GAC TTG GAT ATG GAA AGG GAC ATA ACT CCA GCA CTG TCA CCG TGT
767 GTC GTC AGC AGC AGT CTC TCT GAG TGG CAT ATG CAG ATG GAC ATT
812 ATA CCA GAT AGC ACC ACT GAT CTG TAT AAC CTA CAG GTG TCA CCC
857 ATG CCT TCC ACC TCC GAA GCC GCA ACA GAC GAG GAT GAG GAA GGG
902 AAG ATA GCC GAA GAC CTT ATG AAG CTC TTT GAA CAG TCT GAG TGG
947 CAG CCG ACA CAC ATC GAT GCC AAG ^.GA TAC TTG CTC AAT GAG CCA
992 GGG ACC CAG CTC TCT TCT GTC TAT GGA GAC TTC AGC TGC AAA GAG
1037 GAA CCA GAG ATT GAC AGC CCT CGA GGG GAC ATT GGG ATA GGC ATA
1082 CAA CAT GTC TTC ACG GAG ATG AAG AAT ATG GAC TCC ATC ATG TGG
1127 ATG GAC AGC CTG CTG GGC AAC TCT GTG AGG CTG CCG CCC TCT ATT
1172 CAG GCC ATT CCT TGT GCA CCA TAG TTTGGGTCTCTGACCCGTTCTTGCCC
1222 TCCTGAGTGAGTTAGGCCTTGGCATCATGGTGGCTGTGATACAAAAAAAGCTAGACTCC 1281 TGTGGGCCCCTTGACACATGGCAAAGCATAGTCCCACTGCAAACAGGGGACCATCCTCC 1340 TTGGGTCAGTGGGCTCTCAGGGCTTAGG AGGC AG AGTCTG AGTTTTCTTGT-IAGGTG AA 1399 GCTGGCCCTGACTCCTAGGAAGATGGATTGGGGGGTCTGAGGTGTAAGGCAGAGGCCAT 14 58 GGACAGGAGTCATCTTCTAGCTTTTTAAAAGCCTTGTTGCATAGAGAGGGTCTTATCGC 1517 TGGGCTGGCCCTGAGGGGAATAGACCAGCGCCCACAGAAGAGCATAGCACTGGCCCTAG 1576 AGCTGGCTCTGTACTAGGAGACAATTGCACTAAATGAGTCCTATTCCCAAAGAACTGCT 163 5 GCCCTTCCCAACCGAGCCCTGGGATGGTTCCCAAGCCAGTGAAATGTGAAGGGAAAAAA 1694 AATGGGGTCCTGTGAAGGTTGGCTCCCTTAGCCTCAGAGGGAATCTGCCTCACTACCTG 1753 CTCCAGCTGTGGGGCTCAGGAAAAAAAAATGGCACTTTCTCTGTGGACTTTGCCACATT 1812 TCTGATCAGAGGTGTACACTAACATTTCTCCCCAGTCTAGGCCTTTGC^lllÄliiÖrA 1871 TAGTGCCTTGCCTGGTGCCTGCTGTCTCCTCAGGCCTTGGCAGTCCTCAGCAGGCCCAG 1930 GGAAAAGGGGGGTTGTGAGCGCCTTGGCGTGACTCTTGACTATCTATTAGAAACGCCAC 1989 CTAACTGCTAAATGGTGTTTGGTCATGTGGTGGACCTGTGTAAATATGTATATTTGTCT 2048 TTTTATAAAA'SUISAGTTGTTTACAAAAAAAAAA 2082
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz, die ein IRF-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante davon ist.
10 20 30 40
ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGOCCGTaGCTGGAGGAGCAG
50 60 70 80 90
ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG
100 110 120 130
AAGAAGATTTI1CCAGATCCCGTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGa
140 150 160 170 180
TGGGAGGTGGAAAAGGATGGTGCGGTGTTCAGAAAGTGGGGGATG
190 200 210 220
CATACAGGAAAGGATGAACCAGGAATAGATAAAGCAGATCCAAAA
CATACAGGAAAGGATGAACCAGGAATAGATAAAGCAGATCCAAAA
230 240 250 260 270 AGATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGGCATGAATTGGCTGCCCGAG
280 290 300 310
ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC
ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC
320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACGGGATGCTGCCGTTATGCGAAGGAGGTTCGAAG
370 380 390 · 400
AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAOTAAGCAC
AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAOTAAGCAC
410 420 430 440 450 ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTGATGTTTGGGGCTTAGTAATGGA
460 470 480 490
GTAAGTGGGTTTTCTCCTGAGTATGGGGTGGTGACTTCAGGTATA
GTAAGTGGGTTTTCTCCTGAGTATGGGGTGGTGACTTCAGGTATA
500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAAGATCATAGTTGTAGGACAG
550 560 570 580
TCGCATGTGGACAGCAAGATTGAAGATCAAGAGATCGTCAGTAAC
TCGCATGTGGACAGCAAGATTGAAGATCAAGAGATCGTCAGTAAC
590 600 610 620 630 CCGGGAGACATCTGCGAGGTTGTAGAAGTGACGAGTGAGAGTGAT
640 650 660 670
GAGCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTAGAGATTTGT
GAGCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTAGAGATTTGT
680 690 700 710 720 GGTGTGTCTTGCTACGCAGAAAGGGAAAGTAGCGAGAGTGTGGGC
730* 740 750 760
AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCAGACTGGAGGAAGAGG
AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCAGACTGGAGGAAGAGG
770 780 790 800 810
AGCATCGAAGGCAAGCAGTAGCTCAGGAACATGGGGAGAGGGAAC
820 830 840 850
AGCTATCTGGTGCGCAGCATGGCGACCTTTGTGACCTGCAAGAAG
AGCTATCTGGTGCGCAGCATGGCGACCTTTGTGACCTGCAAGAAG
860 870 880 890 900 GCAGATCTGCAGGTCACGATCAAAGAGGATAGCTCZ11GuGATGCGT
910 920 930 940
TACAACAGCTCGTGGCCCCCATTTACAGACCTTGCCCTTGGTGCC
TACAACAGCTCGTGGCCCCCATTTACAGACCTTGCCCTTGGTGCC
950 960 970 980 990 GCAGTGACGGCCACGCGCAGCAGCAGTCGGGCAGACGGGGAGACC
1000 1010 1020 1030
CGGGCCAGTGTGATCAAGAAGAGATCTGATATCACCCAGGGCGGT
CGGGCCAGTGTGATCAAGAAGAGATCTGATATCACCCAGGGCGGT
1040
GTCAAGAGGTGT
GTCAAGAGGTGT
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, gekennzeichnet dadurch, daß die genannte DNA-Sequenz, die ein IRE-1-aktives Protein codiert, eine Sequenz der folgenden Formel oder eine Degenerat-Variante davon ist.
tctcaggcaagccgggga
ctaacttttagttttgctcctgcgattattcaactgacgggcttt catttccattttacacaccctaacaacactcacaccttgcgggat
TGTATTGGI1AGCGTGGAAAAAAAAAAAGCACATTGAGAGGGTACc
10 20 30 40 ATGCCGGTGGAACGGATGCGAATGCGCCCGTGGCTGGAGGAGCAG
50 60 70 80 ATAAATTCCAATACGATACCAGGGCTAAAGTGGCTGAACAAGGAG
100 110 120 130 AAGAAGATTTTCCAGATCCCCTGGATGCATGCGGCTCGGCACGGA
140 150 160 170 180 TGGGACGTGGAAAAGGATGCTCCGCTCTTCAGAAACTJGGCGATC
190 200 210 2*0 CATACAGGAAAGCATCAACCAGGAATAGATAAACCAGATCCAAAA
230 240 250 260 270 ACATGGAAAGCAAATTTTCGATGTGCCATGAATTCCCTGCCCGAC
280 290 300 31η ATTGAGGAAGTGAAGGACAGAAGCATAAAGAAAGGAAACAACGCC
320 330 340 350 360 TTCAGAGTCTACCGGATGCTGCCCTTATCCGAACGACCTTCCAAG
370 3SO 390 400 AAAGGAAAGAAACCAAAGACAGAAAAAGAAGAGAGAGTTAAGCAC
410 420 _ .130- 440 Δ$ο
ATCAAGCAAGAACCAGTTGAGTCATCTTTGGGGCTTAGTAATGGA
460 470 480 490 GTAAGTGGCTTTTCTCCTGAGTATGCGGTCCTGACTTCAGCTATA
500 510 520 530 540 AAAAATGAAGTGGATAGTACGGTGAACATCATAGTTGTAGGACAG
550 560 570 580 TCCCATCTGGACAGCAACATTGAAGATCAAGAGATCGTCACTAAC
590 600 610 620 630 CCGCCAGACATCTGCCAGGTTGTAGAAGTGACCACTGAGAGTGAT
640 650 660 670 GACCAGCCAGTCAGCATGAGTGAGCTCTACCCTCTACAGATTTCT
680 690 700 710 720 CCTGTGTCTTCCTACGCAGAAAGCGAAACTACCGACAGTGTGGCC
730 740 750 760 AGTGATGAAGAGAACGCAGAGGGGAGACCACACTGGAGGAAGAGG
770 780 790 800 810 AGCATCGAAGGCAAGCAGTACCTCAGCAACATGGGGACACGGAAC
820 830 840 850 ACCTATCTGCTGCCCAGCATGGCGACCTTTGTCACCTCCAACAAG
860 870 880 890 900 CCAGATCTGCAGGTCACCATCAAAGAGGATAGCTGTCCGATGCCT
910 920 930 940 TACAACAGCTCCTGGCCCCCATTTACAGACCTTCCCCTTCCTGCC
950 960 970 980 990 CCAGTGACCCCCACGCCCAGCAGCAGTCGGCCAGACCGGGAGACC
1000 1010 1020 1030 CGGGCCAGTGTCATCAAGAAGACATCTGATATCACCCAGGCCCGT
1040
GTCAAGAGCTGTTAAGCCTTTGACTCTCCCTGGTGGTTGTTGGGA
GTCAAGAGCTGTTAAGCCTTTGACTCTCCCTGGTGGTTGTTGGGA
tttcttagctttgtgttgttctttgtttgtattatattatttttt
ttctctatgatacctatcttagacacatctaagggagaaagcctt
gacgatagattattgattgctgtgtccaactccagagctggagct
tcttcttaactcaggactccagccccccccccccctcggtagatg cgtatctctagaacctgctggatctgccagggctactccctcaag ttcaaggaccaacagccacacgggcagtggaggtgctgcgttgcc tacggtcaaggccagcatggtggagtggatgcctcagaacggagg agaaaatgtgaactagctggaatttttttattcttgtgaatatgt acatagggcagtacgagcaatgtcgcgggctgcttctgcacctta tcttgaagcacttacaataggccttcttgtaatcttgctctcctt cacagcacactcggcgaccccttctgtgtccactaccccacfacc cacccctccctcctcaacccctccatcccggtcctctatgcgccc C^TCCCCCCAACCAATCCCATCACAACCTCTTACCTATCCTTTCC ctcccaaccccttctatcccagcccaccacctaccccactcctcc ccaactcctccattctagcccattacccacgcctctctcctcagc
ccagcctaccccatcccaccctgttcctttcctccagtttcctct cctcaaaggcaaggctctacatcttggaggaggaggaggagaaga aaatgagtttcttcaccgctgtcccattttaagactgcttgaata
-10- 297 ATAAAAAAAAATCTTTCTAATCTGCTATGCTTGAATGGCACGCGG
tacaaaggaaaactgtcatggaaatattatgcaaattcccagatc
• tgaagacggaaaatactctaattctaaccagagcaagctttttta
tttttttatacaaggggaatattttattcaaggtaaaaaaattct
aaataaaatataattgttttttatcttttctacagcaaatttata
attttaagattccttttcctgttcatcagcagttgttattacatc ccttgtggcacattttttttttaattttgtaaaggtgaaaaaaaa
acttttatgagctcatgtagcaatcaaattatcctgtggattgat aataaatgaatatggtatatagttaaagattttaaaaaaaaaaaa
12. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, gekennzeichnet dadurch, daß die DNA-Sequenz, die ein IRF-1-aktives Molekül codiert, eine Sequenz ist, die sich zu einer DNA-Sequenz hybridisiert, wie sie in einem der Ansprüche 6-11 definiert ist.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-12, gekennzeichnet dadurch, daß eine Promolor- und Regulatorsequenz, enthalten in der nachstehenden Formel, an eine Spaltstelle gebunden ist, wodurch in dem resultierenden Vektor die genannte Promotor- und Regulatorsequenz in operablen Assoziationen mii der DNA-Sequenz, die die IRF-1-aktiven Proteine codiert, vorhanden ist.
Pat I
OTGCAGAAAGAGGGGGAOGGTGTCGGGTI11JCOAAGAGAGGGAAGGGGg
OTGCAGAAAGAGGGGGAOGGTGTCGGGTI11JCOAAGAGAGGGAAGGGGg
-299 GC Box 1 GG Box
-25
GCCCGAGGGGGTGGGGAGCACAGCTGCCTTGTACTTCCCCTTCGCOGCTTAGCTCTAC
~193 CAAT Box
AACAGCCTGATTTCCCCGAAATGATGAGGCCGAGTQPGCCAAUGGGCGCGCAGGAGCG
-135 Minor Cap site
Ul GCGCGGCGGGGGCGTGGCCGAGTCCGGGCCGGGGAATCCCGCTAAGTGTTTAGATTTC
"77 Ma;jor Gleite ^
TTCGCGGCGCCGCGGACTCGCCAGTGCGCACCACTCCTTCGTCGAGGTAGGACGTGCT -19 +1
TTGAOACTCTAAGCCGAACOGAACCGAAGCGAAOCGAACCGAACCGGGCCGAOTTGCG +39
CGGΛGGTCAGCCGAGGTGGCCAGAGGACGCCΛGGATC'i1CGGGCΛTCTΐTCGCTTCGTG +97
GGCGGATGGCGTAGGTAGAGGGGAAGTGOGTGGGTGGCTCTCGGGGAGCCTGTGCGAA + 155
Patl
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