DE3650762T2

DE3650762T2 - Kit zur Verwendung bei der Amplifizierung und beim Nachweis von Nukleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE3650762T2
Application number: DE3650762T
Authority: DE
Inventors: Norman Arnheim; Henry Anthony Erlich; Glenn Thomas Horn; Kary Banks Mullis; Randall Keichi Saiki; Stephen Joel Scharf
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1985-03-28
Filing date: 1986-03-27
Publication date: 2002-07-04
Anticipated expiration: 2006-03-28
Also published as: CA1291429C; EP0200362A3; SG111293G; EP0200362B1; IE860843L; ES8706823A1; DE200362T1; DK26595A; IL78284A; ATE84822T1; HK84994A; JPH067166A; EP0200362A2; ES8800357A1; ES8800356A1; ES557287A0; ES557288A0; IL78284A0; DE502589T1; DE3687537T2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kit zur Verwendung beim Amplifizieren bestehender Nucleinsäuresequenzen, wenn diese in einer Testprobe vorhanden sind, und, wenn vorhanden, deren Nachweis durch Verwendung einer Sonde. Die Erfindung kann angewandt werden durch Einsatz eines Verfahrens zur Herstellung jeder speziellen Nucleinsäuresequenz aus einer gegebenen DNA- oder RNA-Sequenz in Mengen, die verglichen mit den anfangs vorhandenen Mengen groß sind, wodurch der Nachweis der Sequenzen erleichtert wird. Die DNA oder RNA kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein und kann eine relativ gereinigte Spezies oder ein Bestandteil eines Gemisches von Nucleinsäuren sein. Das Verfahren verwendet eine repetitive Reaktion, um die Amplifikation der gewünschten Nucleinsäuresequenz zu erreichen.
Insbesondere bei diagnostischen Anwendungen kann es sein, daß die Ziel-Nucleinsäuresequenz nur einen kleinen Teil der betreffenden DNA oder RNA ausmacht, so das es schwierig sein kann, ihre Gegenwart mit nicht-isotopenmarkierten oder end-markierten Oligonucleotid-Sonden nachzuweisen. Es ist viel Mühe darauf verwandt worden, die Empfindlichkeit des Sondennachweissystems zu erhöhen, es sind aber nur wenig Untersuchungen darüber durchgeführt worden, die Zielsequenz so zu amplifizieren, daß sie in genügend großer Menge vorhanden ist, um sie mit gegenwärtig verfügbaren Verfahren ohne weiteres nachweisen zu können.
In der Literatur sind verschiedene Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren - de novo oder von einer vorhandenen Sequenz ausgehend - beschrieben worden. Diese Verfahren ermöglichen es, große Mengen einer gegebenen Nucleinsäure mit einer vollständig beschriebenen Sequenz zu produzieren.
Ein bekanntes Verfahren zur de novo-Synthese von Nucleinsäuren schließt die organische Synthese einer Nucleinsäure aus Nucleosid-Derivaten ein. Diese Synthese kann in Lösung oder, an einem festen Träger ausgeführt werden. Ein Typ einer organische Synthese ist das Phosphotriesterverfahren, das zur Herstellung von Genfragmenten oder kurzen Genen verwendet worden ist. Im Phosphotriesterverfahren werden Oligonucleotide hergestellt, die dann zur Bildung längerer Nucleinsäuren miteinander verbunden werden können. Bezüglich einer Beschreibung dieses Verfahrens vgl. Narang, S.A., et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 90 und US-Patent Nr. 4,356,270. Das Patent beschreibt die Synthese und das Glonieren des Somatostatingens.
Ein zweiter Typ einer organischen Synthese ist das Phosphodiesterverfahren, das zur Herstellung eines tRNA-Gens verwendet worden ist. Bezüglich einer Beschreibung dieses Verfahrens vgl. Brown, E.L., et al., Meth. Enzymol. 68 (1979), 109. Wie das Phosphotriesterverfahren beinhaltet das Phosphodiesterverfahren die Synthese von Oligonucleotiden, die anschließend zur Bildung der gewünschten Nucleinsäure miteinander verknüpft werden.
Obwohl die oben genannten Verfahren für die de novo- Synthese zur Synthese langer Nucleinsäurestränge verwendet werden können, ist ihre Verwendung zur Synthesa großer Nucleinsäuremengen nicht sehr praktisch. Heide Verfahren sind arbeits- und zeitaufwendig, benötigen teure Ausrüstung und Reagenzien und weisen eine niedrige Gesamt-Effizienz auf. Die niedrige Gesamt-Effizienz kann durch die Ineffizienz der Synthese der Oligonucleotide und die der Verknüpfungsreaktionen verursacht sein. Bei der Synthese einer langen Nucleinsäure oder sogar bei der Synthese einer großen Menge einer kürzeren Nucleinsäure müssen viele Oligonucleotide synthetisiert werden, und es sind viele Verknüpfungsreaktionen notwendig. Dementsprechend sind diese Verfahren zur Synthese großer Mengen irgendeiner gewünschten Nucleinsäure unpraktisch.
Es gibt ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäuremengen in großen Mengen ausgehend von einer kleinen Menge der anfangs vorhandenen Nucleinsäure. Diese Verfahren beinhalten das Clonieren einer Nucleinsäure in das geeignete Wirtssystem, wobei die gewünschte Nucleinsäure in einen geeigneten Vektor inseriert ist, der zur Transformation des Wirtes verwendet wird. Wenn der Wirt gezüchtet wird, wird der Vektor repliziert, und so werden mehr Kopien der gewünschten Nucleinsäure produziert. Bezüglich einer kurzen Beschreibung der Subclonierung von Nucleinsäure-Fragmenten vgl. Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1982), S. 390-401. Vgl. ebenfalls die in den US-Patenten mit den Nummern 4,416,988 und 4,403,036 beschriebenen Techniken.
Ein drittes, im US-Patent Nr. 4,293,652 beschriebenes Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren ist ein Hybrid der oben beschriebenen organischen Synthese und der molekularen Clonierungs-Verfahren. In diesen Verfahren wird die zur Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz geeignete Anzahl von Oligonucleotiden organisch synthetisiert und nacheinander in einen Vektor inseriert, der durch Züchten vor jedem nachfolgenden Inserieren amplifiziert wird.
Das Verfahren, das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kits ausgeführt werden kann, besitzt eine gewisse Ähnlichkeit mit dem molekularen Clonierungs-Verfahren; es beinhaltet jedoch keine Vermehrung eines Organismus, und dadurch vermeidet es die möglichen damit einhergehenden Gefahren und Unbequemlichkeiten. Das Verfahren benötigt außerdem keine Synthese von Nucleinsäuresequenzen, die zur gewünschten Sequenz in keiner Beziehung stehen. Deshalb macht die vorliegende Erfindung eine ausgedehnte Reinigung des Produkts aus einem komplizierten biologischen Gemisch unnötig.
In J. Mol. Biol. 56 (1971), 341-361 diskutieren Kleppe et al., Primer-Verlängerungs-Reaktionen unter Verwendung von Matrizen, die mit Teilen eines tRNA-Gens korrespondieren, wobei die in den Reaktionen verwendeten Primer zu wesentlichen Teilen der korrespondierenden Matrizen komplementär sind und deshalb daran verlängert werden und so Duplex-DNAs liefern. Diese, eine einfache Primer-Verlängerung beinhaltenden Matrizen-kopierende Reaktionen werden von den Autoren "Reparations-Replikation" ("repair replication") genannt. Im letzten Abschnitt des Artikels wird theoretisch angenommen, daß sich, falls die Denaturierung von Duplex-DNA in Gegenwart der geeigneten Primer vorgenommen wird, beim Abkühlen zwei Strukturen herstellen ließen, die aus einem mit einem Primer komplexierten Matrizenstrang mit voller Länge bestehen, und daß durch Zufügen von DNA-Polymerase Reparationsreplikation (repair replication) erreicht werden könnte. In dem Absatz wird darauf hingewiesen, daß sich dieser Prozeß wiederholen läßt. Es gibt jedoch weder über die auszuführenden genauen Techniken eine detaillierte Erklärung, noch irgendeine Diskussion darüber, welche Primer "geeignet" sind, und die Möglichkeit des Problems einer Matrizenrenaturierung (Rückbildung einer Duplexstruktur) wird mit dem Hinweis diskutiert, daß man, wenn nötig, von einer Strangtrennung mit einer anschließenden Reparation-Replikation Gebrauch zu machen habe.
Der erfindungsgemäße Kit wird für ein Verfahren verwendet zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischen Nucleinsäuresequenz(en), die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch davon vorhanden ist (sind), unter Verwendung von Primern und Agentien für die Polymerisation und zum darauffolgenden Nachweisen der amplifizierten Sequenz. Das Verlängerungsprodukt des einen Primers wird, wenn man es mit dem anderen hybridisiert, eine Matrize zur Herstellung der gewünschten spezifischen Nucleinsäuresequenz und umgekehrt. Der Prozeß wird so oft wie notwendig wiederholt, um die gewünschte Menge der Sequenz herzustellen. Von diesem Verfahren erwartet man, daß es wirksamer als die vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung großer Mengen Nucleinsäure von einer Zielsequenz und zur Herstellung solcher Nucleinsäure in einer vergleichsweise kurzen Zeitspanne ist. Das vorliegende Verfahren ist besonders nützlich zur Amplifikation seltener in einem Gemisch von Nucleinsäuren vorkommenden Nucleinsäure-Spezies und für den wirksamen Nachweis solcher Spezies.
Genauer gesagt, stellt die vorliegende Erfindung eine exponentielle Amplifikation und einen Nachweis-Kit für die Amplifikation und den Nachweis in einer Probe von (einer) spezifischen Matrizen-Nucleinsäuresequenz(en) bereit, die in einer einzel- oder doppelsträngigen Nucleinsäure oder in einem Gemisch solcher Nucleinsäuren enthalten ist (sind), welcher in abgepackter Form folgende Bestandteile enthält:
(a) mindestens einen ersten und zweiten Oligonucleotid-Primer, die von einander verschieden sind, wobei
(aa) einer dieser Primer im Wesentlichen komplementär zu der einzelsträngigen Nucleinsäure oder zu einem Strang der doppelsträngigen Nucleinsäure ist,
(ab) der andere Primer im Wesentlichen komplementär zu einem Komplement der einzelsträngigen Nucleinsäure oder zum anderen Strang der doppelsträngigen Nucleinsäure ist, und wobei
(ac) diese Primer die Endpunkte der zu amplifizierenden und nachzuweisenden spezifischen Nucleinsäuresequenz definieren;
(b) ein Agens für die Polymerisation; und
(c) Mittel für den Nachweis der amplifizierten spezifischen Nucleinsäuresequenz.
Besondere Ausführungsformen des oben genannten Kits sind in den Ansprüchen 2 bis 12 definiert.
Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines wie oben genannten Kits bereit, um den Nachweis und/oder die Charakterisierung von spezifischen Nucleinsäuresequenzen zu ermöglichen, die mit infektiösen Erkrankungen, wie solche, die durch Bakterien, Viren und protozoische Parasiten verursacht werden, genetischen Störungen, wie solche, die durch spezifische Deletion und/oder Mutation in der genomischen DNA verursacht werden, oder zellulären Störungen, wie Krebs, in Verbindung stehen.
Die parallel anhängige europäische Anmeldung Nr. 201184 offenbart ein Verfahren zur Amplifikation von Nucleinsäuresequenzen und diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung der europäischen Anmeldung Nr. 86 30 2298.4.
Fig. 1 zeigt eine Sequenz von menschlichem ß-Globin mit einer Länge von 94 Basenpaaren, die man amplifizieren möchte. Die mit Sichelzellenanämie assoziierte Einzel- Basenpaar-Änderung ist unterhalb des 94-mers angegeben.
Fig. 2 zeigt eine Photographie eines mit Ethidiumbromid angefärbten Polyacrylamidgels, die eine Amplifikation des 94-mers demonstriert, das in menschlicher Wildtyp-DNA und in einem (mit pBR328 : HbA bezeichneten) Plasmid enthalten ist, das ein 1,9 kb BamHI-Fragment des normalen β-Globingens enthält.
Fig. 3 zeigt eine Photographie eines mit Ethidiumbromid angefärbten Polyacrylamidgels, die die Amplifikation jeder der spezifischen 94-mer Zielsequenzen beweist, die in pBR328 : HbA, einem ein 1,9 kb BamHI -Fragment des Sichelzellallels von ß-Globin enthaltendem (mit pBR328 : HbS bezeichnetem) Plasmid vorhanden sind, wobei die zu amplifizierende Sequenz in pBR328 : HbA mit MstII gespalten, und in pBR328 : HbS zwar mit MstII behandelt, nicht aber gespalten wurde.
Fig. 4 zeigt im Detail die Schritte und Produkte der Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifikation der gewünschten 94-mer Sequenz von menschlichem β-Globin über drei Zyklen unter Verwendung von zwei Oligonucleotid-Primern.
Fig. 5 stellt eine Photographie eines mit Ethidiumbromid angefärbten Polyacrylamidgels dar, die die Amplifikation einer 240-mer Sequenz in-pBR328 : HbA nach vier Zyklen zeigt, wobei die Aliquots mit NcoI (Spur 3), MstII (Spur 4) oder HinfI (Spur 5) gespalten sind. Spur 1 ist der Molekulargewichtsstandard und Spur 2 enthält das intakte 240 bp-Produkt.
Fig. 6 zeigt die Sequenz der normalen (βA-) und der Sichelzellen (βS-) β-Globingene im Bereich der DdeI und HinfI-Restriktionsstellen, wobei die einfachen Linien die Position der DdeI-Stelle (CTGAG) für βA und die doppelten Balken, die Position der HinfI-Stellen (GACTC) für βA und βS angeben.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der sequentiellen Spaltung von normalem β-Globin bei Verwendung einer 40-mer Sonde und der Restriktionsenzyme, DdeI gefolgt von HinfI.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse einer sequentiellen Spaltung von Sichel-β-Globin unter Verwendung derselben 40- mer-Sonde, wie in Fig. 7 und der Restriktionsenzyme Ddel und dann HinfI.
Fig. 9 zeigt eine Photographie eines mit Ethidiumbromid angefärbten Polyacrylamidgels, die die Verwendung derselben 40-mer-Sonde wie in Fig. 7 zum spezifischen Charakterisieren der β-Globinallele demonstriert, die in Proben menschlicher Gesamt-DNA vorhanden sind, die einer Amplifikation, einer Hybridisierung mit der Probe und einer sequentiellen Spaltung mit DdeI und HinfI unterzogen wurde.
Fig. 10 zeigt eine Photographie eines mit Ethidiumbromid angefärbten und mit UV-Licht illuminierten 6%igen NuSieve-Agarosegels. Diese Photographie zeigt die Amplifikation eines Subfragmentes eines 110 bp- Amplifikationsproduktes, wobei das Subfragment ein innerhalb des 110 bp-Fragmentes liegendes Stück ist.
Der Begriff "Oligonucleotid" wie er hier bezugnehmend auf Primer, Sonden, nachzuweisende oligomere Fragmente, Kontroll-Oligomere und unmarkierte Blockierungs-Öligomere verwendet wird, ist als ein Molekül definiert, das zwei oder mehr, bevorzugt mehr als drei Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide enthält. Seine genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die ihrerseits von der letztendlichen Funktion oder Verwendung der Oligonucleotide abhängen.
Der Begriff "Primer", wie er hier verwendet wird, betrifft ein Oligonucleotid, unabhängig davon, ob es natürlicherweise z. B. in einer gereinigten Restriktionsspaltung vorkommt oder synthetisch produziert wurde, das fähig ist, als Initiationspunkt der Synthese zu wirken, wenn es unter Bedingungen eingesetzt wird, in denen die Synthese eines zu einem Nucleinsäurestrang komplementären Primer- Verlängerungsproduktes induziert wird, d. h. in Gegenwart von Nucleotiden und einem Agens für die Polymerisation, wie z. B. DNA-Polymerase und einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH-Wert. Der Primer ist für eine maximale Wirksamkeit bei der Amplifikation bevorzugt einzelsträngig, kann gegebenenfalls aber doppelsträngig sein. Falls er doppelsträngig ist, wird der Primer zuerst zur Trennung seiner Stränge behandelt, bevor er zur Herstellung des Verlängerungsproduktes verwendet wird. Bevorzugt ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muß genügend lang sein, um in Gegenwart des Agens für die Polymerisation die Synthese des Verlängerungsproduktes zu initiieren. Die genaue Länge des Primers hängt von vielen Faktoren, einschließlich Temperatur und Primerquelle ab. Beispielsweise enthält der Oligonucleotid-Primer, je nach Komplexizität der Zielsequenz, typischerweise 15 bis 25 oder mehr Nucleotide, obwohl er weniger Nucleotide enthalten kann. Kurze Primer-Moleküle erfordern im allgemeinen niedrigere Temperaturen, um genügend stabile Hybridkomplexe mit der Matrize zu bilden.
Die hier verwendeten Primer sind so ausgewählt, das sie "im wesentlichen" komplementär zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen zu amplifizierenden Sequenz sind. Das bedeutet, daß die Primer genügend komplementär sein müssen, um mit ihren betreffenden Strängen zu hybridisieren. Somit braucht die Primersequenz nicht die genaue Sequenz der Matrize wiederzuspiegeln. Zum Beispiel kann ein nicht-komplementäres Nucleotidfragment an dem 5'- Ende des Primers angeheftet sein, wobei der Rest der Primersequenz komplementär zu dem Strang ist. In einer anderen Ausführungsform können nicht-komplementäre Basen oder längere Sequenzen in den Primer eingefügt sein, vorausgesetzt, daß die Primarsequenz eine genügend große Komplementarität mit der zu amplifizierenden Sequenz des Stranges aufweist, um damit zu hybridisieren und so eine Matrize zur Synthese des Verlängerungsproduktes des anderen Primers zu erzeugen.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe "Restriktionsendonucleasen" und "Restriktionsenzyme" auf bakterielle Enzyme, von denen jedes doppelsträngige DNA an oder nahe einer spezifischen Nucleotidsequenz schneidet.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff "DNA- Polymorphismus" auf den Zustand, in dem zwei oder mehr verschiedene Nucleotidsequenzen an einer individuellen DNA- Stelle in der DNA vorkommen können.
Der Begriff "Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus" ("restriction fragment length polymorphism", "RFLP") bezieht sich auf die Unterschiede zwischen Individuen in der Länge von durch Spaltung mit einer speziellen Restriktionsendonuclease erzeugten Restriktionsfragmenten.
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Kit zur Amplifikation und zum Nachweis einer oder mehrerer beliebiger gewünschter spezifischer Nucleinsäuresequenz(en), von der (denen) man annimmt, daß sie in einer Nucleinsäure vorhanden ist (sind). Da durch diesen Kit große Mengen einer spezifischen Sequenz hergestellt worden können, kann die Erfindung zur Verbesserung der Clonierungseffizienz von DNA- oder messenger-RNA und zum Amplifizieren einer Zielsequenz zur Erleichterung ihres Nachweises verwendet werden.
Im allgemeinen beinhaltet das mit dem vorliegenden Kit durchgeführte Verfahren eine Kettenreaktion zur Produktion mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz in exponentiellen Mengen bezüglich der Anzahl der involvierten Reaktionsschritte, vorausgesetzt, daß (a) die Enden der benötigten Sequenz genügend genau bekannt sind, um Oligonucleotide synthetisieren zu können, die mit ihnen hybridisieren und (b) eine kleine Menge der Sequenz verfügbar ist, um die Kettenreaktion zu initiieren. Das Produkt der Kettenreaktion ist eine diskrete Duplex-Nucleinsäure mit Enden, die mit den Enden der verwendeten spezifischen Primer korrespondieren.
Jede Quelle einer Nucleinsäure, in gereinigter oder nicht-gereinigter Form, kann man als Ausgangsnucleinsäure (-säuren) verwenden, wenn man annimmt, daß sie die gewünschte spezifische Nucleinsäuresequenz enthält. Somit kann das Verfahren z. B. DNA oder RNA, einschließlich messenger-RNA, verwenden, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein kann. Außerdem kann ein DNA-RNA-Hybrid verwendet werden, der je einen Strang von beiden enthält. Es kann auch ein Gemisch jeder dieser Nucleinsäuren verwendet werden, oder die aus einer früheren erfindungsgemäßen Amplifikationsreaktion unter Verwendung derselben oder verschiedener Primer hergestellten Nucleinsäuren lassen sich so verwenden. Die zu amplifizierende spezifische Nucleinsäuresequenz kann lediglich eine Fraktion eines größeren Moleküls sein, oder sie kann zu Beginn als ein diskretes Molekül vorhanden sein, so daß die spezifische Sequenz die vollständige Nucleinsäure ausmacht. Es ist nicht notwendig, daß die zu amplifizierende Sequenz zu Beginn in einer reinen Form vorliegt; es kann sich z. B. um eine kleinere Fraktion eines komplexen Gemisches, wie z. B. einen Teil des in menschlicher Gesamt-DNA vorkommenden β-Globingens handeln oder um eine von einem speziellen Mikroorganismus herrührende Teil-Nucleinsäuresequenz, wobei der Organismus nur eine sehr kleine Fraktion einer speziellen biologischen Probe ausmacht. Die Ausgangsnucleinsäure kann mehr als eine gewünschte spezifische Nucleinsäuresequenz enthalten, die gleich oder verschieden sein können. Somit ist das vorliegende Verfahren nicht nur zur Herstellung großer Mengen einer spezifischen Nucleinsäuresequenz nützlich, sondern auch zum gleichzeitigen Amplifizieren von mehreren verschiedenen spezifischen Nucleinsäuresequenzen, die auf demselben oder auf verschiedenen Nucleinsäuremolekülen liegen.
Die Nucleinsäure oder -säuren kann (können) aus irgendeiner Quelle erhalten werden, z. B. aus Plasmiden wie pBR322, aus clonierter DNA oder RNA oder aus natürlicher aus irgendeiner Quelle einschließlich Bakterien, Hefe, Viren und höheren Organismen, wie Pflanzen oder Tieren stammender DNA oder RNA. DNA oder RNA kann man aus Blut, Gewebematerial, wie z. B. Choryonzotten oder Amnion-Zellen durch eine Vielzahl von, wie z. B. die von Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), 280-281 beschriebenen Techniken extrahieren.
Mit dem erfindungsgemäßen Kit läßt sich jede spezifische Nucleinsäuresequenz herstellen. Es ist lediglich notwendig, daß eine ausreichende Zahl von Basen an beiden Enden der Sequenz ausreichend genau bekannt ist, so daß zwei Oligonucleotid-Primer hergestellt werden können, die mit den verschiedenen Strängen der gewünschten Sequenz und an entsprechenden Positionen entlang der Sequenz hybridisieren können, so daß ein von einem Primer synthetisiertes Verlängerungsprodukt, wenn es von seiner Matrize (Komplement) getrennt ist, als Matrize zur Verlängerung des anderen Primers - zu einer Nucleinsäure definierter Länge dienen kann. Je besser die Kentnisse über die Basen an beiden Enden der Sequenz sind, desto höher kann die Spezifität des Primers für die Nucleinsäure-Zielsequenz und damit auch die Effizienz des Verfahrens sein. Es wird darauf hingewiesen, daß sich das Wort Primer, wie es hier nachfolgend verwendet wird, auf mehr als einen Primer beziehen kann, insbesondere in dem Fall, wo eine gewisse Zweideutigkeit in der Information über die terminale(n) Sequenz(en) des zu amplifizierenden Fragments besteht. Zum Beispiel wird man in dem Fall, wo eine Nucleinsäuresequenz aus der Protein-Sequenzinformation abgeleitet ist, eine Kollektion von Primern für jeden Strang verwenden, die Sequenzen enthalten, die alle möglichen durch die. Degeneriertheit des genetischen Codes begründeten Codonvariationen darstellen. Ein Primer aus dieser Kollektion ist mit dem Ende der gewünschten zu amplifizierenden Sequenz homolog.
Die Oligonucleotid-Primer können nach jedem geeigneten Verfahren, wie z. B. den vorstehend beschriebenen Phosphotriester- und Phosphodiester-Verfahren oder automatisierten Ausführungsformen davon hergestellt werden. In solch einer automatisierten Ausführungsform werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsreagenzien verwendet. Sie können wie von Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1862, beschrieben, synthetisiert werden. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem modifizierten Festkörperträger ist im US-Patent Nr. 4,458,066 beschrieben. Es ist ebenfalls möglich, einen Primer zu verwenden, der aus einer biologischen Quelle (z. B. einer Restriktionsendonuclease-Spaltung) isoliert worden ist.
Die spezifische Nucleinsäuresequenz wird durch Verwendung der Nucleinsäure hergestellt, die diese Sequenz als Matrize enthält. Wenn die Nucleinsäure zwei Stränge enthält, ist es notwendig, die Stränge der Nucleinsäure entweder in einem getrennten Schritt oder gleichzeitig mit der Synthese des Primer-Verlängerungsproduktes zu trennen, bevor sie als Matrize verwendet werden kann. Diese Strangtrennung läßt sich durch jedes geeignete Denaturierungsverfahren, einschließlich physikalischer, chemischer oder enzymatischer Methoden erreichen. Ein physikalisches Verfahren zur Trennung der Stränge der Nucleinsäure beinhaltet ein Erhitzen der Nucleinsäure bis sie vollständig (> 99%) denaturiert ist. Eine typische Hitzedenaturierung kann Temperaturen in einem Bereich von ungefähr 80 bis 105ºC über einen Zeitraum von ungefähr 1 bis 10 Minuten beinhalten. Strangtrennung kann ebenfalls durch ein Enzym aus der Klasse der als Helicasen bekannten Enzyme induziert werden oder durch das Enzym RecA, das Helicase- Aktivität aufweist und von dem bekannt ist, daß es in Gegenwart von ribo-ATP DNA denaturiert. Die zur Trennung vvn Nucleinsäuresträngen durch Helicasen geeigneten Reaktionsbedingungen sind von Kuhn Hoffmann-Berling, CSH- Quantitative Biologie, 43 (1978), 63 beschrieben und eine Übersicht über Techniken zur Verwendung von RecA findet man in C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16 (1982), 405-37.
Wenn die ursprüngliche, die zu amplifizierende Sequenz enthaltende Nucleinsäure einzelsträngig ist, wird ihr Komplement durch Zugabe von einem oder zwei Oligonucleotid-Primern synthetisiert. Wenn man einen geeigneten einzelsträngigen Primer zugibt, wird in Gegenwart des Primers, eines Agens für die Polymerisation und der vier nachstehend beschriebenen Nucleotide ein Primer- Verlängerungsprodukt synthetisiert. Das Produkt ist partiell komplementär zu der einzelsträngigen Nucleinsäure und hybridisiert mit dem Nucleinsäurestrang unter Bildung einer Duplex-Struktur mit ungleich langen Strängen, die dann wie vorstehend beschrieben, in Einzelstränge getrennt werden kann, wodurch zwei einzelne getrennte komplementäre Stränge produziert werden. Alternativ kann man zwei geeignete Primer zur einzelsträngigen Nucleinsäure geben und die Reaktion aus führen.
Wenn die Ausgangsnucleinsäure die zu amplifizierende Sequenz darstellt, ist das (sind die) hergestellte(n) Primer-Verlängerungsprodukt(e) vollständig zu den Strängen der Ausgangsnucleinsäure komplementär und hybridisiert (hybridisieren) damit unter Bildung einer Duplex-Struktur von gleich langen Strängen, die in einzelsträngige Moleküle zu trennen ist.
Wenn die komplementären Stränge der Nucleinsäure oder -säuren getrennt sind, sind die Stränge unabhängig davon, ob die Nucleinsäure ursprünglich doppel- oder einzelsträngig vorlag, fertig zum Gebrauch als Matrize zur Synthese zusätzlicher Nucleinsäurestränge. Diese Synthese läßt sich unter Verwendung jedes geeigneten Verfahrens durchführen. Im allgemeinen geschieht dies in einer gepufferten wäßrigen Lösung, bevorzugt bei einem pH-Wert von 7 bis 9, meist bevorzugt bei ungefähr 8. Bevorzugt wird ein molarer Überschuß (bei einer clonierten Nucleinsäure gewöhnlich ungefähr 1000 : 1 Primer : Matrize und bei einer genomischen Nucleinsäure gewöhnlich ungefähr 10&sup6; : 1 Primer : Matrize) der beiden Oligonucleotid-Primer zum Puffer gegeben, der die getrennten Matrizen-Stränge enthält. Es wird jedoch darauf hingewiesen, daß die Menge komplementärer Stränge möglicherweise nicht bekannt ist, wenn der erfindungsgemäße Kit in diagnostischen Anwendungen benutzt wird, so daß die relative Menge des Primers bezüglich des komplementären Stranges nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. Aus praktischen Gründen wird die Menge des zugefügten Primers im allgemeinen jedoch im molaren Überschuß bezüglich der Menge des komplementären Stranges (Matrize) vorhanden sein, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch von komplizierten langkettigen Nucleinsäuresträngen enthalten ist. Ein großer molarer Überschuß wird bevorzugt, um die Effizienz des Verfahrens zu verbessern.
Die Desoxyribonucleosid-Triphosphate dATP, dCTP, dGTP und TTP werden in adequaten Mengen ebenfalls zum Synthesegemisch gegeben und die sich ergebende Lösung wird ungefähr 1 bis 10 Minuten, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten auf ungefähr 90 bis 100ºC erhitzt. Nach dieser Erhitzungsdauer läßt man die Lösung auf eine für die Primer-Hybridisierung bevorzugte Temperatur von 20 bis 40ºC abkühlen. Zu dem abgekühlten Gemisch wird ein Agens für die Polymerisation gegeben, und die Reaktion läßt man unter an sich bekannten Bedingungen ablaufen. Diese Synthesereaktion kann von Raumtemperatur an bis zu einer Temperatur ablaufen, oberhalb derer das Agens für die Polymerisation nicht mehr wirksam funktioniert. So ist z. B. die Temperatur im allgemeinen nicht größer als ungefähr 45ºC, wenn DNA-Polymerase als Agens für die Polymerisation verwendet wird. Vorzugsweise ist eine beim Nachweis des Signals wirksame Menge von Dimethylsulfoxid (DMSO) anwesend oder die Temperatur beträgt 35 bis 40ºC. Am meisten bevorzugt ist es, daß 5 bis 10 Volumen-% DMSO anwesend sind, und die Temperatur 35 bis 40ºC beträgt. Bei gewissen Anwendungen, bei denen die zu amplifizierenden Sequenzen Fragmente mit mehr als 110 Basenpaaren sind, wie z. B, die HLA DQ-α- oder -β-Gene, wird eine wirksame Menge (z. B. 10 Volumen-%) DMSO zum Amplifikations-Gemisch gegeben und die Reaktion bei 35 bis 40ºC durchgeführt, um nachweisbare Ergebnisse zu erhalten, oder ein Clonieren zu ermöglichen.
Das Agens für die Polymerisation kann irgendeine, Enzyme einschließende Verbindung oder ein System sein, das so wirkt, daß dadurch die Synthese der Primer- Verlängerungsprodukte erreicht wird. Geeignete Enzyme für diesen Zweck beinhalten z. B.. E. coli DNA-Polymerase I, Klenow Fragment von E. coli DNA-Polymerase I, T4-DNA- Polymerase, andere verfügbare DNA-Polymerasen, reverse Transkriptase und andere - inklusive hitzestabile - Enzyme, die die Kombination der Nucleotide in der korrekten Weise ermöglichen, wodurch die Primer-Verlängerungsprodukte gebildet werden, die zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär sind. Im allgemeinen wird die Synthese am 3'- Ende eines jeden Primers initiiert und schreitet dann in 5'- Richtung entlang des Matrizenstranges fort, bis die Synthese beendet ist, wodurch Moleküle mit verschiedenen Längen produziert werden. Es kann aber auch Agentien geben, die unter Verwendung desselben vorstehend beschriebenen Verfahrens die Synthese am 5'-Ende initiieren und in die ändere Richtung fortschreiten.
Der neue synthetisierte Strang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, das in den nachfolgenden Schritten des Verfahrens verwendet wird. Im nächsten Schritt werden die Stränge des doppelsträngigen Moleküls durch irgendeines der vorstehend beschriebenen Verfahren getrennt, um einzelsträngige Moleküle bereitzustellen.
Neue Nucleinsäure wird an den einzelsträngigen Molekülen synthetisiert. Zusätzliches induzierendes Agens, Nucleotide und Primer können zugegeben werden, falls es unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen notwendig ist, damit die Reaktion voranschreitet. Wieder wird die Synthese an einem Ende des Oligonucleotidprimers initiiert und schreitet entlang des Matrizeneinzelstranges voran, wodurch zusätzliche Nucleinsäure produziert wird. Nach diesem Schritt besteht die Hälfte des Verlängerungsproduktes aus der spezifischen an die beiden Primer gebundenen Nucleinsäuresequenz.
Die Schritte Strangtrennung und Synthese der Verlängerungsprodukte können zur Produktion der gewünschten Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz so oft wie nötig wiederholt werden. Wie nachfolgend im Detail beschrieben wird, akkumuliert die Menge der produzierten spezifischen Nucleinsäuresequenz in einer exponentiellen Weise.
Wenn man mehr als eine spezifische Nucleinsäuresequenz von einer ersten Nucleinsäure oder einem Gemisch von Nucleinsäuren produzieren möchte, verwendet man die geeignete Anzahl von verschiedenen Oligonucleotid- Primern. Wenn z. B. zwei spezifische Nucleinsäuresequenzen produziert werden sollen, werden vier Primer verwendet. Zwei der Primer sind spezifisch für eine der spezifischen Nucleinsäuresequenzen, und die anderen beiden Primer sind spezifisch für die zweite spezifische Nucleinsäureseguenz. Auf diese Weise kann nach dem vorliegenden Verfahren jede der beiden verschiedenen spezifischen Sequenzen exponentiell produziert werden.
Die vorliegende Erfindung kann man in einer schrittweisen Art ausgeführen, wobei man nach jedem Schritt neue Reagenzien zugibt, oder gleichzeitig, wobei man alle Reagenzien beim Anfangsschritt zugibt, oder partiell schrittweise und partiell gleichzeitig, wobei man frische Reagenzien nach einer vorgegebenen Anzahl von Schritten zugibt. Wenn ein Verfahren zur Strangtrennung, wie Hitze verwendet wird, das das Agens für die Polymerisation inaktiviert, wie im Fall eines hitze-labilen Enzyms, dann ist es notwendig, das Agens für die Polymerisation nach jedem Strangtrennungs-Schritt zu ergänzen. Das Simultan- Verfahren kann man verwenden, wenn man eine Anzahlgereinigter Komponenten einschließlich eines enzymatischen Mittels, wie Helicase für den Strangtrennungsschritt verwendet. In der Bimultanprozedur kann das Reaktionsgemisch zusätzlich zu dem (den) die gewünschte Sequenz enthaltenden Nucleinsäurestrang (-strängen) das strangtrennende Enzym (z. B. Helicase), eine geeignete Energiequelle für das strangtrennende Enzym, z. B. rATP, die vier Nucleotide, die Oligonucleotid-Primer in molarem Überschuß und das induzierende Agens (z. B. Klenow-Fragment von E. coli DNA- Polymerase I enthalten. Wenn in einem Simultan-Prozeß Hitze zum Denaturieren verwendet wird, kann ein hitzestabiles induzierendes Agens, wie z. B. eine thermostabile Polymerase verwendet werden, die bei erhöhter Temperatur je nach induzierendem Agens bevorzugt bei 55 bis 90ºC arbeitet. Bei dieser Temperatur besteht die Nucleinsäure aus Einzel- und Doppelsträngen im Gleichgewicht. Für Nucleinsäuren mit kleineren Längen können niedrigere Temperaturen von ungefähr 50ºC verwendet werden. Die höhere Temperatur hängt von der Temperatur ab, bei der sich das Enzym zersetzt, oder der Temperatur, oberhalb der ein unzureichendes Maß an Primer- Hybridisierung stattfindet. Solch ein hitzestabiles Enzym wird z. B. von A.S. Kaledin et al., Biokhimiya, 45 (1980), 644-651 beschrieben. Alle Schritte des Verfahrens ereignen sich nacheinander ungeachtet der Anwesenheit aller Reagenzien zu Beginn. Zusätzliche Materialien können in notwendigem Umfang zugegeben werden. Nach einer Zeitdauer, die geeignet ist, die gewünschte Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz zu produzieren, kann die Reaktion durch Inaktivieren der Enzyme auf jede bekannte Weise oder durch Trennen der Reaktionskomponenten gestoppt werden.
Das mit dem erfindungsgemäßen Kit durchgeführte Verfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden. In einer Ausführungsform eines automatisierten Prozesses kann die Reaktion durch einen denaturierenden Bereich, einen Reagenzien-Zugabebereich und einen Reaktionsbereich zyklisch geführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das für die Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte verwendete Enzym in einer Säule immobilisiert sein. Die anderen Reaktionskomponenten können kontinuierlich mit Hilfe einer Pumpe seriell durch die Säule und eine Heizspirale zirkuliert werden, so daß die produzierten Nucleinsäuren ohne eine Inaktivierung des Enzyms wiederholt denaturiert werden können.
Das mit dem erfindungsgemäßen Kit durchgeführte Verfahren ist nachstehend schematisch erläutert, wobei als Nucleinsäure die doppelsträngige DNA verwendet wird, die die gewünschte die komplementären Stränge [S&spplus;] und [S&supmin;] enthaltenden Sequenz [S] enthält. Während des ersten und jedes nachfolgenden Reaktionszyklus produziert die Verlängerung jedes Oligonucleotid-Primers an der Ausgangsmatrize ein neues einzelsträngiges DNA- Molekülprodukt mit unbestimmter Länge, das mit nur einem der Primer endet. Diese nachstehend als "lange Produkte" bezeichnete Produkte akkumulieren in einer linearen Weise, d. h., die nach irgendeiner Anzahl von Zyklen vorhandene Menge ist zur Anzahl der Zyklen proportional.
Die so hergestellten langen Produkte wirken während der nachfolgenden Zyklen als Matrizen für den einen oder den anderen der Oligonucleotid-Primer, und produzieren Moleküle der gewünschten Sequenz [S&spplus;] oder [S&supmin;]. Diese Moleküle fungieren ebenfalls als Matrizen für den einen oder den anderen der Oligonucleotid-Primer, wodurch weiter [S&spplus;] und [S&supmin;] produziert werden. Dadurch kann eine Kettenreaktion aufrechterhalten werden, die in der Akkumulation von [S] mit einer exponentiellen Rate bezüglich der Anzahl der Zyklen resultiert.
Die durch andere als die beabsichtigten Oligonucleotid-Hybridisierungen gebildeten Beiprodukte sind nicht selbst-katalytisch (außer in seltenen Fällen) und akkumulieren deshalb mit einer linearen Rate.
Die zu amplifizierende spezifische Sequenz [S] kann schematisch angegeben werden als:
[S&spplus;] 5' AAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCC 3'
[S&supmin;] 3' TTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGG 5'
Die geeigneten Oligonucleotid-Primer wären:
Primer 1: GGGGGGGGGG
Primer 2: AAAAAAAAAA
so daß, wenn die [S] enthaltende DNA
...zzzzzzzzzzzzAAAAAAAAAAXXXXXXXXXXCCCCCCCCCCzzzzzzzzzzzz...
...zzzzzzzzzzzzTTTTTTTTTTYYYYYYYYYYGGGGGGGGGGzzzzzzzzzzzz...
in Einzelstränge getrennt wird, und ihre Einzelstränge mit den Primern 1 und 2 hybridisiert werden, durch DNA- Polymerase in Gegenwart der vier Desoxyribonucleosid- Triphsophate die folgenden Verlängerungsreaktionen katalysiert werden können:
Die Denaturierungsprodukte der beiden gebildeten Duplexstrukturen sind:
Wenn man eine Re-Hybridisierung dieser vier Stränge mit den Primern 1 und 2 im nächsten Zyklus zuläßt, katalysiert das Agens für die Polymerisation die folgenden Reaktionen:
Wenn die Stränge der vorstehenden vier Duplexstrukturen getrennt werden, findet man die folgenden Stränge:
Man kann erkennen, daß jeder Strang, der mit der Oligonucleotid-Sequenz des einen und der komplementären Sequenz des anderen Primers terminiert, die spezifische Nucleinsäuresequenz [S] ist, die man produzieren will.
Die Verfahrensschritte können unbegrenzt wiederholt werden. Sie werden nur durch die Menge der Primer 1 und 2, das Agens für die Polymerisation und die anwesenden Nucleotide begrenzt. Für Nachweiszwecke ist die Anzahl der verwendeten Zyklen die, die man benötigt, um ein nachweisbares Signal zu produzieren, eine Menge, die z. B. von der Natur der Probe abhängt. Wenn die Probe z. B. rein oder verdünnt vorliegt, kann es sein, daß man weniger Zyklen benötigt, als wenn es sich um ein komplexes Gemisch handelt. Wenn die Probe menschliche genomische DNA ist, beträgt die bevorzugte Zyklenzahl ungefähr 10 bis 30.
Die Menge der Ausgangsnucleinsäure bleibt während des gesamten Prozesses konstant, da sie nicht repliziert wird. Die Menge der langen Produkte wächst linear, da sie nur von der Ausgangsnucleinsäure produziert werden. Die Menge der spezifischen Sequenz wächst exponentiell. Somit wird die spezifische Sequenz zur vorherrschenden Spezies. Dies ist in der nachfolgenden Tabelle gezeigt, die die relativen Mengen der theoretisch vorhandenen Spezies nach n Zyklen angibt, wobei eine 100%ige Effizienz bei jedem Zyklus angenommen wird: Anzahl der Doppelstränge nach 0 bis n Zyklen
Wenn man eine einzelsträngige Nucleinsäure als Matri-ze verwendet, wird nur ein langes Produkt pro Zyklus gebildet.
Der erfindungsgemäße Kit läßt sich zur Clonierung einer speziellen Aminosäuresequenz für die Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor verwenden. Der Vektor kann dann verwendet werden, um einen geeigneten Wirtsorganismus zu transformieren, um das Genprodukt der Sequenz nach Standardverfahren der DNA-Rekombinationstechnik zu produzieren.
Normalerweise würde solch ein Clonieren entweder das direkte Ligieren in einen Vektor oder das Anfügen von Oligonucleotid-Linkern mit einer anschließenden Restriktionsenzym-Spaltung beinhalten. Beide Verfahren beinhalten jedoch die ineffiziente Ligationsreaktion glatter Enden. Außerdem würde keine der Techniken die Orientierung oder die Multiplizität der Insertion des amplifizierten Produktas in den Clonierungsvektor kontrollieren.
Das durch Verwendung des erfindungsgemäßen Kits durchgeführte Amplifikationsverfahren kann ein Gemisch von Nucleinsäuren liefern, das sich aus der Matrizen-Ausgangs-Nucleinsäure, den erwarteten amplifizierten Zielprodukten und verschiedenen Nicht-Ziel- Begleitprodukten ergibt. Das amplifizierte Produkt kann ebenfalls ein Gemisch sein, wenn die Matrizen-Ausgangs-DNA multiple Zielsequenzen enthält, sowie es bei heterozygoten diploiden Genomen der Fall ist, oder wenn es eine Familie verwandter Gene gibt.
Die erfindungsgemäßen Primer können so modifiziert sein, daß sie die schnelle und spezifische Clonierung des durch die Amplifikationsreaktion produzierten DNA-Gemisches unterstützen. In solch einer Modifikation sind dieselben oder verschiedene Restriktionsstellen in die 5'-Enden eingebaut, die zu Restriktionsstellen an den beiden Enden des amplifizierten Produktes führen. Wenn es mit den geeigneten Enzymen gespalten wird, kann das amplifizierte Produkt dann leicht in Plasmide oder ändere Vektoren eingesetzt und cloniert werden. Dieses Clonieren ermöglicht die Analyse oder die Expression von individuellen amplifizierten Produkten anstelle eines Gemisches.
Obwohl man für beide Primer dieselbe Restriktionsstelle verwenden kann, ermöglicht die Verwendung verschiedener Stellen das Inserieren des Produktes in den Vektor in einer spezifischen Orientierung und unterdrückt multiple Insertionen ebenso wie Insertionen, die sich aus Amplifikationen ergeben, denen nur einer der beiden Prima zugrunde liegt. Die spezifische Orientierung ist nützlich, wenn in einzelsträngige Sequenzierungs-Vektoren cloniert wird, wenn einzelsträngige Hybridisierungs-Sonden verwendet werden, oder wenn das clonierte Produkt exprimiert wird.
Ein Verfahren zur Herstellung der Primer besteht darin, eine Primersequenz zu wählen, die sich minimal von der Zielsequenz unterscheidet. Bereiche, in denen die jeweiligen Primer liegen, werden auf eine Homologie mit Restriktionsstellen hin abgesucht, die für die gewünschten Vektoren geeignet sind. Die Zielsequenz "CAGTATCCGA..." z. B. unterscheidet sich nur durch eine Base von einer Sequenz, die eine BamHI-Stelle enthält. Eine Primersequenz wird so gewählt, daß sie eine genaue Basenpaarung an ihrem 3'-Ende aufweist und nahe ihres 5'-Endes die geänderte Sequenz und Restriktionsstelle (z. B. "CAGgATCCGA...", wobei der kleine Buchstabe eine basen-ungepaarte Stelle mit der Zielsequenz symbolisiert) enthält. Diese geringfügig geänderte Sequenz stört die Fähigkeit des Primers zur Hybridisierung mit der Ausgangsziel-Sequenz und zur Initiation der Polymerisation nicht. Nach dem ersten Amplifikationszyklus ist der Primer kopiert; er wird zum Ziel, und paßt genau zu den neuen Primern. Nach dem Amplifikationsprozeß werden die Produkte mit den geeigneten Restriktionsenzymen gespalten, gegebenenfalls von Inhibitoren der Ligation, wie den Nucleosidtriphosphaten und Salzen durch Passieren über eine Entsälzungssäule oder eine Molekulargewichtschromatographie- Säule abgetrennt und durch Ligieren in einen Clonierungsvektor. z. B. den Bakteriophagen 113 inseriert. Das Gen kann dann nach bekannten Techniken sequenziert und/oder exprimiert werden.
Das zweite Verfahren zur Herstellung der Primer beinhaltet, daß das 3'-Ende der Primer der Zielsequenz entnommen wird und die gewünschte(n) Restriktionsstelle(n) zum 5'-Ende des Primers zugefügt wird (werden). Beim oben genannten Beispiel könnte eine HindIII-Stelle zugefügt werden, um die Sequenz "cgaagcttCAGTATCCGA..." herzustellen, wobei die Kleinbuchstaben die vorstehend beschriebene Bedeutung haben. Die zugefügten Basen tragen beim ersten Amplifikationszyklus nicht zur Hybridisierung bei, passen aber in nachfolgenden Zyklen. Die schließlich amplifizierten Produkte werden dann mit einem Restriktionsenzym (-enzymen) gespalten und, wie vorstehend beschrieben, cloniert und exprimiert. Bei dem amplifizierten Gen kann es sich z. B. um menschliche β-Hämoglobin- oder menschliche HLA DQ-, DR- oder DP-α- und -β-Gene handeln.
Außerdem kann der erfindungsgemäße Kit zur in vitro-Mutagenese verwendet werden. Die Oligodesoxyribonucleotid-Primer brauchen nicht genau komplementär zu der zu amplifizierenden DNA-Sequenz sein. Es ist lediglich notwendig, daß sie in der Lage sind, genügend gut mit der Sequenz zu hybridisieren, um durch das Polymerase-Enzyn oder durch irgendein anderes verwendetes induzierendes Agens verlängert zu werden. Das Produkt einer Polymerasekettenreaktion, bei der die verwendeten Primer nicht genau komplementär zur Ausgangsmatrize sind, enthalten eher die Sequenz des Primers, als die der Matrize, wodurch eine in vitro-Mutation eingeführt wird. In weiteren Zyklen wird diese Mutation mit unverminderter Effizienz amplifiziert, da keine weiteren Primer-Initiationen mit falschen Basenpaarungen nötig sind. Die so produzierte Mutante kann nach molekularbiologischen Standardtechniken in einen geeigneten Vektor eingesetzt werden und kann diesem Vektor die mutanten Eigenschaften, wie z. B. das Potential zur Produktion eines geänderten Proteins verleihen.
Das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung einer geänderten DNA-Sequenz kann wiederholt auf die geänderte DNA-Sequenz angewandt werden, indem verschiedene Primer verwendet und so weitere Sequenzänderungen induziert werden. Auf diese Weise könnte schrittweise eine Serie mutierter Sequenzen produziert werden, wobei sich jede neue Hinzufügung zu der Serie von der letzten in einer geringfügigen, von der Quellenausgangs-DNA-Sequenz aber in einer zunehmend größeren Weise unterscheiden könnte, Auf diese Weise ließen sich schließlich Änderungen vornehmen, die in einem einzelnen Schritt wegen der Funktionsunfähigkeit eines stark unpassenden Primers nicht möglich wären.
Zusätzlich kann der Primer als Teil einer Sequenz eine nicht-komplementäre Sequenz enthalten, vorausgesetzt, daß eine genügend große Menge des Primers eine Sequenz enthält, die zu dem zu amplifizierenden Strang komplementär ist. Zum Beispiel kann eine Nucleotidsequenz, die nicht zu der Matrizen-Sequenz komplementär ist (wie z. B. eine Promotor-, eine Linker-, eine codierende Sequenz usw.) an das 5'-Ende des einen oder beider Primer angeheftet und dadurch dem Produkt des Amplifikationsprozesses hinzugefügt werden. Nachdem der Verlängerungsprimer zugegeben ist, werden genügend Zyklen durchgeführt, um die gewünschte Menge der neuen, die nicht-komplementäre Nucleotid-Insertion enthaltende Matrize zu erhalten. Dies erlaubt unter Anwendung einer einfachen Technik die Produktion von großen Mengen der kombinierten Fragmente in einer relativ kurzen Zeit, z. B. in 2 Stünden oder weniger.
Darüber hinaus kann der erfindungsgemäße Kit zur Synthese eines Nucleinsäurefragmentes aus einem bereits vorhandenen Nucleinsäurefragment verwendet werden, das kürzer als sein Produkt (Kernabschnitt genannt) ist, wobei gewisse Primer verwendet werden, deren 3'-Enden komplementär oder im wesentlichen komplementär zu den 3'-Enden der durch Strangtrennung der ursprünglichen kürzeren Nucleinsäurefragmente erhaltenen Einzelstränge sind, und deren 5'-Enden, die zum Kernabschnitt hinzuzufügende Sequenzinformation enthalten. Dieses Verfahren umfaßt:
(a) Behandeln der Stränge des vorhandenen Fragments mit zwei Oligonucleotid-Primern, unter solchen Bedingungen, daß ein Verlängerungsprodukt jedes Primers synthetisiert, wird, das zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär ist, wobei die Primer so ausgewählt sind, daß sie im wesentlichen komplementär zu den 3'-Enden jedes Stranges des vorhandenen Fragments sind, so daß das von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt als eine Matrize zur Synthese des Verlängerungsproduktes des anderen Primers dienen kann, wenn es von seinem Komplement getrennt worden ist, und wobei jeder Primer an seinem 5'-Ende eine Sequenz von Nucleotiden enthält, die zum vorhandenen Fragment nicht komplementär sind und die mit den beiden Enden des synthetisierten Nucleinsäurefragments korrespondieren;
(b) Trennen der Primer-Verlängerungsprodukte von den Matrizen, an denen sie synthetisiert wurden, um einzelsträngige Moleküle zu produzieren; und
(c) Behandeln der in Schritt (b) erzeugten einzelsträngigen Moleküle mit den Primern von Schritt (a) unter solchen Bedingungen, daß unter Verwendung von jedem der in Schritt (b) produzierten Einzelstränge als Matrize ein Primer-Verlängerungsprodukt synthetisiert wird, so daß zwei intermediäre doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle hergestellt werden, in die jeweils die in dem 5'-Ende des einem der Oligonucleotid-Primer vorhandene Nucleotidsequenz eingebaut ist, und zwei doppelsträngige Nucleinsäuremoleküle mit voller Länge, in die jeweils die in den 5'-Enden der beiden Oligonucleotid-Primer vorhandene Nucleotidsequenz eingebaut ist;
(d) ausreichend häufiges Wiederholen der Schritte (b) und (c), um die doppelsträngigen Moleküle mit voller Länge in einer wirksamen Menge zu produzieren;
(e) Behandeln der Stränge des Produktes von Schritt
(d) mit zwei Primern, um so das Produkt von Schritt (d) an beiden Enden zu verlängern; und
(f) Wiederholen der Schritte (a) bis (d) unter Verwendung des Produktes von Schritt (d) als Kernfragment und zweier Oligonucleotidprimer, die komplementär oder im wesentlichen komplementär zu den 3'-Enden der durch Strangtrennung des Produktes von Schritt (d) produzierten. Einzelstränge sind.
Die Schritte (b) und (c) werden so oft wie nötig, normalerweise mindestens 5 mal, wiederholt, um die benötigte Menge des doppelsträngigen Produktes mit voller Länge zur Synthese des Endproduktes (d. h. die wirksame Menge) zu produzieren. Außerdem kann man den Kernabschnitt als Produkt eines früheren Amplifikationszyklus erhalten. Das in Schritt (d) produzierte Produkt kann vor einem neuen Verlängerungs- und Amplifikationszyklus gereinigt oder direkt unter Verwendung des das Produkt enthaltenen Reaktionsgemisches verwendet werden.
Falls die 3'-Enden der Primer nicht genau komplementär zu den 3'-Enden der Einzelstränge der ursprünglich kürzeren Nucleinsäure sind, entspricht das Kernfragment des Produktes nicht genau der Sequenzinformation, die der ursprünglich kürzeren Nucleinsäure innewohnt. Deshalb können Mutanten der ursprünglichen Nucleinsäure durch Verwendung von Primern hergestellt werden, die an ihren 3'-Enden zu den 3'-Enden der Einzelstränge der ursprünglichen kürzeren Nucleinsäure im wesentlichen komplementär sind.
Wenn in die Primer Linker für Restriktionsstellen eingebaut sind, können die amplifizierten doppelsträngigen Produkte mit den geeingenten Restriktionsenzymen gespalten und direkt mit einem M13-Vektor zur schnellen Clonierung und Sequenzierung ligiert werden. Die die spezifischen amplifizierten Zielsequenzen enthaltenden M13-Plaques können durch Hybridisieren von Plaque-Abziehfiltern (plaque lift filters) mit einer Zielsequenz-spezifischen Sonde identifiziert werden.
Der erfindungsgemäße Kit kann auch dazu verwendet werden, daß es den Nachweis und/oder die Charakterisierung spezifischer Nucleinsäuresequenzen ermöglicht, die assoziiert sind mit infektiösen Erkrankungen, genetischen oder zellulären Störungen, wie Krebs, z. B. Oncogenen. Eine Amplifikation ist dann nützlich, wenn die für eine Analyse verfügbare Nucleinsäuremenge sehr klein ist, wie z. B. in der prenatalen Diagnostik der Sichelzellenanämie, bei der aus fötalen Zellen erhaltene DNA verwendet wird. Eine Amplifikation ist insbesondere nützlich, wann man solch eine Analyse mit einer kleinen Probe ausführen muß, wenn nicht-radioaktive Nachweistechniken, die inhärent insensitiv sein können, oder wenn radioaktive Techniken verwendet werden, aber ein schneller Nachweis wünschenswert ist.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung können genetische Krankheiten spezifische Deletionen und/oder Mutationen in der genomischen DNA irgendeines Organismus z. B. Sichelzellenanämie, cystische Fibrose, α-Thalassemie, ß- Thalassemie und andere einschließen. Sichelzellenanämie läßt sich leicht mittels Oligomer-Restriktionsanalyse oder durch eine einer Amplifikation der geeigneten DNA-Sequenz nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nachfolgenden RFLP-artige Analyse nachweisen. α-Thalassemie läßt sich durch die Abwesenheit einer Sequenz nachweisen, und β-Thalassemie läßt sich durch die Anwesenheit einer polymorphen Restriktionsstelle nachweisen, die eng mit einer Mutation verknüpft ist, die die Krankheit verursacht.
All diese genetischen Krankheiten lassen sich durch Amplifizieren der geeigneten Sequenz und durch deren Analyse durch Southern-, Blot ohne die Verwendung radioaktiver Sonden nachweisen. In solch einem Verfahren wird z. B. eine kleine DNA-Probe z. B. aus der sehr kleine Mengen der gewünschten Sequenz enthaltenden Amnionflüssigkeit amplifiziert, mit einem Restriktionsenzym gespalten und mittels einer Southern- Blot-Technik analysiert. Die Verwendung von nicht-radioaktiven Sonden wird durch den hohen Pegel des amplifizierten Signals erleichtert.
In einer anderen Ausführungsform kann eine kleine DNA-Probe auf ein bequemes Maß amplifiziert werden und dann ein weiterer Zyklus von Verlängerungsreaktionen ausgeführt werden, wobei leicht nachweisbare Nucleotidderivate (wie ³²P- oder Biotin-markierte Nucleosidtriphosphate) direkt in das DNA-Endprodukt eingebaut werden, das durch Restriktion und elektrophoretische Auftrennung oder irgendein anderes geeignetes Verfahren analysiert werden kann. Ein Beispiel dieser Technik ist in einem Modellsystem in Fig. 5 gezeigt.
In einer weiteren in einem Modellsystem in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform kann die Nucleinsäure vor der Amplifikation einer Behandlung mit einer speziellen Restriktionsendonuclease ausgesetzt werden. Da eine Sequenz, die gespalten worden ist, nicht amplifiziert werden kann, bedeutet das Auftreten eines amplifizierten Fragments trotz der vorherigen Restriktion der DNA-Probe das Fehlen einer Endonuclease-Stelle innerhalb der amplifizierten Sequenz. An- und Abwesenheit einer amplifizierten Sequenz läßt sich durch ein geeignetes Verfahren nachweisen.
Eine praktische Anwendung dieser Technik kann veranschaulicht werden durch ihren Nutzen, den Nachweis von Sichelzellenanämie mittels der hier und von Saiki et al., Biotechnology. 3 (1985), 1008-1012 beschriebenen Oligomer- Restriktionstechnik zu erleichtern. Sichelzellenanämie ist eine Krankheit das Hämoglobins, die durch eine einzelne Basenpaaränderung im sechsten Codon des β-Globingens verursacht wird. Fig. 6 zeigt die Sequenz des normalen und des Sichelzell-β-Globingens im Bereich seines Polymorphismus, wobei die einfachen Balken die Lage der nur im normalen Gen vorhandenen DdeI-Stelle angeben, und die doppelten Balken die Lage einer HinfI-Stelle angeben, die nichtpolymorph ist und somit sowohl in den normalen als auch in den Sichelzellallelen vorhanden ist. Fig. 7 erläutert das Verfahren der Oligomer-Restriktion von normaler β-Globin-DNA unter Verwendung einer Sonde, die beide Restriktionsstellen überspannt und die dort, wo der Stern erscheint, markiert ist. (Die Sonde ist bevorzugt an dem Ende markiert, das weniger Basenpaare weit von der Restriktionsstelle entfernt ist als das andere Ende der Sonde.) Die hier bereitgestellte amplifizierte DNA wird denaturiert und an die markierte Sonde angelagert. Die Amplifikation kann bei erhöhten Temperaturen (35 bis 40ºC) in Gegenwart von Dimethylsulfoxid ausgeführt werden, um die Bildung einer Sekundärstruktur so gering wie möglich zu halten. Das Enzym Ddel spaltet die DNA an der wiedergebildeten DdeI-Stelle- und erzeugt ein markiertes Octamer. Unter den im Test verwendeten Bedingungen ist das Octamer kurz genug, um von der Duplek- Struktur zu dissoziieren. Die nachfolgende Zugabe des Enzyms HinfI hat keine Wirkung auf das nun einzelsträngige Octamer. Fig. 8 veranschaulicht dasselbe auf das Sichelzellallel von β-Globin-DNA angewandte Verfahren. Das Enzym DdeI kann wegen der A-A-Basen-Fehlpaarung, die aus der amplifizierten DNA und der markierten Sonde gebildete Duplexstruktur nicht spalten. Das Enzym HinfI jedoch restringiert das Hybrid, und ein markiertes Trimer wird produziert. In der Praxis läßt sich mit dem Verfahren diagnostizieren, ob die DNA eines Individuums entweder homozygot bezüglich des Wildtyps, hymozygot bezüglich des Sichel-Typs oder ein heterozygoter Träger des Sichelzellmerkmals ist, da ein spezifisches Signal mit dem Vorhandensein jedes, der Allele assoziiert ist. Die Verwendung dieses vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Amplifikation der betreffenden Sequenz erlaubt eine schnelle Analyse eines Einzelkopie-Gens, unter Verwendung einer Sonde mit nur einer einzigen ³²P- Markierung.
Eine Reihe von Infektionskrankheiten lassen sich diagnostizieren durch das Vorhandensein von spezifischen, für den verursachenden Mikroorganismus charakteristischen DNA-Sequenzen in klinischen Proben. Dazu gehören Bakterien wie Salmonella, Chlamydia, Neisseria; Viren, wie das Hepatitis virus und Parasiten wie das für Malaria verantwortliche Plasmodium. Das Falkow erteilte U.S.-Patent 4,358,535 beschreibt die Verwendung spezifischer DNA- Hybridisierungs-Sonden zur Diagnose infektiöser Krankheiten. Ein dem Falkow-Verfahren innewohnendes Problem ist, daß eine relativ kleine Anzahl pathogener Organismen in einer klinischen Probe eines infizierten Patienten vorhanden sein kann, und daß die von diesen extrahierte DNA nur eine sehr kleine Fraktion der Gesamt-DNA in der Probe ausmachen kann. Eine spezifische Amplifikation von vermuteten Sequenzen vor der Immobilisierung und dem Hybridisierungs- Nachweis der DNA-Proben könnte die Empfindlichkeit und die Spezifität dieser Verfahren erheblich verbessern.
Eine klinische Routineanwendung von DNA-Sonden zur Diagnose von infektiösen Krankheiten würde erheblich vereinfacht werden, wenn nicht-radioaktiv markierte Sonden wie sie von Ward in EP 63,876 beschrieben sind, verwendet werden können. In diesem Verfahren werden Biotin enthaltende DNA-Sonden durch chromogene Enzyme, die mit Avidin verknüpft sind, oder durch Biotin-spezifische Antikörper nachgewiesen. Diese Nachweisart ist bequem, aber relativ unempfindlich. Die Kombination der spezifischen DNA-Amplifikation durch das erfindungsgemäße Verfahren und die Verwendung stabil markierter Sonden könnte die benötigte Bequemlichkeit und Empfindlichkeit bereitstellen, um die Falkow- und Ward- Verfahren in einem klinischen Routinerahmen nützlich zu machen.
Außerdem kann die Sonde eine biotinylierte Sonde sein, in der Biotin über einen Abstandsarm (spacerarm) der nachstehenden Formel angeheftet ist:
wobei Y ein O, NH oder N-CHO, x eine Zahl von 1 bis 4 und y eine Zahl von 2 bis 4 ist. Der Abstandsarm seinerseits ist an eine Psoraleneinheit der nachfolgenden Formel angeheftet:
Die Psoraleneinheit interkaliert in eine "gapped circle"- Sonde und quervernetzt sie, wie von Courage-Tebbe et a., Biochim. Bionhys. Acta 697 (1982), 1-5, beschrieben ist, wobei der einzelsträngige Hybridisierungsbereich des "gapped circle" den in den Primern enthaltenen Bereich überspannt.
Der Kit läßt sich ebenfalls zur Produktion genügend großer DNA-Mengen von einem in einer einzigen Kopie vorliegendem menschlichen Gen verwenden, so daß man einen Nachweis durch eine einfache nicht-spezifische DNA-Anfärbung wie mit Ethidiumbromid verwenden kann, um so eine DNA-Diagnose direkt vorzunehmen.
Zusätzlich zum Nachweis infektiöser Krankheiten und pathologischer Abnormalitäten im Genom von Organismen kann der erfindungsgemäße Kit ebenfalls verwendet werden, um einen DNA-Polymorphismus nachzuweisen, der möglicherweise nicht mit irgendeinem pathologischen Zustand assoziiert ist.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung. Es ist aber nicht beabsichtigt, daß sie die Erfindung in irgendeiner Weise einschränken. In diesen Beispielen beziehen sich alle Prozentangaben für Feststoffe auf das Gewicht und für Flüssigkeiten auf das Volumen, und alle Temperaturen sind, wenn nicht anders erwähnt, in ºC angegeben.

Beispiel 1

Eine auf einem 47 Basenpaar FokI-Restriktionsfragment von pBR322, das: bei der ATCC erhältlich ist, enthaltene Sequenz von 25 Basenpaaren mit der Nucleotidsequenz
5' CCTCGGCACCGTCACCCTGGATGCT 3'
3' GGAGCCGTGGCAGTGGGACCTACGA 5'
wurde wie folgt präpariert. Eine das 47 Basenpaarfragment enthaltene FokI-Spaltung von pBR322 wurde durch Spalten von pBR322 mit FokI nach vom Hersteller New England Biolabs Inc. empfohlenen Bedingungen gespalten. Die verwendeten Primer waren 5'd(CCTCGGCACCG) 3' und 5' d(AGCATCCAGGGTG) 3'. Sie wurden nach herkömmlichen Verfahren hergestellt. Zu 33 ul eines aus 25 mM Kaliumphosphat, 10 mM Magnesiumchlorid und 100 mM Natriumchlorid bestehenden Puffers mit pH 7,5 wurden die nachstehend aufgeführten Zutaten gegeben: Je 2433 pMol der vorstehend genannten Primer, 2,4 pMol der FokI-Spaltung von pBR322, 12 nMol dATP, 22 nMol dCTP, 19 nMol dGTP und 10 nMol TTP.
Das Gemisch wurde 5 Minuten auf 85ºC erhitzt, und dann zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehen gelassen. Fünf Einheiten Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I wurden zugegeben und die Temperatur wurde 15 Minuten beibehalten. Nach dieser Zeit wurde das Gemisch erneut 5 Minuten auf 85ºC erhitzt. Danach ließ man es abkühlen. Erneut wurden fünf Einheiten Klenow-Fragment zugegeben, und die Reaktion wurde 15 Minuten durchgeführt. Die Schritte Erhitzen, Abkühlen, Synthese wurden elf weitere Male durchgeführt.
Nach der letzten Wiederholung wurde dem Reaktionsgemisch ein 5 ul Aliquot entnommen. Dieses wurde 3 Minuten auf 85ºC erhitzt und dann zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehen gelassen. 12,5 pMol α-³²P- Desoxycytidintriphosphat und 5 Einheiten Klenow-Fragment wurden zugegeben und es wurde 15 Minuten umgesetzt. Die markierten Produkte wurden durch Polyacrylamidgel- Elektrophorese untersucht. Die FokI-Spaltung wurde auf ähnliche Weise markiert und diente als Kontrolle und als ein Molekulargewichts-Standard. Die einzige stark markierte nach 13 Zyklen sichtbare Bande war die beabsichtigte 25 Basenpaar-Sequenz.

Beispiel 2

Die gewünschte zu amplifizierende Sequenz war eine 94 Basenpaar-Sequenz, die in dem menschlichen β-Globingen enthalten ist, und die sich über die in Sichelzellenanämie involvierte MstII-Stelle erstreckt. Die Sequenz besitzt die in Fig. 1 gezeigte Nucleotidsequenz.

I. Primersynthese

Die folgenden beiden Oligonucleotid-Primer wurden nach dem nachstehend angegebenen Verfahren hergestellt:
5' CACAGGGCAGTAACG 3' Primer A
und
5' TTTGCTTCTGACACA 3' Primer B
Automatisierte Syntheseverfahren: Die nach Beaucage und Caruthers (Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1862) synthetisierten Diethylphosphoramidite wurden sequentiell unter Verwendung eines Biosearch SAM-1 an einen mit einem Nucleosid derivatisierten Träger aus porenkontroliertem Glas ankondensiert. Die - Prozedur beinhaltete eine De- Tritylierung mit Trichloressigsäure in Dichlormethan, eine Kondensation unter Verwendung von Benzotriazol als aktivierendem Protonen-Donor und eine Maskierung (Capping) mit Acetanhydrid und Dimethylaminopyridin in Tetrahydrofuran und Pyridin. Die Dauer des Zyklus betrug ungefähr 30 Minuten. Die Ausbeuten in jedem Schritt waren im wesentlichen quantitiv und wurden bestimmt durch die Gewinnung und die spektroskopische Untersuchung des während der De-Tritylierung freigesetzten Dimethoxytrityl-Alkohols.
Prozeduren zur Entfernung der Schutzgruppe und zur Reinigung der Oligonucleotide: Das feste Trägermaterial wurde der Säule entnommen und 5 Stunden bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Röhrchen 1 ml konzentriertem Ammoniak ausgesetzt. Das Trägermaterial wurde dann durch Filtrieren entfernt, und die das teilweise geschützte Oligonucleotid enthaltende Lösung 5 Stunden auf 55ºC gebracht. Ammoniak wurde entfernt und der Rückstand wurde auf ein präparatives Polyacrylamidgel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 90 Minuten bei 30 Volt/cm ausgeführt. Danach wurde die das Produkt enthaltende Bande durch UV-Schattenwurf auf einer fluoresziierenden Platte identifiziert. Die Bande wurde ausgeschnitten und über Nacht bei 4ºC mit 1 ml destilliertem Wasser eluiert. Diese Lösung wurde auf eine Altech RP18- Säule aufgetragen und mit einem 7 bis 13%igem Gradienten von Acetonitril in 1% Ammoniumacetat-Puffer bei pH 6,0 eluiert. Die Elution wurde durch UV-Absorption bei 260 nm überwacht und die geeignete Fraktion wurde gesammelt, durch UV- Absorption in einem festen Volumen quantifiziert und in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur zur Trockene eingedampft.
Charakterisierung der Oligodesoxyribonucleotide: Test-Aliquots der gereinigten Oligonucleotide wurden mit γ - ³²P ATP und Polynucleotid-Kinase ³²P-markiert. Die markierten Verbindungen wurden nach 45 Minuten Elektrophorese bei 50 Volt/cm durch Autoradiographie eines 14 bis 20%igen Polyacrylamidgels untersucht. Diese Prozedur verifiziert das Molekulargewicht. Die Basenzusammensetzung wurde bestimmt durch Verdau der Oligodesoxyribonucleotide mit Schlangengift-Phosphodiesterase und bakterieller alkalischer Phosphatase zu den Nucleosiden und durch anschließende Auftrennung und Quantifizierung der abgeleiteten Nucleoside mit Hilfe einer Reverse-Phasen HPLC- Säule und einer mobilen Phase aus 10% Acetonitril und 1% Ammoniumacetat.

II. DNA-Quelle

A. Extraktion von menschlicher Gesamt-DNA des Wild- Typs

Für normales β-Globulin homozygote genomische menschliche DNA wurde nach dem von Stetler et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. 79 (1982), 5966-5970 beschriebenen Verfahren aus der Zellinie Molt4 (erhalten von Human Genetic Mutant Cell Repository und als GM2219c beschrieben) extrahiert.

B. Konstruktion von clonierten Globin-Genen

Ein 1,9 kb BamHI-Fragment des normalen β-Globingens wurde aus dem Cosmid pFC11 isoliert und in die BamHI-Stelle von pBR328 (Soberon et al., Gene 9 (1980), 287-305) eingesetzt. Dieses Fragment, das den Bereich umfaßt, der zur synthetischen 40-mer Sande hybridisiert, schließt das erste und zweite Exon, das erste Intron, und 5'-flankierende Sequenzen des Gens ein (Lawn et al., Cell 15 (1978), 1157- 1174). Dieser Clon wurde mit pBR328 : HbA bezeichnet und unter der ATCC Nr. 39 698 am 25. Mai 1984 hinterlegt.
Das korrespondierende 1,9 kb BamHI-Fragment des Sichelzellenallels von β-Globin wurde aus dem Cosmid pFC12 isoliert und wie oben beschrieben, cloniert. Dieser Clon wurde mit pBR328 : HbS bezeichnet und unter der ATCC-Nr. 39 699 am 25. Mai 1984 hinterlegt.
Jedes rekombinante Plasmid wurde zur Transformation von E. coli MM294 (ATCC Nr. 39 607) verwendet und in E. coli MM294 vermehrt.

C. Spaltung der clonierten Globingene mit MstIL

Insgesamt je 100 ug pBR328 : HbA und pBR328 : HbS würden einzeln mit 20 Einheiten MstII (New England Biolabs) 16 Stunden bei 37ºC in 200 ul 150 mM NaCl, 12 mM Tris HCl (pH 7,5) 12 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreit (DTT) und 100 pg/ml Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) gespalten. Die Produkte wurden mit pBR328 : HbA/MstII bzw. pBR328 : HbS/MstII bezeichnet.

III. Polymerasekettenreaktion

Zu 100 ul eines aus 60 mM Natriumacetat, 30 mM Tris- Acetat und 10 mM Magnesiumacetat bestehendem Puffer mit pH 8,0 wurden 2 ul einer Lösung gegeben, die 100 pMol Primer A (mit der Sequenz d(CACAGGGCACTAACG)), 100 pMol Primer B (mit der Sequenz d(TTTGCTTCTGACACA)) und je 1000 pMol dATP, dCTP, dGTP und TTP enthielt. Außerdem wurde eine der vorstehend beschriebenen und nachfolgend aufgeführten DNA-Quellen zugegeben:
10 ug menschliche Wild-Typ-Gesamt DNA (Reaktion I)
0,1 pMol pBR328 : HbA (Reaktion II)
0,1 pMol pBR328 : HbS (Reaktion III)
0,1 pMol pBR328 : HbA/MstII (Reaktion IV)
0,1 pMol pBR328 : HbS/MstII (Reaktion V)
Keine Ziel-DNA (Reaktion VI).
Jede resultierende Lösung wurde 4 Minuten auf 100ºC erhitzt und dann zum Abkühlen auf Raumtemperatur 2 Minuten stehen gelassen, worauf 1 ul zugegeben wurde, der 4 Einheiten Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase enthielt. Jade Reaktion ließ man 10 Minuten ablaufen. Danach wurde der aus Zugabe von Primern, Nucleotiden und DNA, Erhitzen, Abkühlen, Zugabe von Poylmerase und Zulassen der Reaktion bestehende Zyklus neunzehnmal für die Reaktion I und viermal für die Reaktionen II bis VI wiederholt.
Vier ul Aliquots aus den Reaktionen I und II, die vor dem ersten Zyklus und nach dem letzten Zyklus jeder Reaktion entnommen wurden, wurden auf ein 12%iges Polyacrylamidgel in 0,089 M Tris-boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 und 2,5 mM EDTA aufgetragen. Das Gel wurde 4 Stunden bei 25 Volt/cm elektrophoretisiert, auf eine als Festphasen-Träger dienende. Nylonmenbran transferiert und mit einem synthetischen 5'-³²p markierten 40 bp-Fragment mit der Sequenz
5d(TCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAG)3',
das nach Standardverfahren hergestellt worden war, in 30% Formamid, 3 · SSPE, 5 · Denhardt's, 5% Natriumdodecylsulfat bei einem pH-Wert von 7,4 sondiert. Fig. 2 ist ein Autoradiogramm der mit der Sonde untersuchten Nylonmembran bezüglich der Reaktionen I und II. Spur 1 enthält als Kontrolle 0,1 pMol eines synthetischen 58 bp-Fragments, von dem ein Strang zu der oben genannten Sonde komplementär ist. Spur 2 enthält 4 ul von Reaktion 1 vor dem ersten Amplifikationszyklus. Spur 3 enthält 4 ul von Reaktion I nach dem 20. Amplifikationszyklus. Spur 4 enthält 4 ul von Reaktion 2 nach vier Amplifikationsschritten. Spur 5 enthält einen Molekulargewichtstandard, der aus einer mit α³²P-dNTPs und Polymerase markierten FokI- (New England Biolabs) Spaltung von pBR322 (New England Biolabs) besteht. Spur 3 zeigt, daß das Reaktionsgemisch I nach 20 Zyklen eine große Menge der spezifischen Sequenz mit dem korrekten Molekulargewicht und keine anderen nachweisbaren Produkte entielt. Das Reaktionsgemisch II entielt wie durch Spur 4 gezeigt, ebenfalls dieses Produkt neben der Ausgangsnucleinsäure und anderen Produkte.
Zu 5,0 ul Aliquots der Reaktionen II-VI wurden nach dem vierten Zyklus je 5 pMol der vorstehend beschriebenen Primers gegeben. Die Lösungen wurden 4 Minuten auf 100ºC erhitzt und dann stehengelassen, bis sie Raumtemperatur angenommen hatten. Es wurden je 3 pMol α-³²P-dATP, α-³²P- dCTP, α-³²P-dGTP und α-³²P-TTP und vier Einheiten Klenow- Fragment zugegeben. In einem Endvolumen von 10 ul und bei den vorstehend angegebenen Salzkonzentrationen wurde 10 Minuten umgesetzt. Die Polymeraseaktivität wurde durch 20 Minuten Erhitzen auf 60ºC beendet. 4 ul Aliquots der Reaktionen II bis VI wurden auf ein 12%iges Polyacrylamidgel in 0,089 M Tris-boratpuffer bei pH 8,3 mit 2,5 mM EDTA aufgetragen. Das Gel wurde 4 Stunden bei 25 Volt/cm elektrophoretisiert. Danach wurde eine Autoradiographie durchgeführt.
Fig. 3 ist eine Autoradiographie der Elektrophorese. Spur 1 ist ein Molekulargewichtstandard, Spur 2 ist die Reaktion II, Spur 3 ist die Reaktion III, Spur 4 ist die Reaktion IV, Spur 5 die Reaktion V. Eine weitere Spur für die Reaktion VI ohne DNA (als Kontrolle) zeigt kein Abild irgend einer anderen Spur. Aus der Figur läßt sich ersehen, daß das aus der Zielsequenz heraus vorhergesagte 94 bp- Fragment nur vorhanden war, wenn intakte β-Globin-DNA- Sequenzen, d. h. pBR328 : HbA (Spur 2), pBR328 : HbS (Spur 3) und pBR328 : HbS/MstII (Spur 5) zur Amplifikation zur Verfügung standen. Ein MstII-Verdau spaltet pBR328 : HbA in der 94-mer- Sequenz und macht damit ihre Amplifikation unmöglich, und die 94-mer-Bande erscheint nicht in, Spur 4. In pBR328 : HbS dagegen wird die 94-mer-Sequenz nicht gespalten, wenn das Plasmid mit MstII verdaut wird, und steht somit, wie in Spur 5 gezeigt, zur Amplifikation zur Verfügung.
Fig. 4 veranschaulicht die Kettenreaktion für drei Zyklen der Amplifikation der 94 bp-Sequenz. PCO1 und PCO2 sind die Primer A und B. Die Zahlen auf der rechten Seite geben die Zyklen an, wohingegen die Zahlen auf der linken Seite die Anzahl der Zyklen angeben, in denen ein spezielles Molekül produziert worden war.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht die Amplifikation einer 110 bp-Sequenz, die die allelische MstII-Stelle im menschlichen Hämoglobingen überspannt.
Eine Gesamtmenge von 1,0 ug menschlicher Gesamt-DNA, 100 pMol d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) und 100 pMol d(CAACTTCATCCACGTTCACC) - die Primer sind nach dem Verfahren von Beispiel 2 hergestellt worden - wurden in 100 ul einer Lösung aufgenommen, die sich zusammensetzte aus:
je 1,5 mM der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate
30 mM Trisacetatpuffer bei pH 7,9
60 mM Natriumacetat
10 mM Magnesiumacetat
0,25 mM Dithiothreit.
Die Lösung wurde 1 Minute auf 100ºC erhitzt und dann 1 Minute schnell auf 25ºC gebracht. Danach wurden 2,5 Einheiten Klenow-Fraqment von DNA-Polymerase zugegeben. Die Polymerasereaktion wurde 2 Minuten bei 25ºC durchgeführt, wonach der aus Erhitzen, Abkühlen, Hinzufügen von Klenow- Enzym und Zulassen der Reaktion bestehende Zyklus so oft wie gewünscht wiederholt wurde.
Mit einer 70%igen Effizienz in jedem Zyklus ergaben 15 Zyklen eine Synthese von 1,4 Femtomol des gewünschten 110 bp-Fragmentes des β-Globingens.

Beispiel 4

Dieses Beispiel veranschaulicht die Amplifikation einer 240 bp-Sequenz, die die allelische MstII-Stelle des menschlichen Hämoglobingens überspannt. Diese Sequenz enthält NcoI-, HinfI- und MstII-Restriktionsstellen.
Zu 100 ul eines Gemisches von 60 mM Natriumacetat, 30 mM Tris-Acetat und 10 mM Magnesiumacetat (pH-Wert 8,0), in dem 0,1 pMol pBR328 : HbA enthalten waren, wurden 2 ul der Lösung A gegeben, die
100 pMol d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) Frimer,
100 pMol d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC) Primer,
je 1000 pMol dATP, dCTP, dGTP und TTP
enthält.
Die beiden Primer wurden nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Lösung wurde 4 Minuten auf 100ºC erhitzt und 2 Minuten an der Luft (mit Raumtemperatur) abgekühlt, wonach 1 ul mit vier Einheiten Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase zugegeben wurden. Die Reaktion ließ man 10 Minuten ablaufen, wonach der aus Zugabe von Lösung A, Erhitzen, Abkühlen, Polymerasezugabe und Zulassen der Reaktion bestehende Zyklus dreimal wiederholt wurde, Zu einem 5 ul Aliquot der Reaktionen wurden je 5 pMol der oben beschriebenen Oligonucleotid- Primer gegeben. Die Lösung wurde 4 Minuten auf 140ºC erhitzt und dann zum Abkühlen auf Raumtemperatur stehen gelassen, wonach je 3 pMol der α-³²P-markierten Desoxyribonucleosidtriphosphate und 4 Einheiten Klenovi- Fragment zugegeben wurden. Die Reaktion mit einem Endvolumen von 10 ul und einer wie vorstehend angegebenen Salzkonzentration ließ man 10 Minuten ablaufen. Die Polymeraseaktivität wurde durch 20 Minuten Erhitzen auf 60ºC beendet. 2 ul Aliquots wurden mit NcoI, MstII oder HinfI gespalten und auf ein 12%iges Polyacrylamidgel in 0,089 M Tris-Boratpuffer mit einem pH-Wert von 8,3 und mit 2,5 mM EDTA aufgetragen. Das Gel wurde 4 Stunden mit 25 Volt/cm elektrophoretisiert, und eine Autoradiographie wurde durchgeführt. Fig. 5 zeigt die Autoradiographie der Elektrophorese. Spur 1 ist ein Molekulargewichtsstandard, Spur 2: ohne Spaltung durch ein Enzym (intakte 240 bp), Spur 3 ist eine Spaltung mit NcoI (131 und 109 bp), Spur 4 eine Spaltung mit MstII (149 und 91 bp) und Spur 5 eine Spaltung mit HinfI (144 und 96 bp). Die Autoradiographie ist konsistent mit der Amplifikation der 240 bp-Sequenz.

Beispiel 5

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis der Sichelanämie durch sequentielle Spaltung.

Synthese und Phosphorylierung von Oligodesoxyribonucleotiden

Die markierte DNA-Sonde RS06 mit der Sequenz:
5' * CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 3',
wobei * die Markierung angibt und das unmarkierte Blockierungs-Oligomer RS10 mit der Sequenz
3' GACAGAGGTCACCTCTTCAGACGGCAATGACGGGACACCC 5',
das gegenüber RS06 drei nicht passende Basenpaare aufweist, wurden nach den in Beispiel 2 (I) bereitgestellten Verfahren synthetisiert. Die Sonde RS06 wurde durch Zusammengeben von 5 pMol davon mit 4 Einheiten T4 Polynucleotidkinase (New England Biolabs) und 50 pMol ³²p-ATP (New England Nuclear, ungefähr 7200 Ci/mMol) und 90 Minuten Inkubieren bei 37ºC in einem 40 ul Reaktionsvolumen, das 70 mM Tris-Puffer (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 1,5 mM Spermin und 2,5 mM Dithiothreit enthielt, markiert. Das Gesamtvolumen wurde dann mit 25 mM EDTA auf 100 ul gebracht und nach dem Verfahren von Maniatis et al., Molecular Cloning (1982), 464-465 über eine 1 ml Bio Gel P-4-Zentrifugations-Dialyse-Säule (spin dialysis column) von BioRad gereinigt, die mit Tris-EDTA (TE-)Puffer (10 mM Tris-Puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert war. Die markierte Sonde wurde weiter durch Elektrophorese in einem 18%igen Polyacrylamidgel (19 : 1 Acrylamid : BIS, BioRad) in Tris-Borsäure-EDTA-(TBE-) Puffer (89 mM Tris, 89 mIN Borsäure, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) bei 500 Volt Stunden elektrophoretisiert. Nach dem Lokalisieren durch Autoradiographie wurde der die markierte Probe enthaltende Teil des Gels ausgeschnitten, zerquetscht und über Nacht bei 4ºC in 0,2 ml TE-Puffer eluiert. TCA- (trichloric acid, Trichloressigsäure-) Fällung des Reaktionsproduktes zeigt, daß die spezifische Aktivität 4,9 Ci/mMol betrug, und die Endkonzentration 20 pMol/ml war. Das unmarkierte RS10-Blockierungs-Oligomer wurde bei einer Konzentration von 200 pMol/ml verwendet.

Isolieren menschlicher genomischer DNA aus Zellinien

Genomische DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus den Lymphoid-Zellinien Molt4, SC-1 und GM2064 im wesentlichen nach dem Verfahren von Stetler et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 79 (1982), 5966-5970 (bei Molt4) und Maniatis et al., Molecular Clonincr (1982), 280-281 isoliert.
Molt4 (Human Mutant Cell Repository, GM2219C) ist eine für normales 8-Globin homozygote T-Zellinie, und die am 19. März 1985 bei der ATCC hinterlegte SC-1 ist eine EBVtransformierte B-Zellinie, die für die Sichelzellallele homozygot ist. GM2064 (Human Mutant Cell repository, GM2064) würde ursprünglich aus einer individuellen für erbliche Persistenz von fötalem Hämoglobin (hereditary persistance of fetal hemoglobin, HPFH) isoliert und enthält keine- oder δ- Globingensequenzen. Alle Zellinien wurden in RPMI-1640 mit 10% fötalem Kälberserum gehalten.

Isolieren menschlicher genomischer DNA aus klinischen Blutproben

Eine mit CH12 bezeichnete klinische Blutprobe von einem bekannten Sichelzell-Träger (AS) wurde von Dr. Bertram Lubin vom Kinderkrankenhaus in Oakland, Kalifornien erhalten. Genomische DNA wurde aus der "buffy coat"- Fraktion, die sich hauptsächlich aus peripheren Blutlymphocyten zusammensetzt, unter Anwendung einer Modifikation des von Nunberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75 (1978), 5553-5556 beschriebenen Verfahrens präpariert.
Die Zellen wurden in 5 ml Tris-EDTA-NaCl-(TEN)-Puffer (10 mM Tris-Puffer (pH 8), 1 mM EDTA, 10 mM NaCl) suspendiert und auf 0,2 mg/ml Proteinase K und 0,5% SDS eingestellt und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Dann wurde Natriumperchlorat zugegeben, bis ein Wert von 0,7 M erreicht war, und das Lysat wurde 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur sanft geschüttelt. Das Lysat wurde mit 30 ml Phenol/Chloroform (1 : 1), dann mit 30 ml Chloroform extrahiert. Dem folgte eine Ethanolpräzipitation der Nucleinsäuren. Das Sediment wurde in 2 ml TE-Puffer resuspendiert, und RNase A bis zu einem Wert von 0,005 mg/ml zugegeben. Nach einem einstündigen Verdau bei 37ºC wurde die DNA je einmal mit gleichen Volumina Phenol, Phenol/Chloroform und Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde in 0,5 ml TE-Puffer resuspendiert und die Konzentration wurde durch die Absorption bei 260 nm bestimmt.

Polymerasekettenreaktion zur selektiven Amplifikation von β-Globinsequenzen

2 ug genomische DNA wurden in einem Anfangs- Reaktionsvolumen von 100 ul, in dem 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, 150 pMol des Primers A mit der Sequenz d(CACAGGGCACTAACG) und 150 pMol des Primers B mit der Sequenz d(CTTTGCTTCTGACACA) enthalten waren, und das mit ungefähr 100 ul Mineralöl zum Verhindern einer Verdampfung überschichtet war, amplifiziert.
Jede DNA-Probe wurde 15 Amplifikationszyklen unterzogen, wobei sich ein Zyklus aus drei Schritten zusammensetzte:
1) 2 Minuten denaturieren in einem auf 95ºC eingestellten Heizblock.
2) Unmittelbarer Transfer in einen auf 30ºC eingestellten Heizblock für 2 Minuten um den Primern und der genomischen DNA zu erlauben, sich aneinanderzulagern.
3) Zugabe von 2 ul einer Lösung, die 5 Einheiten Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase 1 (New England Biolabs), je 1 nMol dATP, dCTP, dGTP und dTTP in einem aus 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2; und 4 mM Dithiothreit zusammengesetzten Puffer enthielt. Diese Verlängerungsreaktion wurde 10 Minuten bei 30ºC durchgeführt.
Nach dem letzten Zyklus wurde die Reaktion durch 2 Minuten Erhitzen auf 95ºC beendet. Das Mineralöl wurde mit 0,2 ml Chloroform extrahiert und verworfen. Das End- Reaktiosvolumen betrug 130 ul.

Hybridisierung/Spalten von amplifizierter genomischer DNA mit Sonden und DdeI/HinfI

45 ul der amplifizierten genomischen DNA wurden mit Ethanol gefällt und in einem gleichen Volumen von TE-Puffer resuspendiert. 10 ul (die das Vor-Amplifikationsäquivalent von 154 ng genomischer DNA enthalten) wurden zu 20 ul TE- Puffer (ein Gesamtvolumen von 30 ul ergebend) in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß (Microfuge tube) gegeben. Die Probe wurde mit Mineralöl überschichtet und 10 Minuten bei 95ºC denaturiert. 10 ul 0,6 M NaCl, die 0,02 pMol markierter RS06-Sonde enthielten, wurden in das Reaktionsgefäß gegeben, vorsichtig gemischt und sofort für 1 Stunde in einen 560C-Heizblock transferiert. 4 ul unmarkiertes RS10-Blockierungs-Oligomer (0,8 pMol) wurden zugegeben und die Hybridisierung wurde weitere 10 Minuten bei derselben Temperatur fortgesetzt. 5 ul 60 mM MgCl&sub2;/0,1% BSA und 1 ul DdeI (10 Einheiten, New England Biolabs) wurden zugegeben und die wieder aneinandergelagerte DNA wurde 30 Minuten bei 56ºC gespalten. Dann wurde 1 ul HinfI (10 Einheiten, New England Biolabs) zugegeben und weitere 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Zugabe von 4 ul 75 mM EDTA und 6 ul Farbstoff (tracking dye) bis zu einem Endvolumen von 61 ul.
Das Mineralöl wurde mit 0,2 ml Chloroform extrahiert, und 18 ul des Reaktionsgemisches (45 ng genomische DNA) wurden auf ein 30%iges Polyacrylamid-Mini-Gel (19 : 1, Bio Rad) in einem Hoeffer SE200-Gerät aufgetragen. Das Gel wurde 1 Stunde bei ungefähr 300 Volt elektrophoretisiert, bis die Bromphenolblau-Farbstoff-Front 3 cm vom Auftragsort gewandert war. Die oberen 1,5 cm des Gels wurden entfernt und vom übrigbleibenden Gel wurde 4 Tage bei -70ºC mit einer Verstärkerfolie eine Autoradiographie angefertigt.

Diskussion der Photographie (Fig. 9)

Jede Spur enthält 45 ng der amplifizierten genomischen DNA. Die Spur A enthält Molt4-DNA; Spur B CH12; Spur C SC-1; und Spur D GM2064. Molt4 steht für den Genotyp eines normalen Individuums mit zwei Kopien des βA-Gens pro Zelle (AA), CH12 ist eine klinische Probe von einem Sichelzell-Träger mit einem βA und βS-Gen pro Zelle (AS), und SC-1 steht für den Genotyp eines Sichelzell-Individuums mit zwei Kopien des βS-Gens (SS) pro Zelle. GM2064, das keine β- oder δ-Globinsequenzen enthält, ist als negative Kontrolle vorhanden.
Wie die Photographie zeigt, ist das DdeI-gespaltene βA-spezifische Octamer nur in solchen DNAs vorhanden, die βA-Gene (Spuren A und B) enthalten, und das HinfI-gespaltene βS-spezifische Trimer ist nur in solchen DNAs vorhanden, die das βS-Gen enthalten (Spuren B und C). Die Anwesenheit sowohl des Trimers als auch des Octamers (Spur B) ist für einen Sichelzell-Träger diagnostisch, und läßt sich von einem normalen Individuum (Spur A) mit nur einem Octamer und einem Sichelzell-erkrankten Individuum (Spur C) mit nur dem Timer unterscheiden.
Zum Vergleich ergibt sich aus einer Wiederholung des vorstehend beschriebenen Experimentes unter Verwendung nicht-amplifizierter genomischer DNA, daß die Amplifikation die Empfindlichkeit des Nachweises mindestens 1000-fach erhöht.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt den direkten Nachweis eines vollkommen ungereinigten Einzelkopie-Gens in menschlicher Gesamt-DNA auf Gelen, ohne daß eine markierte Sonde gebraucht wird.
Mit der in Beispiel 3 beschriebenen Technik wurde ein 110 bp-Fragment aus einer Sequenz im ersten Exon des β- Globingens aus 10 ug der menschlichen Gesamt-DNA über 20 Zyklen amplifiziert. Dieses nach 20 Zyklen produzierte 110 bp-Fragment ließ sich auf mit Ethidiumbromid angefärbten Gelen leicht sichtbar machen.
Die Sequenz wurde nicht amplifiziert, wenn sie zuerst mit dem Restriktionsenzym Ddel gespalten wurde, außer wenn, wie beim β-Globin-S-Allel die Sequenz keine vom Enzym erkannte Restriktionsstelle enthielt.

Beispiel 7

A. Insgesamt 100 fMol des eine 1,9 kb Insertion von menschlichem β-Globin-A-Allel enthaltenden pBR328, je 50 nMol α-³²P-dNTP mit 500 Ci/Mol und je 1 nMol der in Beispiel 3 verwendeten Primer wurden in einer Lösung gelöst, die 100 ul 30 mM Tris-Atetat (pH 7,9), 60 mM Natriumacetat, 100 mM Dithiothreit und 100 mM Magnesiumacetat enthielt. Diese Lösung wurde 2 Minuten auf 100ºC gebracht und 1 Minute auf 25ºC abgekühlt. Insgesamt 1 ul, der 4,5 Einheiten Klenow- Fragment von E. coli DNA-Polymerase I und 0,09 Einheiten anorganischer Pyrophosphatase enthielt, wurde zugegeben, um eine mögliche Pyrophosphatansammlung im Reaktionsgemisch zu vermeiden. Die Reaktion ließ man 2 Minuten bei 25ºC ablaufen, wonach der aus Heizen, Abkühlen, Enzymzugabe und Reaktion bestehende Zyklus neunmal wiederholt wurde. Nach jedem Synthesezyklus wurden 10 ul Aliquots entnommen und zu 1 ul 600 mM EDTA gegeben. Jedes wurde auf einem 14%igem Polyacrylamidgel in 90 mM Tris-Borat (pH 8,3) und 2,5 mM EDTA 2,5 Stunden mit 24 Volt/cm analysiert. Das gesamte Gel wurde 20 Minuten im selben Puffer, dem 0,5 ug/ml Ethidiumbromid zugegeben waren, durchtränkt, mit dem Ausgangspuffers gewaschen und unter Verwendung eines Rotfilters im UV-Licht photographiert.
Das produzierte 110 bp-Fragment wurde aus dem Gel unter ultraviolettem Licht ausgeschnitten und das eingebaute ³²P durch Cerenkov-Strahlung gezählt. Ein Versuch, die Ergebnisse an eine Gleichung der Form: pMol/10 ul = 0,01 [(1 + y)N - yN - 1] anzupassen, wobei N die Anzahl der Zyklen und Y die fraktionelle Ausbeute pro Zyklus angibt, war optimal mit y = 0,619. Dies zeigt, daß eine nennenswerte Amplifikation stattfindet.
B. Das oben beschriebene Experiment wurde wiederholt, außer daß je 100 nMol dNTP zu einer 100 ul- Reaktion gegeben wurden. Es wurde keine radioaktive Markierung verwendet, und es wurden keine Aliquots nach jedem Zyklus entnommen. Nach 10 Zyklen wurde die Reaktion durch 2 Minuten Kochen beendet, und die Re-Hybridisierung, wurde 1 Stunde bei 57ºC durchgeführt. Die Sequenz des 110 bp-Produktes wurde bestätigt durch Restriktionsanalyse von 8 ul Aliquots durch Zugabe von 1 ul Rinderserumalbumin (25 mg/ml) und 1 ul des geeigneten Restriktionsenzyms (HinfI MnlI, MstII, NcoI) und durch 15stündige Reaktion bei 37ºC. Eine PAGE wurde tue vorstehend beschrieben durchgeführt.

Beispiel 8

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung verschiedener Primer zur Amplifikation verschiedener Fragmente von pBR328 und 322.
A. Das in Beispiel 7A beschriebene Experiment wurde wiederholt außer, daß die folgenden Primer verwendet wurden:
d(TTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) und
d(GCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACC),
um ein 130 bp-Fragment von pBR328 zu produzieren.
B. Das in Beispiel 7A beschriebene Experiment wurde wiederholt, außer daß zur Produktion eines 262 bp-Fragmentes von pBR328 die folgenden Primer verwendet wurden:
d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) und
d(TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG).
Die Reaktionszeit pro Zyklus betrug 20 Minuten.
C. Das in Beispiel 8B beschriebene Experiment wurde wiederholt, außer daß als Ausgangsmatrize 100 fMol der- MstII-Spaltung von pBR328 verwendet wurden, das eine 1,9 kb- Insertion aus dem menschlichen β-Globin-S-Allel enthielt. Dieses Plasmid wurde mehrmals durch MstII gespalten, aber nicht innerhalb der zu amplifizierenden Sequenz. Außerdem wurden die folgenden Primer verwendet:
d(GGTTGGCCAATCTACTCCCAGG) und
d(TAACCTTGATACCAACCTGCCC),
um ein 240 bp-Fragment zu produzieren.
D. Das in Beispiel 7B beschriebene Experiment wurde wiederholt, außer daß als Matrize 100 fMol von mit NruI gespaltenem pBR322 verwendet wurden. Je 200 nMol dNTPs wurden in einer 100 ul-Reaktion verwendet, und die Primer zur Produktion eines 500 bp-Fragmentes von pBR322 waren:
d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) und
d(CTTCCCCATCGGTGATGTCG).
Die Reaktionszeit pro Zyklus betrug bei 37ºC 20 Minuten. Die Re-Hybridisierung am Ende wurde 15 Stunden bei 57ºC durchgeführt. Elektrophorese wurde auf einem 4%igem Agarosegel vorgenommen.

Beispiel 9

Dieses Beispiel veranschaulicht das erfindungsgemäße Verfahren, wobei eine in vitro Mutation in den amplifizierten Abschnitt eingeführt wird.
A. Insgesamt wurden 1 fMol von mit NruI liniarsiertem pBR322, je 100 nMol der Primer:
d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) und
d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT),
die zur Produktion eines 75 bp-Fragments entworfen waren, je 100 nMol dNTP in 100 ul 40 mM Tris (pH 8), 20 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreit und 5 mg/ml Rinderserumalbumin zusammengegeben.
Das Gemisch wurde 1 Minute auf 100ºC gebracht und 1/2 Minute in einem Wasserbad mit 23ºC gekühlt. Danach wurden 4,5 Einheiten Klenow-Fragment und 0,09 Einheiten anorganische Phosphatase zugegeben, und es wurde eine Reaktion von 3 Minuten zugelassen. Der aus Erhitzen, Kühlen, Zugabe der Enzyme und Reaktion bestehende Zyklus wurde 9 mal wiederholt. Der zehnte Zyklus wurde durch Einfrieren beendet und ein 8 ul-Aliquot des Reaktionsgemisches wurde auf ein 4%iges Agarosegel gegeben und das Material wurde mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
B. Das in Beispiel 9A beschriebene Experiment wurde wiederholt, außer daß die Oligonucleotid-Primer:
d(CGCATTAAAGCTTATCGATG) und
d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT)
verwendet wurden. Diese Primer sind so entworfen, daß ein 101 bp-Fragment produziert wird. 26 Nucleotide davon (im zweiten aufgeführten Primer) sind in pBR322 nicht vorhanden. Diese Nucleotide stellen die Sequenz des T7-Promotors dar, die an die 75 bp-Sequenz von pBR322 durch Verwendung des Primers mit 20 komplementären Basen und einer 26 bp 5'- Verlängerung angeheftet wurde. Das Verfahren benötigte weniger als 2 Stunden, und es wurden 2 pMol des relativ reinen 101 bp-Fragments aus 100 fMol pBR322 erhalten.
Der T7-Promotor läßt sich zur Initiation von RNA- Transkription verwenden. T7-Polymerase kann zum 101 bp- Fragment gegeben werden, um einzelsträngige RNA zu produzieren.
C. Das in Beispiel 8D beschriebene Experiment wurde wiederholt, außer daß die folgenden Oligonucleotid-Primer
d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) und
d(CCAGCAAGACGTAGCCCAGC)
zur Produktion eines 1000 bp-Fragments von pBR322 verwendet wurden.
D. Das in Beispiel 9C beschriebene Experiment wurde wiederholt, außer daß die folgenden Oligonucleotid-Primer
d(TAGGCGTATCACGAGGCCCT) und
d(AATTAATACGACTCACTATAGGGAGATAGGCGTATCACGAGGCCCT)
zur Produktion eines 1026 bp-Fragments verwendet wurden. 26 Nucleotide davon (im zweiten aufgeführten Primer) sind in pBR322 nicht vorhanden und stellen den oben beschriebenen T7-Promotor dar. Der Promotor ist neben ein 1000 bp-Fragment von pBR322 inseriert worden.
Die Ergebnisse zeigen, daß ein zur Matrizensequenz nicht perfekt passender Primer, der aber nichtsdestoweniger genügend hybridisieren kann, um enzymatisch verlängert zu werden, ein langes Produkt produziert, das anstelle der korrespondierenden Sequenz der Ausgangsmatrize die Sequenz des Primers enthält. Das lange Produkt dient als eine Matrize für den zweiten Primer zur Einführung einer in vitro-Mutation. In weiteren Zyklen wird diese Mutation mit einer unverminderten Effizienz amplifiziert, da keine weiteren basen-ungepaarten Primer-Initiationen benötigt werden. In diesem Fall wurde ein an seinem 5'-Ende eine nicht-komplementäre Verlängerung tragender Primer verwendet, um eine neue Sequenz in das Produkt neben der zu kopierenden Matrizensequenz zu inserieren.

Beispiel 10

Dieses Beispiel veranschaulicht die Verwendung von verschachtelten Sätzen (nested sets) von Primern, um die Nebenprodukte bei der Amplifikation von in nur einer Kopie vorkommenen Genen zu vermindern.
Für Wildtyp-β-Globingene homozygote menschliche Gesamt-DNA wurde folgendermaßen 20 Amplifikationszyklen unterworfen: Insgesamt 10 ug DNA, je 200 pMol der Primer
d(ACACAACTGTGTTCACTAGC) und
d(CAACTTCATCCACGTTCACC)
und je 100 nMol dNTPs in 100 ul 30 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 60 mM Natriumacetat, 10 mM Dithiothreit und 10 mM Magnesiumacetat wurden 1 Minute auf 100ºC erhitzt, 1 Minute auf 25ºC abgekühlt und 2 Minuten mit 2 Einheiten Klenow- Fragment behandelt. Der aus Erhitzen, Abkühlen und Zugabe von Klenow-Enzym bestehende Zyklus wurde 19 mal wiederholt ul 10 ul Aliquot wurde dem Reaktionsgemisch entnommen und weiteren 10 Amplifikationszyklen unterworfen unter Verwendung der beiden Primer:
d(CAGACACCATGGTGCACCTGACTCCTG) und
d(CCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCC),
die ein im vorstehend produzierten 110 bp-Fragments enthaltenes 58 bp-Fragment amplifizieren. Diese letzten 10 Amplifikationszyklen wurden erreicht durch Verdünnen des 10 ul Aliquots mit 90 ul des frischen oben beschriebenen Tris- Acetatpuffers, der je 100 nMol dNTPs und je 200 pMol der Primer enthielt. Die Reaktionsbedingungen waren wie oben beschrieben. Nach 10 Zyklen wurde ein 10 ul Aliquot (das mit 100 ng der ursprünglichen DNA korrespondiert) auf ein 6prozentiges NuSieve- (FMC Corp.) Agarosegel aufgetragen, und das Material wurde unter Verwendung von Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Fig. 10 zeigt dieses mit UV-Licht angeleuchtete und durch ein Rotfilter in bekannter Weise fotographierte Gel. Spur 1 enthält Molekulargewichtsmarker. Spur 2 ist ein Aliquot der oben beschriebenen Reaktion. Spur 3 ist ein Aliquot einer zu der oben beschriebenen identischen Reaktion, außer, daß die ursprüngliche Wildtyp-DNA vor der Amplifikation mit DdeI gespalten worden war. Spur 4 ist ein Aliquot einer zu der vorstehend beschriebenen identischen Reaktion, außer daß die für Sichel-ß-Globinallele homozygote menschliche DNA vor der Amplifikation mit DdeI gespalten worden war (das Sichelzellenallel enthält in dem hier amplifizierten Fragment keine DdeI-Stelle). Spur 5 ist ein Aliquot einer mit der vorstehend beschriebenen identischen Reaktion, außer daß menschliche DNA durch Lachsspermien-DNA ersetzt worden war. Spur 6 ist ein Aliquot einer mit der vorstehend beschriebenen identischen Reaktion, außer daß das Aliquot nach der Amplifikation mit DdeI behandelt wurde (Ddel sollte das 58 bp-Wildtyp-Produkt in 27- und 31 bp- Fragmente überführen). Spur 7 ist ein Aliquot vom Material von Spur 4, das nach Amplifikation mit DdeI behandelt wurde (das 58 bp Sichelprodukt enthält keine DdeI-Stelle).
Der Nachweis eines 58 bp-Fragments, das für ein Einzelkopie-Gen repräsentativ ist, aus 1 ug menschlicher DNA unter der alleinigen Verwendung einer Ethidiumbromidanfärbung eines Agarosegels benötigt eine ungefähr 500000- fache Amplifikation. Dies wurde hier erreicht durch Verwendung der beiden verschachtelten Sätze (nested sets) von Oligonucleotid-Primern. Der erste Satz amplifiziert das 110 bp-Fragment, und der innenliegende Satz amplifiziert ein Subfragment dieses Produktes, auf das in Fig. 10 gezeigte Maß für einen bequemen Nachweis. Dieses Verfahren, Primer zum Amplifizieren einer kleineren Sequenz zu verwenden, die innerhalb der im vorangehenden Amplifikationsverfahren amplifizierten Sequenz und in den Verlängerungsprodukten der anderen Primer enthalten ist, erlaubt es, den Wildtyp vom Sichelallel am β-Globinlocus zu unterscheiden, ohne Gebrauch zu machen von einem Hybridisierungsverfahren mit einer Radioisotopen- oder einer Nicht-Radioisotopen Sonde, wie bei Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 278 und Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 4045 beschrieben.

Beispiel 11

Man erwartet, daß das vorliegende Verfahren dazu nützlich ist, unter Verwendung einer die gewünschte amplifizierte Sequenz überspannenden biotinylierten Hybridisierungssonde und unter Verwendung des im US-Patent 4,358,535 (siehe oben) beschriebenen Verfahrens, eine spezifische mit einer Infektionskrankheit assoziierte Sequenz wie z. B. Chlamydia in einer DNA-Probe eines Patienten nachzuweisen. Die biotinylierte Hybridisierungs- Sonde kann durch Interkalation und Bestrahlung einer partiell doppelsträngigen DNA mit einem 4'-Methylensubstituierten 4,5'-8-Trimethylpsoralen, das über einen Abstandsarm (spacerarm) mit der Formel
mit dem Biotin verknüpft ist, wobei Y ein O, NH oder N-CHO, x eine Zahl von 1 bis 4 und y eine Zahl von 2 bis 4 ist. Ein Nachweis der Biotinylgruppen auf der Sonde läßt sich durch Verwendung eines von Enzo Biochem Inc. käuflich erhältlichen Streptavidin-Saure Phosphatase-Komplexes nach den vom Hersteller in seiner Broschüre vorgeschlagenen Prozeduren erreichen. Die hybridisierende Sonde ist als Fleck präzipitierten Farbstoffs zu erkennen, der durch die Bindung des Nachweis-Komplexes und der nachfolgenden durch Saure Phosphatase katalysierten Reaktion, die einen präzipitierbaren Farbstoff produziert, hervorgerufen wird.

Beispiel 12

In diesem Beispiel wurde im wesentlichen das Verfahren nach Beispiel 7 zur Amplifikation eines 119 bp- Fragments des menschlichen β-Hämoglobingens unter Verwendung der Primer:
5'-CTTCTGcagCAACTGTGTTCACTAGC-3' (GH18)
5'-CACaAgCTTCATCCACGTTCACC-3' (GH19)
angewandt, wobei die kleinen Buchstaben Fehlpaarungen zur Wild-Typ-Sequenz für die Erzeugung von Restriktionsenzym- Stellen kennzeichnen. Das vollständige Schema ist in Tabelle I gezeigt. Tabelle I zeigt ein Diagramm der Primer GH18 und GH19, die zur Clonierung und zum Sequenzieren eines 119 bp- Fragmentes des menschlichen β-Globingens verwendet werden, und die so entworfen sind, daß sie interne Restriktionsstellen enthalten. Das Startcodon ATG ist unterstrichen. GH18 ist ein zum negativen Strang komplementäres 26 Basen-Oligonucleotid und enthält eine interne PstI-Stelle. GH19 ist ein zum Plus-Strang komplementäres 23 Basen Oligonucleotid und enthält eine interne Hindill Erkennungssequenz. Pfeile kennzeichnen die Richtung der Verlängerung durch DNA-Polymerase I. Die eingerahmten Sequenzen geben die Restriktionsenzym- Erkennungssequenzen jedes Primers an. Diese Primer wurden durch ein erstes Absuchen der Bereiche des Gens nach Homologie mit PstI und HindIII Restriktionsstellen des Bacteriophagen M13 ausgewählt. Die Primer wurden dann, wie in früheren Beispielen beschrieben, hergestellt. Tabelle 1

Amplifikation und Clonierung

Nach 20 Amplifikationszyklen von 1 ug menschlicher aus der Zellinie Molt 4 nach Beispiel 2 isolierter genomischer DNA wurde 1/14 des Reaktionsproduktes nach den vorstehend für Oligomer-Restriktion beschriebenen Verfahren gegen die markierte β-globin-spezifische Oligonucleotid- Sonde RS06 mit der Sequenz
5'-CTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG-3'
hybridisiert. Nach der Hybridisierung in Lösung wurde das Reaktionsgemisch unter Bedingungen für eine Restriktions- Spaltung wie oben beschrieben, mit Ddel behandelt, um ein 8 Basenpaar-Oligonucleotid zu produzieren. Die Menge dieses 8 Basenpaar-Produktes ist zu der Menge des produzierten amplifizierten Produktes proportional. Die Spaltprodukte wurden auf einem 30%igen Polyacrylamidgel aufgetrennt und durch Autoradiographie sichtbar gemacht.
Die Analyse des Autoradiogramms ergab, daß die Amplifikationseffizienz mit der Amplifikation mit den Primern PCO&sub3; (5'-ACACAACTGTGTTCACTAGC-3') und PCO4. (5'-CCACTTGCACCTACTTCAAC-3'), die zum negativen bzw. positiven Strang des Wildtyp-β-Globins komplementär sind, vergleichbar war.
Das amplifizierte Produkt wurde zum Entsalzen und Konzentrierten der Probe mit Ethanol gefällt, in einem Restriktionspuffer mit 10 mM Tris, pH 8,10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 100 mM NaCl aufgenommen und simultan mit PstI und HindIII gespalten. Nach der Spaltung wurde die Probe mit einem Centricon 10-Konzentrator entsalzt und über Nacht bei 12ºC mit 0,3 ug des mit PstI/HindIII gespaltenen Vektors M13mp10w, ligiert, der von Boehringer-Mannheim erhältlich ist.
Der E. coli Stamm JM103, der von BRL in Bethesda, MD, erhältlich ist, wurde mit dem gesamten Ligationsgemisch transformiert. Die zur Herstellung des transformierten Stammes angewandte Prozedur ist bei J. Messing (1981), Third Cleveland Symposium on Macromolecules : Recombinant DNA, Herausgeber A. Walton, Elsevier, Amsterdam, 143-153 beschrieben.
Das Transformationsgemisch wurde auf x-gal-Medium zum Screening über Plaque-Hybridisierung mit Hilfe von Nylon- Filtern plattiert. Die Filter wurden mit der β-Globin- spezifischen Oligonucleotid-Sonde RS24 mit der Sequenz 5'-CCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAG-3' getestet, um die Anzahl der β-Globininsertionen zu bestimmten. Die Filter wurden dann erneut mit dem Filter PCO4 getestet, um die Gesamtanzahl von Insertionen zu bestimmen.

Plattieren und Screening

Tabelle II faßt die Plattierungs- und Plaque- Hybridisierungsergebnisse zusammen. Die Filter wurden mit dem Primer PCO4 untersucht, um den Prozentsatz der Insertionen zu bestimmen, der sich aus der Amplifikation und der Clonierung ergibt; 1206 klare Plaques (90% der Gesamtzahl klarer Plaques) hybridisierten mit dem Primer. 15 Plaques hybridisierten mit der β-Globin-spezifischen Sonde RS24. Der Prozentsatz der β-Globin-positiven Plaques unter den amplifizierten primer-positiven Plaques ist ungefähr 1 %. Tabelle II
Prozentsatz der amplifizierte Sequenzen enthaltenden Plaques, die eine β-Globininsertion enthalten = 15/1206 · 100 = 1,24%
% aller Plaques, die eine β-Globininsertion enthalten = 15/1496 · 100 = ca. 1%
% der Gesamtplaques, die amplifizierte Sequenzen enthalten = 1206/1496 · 100 = 0,8%
* Klare Plaques, die nicht mit dem Primer PCO4 hybridisieren
** Klare Plaques, die mit dem Primer PCO4 hybridisieren

Restriktionsenzyme und Southern-Blot-Analyse

DNA aus Phagen DNA-Minipräparationen von drei β- globin-positiven und zwei β-globin-negativen (aber PCO&sub4; primer-positiven) Plaques wurde durch Restriktionsenzym- Analyse untersucht. Eine MstII-Spaltung der DNA aus M13- Clonen, die das amplifizierte β-Globin-Fragment enthalten, sollte ein charakteristisches 283 Basenpaar-Fragment erzeugen. Durch die MstII-Spaltung produzierten alle drei β- globin-positiven Clone das vorausgesagte 283 Basenpaar- Fragment, während die beiden Clone, die nur bezüglich des Primers positiv waren, größere Fragmente produzierten.
Das Gel dieser Analyse wurde auf ein MSI-Nylonfilter transferiert und mit einer radioaktiv markierten "nicktranslatierten" β-Globin-Sonde hybridisiert, die nach Standard "Nick-Translations"-Verfahren hergestellt wurden, wie es bei Rigby et al., J. Mol. Biol. 113 (1977), 237-5 V beschrieben worden ist. Die einzigen mit der β-Globin-Sonde hybridisierenden Banden waren die drei β-globin-positiven Clone. Die beiden anderen Clone besaßen Insertionen, die mit der β-Globin-Sonde nicht hybridisierten.

Sequenzanalyse

Zehn β-globin-positive Clone, von denen durch Restriktionsenzym-Analyse gezeigt worden war, daß sie die β- Globininsertion enthielten, wurden unter Anwendung des M13- Didesoxy-Sequenzierungsverfahren sequenziert. Neun der zehn Clone waren mit der β-Wildtyp-Sequenz identisch. Der andere Clon war mit dem δ-Globingen identisch, von dem gezeigt worden war, daß es lediglich in einem kleinen Ausmaß von dem β-Globinprimern amplifiziert wird.
Man kann schlußfolgern, daß die modifizierten Linker- Primer beinahe ebenso effizient bei der Amplifikation der β- Globinsequenz waren, wie die unmodifizierten Primer. Die Primer waren in der Lage, das Inserieren amplifizierter DNA in Clonierungsvektoren zu erleichtern. Wegen der Amplifikation anderer Abschnitte des Genoms enthielten nur 1 % der Clone Hämoglobinsequenzen.
Es wurde festgestellt, daß neun der zehn Clone mit der publizierten β-Globin-Sequenz identisch waren, was zeigte, daß das Verfahren genomische DNA mit einer hohen Genauigkeit amplifiziert. Es wurde festgestellt, daß einer der Clone mit der publizierten δ-Globinsequenz identisch war, wodurch bestätigt wurde, daß die Primer für das β- Globin-Gen spezifisch waren, obwohl sie eine nennenswerte Sequenzhomologie mit dem δ-Globin aufwiesen.
Wenn die Clonierung mit einem 267 Basenpaar-Fragment des β-Globingens ausgeführt wurde, war die Clonierung nur dann effektiv, wenn Dimethylsulfoxid während der Amplifikationsprozedur anwesend war (10 Vol.-% bei 37ºC).
Restriktionsstellen-modifizierte Primer wurden ebenfalls zur Amplifikation und Clonierung und partiellen Sequenzierung des menschlichen N-ras-Oncogens und zur Clonierung von 240 Basenpaar-Abschnitten der HLA DQ-α- und DQ-β-Gene verwendet. All diese Amplifikationen würden in Gegenwart von 10 Vol.-% Dimethylsulfoxid bei 37ºC ausgeführt. Die Primer für die Amplifikation von HLA DQ-α- und DQ-β-Genen waren viel spezifischer bezüglich ihrer beabsichtigten Ziele als die β-Globin- und DR-β-Primer, die auf einem mit Ethidiumbromid angefärbten Agarosegel nur zu einer verschmierten statt zu einer diskreten Bande führten. Außerdem produzierten die HLA DQ-α-Primer bis zu 20% der Clone mit amplifizierten Insertionen, die das gewünschte HLA-Zielfragment enthielten, wohingegen 1% der β-Globin- Clone die Zielsequenz enthielten. Das Clonieren der HLA DQ- α- und DQ-β-Gene war nur effektiv, wenn DMSO vorhanden und die Temperatur erhöht war.

Beispiel 13

Dieses Beispiel veranschaulicht die Nützlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Präparation des TNF-Gens mit 494 Basenpaaren, ausgehend von zwei Oligonucleotiden mit je 74 Basenparen.

Primer

Die verwendeten Primer, bei denen es sich jeweils um 74-mere handelt, wurden nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren hergestellt. Sie sind nachstehend beschrieben.

Gesamtverfahren

1. Zehn Zyklen des unten aufgeführten Protokolls wurden durchgeführt unter Verwendung der Primer TN10 und TN11, die so wie im nachstehenden Diagramm, Schritt (a) gezeigt, interagierten.
II. Insgesamt 2 ul des Reaktionsgemisches vom vorstehenden Teil I wurden zu den Primern LL09 und LL12 gegeben. Das nachstehend beschriebene Protokoll wurde über 15 Zyklen ausgeführt, so daß die Primer mit dem Produkt von Abschnitt I so interagierten wie im nachstehenden Diagramm, Schritt (b) gezeigt ist.
III. Insgesamt 2 ul des Reaktionsgemisches vom vorstehenden Abschnitt II wurden zn den Primern TN08 und TN13 gegeben. Das nachstehend beschriebene Protokoll wurde über 15 Zyklen ausgeführt, so daß die Primer mit dem Produkt von Abschnitt II so interagierten wie im nachstehenden Diagramm, Schritt (c) gezeigt ist.
IV. Insgesamt 2 ul des Reaktionsgemisches des vorstehenden Abschnitts III wurden zu den Primern LL07 und LL14 gegeben. Das nachstehend beschriebene Protokoll wurde über 15 Zyklen ausgeführt, so daß die Primer mit den Produkt des Abschnitts III so interagierten wie im nachstehenden Diagramm, Schritt (d) gezeigt ist.

Protokoll

Jede Reaktion enthielt 100 ul von:
je 2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP
je 3 mM der in dem betreffenden Schritt verwendeten Primer
1 · Polymerasepuffer, (30 mM Tris-Acetat, 60 mM Na- Acetat, 10 mM Mg-Acetat, 2,5 mM Dithiothreit)
Jeder Zyklus beinhaltet:
1) 1 Minute in kochendem Wasser
2) 1 Minute Abkühlen auf Raumtemperatur
3) Zugabe von 1 ul (5 Einheiten) Klenow-Fragment von DNA-Polymerase
4) 2 Minuten Zulassen der Polymerisationsreaktion.
Der nächste Zyklus beginnt wieder mit Schritt 1. Schema

Hinterlegung der Materialien

Die Zelllinle SC-1 (CTCC #0082) wurde am 19. März 1985 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 USA unter der ATCC- Hinterlegungsnummer CRL#8756 hinterlegt. Die Hinterlegung von SC-1 erfolgte gemäß einem Vertrag zwischen der ATCC und der Anmelderin dieser Patentanmeldung, der Firma Cetus Corporation. Der Vertrag mit der ATCC macht die Nachkommen dieser Zelllinie der Öffentlichkeit ständig verfügbar nach Erteilung des US-Patents, das die Hinterlegung oder die Publikationen beschreibt und, identifiziert, oder nach der Offenlegung jeglicher amerikanischer oder ausländischer Patentanmeldungen, je nachdem, was zuerst eintritt. Darüber hinaus macht sie die Nachkommen der Zelllinie jemandem verfügbar, der durch den Präsidenten des amerikanischen Patentamts (US Commissioner of Patents and Trademarks) gemäß 35 CFR §122 und durch die Bestimmungen des Commissioners demgemäß (einschließlich 37 CFR & 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638) dazu ermächtigt wurde. Die Anmelderin der vorliegenden Patentanmeldung war einverstanden, dass, wenn die hinterlegte Zelllinie bei der Züchtung unter geeigneten Bedingungen absterben oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, sie diese sofort nach Benachrichtigung durch eine lebensfähige Kultur der gleichen Zelllinie ersetzen wird.
Zusammenfassend ist die vorliegende Erfindung - so aufzufassen, daß sie ein Verfahren bereitstellt zum Nachweis von Sequenzen in Nucleinsäuren, dadurch daß man eine oder mehrere spezifische Nucleinsäuresequenz(en) unter Verwendung einer Kettenreaktion amplifiziert, bei der Primer- Verlängerungsprodukte produziert werden, die nachfolgend als Matrizen für weitere Primer-Verlängerungsreaktionen wirken können. Das Verfahren ist insbesondere zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen nützlich, die zu Beginn nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind. Das Amplifikationsverfahren kann außerdem zur molekularen Clonierung verwendet werden.

Claims

1. Exponentielle Amplifikation und Nachweis-Kit für die Amplifikation und den Nachweis in einer Probe von (einer) spezifischen Matrizen- Nucleinsäuresequenz(en), die in einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nucleinsäure oder in einem Gemisch solcher Nucleinsäuren enthalten ist (sind), welcher in abgepackter Form folgende Bestandteile enthält:

(a) mindestens einen ersten und zweiten einzelsträngigen Oligonucleotidprimer, welche sich voneinander unterscheiden, wobei

(aa) einer dieser Primer im Wesentlichen komplementär zu der einzelsträngigen Nucleinsäure oder zu einem Strang der doppelsträngigen Nucleinsäure ist,

(ab) der andere Primer im Wesentlichen komplementär zu einem anderen Komplement der einzelsträngigen Nucleinsäure oder zum anderen Strang der doppelsträngigen Nucleinsäure ist, und wobei

(ac) diese Primer die Endpunkte der zu amplifizierenden und nachzuweisenden spezifischen Nucleinsäuresequenz definieren;

(b) ein Agens für die Polymerisation; und

(c) Mittel für den Nachweis der amplifizierten spezifischen Nucleinsäuresequenz.

2. Kit nach Anspruch 1, wobei die spezifische Matrizen-Nucleinsäuresequenz in einer größeren Sequenz enthalten ist.

3. Kit nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Nucleinsäure DNA oder RNA ist, einschließlich Messenger-RNA, wobei die DNA oder RNA als einzelsträngige oder doppelsträngige Nucleinsäure oder als DNA-RNA-Hybrid vorliegt.

4. Kit nach einem Anspruche 1 bis 3, wobei die Nucleinsäure genomische DNA ist.

5. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Primer etwa 15 bis 25 Nucleotide umfassen.

6. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens einer der Primer eine an seinem 5'-Ende angehängte Nucleotidsequenz enthält, deren Sequenz nicht komplementär zu der Nucleinsäure ist.

7. Kit nach Anspruch 6, wobei die am 5'-Ende des Primers angehängte Nucleotidsequenz eine Promotorsequenz ist.

8. Kit nach Anspruch 7, wobei der Promotor ein T7-Promotor ist.

9. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei mindestens einer der Primer zusätzlich Basen oder eine Nucleotidsequenz enthält, wobei die Basen oder die Nucleotidsequenz zu der spezifischen Nucleinsäuresequenz, die amplifiziert und nachgewiesen werden soll, nicht komplementär sind.

10. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei einer der Primer eine Restriktionsschnittstelle enthält.

11. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Agens für die Polymerisation ein Enzym ist, ausgewählt aus E. coli-DNA-Polymerase 1, Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I, T4-DNA-Polymerase, einer anderen DNA-Polymerase, reverser Transkriptase und hitzestabilen Enzymen.

12. Kit nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Mittel für den Nachwels der amplifizierten spezifischen Matrizen-Nucleinsäuresequenz(en) eine markierte Oligonucleotidsonde umfasst.

13. Verwendung eines Kits nach einem der Ansprüche 1 bis 12, für die Amplifikation, den Nachweis und/oder die Charakterisierung von (einer) spezifischen Matrizen-Nucleinsäuresequenz(en), die in einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nucleinsäure oder einem Gemisch solcher Nucleinsäuren enthalten ist (sind).

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die spezifische(n) Matrizen- Nucleinsäuresequenz(en) mit infektiösen Erkrankungen, wie solche, die durch Bakterien, Viren und protozoische Parasiten verursacht werden, genetischen Störungen, wie solche, die durch spezifische Deletion und/oder Mutation in der genomischen DNA verursacht werden, oder zellulären Störungen, wie Krebs, in Verbindung stehen.