DE68916671T2 - Mutationsnachweis durch kompetitiven Oligonukleotid-Priming. - Google Patents
Mutationsnachweis durch kompetitiven Oligonukleotid-Priming.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Ermittlung von Unterschieden (Mutationen) in genetischen Sequenzen durch konkurrierendes Oligonucleotid-Primen. Das Ermittlungsverfahren ist bei einer Vielfalt von Gebieten von Nutzen, einschließlich Prüfen auf genetische Erkrankung, infektiöse Erkrankung und Krebs; Gerichtsmedizin; Tierhaltung in der Landwirtschaft einschließlich Züchtung für Landwirtschaft und Neuschöpfungs-Zwecke.
- Diese Erfindung ist eine Verbesserung hinsichtlich gegenwärtig eingesetzter Verfahren zur Ermittlung von Unterschieden in DNS- Sequenzen. Die Ermittlung von Unterschieden in DNS-Sequenzen ist ein wünschenswertes und notwendiges Verfahren auf den folgenden beispielhaften Gebieten; Ermittlung und Diagnose von Allelen, die für Erbkrankheiten bei Menschen und anderen Spezies verantwortlich sind; Ermittlung und Diagnose von DNS-Sequenzen, die vereinigt oder verbunden sind mit Genen, die an Krankheiten bei Menschen und anderen Spezies beteiligt oder nicht beteiligt sein können; Ermittlung und Diagnose von Geschwulstbildungen und der Therapiewirkungen auf Geschwul Ermittlung von und Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Krankheitserregern (z. B. Viren, Bakterien und Pilzen); Bestimmung der Reinheit von Tierrassen und -stammbäumen; Unterscheidung und Identifizierung unterschiedlicher menschlicher und tierischer Proben in der Gerichtsmedizin.
- Häufig ist der zu ermittelnde DNS-Sequenzunterschied eine einzelne DNS-Basen-Substitution (Punktmutation). DNS ist normalerweise zusammengesetzt aus verschiedenen Kombinationen von vier Adenin (A); Thymidin (T); Cytosin (C) und Guanosin (G) genannten Basen. So kann ein Beispiel einer DNS-Sequenz ATCGCGATCGT sein. Eine Punktmutation kann die Substitution irgendeiner der drei Basen, die normalerweise nicht an einer einzelnen Position gefunden wird, gegen eine Base, die normalerweise an dieser Position gefunden wird, sein. Zum Beispiel ist die Umbildung einer DNS-Sequenz ATCG GATCGT zu ATCG GATCGT eine Punktmutation an der unterstrichenen Position.
- Obwohl Punktmutationen wohl für die Mehrheit von Unterschieden zwischen zufällig ausgewählten DNS-Sequenzen nicht verantwortlich sind sind sie verantwortlich für viele Unterschiede zwischen DNS- Sequenzen, die verantwortlich sind für Polymorphismen und mit "Krankheit" in Zusammenhang stehender DNS.
- DNS, die sich nur durch Punktmutation unterscheiden, sind mittels gängiger Technologien sehr schwer zu unterscheiden. Verfahren zur Ermittlung von Punktmutationen fallen in zwei Hauptkategorien: (1) Verfahren, die Punktmutationen ermitteln können, wenn die genaue DNS-Sequenzveränderung vorausgesehen werden kann; (2) Verfahren, die auf Punktmutationen "abtasten", wo die genaue Art der einzelnen DNS-Genveränderung nicht bekannt ist. Die vorliegende Erfindung wird in jeder Situation arbeiten.
- Vor der vorliegenden Erfindung wurden Punktmutationen, bei denen eine gewisse Kenntnis der DNS-Sequenzunterschiede zwischen der normalen und der abweichenden DNS vorhanden war, ermittelt durch:
- (1) Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (D. Botstein, et al. Am. J. Hum. Genet., 32 : 314-331 (1980)) oder (2) allelspezifische Oligonucleotid (ASO)-Sondierung (G. Angelini, P. N. A. S. (USA), 83 : 4489-4493 (1986).
- Bei dem Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Verfahren werden Restriktionsendonucleasen verwendet, um die DNS in verschiedene Kettenlängen zu schneiden, die gemessen werden können. Bei der allelspezifischen Oligonucleotid-Sondierung werden einzelne Basenfehlpaarungen mittels thermodynamischer Unterschiede bestimmt. Die Verbindungsbedingungen werden so eingestellt, daß sich perfekt gepaarte Stränge verbinden und nicht perfekt gepaarte Stränge nicht verbinden.
- Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die durch die US-Patente Nr. 4 683 202 und Nr. 4 683 195 illustriert wird, wird verwendet, um spezifische DNS-Sequenzen zu vermehren, jedoch schafft PCR an sich kein Verfahren zur Ermittlung einzelner Basenmutationen. Die PCR kann in Verwendung mit anderen Techniken wie der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Punktmutationen und andere DNS- Sequenzunterschiede zu ermitteln.
- Die gegenwärtige Erfindung, konkurrierendes Oligonucleotid-Primen (competitive oligonucleotide priming COP), unterscheidet eng verwandte DNS-Sequenzen durch Vergleichen konkurrierenden Verbindens oder Verschmelzens von zwei oder mehr DNS-Sequenzen, die an die DNS- Sequenz von Interesse eng angepaßt sind. Das COP-Verfahren hat eine gewisse Ähnlichkeit mit dem allel spezifischen Oligonucleotid- Sondierungsverfahren und mit dem Verfahren der Polymerase- Kettenreaktion, jedoch verwenden weder ASO-Sondierungsverfahren noch PCR-Vermehrungsverfahren den einzigartigen Nachweis der konkurrierenden Verbindung der vorliegenden Erfindung, um spezifische Sequenzen zu ermitteln, die sich durch eine einzelne Base unterscheiden.
- Das COP-Verfahren der vorliegenden Erfindung besitzt die Vorteile von Einfachheit und Geschwindigkeit. Außerdem wird kein Filter für die Hybridisierung benötigt, es kann mit festen Trägern verwendet werden, und das ganze Verfähren kann zur Kostenverringerung automatisiert werden. Es schafft ein Verfahren zur Befriedigung eines lang empfundenen Bedürfnisses, die Ermittlung des Austausches von einzelnen Basen in DNS-Sequenzen zu verbessern und zu vereinfachen.
- EP-A-0 317 239 offenbart auf Seite 9, Zeilen 9 bis 26, ein Verfahren zur Ermittlung von Abänderungen in Nucleinsäure-Sequenzen zwischen mindestens zwei Nucleinsäure-Testproben auf der Basis der gemeinsamen Verwendung eines "festen" Primers und mindestens zweier veränderlicher Primer, die sich in mindestens einer Base unterscheiden und die jeweils mit einem unterschiedlichen Marker markiert sind, der in dem Verlängerungs- oder Extensionsprodukt der Vermehrungsreaktion identifizierbar ist. Diese Offenbarung ist jedoch für den Gegenstand der vorliegenden Anmeldung nicht neuheitsschädlich, da das Prioritätsdatum, auf das diese Offenbarung Anspruch hat, nicht früher ist als das Prioritätsdatum, auf das die vorliegende Erfindung Anspruch hat.
- Laboratory Investigation, Band 59, Nr. 3, März 1988, Seiten 403-408 (Dermer et al) offenbart insbesondere in Fig. 1 und auf Seite 406, Spalte 1, Absatz 2 bis Seite 407, Spalte 2, Absatz 2, ein Verfahren für die DNS-Analyse eines α&sub1;-Antitrypsin (ATT)-Mangels auf der Basis der Verwendung von zwei (unterscheidenden) Oligonucleotid-Primern, die entweder an das (MP) normale ATT-Gen oder an eine Punktbasenmutations-Variation (ZP) des ATT-Gens angepaßt sind. Zusätzlich wird ein dritter Primer verwendet, der homolog zu dem (-) Strang des AAT-Gens ist. Dieses offenbarte Verfahren bringt jedoch die Verwendung getrennter Versuche mit sich, wohingegen für die vorliegende Erfindung ein einziger Versuch unter einem System konkurrierender Oligonucleotid-Primer verwendet wird. Nirgendwo in dieser Schrift wird gelehrt oder vorgeschlagen, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung zu einem einzigen Versuch kombiniert werden kann.
- Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer spezifischen bekannten Nucleinsäure-Sequenz oder zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Sequenzen zur Verfügung gestellt, das folgende Schritte aufweist:
- Hinzufügen von konkurrierenden Oligonucleotid-Primern zu einer Probe von Nucleinsäure oder einer Mischung von Nucleinsäuren, wobei die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer mindestens zwei Primer aufweisen, einen, der zu der spezifischen bekannten Sequenz im wesentlichen komplementär ist, und mindestens einen anderen Primer, der mit der spezifischen bekannten Sequenz mindestens eine zusätzliche Basenfehlpaarung aufweist;
- Bevorzugtes Hybridisieren des im wesentlichen komplementären Primers an die spezifische bekannte Sequenz unter Konkurrenzbedingungen;
- Verlängern des bevorzugt hybridisierten Primers von seinem 3'-Ende aus zur Synthese eines Verlängerungsprodukts, das komplementär ist zu dem Strang, an den der Primer hybridisiert wird; und
- Identifizieren des Verlängerungsprodukts.
- Zusätzliche Ausführungen der Erfindung beinhalten das Anbringen von Markierungen an den konkurrierenden Oligonucleotid-Primern zur leichten Ermittlung der Verlängerungsprodukte. Zu diesen Markierungen gehören Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe, Chemilumineszenzfarbstoffe, Enzyme und Antikörper.
- Bei anderen Ausführungsformen wird die zu ermittelnde Sequenz während des konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Versuchs und/oder vor der Durchführung des konkurrierenden Oligonucleotid-Primer- Versuchs vermehrt.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird der gemeinsame Oligonucleotid-Primer an einen festen Träger gebunden, und das vermehrte Verlängerungsprodukt wird durch Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit der an dem festen Träger befestigten Markierung identifiziert.
- Eine weitere Ausführungsform verwendet vielfache konkurrierende Oligonucleotid-Primer, von denen jeder unterschiedlich markiert ist, um gleichzeitig genetischen Polymorphismus an einer einzelnen Stelle oder unterschiedlichen Stellen nachzuweisen.
- Eine andere Ausführungsform beinhaltet die Verwendung des konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Verfahrens bei der Erbkrankheits-Ermittlung, in der Gerichtsmedizin, beim Vaterschaftstest, bei der Gen-Kartiertung, beim Nachweis von Krankheitserregern und beim Prüfen auf und der Therapie von Neoplasie.
- Eine zusätzliche Ausführungsform beinhaltet das Aufteilen einer Nukleinsäure-Probe von einem Individuum und das gleichzeitige Durchführen des konkurrierenden Oligonucleotid-Primer- Versuchs an den verschiedenen Portionen.
- Die vorliegende Erfindung ist nützlich bei der Ermittlung von genetischen Polymorphismen. Zu spezifischen Anwendungen gehören: Ermittlung genetischer Krankheiten wie Sichelzellenanämie, α&sub1;- Antitrypsin-Mangel und Hämpohilie; Prüfung auf Krankheits-Begleitung durch Verknüpfungsanalyse; Gewebetypisierung; Gen-Kartierung; Prüfung auf Neoplasma und die Therapiewirkung; Nachweis bekannter Pathogene (zum Beispiel Viren, Bakterien, Hefe und Pilze); Bestimmung der Stammbäume und/oder Reinheit von Tierrassen; und Prüfung auf Krankheit bei Tieren.
- Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden deutlich werden aus der folgenden Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zum Zweck der Offenbarung angegeben sind, in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen.
- Die Erfindung wird leichter verstanden werden durch das Lesen der folgenden Beschreibung und durch Bezugnahme auf die begleitenden Zeichnungen, die einen Teil davon ausmachen:
- Fig. 1 zeigt das grundlegende Prinzip des Systems mit konkurrierenden Oligonucleotid-Primern;
- Fig. 1A zeigt, daß, wenn zwei eng verwandte Primer um eine einzige DNS-Matrize konkurrieren, ein perfekt angepaßter Primer sich bevorzugt mit der Matritze verbinden oder mit ihr hybridisieren wird gegenüber einem Primer mit einer einzigen Basenfehlpaarung;
- Fig. 1B zeigt, daß ein Oligonucleotid-Primer radioaktiv gemacht werden kann, um seinen Nachweis zu erleichtern;
- Fig. 1C zeigt den Nachweis von konkurrierendem Oligonucleotidprimen durch die Polymerase- Kettenreaktion (PCR). Eine DNS-Matrize wird an zwei Steilen mit einem Primer versehen. Ein einziger Oligonucleotid-Primer wird an einer der Stellen verwendet (gemeinsamer Primer), und die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer werden an der anderen Stelle verwendet, welche die DNS-Mutation enthält. Nach der PCR-Vermehrung ist der "korrekte", perfekt angepaßte Primer in das PCR- Vermehrungsprodukt eingebaut;
- Fig. 2 DNS-Sequenz von Bereichen, welche die Oligonucleotid primenden Stellen in den Beispielen 1 und 2 umgeben;
- Fig. 2A zeigt die M13mp18 DNS-Sequenz in filamentöser Phase.
- Fig. 2B zeigt die Ornithintranscarbamylase-cDNS-Sequenz;
- Fig. 3A zeigt die Analyse von Produkten des konkurrierenden Oligonucleotid-Primens, die erzeugt wurden von Primern, die spezifisch sind für + und spf OTC- Allele;
- Fig. 3B zeigt Autoradiografien des in 3A gezeigten Gels, die beweisen, daß die radioaktiven Primer in ein Fragment mit 72 Nucleotiden in den Spuren 1 und 4 eingebaut wurden, wo die radioaktiven Primer perfekt an die Matrize angepaßt sind, während die radioaktiven Fehlpaarungs-Primer in den Spuren 2 und 3 ausgeschlossen wurden;
- Fig. 4A zeigt die autoradiographische Analyse von Fragmenten, die unter Verwendung von 12-Mer Oligonucleotiden im Wettbewerb aus COP und PCT oder M13mp18 DNS erzeugt wurden.
- Fig. 4B zeigt die Autoradiographie-Analyse von Fragmenten, die unter Verwendung von 20-Mer Oligonucleotiden im Wettbewerb aus COP und PCT von M13mp18 DNS erzeugt wurden.
- Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu, und bestimmte Merkmale der Erfindung können im Maßstab übertrieben sein oder in schematischer Form gezeigt sein im Interesse von Klarheit und Prägnanz.
- Der Begriff "Oligonucleotid-Primer", wie er hierin verwendet wird, definiert ein Molekül, das aus mehr als drei Deoxynbonucleotiden oder Ribonucleotiden zusammengesetzt ist. Seine genaue Länge wird von vielen Faktoren abhängen, die in Beziehung stehen zu der endgültigen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotid-Primers einschließlich Temperatur, Quelle des Primers und Verwendung des Verfahrens. Der Oligonucleotid-Primer kann natürlich vorkommen wie in einem gereinigten Restriktions-Auszug oder synthetisch hergestellt werden. Der Oligonucleotid-Primer ist in der Lage, als ein Punkt der Synthese- Einleitung zu wirken, wenn er unter Bedingungen gebracht wird, die die Synthese eines zu einem Nucleinsäure-Strang komplementären Primer- Extensionsprodukts veranlassen. Zu den Bedingungen kann gehören die Anwesenheit von Nucleotiden und eines induzierenden Mittels wie DNS- Polymerase bei einer geeigneten Temperatur und einem geeigneten pH. Obwohl der Primer bevorzugt einzelsträngig ist, kann er alternativ doppelsträngig sein. Wenn er doppelsträngig ist, muß der Primer zuerst behandelt werden, um seine Stränge zu trennen, bevor er zur Erzeugung von Verlängerungsprodukten verwendet wird. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist der Primer ein Oligodeoxyribonucleotid. Der Primer muß ausreichend lang sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in Gegenwart des induzierenden Mittels zu primen oder zu starten. Bei dem konkurrierenden Oligonucleotid-Primer- Verfahren können Oligonucleotide im Bereich von etwa 8 bis 30 Mers in der Länge liegen. Bei der bevorzugten Ausführungsform sind die konkurrierenden Primer 12 bis 16 Mers in der Länge. Die Empfindlichkeit und Spezifität des konkurrierenden Oligonucleotid- Primer-Versuchs wird durch die Länge bestimmt. Primer, die zu kurz sind, d. h. weniger als etwa 8 Mers, zeigen unspezifische Bindung an eine breite Vielfalt von Sequenzen in dem Genom und sind daher nicht sehr nützlich. Andererseits zeigen Primer, die zu lang sind, d. h. größer als etwa 30 Mers, keine konkurrierende Bindung, weil bei langen Oligonucleotiden eine einzelne Basenfehlpaarung üblicherweise nicht die Bindungs-Wirksamkeit beeinflußt.
- "Konkurrierende Oligonucleotid-Primer" wie hierin verwendet soll sich auf diejenigen Oligonucleotid-Primer beziehen, die sich durch mindestens eine Basenfehlpaarung unterscheiden. Dieser Unterschied oder Unterschiede führen zu einer unterschiedlichen Geschwindigkeit und Fähigkeit, an die bekannte Nucleotid-Sequenz anzubinden. Durch Steuerung der Bindungsgeschwindigkeit und -fähigkeit kann der konkurrierende Oligonucleotid-Primer vorteilhaft verwendet werden.
- Eine Vielfalt von Bedingungen einschließlich Temperatur, Ionenstärke und die chemische Zusammensetzung des Puffers wird die Bindungsfähigkeit verändern. Unter geeigneten Bedingungen wird, wenn konkurrierende Oligonucleotid-Primer mit einer DNS-Matrize inkubiert werden, die Oligonucleotid-Sequenz, die am nahesten an die bekannte, zu hybridisierende Sequenz angepaßt ist, bevorzugt gegenüber der Sequenz, die eine Basenfehlpaarung oder die meisten Basenfehlpaarungen hat, binden.
- "Basenfehlpaarung" wie hierin verwendet, soll sich auf eine Veränderung in den Nucleotiden beziehen, dergestalt, daß, wenn ein Primer sich an die bekannte Sequenz anlegt, ein anormales Bindungspaar von Nucleotiden gebildet wird. Normalerweise binden bei der Bildung von doppelsträngigen Nucleinsäuren Guanin (G) und Cytosin (C) und binden Adenin (A) und Thymin (T). Daher wird die Standard- Basenpaarting, A-T oder G-C bei basenfehlgepaarter Paarung nicht gesehen. Es kann eine Vielfalt von Basenfehlpaarungen auftreten, zum Beispiel G-G, C-C, A-A, T-T, A-G, A-C, T-G oder T-C. Diese Fehlpaarung und ihre Auswirkungen auf die Wirksamkeit des Verbindens ist eine Grundlage für die konkurrierende Bindung der Oligonucleotid-Primer.
- Ein "gemeinsamer Primer" wie hierin verwendet ist ein Primer, der an den Strang bindet, der komplementär ist zu dem Strang, an den die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer binden, und er bindet an einer von den konkurrierenden Oligonucleotid-Primern entfernten Stelle. Diese Entfernung sollte ausreichend sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten zwischen den zwei Bindungsstellen zu erlauben, aber nahe genug, so daß die Verlängerungsprodukte des gemeinsamen Primers oder der gemeinsamen Primer den konkurrierenden oder die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer überlappen und die Verlängerungsprodukte des oder der konkurrierenden Oligonucleotid- Primer den oder die gemeinsamen Primer überlappen. Die Verlängerungsprodukte von dem gemeinsamen Primer oder den gemeinsamen Primern und dem konkurrierenden Primer oder den konkurrierenden Primern sind zueinander komplementär.
- Alle die hierin verwendeten Oligonucleotid-Primer sind ausgewählt, daß sie im wesentlichen komplementär zu den unterschiedlichen Strängen (Matrizen) jeder bekannten spezifischen Sequenz, die ermittelt werden soll, sind, so daß die Primer mit ihren entsprechenden Strängen hybridisieren. Die Primersequenz braucht nicht die genaue Sequenz der Matrize widerzuspiegeln bei dem konkurrierenden Oligonucleotid- Primer-Versuch. Es ist jedoch wichtig, daß die verschiedenen Sequenzen, die als konkurrierende Oligonucleotid-Primer verwendet werden, unterschiedliche Anzahlen von Basenfehlpaarungen haben. Zum Beispiel könnten bei der Ermittlung einer normalen genetischen Sequenz die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer einen Primer enthalten, der eine genaue Kopie des zu der normalen genetischen Sequenz komplementären Stranges ist, und einen Primer, der eine Kopie des komplementären Stranges mit einem fehlgepaarten Basenpaar ist (siehe Fig. 1A). Sowohl ein perfekt angepaßter Primer als auch ein Primer mit einer einzelnen DNS-Basenfehlpaarung ist in der Lage, an die Matrize zu binden. Wenn jedoch die zwei nahe verwandten Primer zusammen mit der DNS-Matrize inkubiert werden, wird die Bindung des perfekt angepaßten Primers gegenüber einem Primer mit einer einzelnen Basenfehlpaarung begünstigt werden. Alternativ kann einer der Primer eine Basenfehlpaarung gegenüber der bekannten genetischen Sequenz enthalten, und die anderen Oligonucleotide würden mindestens zwei Fehlpaarungen enthalten. So sind die Erfordernisse im wesentlichen, daß eine der Sequenzen N Fehlpaarungen besitzt und die andere Sequenz oder die anderen Sequenzen mehr als N Fehlpaarungen besitzen, wobei N von Null bis zu irgendeiner Zahl von Fehlpaarungen sein kann, die noch eine im wesentlichen ähnliche Sequenz schaffen werden, die zu binden in der Lage ist. Wenn zwei Oligonucleotide, die sich durch eine einzelne DNS-Base unterscheiden, als Primer in einer Reaktion zugeführt werden, die eine einzelne DNS- oder RNS-Matritze enthält, dann wird der perfekt angepaßte Oligonucleotid-Primer hochgradig gegenüber dem Primer mit der einzelnen Basenfehlpaarung begünstigt werden. In ähnlicher Weise wird, wenn keiner der Primer eine perfekte Anpassung darstellt, der näher angepaßte Primer begünstigt werden. Je größer der Unterschied zwischen der Sequenz von Interesse und den anderen Sequenzen, desto wirkungsvoller arbeitet der konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Nachweis. Wenn jedoch der Unterschied zu groß ist, kann er nicht länger als ein konkurrierender Nachweis arbeiten.
- Der Begriff "genetischer Polymorphismus" wie hierin verwendet, betrifft die an einer genetischen Stelle festzustellende Veränderung, bei der zwei oder mehr verschiedene Nucleotid-Sequenzen an der gleichen genetischen Stelle in der DNS koexistieren können. Die unterschiedlichen Sequenzen können zu einer Krankheit führen oder nicht. Zum Beispiel haben HL-A-Haplotypen unterschiedliche genetische Sequenzen, die variieren, aber nicht zu einer Krankheit führen, während Sichelzellenanämie eine durch eine einzelne Veränderung in der genetischen Sequenz verursachte Krankheit ist.
- Wie hierin verwendet, betrifft die "normale genetische Sequenz" die Sequenz, die im Falle einer Erbkrankheit zu dem normalen Phänotyp führt, oder im Fall keiner Krankheit zu dem üblichsten Haplotyp führt, der in der Population gefunden wird.
- Wie hierin verwendet, betrifft die "mutierte genetische Sequenz" die Sequenz, die mindestens einen Basenaustausch-Unterschied in der DNS- Sequenz gegenüber der normalen genetischen Sequenz besitzt. Die mutierte Sequenz oder Sequenzen sind verantwortlich für die genetische Krankheit oder die weniger üblichen Haplotypen, die an einer gegebenen Stelle exprimiert werden.
- Der Begriff "Verlängerungsprodukt" wie hierin verwendet, soll das Produkt sein, das von dem 3'-Ende des Oligonucleotid-Primers her synthetisiert wird und das komplementär ist zu dem Strang, an den der Oligonucleotid-Primer gebunden ist.
- Ein "konkurrierendes Verlängerungsprodukt" soll sich auf das Verlängerungsprodukt beziehen, das von dem 3'-Ende eines der konkurrierenden Oligonucleotid-Primer her synthetisiert wird.
- Der Begriff "unterscheidend markiert" wie hierin verwendet, soll angeben, daß jeder konkurrierende Oligonucleotid-Primer eine unterschiedliche Markierung integriert hat. Ein Fachmann wird erkennen, daß eine Vielfalt an Markierungen zur Verfügung steht. Zum Beispiel können zu ihnen Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe, Chemilumineszenzfarbstoffe, Enzyme und Antikörper gehören. Verschiedene Faktoren beeinflussen die Wahl der Markierung. Zu diesen gehören die Wirkung der Markierung auf die Hybridisierungsgeschwindigkeit und das Binden des Primers an die DNS, die Empfindlichkeit der Markierung, die Einfachheit der Herstellung des markierten Primers, die Fähigkeit zu Automatisieren, verfügbare Gerätschaften, Bequemlichkeit und dergleichen. Zum Beispiel könnte bei den Verfahren, die unterscheidend markierte Primer verwenden, jeder Primer mit einem unterschiedlichen Radioisotop wie ³²P, ³H und ¹&sup4;C markiert werden, oder jeder Primer könnte mit einem unterschiedlichen Isotop des gleichen Elements markiert werden; mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff wie Fluorescin, Tetramethylrhodamin, Texasrot und 4-Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1-diazol (NBD); oder mit einer Mischung unterschiedlicher Markierungen wie Radioisotope, Fluoreszenzfarbstoffe und Chemilumineszenzfarbstoffe. Bei diesen Beispielen kann jeder Primer von allen anderen Primern unterschieden werden, wenn sie in einer Mischung sind.
- Die spezifische bekannte Nucleinsäure-Sequenz, die hierin ermittelt wird, kann von irgendeiner Quelle oder Quellen in gereinigter oder nicht gereinigter Form gewonnen werden. Zu Quellen können gehören Plasmide und geklonte DNS, genomische DNS aus irgendeiner Quelle einschließlich Bakterien, Pilze, Hefe, Viren und höheren Organismen wie Pflanzen, Vögel, Reptilien und Säugetieren. Bei der bevorzugten Ausführungsform ist die Quelle genomische DNS. Die genomische DNS kann hergestellt werden aus Blut, Urin, Gewebematerial wie chorionische Villi und Amnionzellen, mittels einer Vielfalt von dem Fachmann bekannten Techniken.
- Nach dem vorliegenden Verfahren kann jede spezifische bekannte Nucleinsäure-Sequenz ermittelt werden. Es ist nur notwendig, daß eine ausreichende Anzahl an Basen an beiden Enden der Sequenz mit ausreichender Genauigkeit bekannt ist, um zwei Oligonucleotid-Primer herzustellen, die an die verschiedenen Stränge der gewünschten Sequenz an entsprechende Positionen entlang der Sequenz hybridisieren. Nach der Hybridisierung der Primer wird von einem Primer ein Verlängerungsprodukt synthetisiert. Wenn das Verlängerungsprodukt von seiner Matrize getrennt ist, kann es als eine Matrize zur Verlängerung des anderen Primers in eine Nucleinsäure definierter Länge dienen. Je größer die Kenntnis über die Basen an beiden Enden der Sequenz, desto größer kann die Spezifizität der Primer für die Ziel-Nucleinsäure- Sequenz und damit die Wirksamkeit des Verfahrens sein.
- Die Oligonucleotid-Primer können unter Verwendung irgendeines geeigneten Verfahrens, zum Beispiel der Phosphotriester- und Phosphodiester-Verfähren oder automatisierten Ausführungsformen davon, der Synthese von Oligonucleotiden auf einem modifizierten festen Träger, der Isolierung aus einer biologischen Quelle (Restriktionsendonuclease-Aufschluß) und der Erzeugung durch enzymatisch gesteuertes Kopieren einer DNS- oder RNS-Matrize hergestellt werden.
- Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer spezifischen bekannten Nucleinsäure-Sequenz oder zur Unterscheidung zwischen verschiedenen Sequenzen, folgende Schritte aufweisend: Hinzufügen von konkurrierenden Oligonucleotid-Primern zu einer Probe von Nucleinsäure oder einer Mischung von Nucleinsäuren, wobei die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer mindestens zwei Primer aufweisen, einen, der zu der spezifischen bekannten Sequenz im wesentlichen komplementär ist, und mindestens einen anderen Primer, der mit der spezifischen bekannten Sequenz mindestens eine zusätzliche Basenfehlpaarung aufweist; bevorzugtes Hybridisieren des im wesentlichen komplementären Primers an die spezifische bekannte Sequenz unter Konkurrenzbedingungen; Verlängern des bevorzugt hybridisierten Primers von seinem 3'-Ende aus zur Synthese eines Verlängerungsprodukts, das komplementär ist zu dem Strang, an den der Primer hybridisiert wird; und Identifizieren des Verlängerungsprodukts.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung können zwei nahe verwandte DNS- Sequenzen durch konkurrierendes Oligonucleotidprimen unterschieden werden.
- Grundsätzlich werden, um eine DNS-Sequenz, die sich durch eine oder mehrere Basen von einer bekannten DNS-Sequenz unterscheidet, zu ermitteln, Oligonucleotid-Primer, die der bekannten DNS-Sequenz angepaßt sind, und Oligonucleotid-Primer, die sich von den angepaßten Oligonucleotid-Primern durch mindestens ein Basenpaar unterscheiden, in der Gegenwart der zu testen den DNS inkubiert. Mindestens einer der Primer kann nachweisbar markiert werden, wie unten beschrieben. Der Nachweis der vorliegenden Erfindung ermittelt die Vorliebe für näher angepaßte DNS-Primer, an ihre entsprechende Matrize zu binden oder zu hybridisieren, durch Bestimmen, welcher der markierten Primer in das Verlängerungsprodukt inkorporiert wird.
- Zum Beispiel können die Reaktionsbedingungen zwei Oligonucleotid- Primer beinhalten, bevorzugt in mindestens einmolarem Überschuß von Primer zur Matrize. Die Deoxyribonucleosid-Triphosphat dATP, dCTP, dGTP und TTP werden in geeigneten Mengen zugegeben, um ausreichend Substrat für die Synthese der neuen DNS-Stränge zu liefern, und in Konzentrationen, die für die Aktivität der zu verwendenden Polymerase ausreichend sind. Die sich ergebende Lösung wird für etwa 15 Sekunden bis etwa 2 Minuten und bevorzugt etwa 1 Minute auf etwa 100ºC erhitzt, um jegliche doppelsträngigen Spezies zu denaturieren. Eine Vielfalt von Puffern kann verwendet werden, um die konkurrierende Hybridisierung zu unterstützen. Es ist erforderlich, daß die Stringenz der Puffer-Bedingungen derartig ist, daß der am besten passende Primer in der Lage ist, wirksam zu binden, um DNS-Extension zu erlauben. Der Puffer muß auch erlauben, daß die Enzyme, die die DNS-Extension katalysieren, arbeiten. Die vorhandene Menge an dem Primer muß größer sein als die vorhandene molare Menge der Matrize, es ist jedoch nicht notwendig, daß jeder der Primer in der gleichen molaren Menge anwesend ist.
- Die Länge des Denaturierungs-Zeitraums kann variieren. Es ist nur notwendig, daß er ausreichend ist, um Denaturierung jeglicher doppelsträngiger Matrizenspezies in der Mischung zu erlauben. Die Temperatur, bei der die Denaturierung durchgeführt wird, kann ebenso in Abhängigkeit von den anderen Denaturierungs-Bedingungen wie Puffer-Bestandteile, Länge des Denaturierungs-Zeitraums, Konzentrationsniveau der doppelsträngigen Bestandteile in der Mischung, und physikalischen Charakteristika wie Schmelztemperatur der doppelsträngigen Komponente(n) variieren. Bevorzugt liegt die Temperatur für das Denaturierungs-Verfahren im Bereich von etwa 90ºC bis 110ºC: am meisten bevorzugt wird die Denaturierung bei etwa 105ºC durchgeführt.
- Nach Abschluß der Denaturierung läßt man die Lösung abkühlen, und man läßt die Primer unter konkurrierenden Bedingungen an die Matrizenstränge hybridisieren (oder verbinden). Die Verbindungs- Temperatur kann von etwa 10ºC bis 65ºC, bevorzugt 28ºC, variieren. Die ideale Temperatur kann gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren bestimmt werden und wird abhängig sein von Faktoren wie der Schmelztemperatur des am besten passenden Primers sowie den anderen oben beschriebenen Versuchsbedingungen. Man läßt den Verbindungsprozeß mindestens 5 Sekunden lang fortschreiten. Bevorzugt wird der Verbindungsprozeß bei 28ºC 30 Sekunden lang durchgeführt.
- Nach Abschluß des Vebindungsprozesses wird ein induzierendes oder katalysierendes Mittel in die Lösung eingebracht, um die Primer- Verlängerungsreaktion zu starten. Das induzierende oder katalysierende Mittel kann ein Mittel sein, das die Verlängerung des Oligonucleotid- Primers fördert, wie das Klenow-Fragment von DNS-Polymerase 1 von E. coli oder die hitzefeste DNS-Polymerase von Thermus aquaticus (Taq-Polymerase). Die Menge an hinzugefügtem katalysierendem Mittel wird abhängen von der der Zubereitung eigenen Aktivität und wird dem Fachmann bekannt sein. Zum Beispiel, wenn das E. coli Klenow- Fragment als das katalysierende Mittel verwendet wird, mindestens 0,1 bis 100 Einheiten. Eine Einheit an Klenow-Aktivität kann definiert werden als die Menge an Enzym, die die Inkorporierung von 10 nM Gesamt-Deoxynbonucleotide in 30 Minuten bei 37ºC unter Verwendung von Poly[d(A-T)] als Matrizen-Primer in säurefällbares Material katalysieren wird. Bevorzugt werden 5 Einheiten hinzugefügt. Dem Fachmann sind verschiedene Bedingungen bekannt, aber die Verlängerungsreaktion kann bei 8ºC bis 90ºC stattfinden unter Verwendung von, zum Beispiel, DNS-Polymerase (Klenow) oder hitzefester DNS-Polymerase (Taq). Die Verlängerungsreaktionen werden üblicherweise in einem Endvolumen von 100 Mikrolitern durchgeführt, das 30 mM Trisacetet, pH 7,9, 60 mM Natriumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 10 mM Dithiothreitol, jeweils 1,5 mM des dATP, TTP, dCTP und dGTP, 4 uM jedes Primers oder jeder Primer-Familie und etwa 0,5 bis 1 uM DNS enthält.
- In Abhängigkeit von dem zur Identifizierung des Verlängerungsprodukts verwendeten Verfahren werden die beteiligten Schritte variieren. Zum Beispiel werden, wenn der gemeinsame Primer an einem festen Träger befestigt ist, die Sequenzen des an die bekannte Sequenz bindenden Verlängerungs-Primers an den festen Träger gebunden werden. So wird das Feststellen der Anwesenheit oder Abwesenheit einer Sequenz auf dem festen Träger die Identifizierung des Primers erlauben. Andererseits kann es, wenn die Primer nicht an einem festen Träger befestigt sind, nötig sein, das doppelsträngige Extensionsprodukt-Matrize zu behandeln, um Einzelstränge zu bilden. Der Fachmann wird erkennen, daß physikalische, enzymatische und chemische Mittel verfügbar sind, um die Stränge zu trennen. Typischerweise wird Denaturierung durch Hitze verwendet.
- Zum Nachweis von Nucleinsäure-Sequenzen ist eine Vielfalt von Verfahren in der Technik bekannt. Zum Beispiel können Nucleinsäure- Sequenzen markiert werden mit Radioisotopen, Fluoreszenzfarbstoffen, Chemilumineszenzfarbstoffen, Enzymen und Antikörpern. Die Anwesenheit oder Abwesenheit der Markierung zeigt an, ob das Verlängerungsprodukt von dem spezifischen Primer ist (Fig. 1B).
- Alternativ könnte die Sequenz von Interesse eine Restriktions- Endonuclease-Stelle enthalten, die unterschiedlich ist in der normalen und der mutierten Sequenz. In diesem Fall würde das doppelsträngige Extensionsprodukt-Matrize nicht getrennt werden, sondern würde vielmehr dem Restriktionsendonuclease-Aufschluß unterworfen werden und die sich ergebenden Restriktionsfragmentlängen gemessen werden.
- Eine andere Ausführungsform des Verfahrens beinhaltet den weiteren Schritt des Vermehrens des Verlängerungsprodukts vor dem Identifizierungsschritt. Die Vermehrung beinhaltet das Hinzufügen eines gemeinsamen Primers und das mindestens einmalige Wiederholen von:
- (1) Abtrennen des Verlängerungsprodukts von seinem komplementären Strang, (2) bevorzugtes Hybridisieren des Primers und (3) Verlängern des hybridisierten Primers. Die Schritte des Vermehrungsverfahrens können unbegrenzt wiederholt werden. Die Anzahl an Wiederholungen ist begrenzt durch die Menge an konkurrierenden Primern, gemeinsamen Primern und Deoxynucleotiden. Die Verlängerungsprodukte erhöhen sich exponentiell. Dieses Verfahren kann in Fig. 1C gesehen werden. Dieses Verfahren kann verwendet werden zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch Erhöhen der Menge an nachzuweisenden Sequenzen. So gibt es eine Steigerung der Sequenz von Interesse gegen den Hintergrund.
- Alternativ kann es vorteilhaft sein die Sequenz von Interesse vor einem Hinzufügen der konkurrierenden Oligonucleotid-Primer zu vermehren. Das Verfahren zur Vermehrung einer Sequenz ist beschrieben in "Process for Amplifying Nucleic Acid Sequence" U.S. Patent 4 483 202 und in "Process for Amplifying, Detecting, and/or Cloning Nucleic Acid Sequences" U.S. Patent 4 683 195. Grundlegend weist dieses Verfahren folgende Schritte auf: Verbinden eines Oligonucleotid-Primers mit jedem Strang jeder unterschiedlichen spezifischen Sequenz; Verlängern des Primers von seinem 3'-Ende aus unter Bedingungen, welche ein Verlängerungsprodukt synthetisieren, das komplementär ist zu jedem Strang, wobei das Verlangerungsprodukt nach dem Abtrennen von seinem Komplement als eine Matrize dient für die Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers, Abtrennen des Primer Verlängerungsprodukts von den Matrizen, an denen sie synthetisiert wurden, um einsträngige Moleküle zu erzeugen; und Vermehren der spezifischen Sequenz durch mindestens einmaliges Wiederholen der Schritte des Verbindens, Verlängerns und Abtrennens.
- Nachdem die Vermehrung stattgefunden hat, können die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer zugefügt werden, und es wird dem wie vorstehend beschriebenen konkurrierenden Oligonucleotid-Primer- Verfahren gefolgt.
- Ein Hauptunterschied und -vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber den vorstehenden Verweisungen ist die konkurrierende Natur der Bindung zwischen der im wesentlichen komplementären Sequenz und der, die mindestens eine Basenfehlpaarung mehr enthält. Zum Beispiel verwendet das allelspezifische Oligonucleotid (ASO)- Sondierungsverfahren des Punktmutations-Nachweises Oligonucleotide als Hybridisierungs-Sonden, nicht als Primer. Die verschiedenen ASO- Sonden werden in getrennten Reaktionen verwendet und werden nicht im Wettbewerb gehalten.
- Eine der Arten, in der das COP-Verfahren sich von dem PCR-Verfahren unterscheidet, ist, daß PCR Paare gegenüberliegender Primer verwendet, die an unterschiedlichen Stellen wirken, um spezifische DNS-Sequenzen zu vermehren, während COP Primer-Sets an einer einzigen Stelle verwendet, damit sie um die Bindung konkurrieren. Bei dem PCR- Verfahren können mehr als zwei Oligonucleotid-Primer anwesend sein, und diese können verwendet werden, um unterschiedliche Stellen in dem gleichen Reaktionsgefäß zu vermehren. Zusätzlich kann die PCR Primer verwenden, die nicht perfekt an die DNS-Matrize angepaßt sind, sondern nur "im wesentlichen" sind. Die PCR benutzt jedoch nicht Mischungen von Primern, die um eine einzelne Bindungsstelle an der Polynucleotid-Matrize auf solche Weise konkurrieren, daß, wenn der am meisten begünstigte konkurrierende Oligonucleotid-Primer nicht anwesend war, der nächst engst angepaßte konkurrierende Primer binden und die DNS-Synthese an der gleichen Stelle starten würde. So ist es die konkurrierender Oligonucleotid-Primer, jeweils als Primer für DNS Synthese von einer gemeinsamen Stelle aus zu arbeiten, aber das Vorherrschen der Inkorporierung des am besten angepaßten Primers, das das COP einzigartig macht. Das unterscheidende Markieren der einzelnen konkurrierenden Oligonucleotid-Primer erlaubt es, daß das Ereignis überwacht wird, und so kann durch Kennen des Oligonucleotid- Primers, der am besten angepaßt ist, die DNS-Sequenz der Matrize gefolgert werden.
- Ein anderer Hauptunterschied gegenüber früheren Verfahren ist die Tatsache, daß kurze Primer, etwa 12 Mers, leichter für den konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Versuch verwendet werden können, während es üblicherweise wünschenswert ist, für das Vermehrungsverfahren längere Primer zu verwenden. Wegen der empfindlichen Natur des Basenfehlpaarungs-Nachweises können die längeren Primer, die üblicherweise für die Vermehrung verwendet werden, bei einem konkurrierenden Nachweis nicht so wirkungsvoll sein.
- Der konkurrierende Oligonnucleotid-Priming-Nachweis kann in Situationen arbeiten, wo die genaue DNS-Sequenz, die getestet werden soll, nicht bekannt ist. Ein minimales Erfordernis ist eine ausreichende Information über die DNS-Sequenz, um die Synthese oder Gewinnung eines Oligonucleotid-Primers zu erlauben, der an der normalen DNS- Matrize an sie binden und die DNS-Synthese starten wird. Es können konkurrierende Oligonucleotid-Primer verwendet werden, die sich von den Oligonucleotid-Primern unterscheiden, die an die normale DNS- Matritze binden. Vorausgesetzt, daß irgendein Primer auf eine Art markiert ist, daß er von anderen konkurrierenden Oligonucleotid-Primern unterschieden werden kann, dann kann die Konkurrenz zwischen dem markierten Primer und anderen Primern mittels der Inkorporierung der Markierung in das DNS-Verlängerungsprodukt überwacht werden.
- Das konkurrierende Oligonucleonid-Priming-Verfahren kann für eine Vielfalt von Zwecken verwendet werden. Es kann zur Ermittlung bekannter genetischer Sequenzen verwendet werden. Eine Anwendung ist die Erbkrankheits-Ermittlung. Irgendeine Erbkrankheit, für die die Mutation(en) bekannt ist (sind) und die umgebende Nucleotid-Sequenz bekannt ist, kann mit diesem Verfahren ermittelt werden. Bei Sichelzellenanämie zum Beispiel führt ein einziger Basenaustausch zu der Erbkrankheit. Die Mutation und die umgebende Sequenz sind bekannt und daher kann das konkurrierende Oligonucleotid-Primer- Verfahren zur Ermittlung von Sichelzellenanämie verwendet werden. Da das konkurrierende Oligonucleotid-Verfahren eine relativ einfache, schnelle, preiswerte und genaue Untersuchung ist, sollte es zur Diagnose das Verfahren der Wahl werden. Zum Beispiel dauert es nur etwa 6 Stunden von der Zeit, wenn die Probe genommen wird, bis das Ergebnis bekannt ist.
- Andere Krankheiten einschließlich Thalassämie, Ornithintranscarbamylase-Mangel, Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl- Transferase-Mangel sind Phenylketonurie können unter Verwendung dieses Verfahrens leicht ermittelt werden. Dieses Verfahren kann angewendet werden auf Zellen, die gewonnen wurden durch Biopsie, Amniocentese oder als chononische Villi. Da das Verfahren DNS- Basenaustausch direkt mißt, gibt es keine Beschränkungen hinsichtlich der Entwicklungszeit oder des Gewebes, das untersucht werden muß. Das einzige Erfordernis ist, daß es an der Stelle, die die Primer binden werden, eine bekannte Sequenz gibt. Dieser Vorteil kann leicht richtig eingeschätzt werden bei einer Krankheit wie Phenylketonurie, die normalerweise nur in der Leber exprimiert wird. Das vorliegende Verfahren erlaubt den Nachweis von Phenylketonurie in Amnionflüssigkeit, chorionischen Villi oder Blut, ohne eine Leberbiopsie zu erfordern. So wird der Fachmann leicht die herausragenden Vorteile hinsichtlich Geschwindigkeit, Zeit, Sicherheit und Einfachheit der Durchführung der Untersuchung des vorliegenden Verfahrens erkennen.
- Von anderen Anwendungen kann man sich leicht ein Bild machen. Zum Beispiel Test auf Vaterschaft durch Testen von genetischen Polymorphismen an irgendeiner Anzahl von Stellen mit bekannten Sequenzen. Bei dem konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Verfahren könnte eine unterschiedliche Markierung für jede Stelle verwendet werden und auf diese Weise könnte eine Vielfalt unterschiedlicher Stellen gleichzeitig getestet werden. In ähnlicher Weise kann das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren zur Genkartierung und Verknüpfungs-Analyse verwendet werden. So könnte, selbst wenn das Gen selbst nicht bekannt ist, aber eine in nahem Zusammenhang stehende Sequenz mit einem Polymorphismus bekannt ist, das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren verwendet werden, um die genetische Verschiedenheit an der in Zusammenhang stehenden Sequenz nachzuweisen und eine Diagnose zu machen.
- Ein anderes Gebiet, auf dem das Verfahren eine breite Anwendbarkeit hätte, ist in der Gerichtsmedizin. In der Gerichtsmedizin wird der Nachweis genetischer Veränderung verwendet, um ein Verfahren zur Bestimmung der Herkunft der Probe zu schaffen. Das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren schafft ein schnelles und genaues Verfahren zur Bestimmung der Sequenzen einer Anzahl genetischer Stellen der gleichen Probe.
- Die Hinzufügung von zusätzlichem genetischem Material zu einem Genom kann eben falls durch das konkurrierende Oligonucleotid-Primer- Verfahren festgestellt werden. Zum Beispiel können verschiedene infektiöse Krankheiten durch die Anwesenheit spezifischer DNS- Sequenzen, die für den verursachenden Mikroorganismus charakteristisch sind, in klinischen Proben diagnostiziert werden. Zu diesen gehören Bakterien aus Klassen wie Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus bacillus; alle Pilze, alle Hefen und Viren wie Cytomegaloviren, Herpex simplex Typ I und II und HIV (Aidsvirus), die zu infektiösen Krankheiten führen. Wieder erlaubt die schnelle, relativ einfache Art des konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Verfahrens ein rasches Verfahren zum Nachweis von Krankheiten. Wegen der geringen Menge mancher dieser Mikroorganismen in einer biologischen Probe kann es notwendig sein, die Sequenzen von Interesse zu vermehren unter Verwendung des in den US-Patenten 4 683 195 und 4 683 202 beschriebenen PCR- Verfahrens, bevor man die konkurrierende Oligonucleotid-Primer- Untersuchung der vorliegenden Erfindung anwendet.
- Eine andere wichtige Verwendung dieses Verfahrens ist der Nachweis von Neoplasmen und die Überwachung der Therapie des Neoplasmus.
- Weil viele Neoplasmen zu Mutationen genetischer Sequenzen im Genom des Wirts oder zur Einfügung bekannter Sequenzen führen, kann das konkurierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren zum Nachweis dieser Sequenzen verwendet werden. Obwohl der Nachweis von Neoplasmen wichtig ist, ist die Überwachung der Therapie noch wichtiger. Nach dem Einsetzen der Therapie, ob durch Arzneimittelbehandlung oder Radioaktivität, führt eine erfolgreiche neoplastische Therapie zum Verschwinden der mit der Krankheit in Verbindung stehenden Sequenz. So könnten, nachdem die Therapie begonnen wurde, Proben genommen werden, und das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren verwendet werden, um den Verlauf und die Wirksamkeit der Therapie zu verfolgen. Dies würde eine bessere Rückfall-Prognose schaffen, da sehr kleine Mengen der Sequenz nachgewiesen werden können, der Test relativ schnell ist und viele Proben über die Zeit hin überwacht werden können.
- Zusätzlich zu den vielen Verwendungen des konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Verfahrens bei Menschen gibt es auch ausgedehnte Möglichkeiten für die Verwendung des Verfahrens bei Tieren. In vielen Fällen, zum Beispiel Pferderassen und Zuchtviehbestand, bei Kühen, Schweinen, Hunden, Katzen und anderen Tieren könnte das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren verwendet werden, um die Reinheit der Rasse zu bestimmen. Da das Bestimmen der Reinheit der Rasse ein Maß der Gleichheit der genetischen Sequenz ist und da der konkurrierende Oligonucleotid- Primer verwendet werden kann, um schnell und rasch genetische Sequenzen zu messen, kann er als ein genaues Maß der Reinheit der Rasse bei Tieren verwendet werden. Wie bei Menschen kann das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren auch für Stammbaums- Analyse und Suche nach Krankheiten bei Tieren verwendet werden. Wieder würde dies wichtig sein bei Tierverwandtschaft, zum Beispiel Rassepferden, Bullenzucht-, Milchvieh- und Rindviehzucht-, Hühnerzucht- und Schweinzucht-Programmen. Zusätzlich könnte, da Krankheitszustände genau und schnell bestimmt werden können, die Länge der Quarantäne für importierte Tiere wesentlich verringert werden.
- Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung angeboten und sollen die Erfindung nicht in irgendeiner Weise beschränken. In diesen Beispielen sind, wenn nicht anders angegeben, alle Prozentangaben in Gewichts-%, wenn für Feststoffe, und in Volumen-%, wenn für Flüssigkeiten, und alle Temperaturen sind in Grad Celsius.
- Ein Beispiel für Punktmutations-Nachweis nach dem konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Verfahren wird aufgezeigt unter Verwendung von geklonten cDNS-Sequenzen von dem Mäuse-Ornithintranscarbamylase- OTC-Gen (Veres et al. Science 237 415 (1987)). Die Zielsequenzen sind geklonte cDNS von normalen OTC-Mäusen und Mutanten-OTC-cDNS von "Dünnfell"-Mäusen mit OTC-Mangel, die identisch sind mit Ausnahme der Substitution eines A:T-Basenpaars gegen ein C:G- Basenpaar an einer vorbestimmten Position. Zwei Oligomere (12-Mers), die entweder zu der (+) oder (spf) cDNS-Sequenz komplementär waren, wurden synthetisiert und sind in Tabelle 1 als #92 bzw. #93 gezeigt. Die vollständige DNS-Sequenz des Bereichs, der die Primer-Bindungsstellen umgibt, ist in Fig. 2B gezeigt. TABELLE 1 OLIGONUCLEOTID-PRIMER Nr. Sequenz Länge Matrize gemeinsam
- a Klammern bezeichnen gemischte Oligonucleotide an einer einzigen Position.
- Die in diesem Beispiel verwendeten DNS-Matritzen unterscheiden sich durch einen einzigen DNS-Basenpaar-Austausch. Die zwei Primer, #92 und #93, wurden zusammen mit einem dritten, gemeinsamen Oligonucleotid-Primer, #94, verwendet, der gegenläufig zu den zwei konkurrierenden Primern (#92 und #93) war. Die Primer #92 und #93 sind 12 Mers in der Länge und #94 ist ein Primer von 18 Mer in der Länge. Es wurden Doppelreaktionen durchgeführt, bei denen entweder das #92 oder #93-Oligomer mit ³²P radioaktiv markiert war. Bei diesen Reaktionen konkurrierten die Primer #92 und #93 zum Nachweis der Anwesenheit der spf-Mutation. Primer #94 war der gemeinsame Primer in der Reaktion.
- Es wurden insgesamt vier Reaktionen durchgeführt: (1) normale Matrize in Kombination mit radioaktiv markiertem normalem Primer und unmarkiertem Mutanten-Primer; (2) normale Matrize in Kombination mit unmarkiertem normalem Primer und radioaktiv markiertem Mutanten- Primer; (3) Mutanten-Matrize in Kombination mit radioaktiv markiertem normalem Primer und unmarkiertem Mutantenprimer; und (4) Mutanten- Matrize in Kombination mit unmarkiertem normalem Primer und markiertem Mutanten-Primer. So waren die chemischen Zusammensetzungen aller vier Reaktionen ähnlich, außer daß entweder die normale oder Mutanten-Matrize anwesend war mit einer radioaktiven Markierung, die entweder in dem normalen oder Mutanten-Primer der konkurrierenden Primer anwesend war.
- Die Matrizen waren anwesend in Mengen von jeweils etwa 500 ng. Primer #94 war anwesend in 4 uM und Primer #92 und #93 waren jeweils in 2 uM anwesend. Die Primer wurden am 5'-Ende mit ³²P radioaktiv markiert. Die Reaktionen wurden ausgeführt in etwa 30 uM Trisacetat bei etwa pH 7,9, etwa 10 uM Magnesiumacetat, etwa 10 uM Dithiothereitol und jeweils etwa 1,5 uM dATP, TTP, dCTP, dGTP. Das Gesamtvolumen der Reaktion war näherungsweise 100 ul. Die Proben wurden 2 Minuten lang auf etwa 105º erhitzt, 30 Sekunden bei etwa 28º verbunden, und es wurden etwa 5 Einheiten des Klenow-Fragments von DNS-Polymerase 1 von E. coli hinzugefügt. Die DNS-Polymerisierung wurde etwa 2 Minuten durchgeführt. Der Zyklus des Erhitzens, Abkühlens und der DNS-Polymerisierung wurden etwa 10 mal wiederholt. Die Reaktionsprodukte wurden analysiert mittels Elektrophorese auf einem 4% NuSieve-Agarosegel, gefolgt von Autoradiographie.
- Jede Reaktion erzeugte ein 72 bp-Fragment, das dem Bereich zwischen den Primern #94 und entweder #92 oder #93 entsprach (Fig. 3A). Jede Spur enthält das Produkt von 10 Zyklen der PCR-Vermehrung unter Verwendung von entweder (+) OTC-geklonter cDNS (Spuren 1 und 2) oder spf OTC-geklonter cDNS (Spuren 3 und 4). Spuren 1 und 3 enthielten zu (+) OTC-cDNS spezifische radioaktiv markierte Primer, Spuren 2 und 4 enthielten für spf-OTC-cDNS spezifische radioaktiv markierte Primer. Das COP-Ereignis wurde durch PCR-Vermehrung in ein 72bp-Produkt vermehrt.
- Die Anwesenheit des 72bp-Fragments in jeder Reaktion zeigt, daß wirkungsvolle Verlängerung voll Oligonucleotid-Primern an jeder der erwarteten Positionen stattfand, und daß Vermehrung erreicht wurde. Autoradiographische Analyse des Agarosegels enthüllte bevorzugte Verwendung der perfekt passenden Primer an Stellen, wo die zwei konkurrierenden Primer binden könnten (Fig. 3B). So zeigten die Reaktionen (1) und (4) Einbau von Radioaktivität in das Reaktionsprodukt, und im Gegensatz dazu hatten die Reaktionen (2) und (3) keine Radioaktivität in das Reaktionsprodukt eingebaut. Der Unterscheidungsgrad der Untersuchung, das heißt, das Ausmaß bevorzugter Verwendung des korrekt angepaßten Primers gegenüber und über dem Fehlpaarungs-Primer, ist in Fig. 3B gezeigt. Wo man erwartet, daß die Radioaktivität inkorporiert wird, ist das radioaktive Signal größer als das Hundertfache des Falles, wo man erwartet, daß die Radioaktivität ausgeschlossen wird.
- Um das COP-Prinzip weiter zu erläutern und um die Wirksamkeit der Länge der konkurrierenden Oligomere hinsichtlich des COP-Phänomens zu untersuchen, wurden Experimente durchgeführt unter Verwendung von einzelsträngiger DNS-Matritze, die von dem filamentösen Phagen M13mp18 stammte.
- Das nützliche Merkmal von mp18 ist, daß es einen DNS-Bereich enthält, der innerhalb seiner Sequenz die Erkennungsstellen für die Spaltung durch eine Anzahl von Restriktions-Endonucleasen hat. Wenn mp18 mittels DNS-Synthese genau kopiert wird, werden die Restriktions- Endonuclease-Erkennungsstellen reproduziert. Abweichende DNS- Reproduktion, so, wie wenn ein fehlgepaarter DNS-Primer eingebaut wird, wird die Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen zerstören und Spaltung durch diese Enzyme verhindern. Wenn zwei Primer gleichzeitig als Primer für DNS-Synthese unter Verwendung von mp18 als eine DNS-Matrize vorgesehen werden, wobei ein Primer perfekt komplementär zu der Matrize ist und ein Primer eine einzelne DNS- Basenänderung enthält, die eine Restriktions-Endonuclease- Erkennungsstelle zerstört, kann die entsprechende Verwendung jedes der zwei Primer in der DNS-Synthesereaktion durch die Aktivität der Restriktions-Endonuclease hinsichtlich des Syntheseprodukts bestimmt werden. Dieses Beispiel beweist, daß perfekt angepaßte 12-Mer- Oligomere (A) und 20-Mer-Oligomere (B) jeweils verwendet werden können, um mp18-DNS zu kopieren und ein Syntheseprodukt zu erzeugen, das die ursprünglich anwesenden Restriktions-Endonuclease- Erkennungsstellen enthält. Als nächstes wurden die 12-Mers oder die 20- Mers mit anderen Oligonucleotid-Primern gemischt, die identisch waren mit Ausnahme der Anwesenheit von einzelnen DNS-Basen-Ersetzungen, welche die Restnktions-Endonuclease-Erkennungssequenzen zerstören, und dann wurden die DNS-Synthesereaktionen durchgeführt. Wenn die Primer-Mischung 12-Mers enthielt, wurde das perfekt angepaßte Oligomer vorherrschend bei der DNS-Synthesereaktion eingebaut, wie durch den Fortbestand von Endonuclease-Erkennungsstellen in den DNS- Syntheseprodukten enthüllt. Die Konkurrenzwirkung wurde verringert, wo die Oligomer-Primer 20-Mers waren. So zeigen unter den hier verwendeten Bedingungen 12-Mer-Primer wirkungsvollere COP als 20- Mers.
- In diesem Beispiel war die DNS-Matrize eine einzelsträngige DNS des filamentösen Phagen M13 Mp18 (mp18). Es wurden drei Primer verwendet, um das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren zu demonstrieren. Ein 12-Mer-Primer, #85, der perfekt komplementär war zu einem Gebiet der mp18-DNS-Matrize, die die Restriktions- Endonoclease-Erkennungsstellen für RsaI und MspI enthielt, wurde synthetisiert. Ein 12-Mer-Primer, #86, wurde unter Verwendung von Misch-Kopplungsfunktionen an einem Oligonucleotid-Synthesizer hergestellt. Primer #86 ist identisch zu Primer #85, mit der Ausnahme, daß an zwei Nucleotid-Positionen innerhalb der #86-Sequenz während der Herstellung ein Paar DNS-Basen hinzugefügt wurde. So war die #86-"Familie" zusammengesetzt aus näherungsweise 25% AGCTCGG AC C 25% AGCTCGG AC C, 25% AGCTCGG AC C und 25% AGCTCGG AC C. Die Basen- Substitutionen an den zwei Positionen wurden verwendet, um Familienmitglieder darzustellen, die entweder (a) perfekt komplementar waren zu der mp18 Matrize od er (b), wenn sie an die mp18 Matrize hybridisiert würden, ein Reaktionsprodukt erzeugen würden, das nicht länger die korrekte DNS-Sequenz für Erkennung und Spaltung durch die Restriktions-Endonucleasen RsaI oder MspI besitzen würde. Ein 15- Mer-Primer, #1, der komplementär war zu der mp18-DNS, in entgegengesetzter Richtung zu und näherungsweise 25 Basenpaare von den #85- und #86-Bindungsstellen war, wurde ebenfalls hergestellt. Primer #1 war der gemeinsame Olionucleotid-Primer. Primer #1 wurde mit ³²P am 5'-Ende radioaktiv markiert. Die Sequenz des Primers ist in Tabelle 1 gezeigt. Die DNS-Sequenz des die Primer-Bindungsstellen umgebenden Gebiets ist in Fig. 2A gezeigt.
- Zwei Reaktionen wurden durchgeführt. Jede enthielt etwa 500 ng mp18- DNS-Matrize, etwa 4 uM radioaktiv markierten Primer #1 in etwa 30 uM Trisacetat bei etwa pH 7,4, etwa 50 uM Natriumacetat, etwa 10 uM Magnesitimacetat, etwa 10 uM Dithiothreitol und etwa 1,5 uM jeweils voll dATP' TTP' dCTP, dETP, das Gesamtvolumen war näherungsweise 100 ul. Eine Reaktion enthielt Primer #85 und die andere enthielt Primer-Familie #86. Die Reaktionsmischungen wurden etwa 2 Minuten lang auf etwa 105º erhitzt etwa 30 Sekunden lang auf etwa 28º abgekühlt, etwa 5 Einheiten des großen Fragments von DNS-Polymerase 1 von E. coli wurden hinzugefügt und es wurde etwa 2 Minuten lang bei etwa 28º DNS-Polymerisierung durchgeführt. Das Erhitzen, Verbinden und die DNS-Polymerisierung wurden zehnmal wiederholt. Nach 5 und 10 Durchgängen der Vermehrung wurden gleiche Teile jeder Reaktion genommen und entweder direkt durch Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert oder mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt und dann mittels Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert.
- Fig. 4A zeigt, daß das Material, das nicht mit Restriktions-Endonuclease behandelt wurde (ungeschnitten), durch ein 85 bp-Fragment dargestellt wird. Das 85 bp-Fragment ist radioaktiv, weil es Primer #1 enthält. Wenn Proben aus der ersten Reaktion, die Primer #85 enthielt, mit der Restriktions-Endonuclease PstI, die die DNS-Sequenz zwischen den Bindungsstellen für Primer #1 und Primer #85 erkennt und spaltet, behandelt wurden, dann wird, wie erwartet, ein radioaktiv markiertes 48 bp-Produkt erzeugt. Da die PstI-Erkennungssequenz zwischen den Oligonucleotid-Primern ist und während aufeinanderfolgender Durchgänge der DNS-Synthese genau hätte kopiert werden sollen, dient die PstI-behandelte Probe als eine Kontrolle.
- Wenn Proben aus der ersten Reaktion, die Primer #85 enthielten, mit der Restriktions-Endonticlease RsaI oder MspI behandelt wurden, wurden die erwarteten radioaktiv markierten 76 bp- und 75 bp- Fragmente erzeugt, Fig. 4A. Die Anwesenheit der RsaI- und MspI- Restriktions-Endonuclease-Erkennungssequenz zeigt an, daß während der aufeinanderfolgenden Durchgänge der DNS-Synthese Primer #85 genau eingebaut wurde.
- Wenn die Produkte der zweiten Reaktion, die Primer-Familie #86 enthielt, in der gleichen Weise analysiert wurden, wurde ein ähnliches Ergebnis beobachtet (Fig. 4A). Das heißt, die Restriktions-Endonuclease PstI spaltete ein 48 bp-Fragment, was zeigt, daß der Bereich zwischen Primer #1 und der Primer-Familie #86 während aufeinanderfolgender Durchgänge der DNS-Synthese gen au kopiert wurde. Mit RsaI oder MspI wurde jedoch auch eine vollständige Spaltung des 85 bp-Fragments beobachtet. Dieses Ergebnis zeigt an, daß ein einzelnes Mitglied der Primer #86 Oligonucleotid-Familie mit vier Mitgliedern während der aufeinanderfolgenden Durchgänge der DNS-Synthese bevorzugt eingebaut wurde. Der Fehlschlag, irgendeines der anderen drei Familienmitglieder, die DNS-Basenfehlpaarungen enthielten, einzubauen, beweist den wirkungsvollen Wettbewerb eines perfekt angepaßten Primers mit anderen Primern, die keine perfekten Anpassungen für die DNS-Matrize sind.
- Dieses Verfahren, das 20-Mer-Oligomere verwendet, ist vom Konzept her ähnlich zu dem obigen Beispiel das 12-Mers verwendet.
- Wieder wurde eine einzelsträngige DNS des filamentösen Phagen M13 mp18 als die Matrize verwendet. Es wurden drei Primer verwendet, um das konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Verfahren zu zeigen. Ein 20- Mer-Primer, #89, wurde verwendet, der eine perfekte Anpassung darstellte für einen Bereich der mp18-DNS-Matrize, welche die Restriktions-Endonuclease-Erkennungsstellen für SacI, RsaI und MspI enthielt. Ein 20-Mer-Primer, #90, Oligonucleotid-"Familie", wurde unter Verwendung von Mischkopplungsfunktionen an einem Oligonucleotid-Synthesizer hergestellt. Primer #90 ist dem Primer #89 ähnlich mit der Ausnahme, daß an drei Positionen innerhalb der #90 Sequenz ein Paar von DNS-Basen während der Synthese hinzugefügt wurde. So hat die #90 Oligonucleotid-Familie acht Mitglieder, wobei eines DNS-Sequenzen enthält, die von allen drei Restriktions- Endonucleasen erkannt werden, drei Kombinationen von zwei Stellen enthalten, drei eine Stelle enthalten und eines keine Restriktionsstellen hat. Außerdem wird jede Stelle gleichermaßen mittels einer perfekten Anpassung für die mp18-DNS- Matrize verkörpert. Der 15-Mer-Primer, #1, wurde als der gemeinsame Primer verwendet. Die Sequenzen der Primer sind in Tabelle 1 gezeigt. Die DNS-Sequenz, die die Primer- Bindungsstellen umgibt, ist in Fig. 2A gezeigt. Die Bedingungen für jede Reaktion waren die gleichen wie die oben beim konkurrierenden Oligonucleotid-Primen von mp18 mit 12-Mers verwendeten.
- Wenn nach zehn Zyklen der DNS-Synthese Proben aus den Reaktionen, die Primer #89 enthielten, genommen und mit den Restriktions- Endonucleasen PstI, SacI, RsaI oder MspI behandelt wurden, dann wurde ein radioaktiv markiertes 91 bp-Fragment beobachtet, das durch die Restriktions-Endonucleasen auf 81, 76 bzw. 75 bps reduziert werden konnte (Fig. 4B). Dies zeigte an, daß sowohl der Bereich zwischen den Primern #1 und 89 als auch die voll Primer Nr. 89 überlappten DNS- Sequenzen während der wiederholten Durchgänge der DNS-Synthese getreulich kopiert wurden.
- Im Gegensatz dazu waren einige der Produkte der die Oligonucleotid- Primer-Familie #90 enthaltenden Reaktion widerspenstig gegen Spaltung durch die Restriktions-Endonucleasen SacI, RsaI und MspI (Fig. 4B). Die Restriktions-Endonuclease PstI, die DNS-Sequenzen zwischen den Oligonucleotid primenden Stellen erkennt, spaltete das Reaktionsprodukt wirksam. Der Spaltungs-Fehlschlag lag daher an dem Einbau der fehlgepaarten Oligonucleotide aus der #90 Oligonucleotid-Familie. So können, während das Experiment mit mp18-DNS und 12 Mers, Beispiel 2(A) oben, veranschaulicht, daß, unter diesen Reaktionsbedingungen, 12 Mers einen wirkungsvollen Wettbewerb um eine einzigartige DNS- Prime-Stelle ausführen können, längere (20 Mer) Oligomere weniger wirkungsvolles konkurrierendes Oligonucleotid-Primen ausüben.
- Die Mutation bei Menschen, die Sichelzellen-Anämie verursacht, ist ebenfalls durch konkurrierendes Oligonucleotid-Primen nachweisbar. Die normale DNS-Sequenz (β&spplus;) des menschlichen β-Globin-Gens im Bereich des β-Sichelzellen-Allels ist:
- Und die Stelle des einzelnen DNS-Basenaustauschs, die die βS (Sichelzellen)-Hämoglobin-Krankheit verursacht, ist mit einem Pfeil bezeichnet. Der Basenaustausch, der zu dem βS-Genotyp führt, ist A → T. Daher können die folgenden Primer aufgebaut und bei dem konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Nachweis verwendet werden:
- (1) 5'- CTC.CTG.AGG.AGA.-3' (12-Mer-β&spplus; spezifisch)
- (2) 5'-CTC.CTG.TGG.AGA.-3' (12-Mer-βS spezifisch)
- Die Primer (1) und (2) können unterscheidend markiert und dann gleichzeitig in einer COP-Reaktion entweder mit geklonten β&spplus;-Globin- oder βS-Globin-Sequenzen verwendet werden.
- Der erfolgreich konkurrierende Primer wird dann unter Verwendung eines dritten Primers zur Vermehrung des Verlängerungsprodukts des konkurrierenden Primers der die DNS erfolgreich band, identifiziert:
- (3) 5'- CGT.TCA.CCT.TGC.CCC.ACA.GG-3'
- Primer 3 wird die DNS-Synthese in einer entgegengesetzten Richtung zu den Primern 1 oder 2 starten. Wenn dieser Nachweis unter Verwendung des Primer-Trios 1, 2 und 3 durchgeführt wird, dann wird ein 47 bp- Fragment erzeugt und würde die wahre DNS-Sequenz der DNS-Matrize angeben.
- Wenn das zu untersuchende Ausgangsmaterial eine komplexe DNS- Mischung war, z. B. menschliche genomische DNS, dann können zuerst zwei Primer verwendet werden, um die das βS-Mutantenallel enthaltende Stelle zu vermehren.
- Zum Beispiel vermehren die Oligonucleotide
- 5'-TGG.TCT.CCT.TAA.ACC.TGT.CTT.G-3'
- 5'-ACA.CAA.CTG.TGT.TCA.CTA.G-3'
- ein 167 bp-Segment des menschlichen β-Globin-Gens, das zu den hierin beschriebenen Primern 1, 2 und 3 komplementäre DNS enthält.
- Nach der Vermehrung des die βS-Mutation enthaltenden Bereichs kann der konkurrierende Oligonucleotid-Primer-Nachweis wie oben beschrieben durchgeführt werden. In jedem Fall würden die entweder den B&spplus;- oder BS-Allelen entsprechenden Oligomere markiert werden, um von den anderen Oligomeren unterschieden zu werden. Der Nachweis der einzigartigen Markierung ist der Endpunkt des Nachweises.
- Die Mutationen bei Menschen, die zu einem Mangel an α&sub1;-Antitrypsin führen, sind auch durch konkurrierendes Oligonucleotid-Primen nachweisbar. Die normale menschliche DNS-Sequenz (M) in dem α&sub1;- Antitrypsin-Gen, welche die das α&sub1;-Z-Allel enthaltende Stelle umgibt, ist:
- und die bei dem Pfeil (G → A) gezeigte Mutation verursacht das Mutanten-Z-Allel.
- In ähnlicher Weise ist die normale menschliche DNS-Sequenz (M) in dem α&sub1;-Antitrypsin-Gen, welche die das α&sub1;-S-Allel enthaltende Stelle umgibt:
- und die gezeigte Mutation (A → T) verursacht das S-Allel.
- So können für die Unterscheidung des M/Z-Allelpaars oder des M/S- Allelpaars spezifische Primer aufgebaut werden:
- (A) M/Z (1) 5'-ATC.GAC.GAG.AAA.-3' (M)
- (2) 5'-ATC.GAC.AAG.AAA.-3' (Z)
- (B) M/S (3) 5'-ACC.TGG.AAA.ATG.-3' (M)
- (4) 5'-ACC.TGG.TAA.ATG.-3' (S)
- Die Primer (1) und (2), und (3) und (4) können unterscheidend markiert und bei dem konkurrierenden Oligonucleotid-Primer-Nachweis verwendet werden, um geklonte normale (M) oder mutierte (Z oder S) α&sub1;-Antitrypsin-DNS-Sequenzen zu unterscheiden. Die Verlängerungsprodukte der erfolgreich konkurrierenden Primer können, nach Vermehrung, durch Verwendung von gemeinsamen Primern nachgewiesen werden.
- Zum Beispiel werden die Primer (1) und (2) plus Primer (5) (5'- CAG.CCA.GCT.TCA.GTC.CCT.TTC-3') zusammen bei der Reaktion ein Fragment von 81bp erzeugen. Die Primer (3) und (4) plus Primer (6) (5'-GGG.AAT.CAC.CTT.CTG.TCT.TC-3') werden ein Fragment von 70 bp erzeugen.
- Wenn das Ausgangsmaterial Proben menschlicher genomischer DNS enthält, dann können die Primer-Sets
- 5'-ACG.TGG.AGT.GAC.GAT.GCT.CTT.CCC-3' und
- 5'-GTG.GGA.TTC.ACC.ACT.TTT.CCC-3',
- die die Mutations-Stelle für das Z-Allel flankieren, aber nicht enthalten, verwendet werden, um ein das Z-Allel enthaltendes 450 bp-Fragment des α&sub1;-Antitrypsin-Gens vorzuvermehren. Die Primer-Sets
- 5'-GAA.GTC.AAG.GAC.ACC.GAG.GAA-3' und
- 5'-AGC.CCT.CTG.GCC.AGT.CCT.AGT.G-3',
- die die Mutations-Stelle für das S-Allel flankieren, aber nicht enthalten, können zur Vorvermehrung einer das S-Allel enthaltenden 340 bp- Region des α&sub1;-Antitrypsin-Gens verwendet werden.
- Die vermehrten Mutations-Stellen könnten dann als Ausgangsmaterial für die COP-Analyse verwendet werden, unter Verwendung der konkurrierenden Oligonucleotide und ihrer gegen überstehenden gemeinsamen Primer. Zum Beispiel konkurrieren die Primer (1) und (2) darum, an die Stelle des Z-Allels innerhalb des vermehrten 450 bp- Fragments zu binden. Das Verlängerungsprodukt des erfolgreich konkurrierenden Primers, entweder (1) oder (2), kann dann nach Vermehrung durch den Gebrauch des gemeinsamen Primers (5) nachgewiesen werden. In ähnlicher Weise konkurrieren die Primer (3) und (4) darum, an die Stelle des S-Allels innerhalb des 340 bp- Fragments zu binden, und das Verlängerungsprodukt des erfolgreich konkurrierenden Primers, entweder (3) oder (4), kann nach Vermehrung durch die Verwendung des gemeinsamen Primers (6) nachgewiesen werden.
- Ein Fachmann wird leicht erkennen, daß die vorliegende Erfindung gut dazu ausgelegt ist, die erwähnten Aufgaben auszuführen und die erwähnten Zwecke und Vorteile zu erreichen. Die hierin beschriebenen Verfahren, Vorgehensweisen und Techniken sind gegenwärtig repräsentativ für die bevorzugten Ausführungsformen, sollen beispielhaft sein und sollen den Schutzumfang nicht beschränken.
Claims (11)
1. Verfahren zum Feststellen der Anwesenheit oder
Abwesenheit einer spezifischen bekannten
Nucleinsäure-Sequenz oder zur Unterscheidung zwischen
verschiedenen Sequenzen, folgende Schritte
aufweisend:
Hinzufügen von konkurrierenden Oligonucleotid-
Primern zu einer Probe von Nucleinsäuren oder
einer Mischung von Nucleinsäure, wobei die
konkurrierenden Oligonucleotid-Primer mindestens zwei
Primer aufweisen, einen, der zu der spezifischen
bekannten Sequenz im wesentlichen komplementär
ist, und mindestens einen anderen Primer, der mit
der spezifischen bekannten Sequenz mindestens eine
zusätzliche Basenfehlpaarung aufweist;
Bevorzugtes Hybridisieren des im wesentlichen
komplementären Primers an die spezifische bekannte
Sequenz unter Konkurrenzbedingungen;
Verlängern des bevorzugt hybridisierten Primers
von seinem 3'-Ende aus zur Synthese eines
Verlängerungsprodukts, das komplementär ist zu dem
Strang, an den der Primer hybridisiert wird; und
Identifizieren des Verlängerungsprodukts.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das vor dem Hinzufügen
von konkurrierenden Oligonucleotid-Primern
folgende Schritte aufweist:
Verbinden eines spezifischen Oligonucleotid-
Primers mit jeder spezifischen bekannten Sequenz;
Verlängern eines jeden der verbundenen Primer von
seinem 3'-Ende aus zur Synthese eines
Verlängerungsprodukts, das komplementär ist zu dem
mit dem Primer verbundenen Strang, wobei das
Verlängerungsprodukt nach dem Abtrennen von seinem
Komplement als eine Matrize dient für die Synthese
eines Verlängerungsprodukts eines anderen der
Primer;
Abtrennen des Primer-Verlängerungsprodukts von den
Matrizen, an denen sie synthetisiert wurden, zur
Erzeugung einsträngiger Moleküle;
Vermehren der einsträngigen Moleküle mit der
spezifischen bekannten Sequenz durch mindestens
einmaliges Wiederholen der Schritte des
Verbindens, Verlängerns und Abtrennens.
3. Verfahren nach Anspruch 1, folgende weitere
Schritte aufweisend:
Hinzufügen eines gemeinsamen Oligonucleotid-
Primers vor dem Identifizierungs-Schritt;
Verbinden des im wesentlichen komplementären
konkurrierenden Oligonucleotid-Primers und des
gemeinsamen Nucleotid-Primers mit getrennten,
komplementären Strängen unter Bedingungen, unter
denen der gemeinsame Primer sich mit einem der
komplementären Stränge verbindet, und der im
wesentlichen komplementäre konkurrierende
Oligonucleotid-Primer sich mit dem anderen
komplementären Strang verbindet, der die
spezifische bekannte Sequenz enthält;
Verlängern der verbundenen Primer von ihren 3'-
Enden aus zur Synthese eines
Verlängerungsprodukts, das zu den mit den Primern
verbundenen Strängen komplementär ist, wobei das
Verlängerungsprodukt nach dem Abtrennen von seinem
Komplement als eine Matrize dient für die Synthese
eines Verlängerungsprodukts des anderen der
verbundenen Primer;
Abtrennen der Verlängerungsprodukte von den
Matrizen zur Erzeugung einsträngiger Moleküle;
Vermehren der einsträngigen Moleküle mit der
spezifischen bekannten Sequenz durch mindestens
einmaliges Wiederholen der Schritte des
Verbindens, Verlängerns und Abtrennens;
Identifizieren des vermehrten
Verlängerungsprodukts.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum
Feststellen einer Erbkrankheit, die herrührt von
mindestens einer Mutation in einer spezifischen
bekannten Nucleinsäure-Sequenz, bei dem die
konkurrierenden Oligonucleotid-Primer mindestens
zwei Primer aufweisen, einen, der im wesentlichen
komplementär ist zu der normalen genetischen
Sequenz, und mindestens einen, der im wesentlichen
komplementär ist zu der mutierten genetischen
Sequenz; und bei dem die im wesentlichen
komplementären Primer unter Konkurrenzbedingungen
bevorzugt an die geeigneten Stränge, die die
spezifische bekannte Sequenz enthalten, hybridisiert
werden.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei dem die konkurrierenden Oligonucleotid-Primer
etwa 8 bis 30 Monomere lang sind.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei dem mindestens einer der konkurrierenden
Oligonucleotid-Primer markiert ist und das
Verlängerungsprodukt identifiziert wird durch
Feststellen der Anwesenheit oder Abwesenheit der
Markierung in dem Verlängerungsprodukt.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei dem die Markierung ausgewählt ist aus der
Gruppe, die besteht aus Radioisotopen,
Fluoreszenzfarbstoffen,
Chemilumineszenzfarbstoffen, Enzymen und Antikörpern.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, bei
dem der gemeinsame Oligonucleotid-Primer an einen
festen Träger gebunden ist und das vermehrte
Verlängerungsprodukt identifiziert wird durch Messen
der Anwesenheit oder Abwesenheit der an dem festen
Träger befestigten Markierung.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, bei
dem die spezifische Nucleinsäure-Sequenz
mindestens eine Mutation enthält, die eine
Erbkrankheit verursacht.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei
dem jeder konkurrierende Oligonucleotid-Primer
verschieden markiert wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, folgende weitere
Schritte aufweisend:
Auftrennen der Probe in eine Mehrzahl von
Portionen vor dem Hinzufügen der konkurrierenden
Oligonucleotid-Primer;
Hinzufügen eines unterschiedlichen, markierten
konkurrierenden Oligonucleotid-Primers zu jeder
der Portionen; und
Messen der Anwesenheit oder Abwesenheit der
Markierung in den Verlängerungsprodukten in jeder
der Portionen.
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