DE3626414C2

DE3626414C2 - Präparat zur Stimulierung von Chondrocyten und Osteoblasten (Ossein-Hydroxyapatit-Komplex), Verfahren zu seiner Herstellung und dieses enthaltende Arzneimittel

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Publication number: DE3626414C2
Application number: DE3626414A
Authority: DE
Original assignee: Robapharm AG
Current assignee: Robapharm AG
Priority date: 1986-08-05
Filing date: 1986-08-05
Publication date: 1994-11-10
Anticipated expiration: 2006-08-06
Also published as: AR242589A1; FI91877B; AU604014B2; DE3626414A1; EP0255565B1; KR880002534A; IL82213A0; EP0255565A3; NO871599D0; AU7157787A; ZA872701B; FI871670A; IE870983L; ES2041647T3; NO871599L; DK196387D0; HU205373B; GR3005579T3; JPH0558606B2; US4919931A

Description

Die Erfindung betrifft einen Ossein-Hydroxyapatit-Komplex (OHK) zur Stimulierung von Chondrocyten und Osteoblasten. Außerdem betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung des OHK. Die Erfindung betrifft ferner Arzneimittel, insbesondere zur oralen Verabreichung zur Prophylaxe und Behandlung von Osteoarthrose und Osteoporose und der Heilung von Knochenbrüchen, Knorpel- und Knochendefekten.

Ein mikrokristallines Hydroxyapatit-Präparat (MCHC) zur Verhinderung der Osteoporose aufgrund einer Corticosteroid- Therapie ist bekannt; vgl. A. Pines et al., Current Medical Research and Opinion, Vol. 8, No. 10, 1984, 734- 742. Das Präparat besteht zu etwa 50 Gew.-% aus einem Komplexsalz aus Hydroxyapatit und Calciumphosphat. Ferner enthält es etwa 26% Kollagen und etwa 9% nicht-kollagene Proteine/Peptide. Es enthält ferner etwa 0,65% Natrium sowie Magnesium und Kalium und als Spurenelemente Fluor, Zink, Strontium, Silicium, Eisen, Rubidium, Caesium und Platin. Schließlich enthält das Präparat Glucosaminoglykane, Citrat und Wasser. Über die Herstellung von MCHC ist nichts Näheres bekannt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Ossein- Hydroxyapatit-Komplex (OHK) sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe ist es, Arzneimittel bereitzustellen, die OHK enthalten, und die sich zur Stimulierung (Proliferation) von Chondrocyten und Osteoblasten und damit zur Prophylaxe und Behandlung von Osteoarthrose und Osteoporose und bei der Heilung von Knochenbrüchen, Knorpel- und Knochendefekten eignen.

Es wurde gefunden, daß OHK eine spezifische Wirkung auf den Knochen- bzw. Knorpelstoffwechsel hat, denn es enthält organische Komponenten in nicht-denaturiertem Zustand sowie anorganische Komponenten in einem physiologisch ausgewogenen Mengenverhältnis. Durch die Applikation von OHK wird der Organismus von Mensch und Tier mit essentiellen Substanzen (nicht-kollagenen knochenspezifischen Peptiden, lokal wirksamen Knochen- bzw. Knorpelzell-Regulationsfaktoren, Calcium und Phosphat) des Skelettsystems versorgt. OHK unterstützt mit einer organischen Ossein-Matrix aus Kollagenen und essentiellen, knochenspezifischen, nichtkollagenen Peptiden bzw. Proteoglykanen den Knochenstoffwechsel, fördert die Knochenneubildung und steigert den Einbau der in der Ossein-Matrix eingebetteten anorganischen Komponenten aus Hydroxyapatit in den Knochen. Darüber hinaus stimuliert OHK die körpereigenen Reparaturmechanismen des Knorpels und schützt Knorpelgewebe vor Abbau.

OHK hat eine charakteristische biologische Wirkung gegenüber Osteoblasten. Diese Zellen sind für den Aufbau des Knochengewebes verantwortlich. OHK steigert die Proliferation und den Metabolismus von Osteoblasten und fördert darüber hinaus die Differenzierung von unspezifischen Mesenchymzellen zu Chondroblasten bzw. Osteoblasten. Damit ist OHK ein neuartiges Therapeutikum für Knochenerkrankungen verschiedener Genese, beispielsweise bei primären und sekundären Osteoporosen und bei Knochenbruch- bzw. Knochendefektheilungen bzw. zur Optimierung der Prothetik. Aufgrund der genannten zellbiologischen Eigenschaften, die in vivo pharmakologisch am Tier und klinisch am Menschen bestätigt wurden, ist OHK üblichen Calciumpräparaten sowie allen Knochenmehlen deutlich überlegen. Zu den reinen Knochenresorptions-Hemmstoffen innerhalb der Osteoporose- Therapeutika, z. B. Östrogene und Calcitonine, bietet OHK eine echte Alternative, da OHK nicht nur den Knochenabbau hemmt, sondern vor allem den Knochenaufbau fördert. Von den bestehenden Therapeutika, die ebenfalls den Knochenstoffwechsel fördern, z. B. Natriumfluorid und Diphosphonate, unterscheidet sich OHK durch eine deutlich geringere Anzahl von Nebenwirkungen, wie das Fehlen gastrointestinaler Störungen und Gelenkschmerzen. Diphosphonate haben eine sehr geringe therapeutische Breite. OHK ist dagegen praktisch ungiftig.

Ferner zeigt OHK eine biologische Wirkung auf Chondrocyten, die für den Aufbau und Abbau des Knorpelgewebes verantwortlich sind. Durch OHK werden Chondrocyten ohne Verlust ihres Phänotyps zur Proliferation und zur Steigerung ihres Metabolismus angeregt, sowie gegen iatrogene Noxen, z. B. Corticosteroide, geschützt. Daneben fördert OHK die Differenzierung von unspezifischen Mesenchymzellen zu Chondrocyten und fördert somit die chondroide Mataplasie, ein Vorgang, der bei der Regeneration von Knorpelgewebe eine bedeutende Rolle spielt.

Damit eignet sich OHK hervorragend zur Behandlung von Osteoarthrose, bei der eine Verminderung der Anzahl und der metabolischen Aktivität der Chondrocyten auftritt und bei der eine geordnete chondroide Metaplasie zur Knorpelregeneration nötig wäre. Außerdem ist OHK zur Behandlung von Osteoporose sowie zur Unterstützung der Heilung von Knochenbrüchen sowie von Knochen- und Knorpeldefekten geeignet.

Die biologische Aktivität von OHK läßt sich in vitro beispielsweise nachweisen als

- Stimulierung der DNA-Synthese von Osteoblasten, Chondrocyten und Fibroblasten,
- Stimulierung der Protein-Synthese von Chondrocyten und Fibroblasten,
- selektive Stimulierung der Kollagen-Gesamtsynthese von Chondrocyten im Vergleich zur Stimulierung der Gesamt- Protein-Synthese,
- Induktion der Synthese der Proteine x und y in Chondrocyten und
- Förderung der Differenzierung von unspezifischen Mesenchym-Zellen zu Chondrocyten bzw. Osteoblasten.

Bei der Stimulierung der Kollagen-Gesamtsynthese wird das Verhältnis der Kollagentypen I und II in Chondrocyten-Kulturen innerhalb von 24 Stunden nicht verändert, so daß der Phänotyp der Chondrocyten in diesem Zeitraum erhalten bleibt.

Die Bestimmung der biologischen Wirkung auf die DNA-Synthese wird in an sich bekannter Weise durch Messung der Stimulierung des ³H-Thymidin-Einbaus von Zellinien, beispielsweise von 3T3 Fibroblasten, vorgenommen; vgl. Jimenez de Asua et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Vol. 72 (1975), 2724-2728. Dabei handelt es sich um ein übliches biologisches Nachweisverfahren für mitogene Substanzen. Die Verwendung von Zellinien bei diesem Nachweisverfahren ist vorteilhaft, da sich Zellinien leicht züchten lassen.

Bei diesem Testverfahren wird von der Überlegung ausgegangen, daß nicht transformierte Fibroblasten in der Zellkultur zwei extreme Wachstumsstadien aufweisen. Im Stadium der Ruhe befinden sich die Zellen in der G₀-G₁-Phase des Zellzyklus und sind somit teilungsinaktiv. Daneben gibt es das Stadium der aktiven Proliferation. Der Übergang vom Stadium der Ruhe in das der Proliferation kann durch die Konzentration von essentiellen Nährstoffen, des Serums oder anderer wachstumsfördernder Faktoren reguliert werden. OHK enthält solche Wachstumsfaktoren. Diese lösen sich in neutral gepufferten, physiologischen Lösungsmitteln, wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder physiologischer Kochsalzlösung, und bewirken einen hohen stimulatorischen, dosisabhängigen Einbau von ³H-Thymidin durch ruhende 3T3 Fibroblasten.

Das häufig verwendete Verfahren der Sterilisation von Lebensmitteln und pharmazeutischen Präparaten durch Bestrahlung mit Gammastrahlen beeinträchtigt nicht die biologische Aktivität von OHK, gemessen am stimulatorischen Effekt auf die ³H-Thymidin-Aufnahme von 3T3 Fibroblasten.

Mit diesem experimentellen System läßt sich auch eine zellspezifische Stimulierung der DNA-Synthese von Osteoblasten nachweisen. Dabei werden aus Ratten-Calvarien durch sequentielle Enzymverdauung gewonnene Osteoblasten-Populationen verwendet. Die Osteoblasten-Populationen repräsentieren verschiedene Reifungsstadien der Osteoblasten. Dabei werden die Populationen I bis III als Präosteoblasten-ähnlich, die Populationen IV bis VII als Osteoblasten-ähnlich und die Population L als ruhende , Osteoblasten-ähnliche Zellen oder Osteocyten betrachtet.

Neutrallösliche OHK-Bestandteile stimulieren dosisabhängig die Osteoblasten der Populationen V und VI. Die Proliferation von parallel getesteten Primärkulturen von Rattenfibroblasten wird nicht stimuliert. Aus diesen experimentellen Befunden folgt, daß die neutrallöslichen OHK- Bestandteile eine Knochenzell-spezifische Aktivität aufweisen.

Die Bestimmung der biologischen Wirkung auf die Proteinsynthese erfolgt in an sich bekannter Weise durch Messung der Stimulierung des L-(5-³H)-Prolin-Einbaus von Zellen, beispielsweise von Zellinien, wie 3T3 Fibroblasten, oder von menschlichen Vorhaut-Fibroblasten. Bei diesem Verfahren wird von der Überlegung ausgegangen, daß die Proteinsynthese stimulierter Zellen steigt. Wird den stimulierten Zellen L-(5-³H)Prolin im Zellkulturmedium angeboten, so bauen sie es in die neu synthetisierten Proteine ein. Nach einer vorgegebenen Inkubationszeit wird die Menge der aufgenommenen Radioaktivität gemessen. Sie ist ein Maß für den stimulatorischen Effekt. OHK enthält neutrallösliche Bestandteile, die eine hohe stimulatorische, dosisabhängige Wirkung auf die Proteinsynthese von 3T3 Fibroblasten und von menschlichen Vorhaut-Fibroblasten haben.

Die Bestimmung der alkalischen Phosphatase erfolgt nach den Empfehlungen der Deutschen Gesellschaft für klinische Chemie, Z. Klin. Chem. und Klin. Biochem., Bd. 8 (1970), 658; 9 (1971), 464; 10 (1972), 182. Die Bestimmung der Phosphatase- Aktivität dient zur Qualitätskontrolle auf jeder Stufe des Verfahrens der Erfindung.

Die durch Analyse ermittelte Zusammensetzung von OHK (Werte aus etwa 150 Chargen) ist in Tabelle I zusammengefaßt.

Sinnenprüfung
feines bis leicht körniges, beige-graues Pulver mit schwachem Eigengeruch
Identität	- Nachweis von Calcium und Phosphat
	- Nachweis von Kollagen
Wassergehalt	< 7%
Glührückstand	51,3-62,7%
Calcium	19,2-23,6%
Phosphor	8,9-10,9%
Kollagen	23,4-28,6%
Nichtkollagene Proteine/Peptide	7,2-10,8%
Spurenelemente	Nachweis von F, Na, K, Mg, Fe, Zu, Cu und Ni
Phosphatase-Aktivität	0,5-15 mE/mg
Anomale Toxizität	keine Intoleranzanzeichen
Gesamtkeimzahl	< 10⁴/g
Hefen	< 10²/g
Enterobacteriaceen	< 10²/g
spezielle Keimarten	abwesend/g

Zur Herstellung von OHK werden erfindungsgemäß folgende Schritte ausgeführt:

Zunächst werden Knochen von foetalen bis etwa 12 Monate alten Säugetieren, die durch amtliche Tierärzte untersucht worden sind, entnommen. Nach dem Entbeinen werden die sauberen Knochen rasch tiefgefroren und bei etwa -20 bis -30°C bis zur Weiterverarbeitung aufbewahrt; vgl. Fig. 1, Ziff. 1. Vor der Weiterverarbeitung wird überprüft, ob die Knochen noch frisch sind. Dies ist an Geruch und Farbe der Knochen erkennbar. Ferner wird überprüft, ob die Knochen sauber sind und ob es sich um die gewünschten Knochen handelt. Gegebenenfalls werden die Knochen nach Größe und Form gemäß einem Lehrbuch der Anatomie für Haustiere bestimmt. Gegebenenfalls werden noch anhaftende Fleisch-, Sehnen- und Knorpelreste entfernt.

Falls Zweifel an der Tieridentität bestehen, kann auch eine Bestimmung der Tierart mit Hilfe üblicher immunbiologischer Reaktionen, z. B. Präzipitation, durchgeführt werden.

Sodann werden die Knochen in einem Brechwerk bis zu einer Partikelgröße von höchstens etwa 1 cm zerkleinert (vgl. Fig. 1, Ziff. 2). Anschließend werden die Knochenpartikel unter vermindertem Druck bei 20 bis 80°C bis zu einem Restwassergehalt von höchstens etwa 10% oder von etwa 10 bis 25% getrocknet (vgl. Fig. 1, Ziff. 3a und 3b). Das erhaltene Knochenmaterial wird sodann mit einer Säure, wie Salzsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure oder Citronensäure, auf einen pH-Wert von etwa 5,0 bis 5,5 eingestellt. Anschließend wird das Knochenmaterial mit einem hydrophilen und lipophilen Lösungsmittel bis zu einem Restwasser- und Festfettgehalt von höchstens etwa 5% dehydratisiert und entfettet oder zunächst mit einem hydrophilen Lösungsmittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restwassergehalt von höchstens etwa 5% dehydratisiert und sodann mit einem lipophilen Lösungsmittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restfettgehalt von höchstens etwa 5% entfettet (vgl. Fig. 1, Ziff. 4a und 4b).

Danach wird das erhaltene dehydratisierte und entfettete Knochenmaterial unter vermindertem Druck bei 20 bis 80°C weiter getrocknet, z. B. im Wirbelstrom, bis der Lösungsmittelgehalt höchstens etwa 1% beträgt (vgl. Fig. 1, Ziff. 5).

Je nach Verwendungszweck wird das erhaltene Knochenmaterial sodann in Mahl- und Siebanlagen in üblicher Weise zu Pulvern verschiedener Korngröße von etwa 50 bis 300 Mikrometer verarbeitet (vgl. Fig. 1, Ziff. 6).

Falls die im Knochenmaterial vorhandene Keimzahl mehr als etwa 10 000 pro Gramm beträgt, wird das Knochenmaterial in üblicher Weise sterilisiert, z. B. durch Behandlung mit Äthylenoxid oder durch Bestrahlung mit Gammastrahlen (vgl. Fig. 1, Ziff. 10 bis 12). Es wird das zur Herstellung von Arzneimitteln geeignete OHK erhalten (vgl. Fig. 1, Ziff. 13).

Gemäß einer Alternative des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die vorstehend beschriebenen Knochen von Säugetieren bis zu einer Partikelgröße von höchstens etwa 1 cm zerkleinert, z. B. in einem Brechwerk (vgl. Fig. 2, Ziff. 2). Die Knochenpartikel werden sodann mit einer Säure auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 eingestellt. Anschließend wird mit einem hydrophilen und lipophilen Lösungsmittel bis zu einem Restwasser- und Restfettgehalt von höchstens etwa 5% dehydratisiert und entfettet oder zunächst mit einem hydrophilen Lösungsmittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restwassergehalt von höchstens etwa 5% dehydratisert und anschließend mit einem lipophilen Lösungsmittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restfettgehalt von höchstens etwa 5% entfettet (vgl. Fig. 2, Ziff. 3a und 3b).

Das erhaltene dehydratisierte und entfettete Knochenmaterial wird sodann unter vermindertem Druck bei 20 bis 80°C weiter getrocknet, z. B. im Wirbelstrom, bis der Lösungsmittelgehalt höchstens etwa 1% beträgt (vgl. Fig. 2, Ziff. 4). Gegebenenfalls wird das Knochenmaterial wie vorstehend beschrieben weiter verarbeitet (vgl. Fig. 2, Ziff. 5 bis 11). Es wird das zur Herstellung von Arzneimitteln geeignete OHK erhalten (vgl. Fig. 2, Ziff. 12).

Vorzugsweise werden bei den vorstehend erläuterten erfindungsgemäßen Verfahren Röhrenknochen, wie Humerus, Femur, Tibia, Radius mit Ulna, Os metacarpale oder Os metatarsale, verwendet. Außerdem werden vorzugsweise Knochen von Rinderkälbern (Bos taurus) verwendet.

Es ist ersichtlich, daß die Trocknungs- und Entfettungstemperatur in jedem Fall mit abnehmendem Feuchtigkeits- und Lösungsmittelgehalt abgesenkt werden muß, um eine Denaturierung des Produktes zu vermeiden. Wie bereits erwähnt, wird bei der Dehydratisierung und Trocknung eine Temperatur von höchstens 80°C angewendet. Mit abnehmendem Wasser- und Lösungsmittelgehalt wird die Temperatur abgesenkt und sehr rasch gearbeitet.

Der Druck beim Entwässern und Trocknen beträgt höchstens etwa 100 mbar.

Typische Beispiele für geeignete lipophile Lösungsmittel sind Aceton, Trichloräthylen, Methylenchlorid und niedrig siedender Petroläther. Typische Beispiele für geeignete hydrophile Lösungsmittel sind Aceton, Äthanol und Isopropanol.

Das erhaltene OHK läßt sich in üblicher Weise zu oral applizierbaren Arzneimitteln, wie Granulaten, Filmtabletten, Kapseln, Drag´es, Pulvern oder Suspensionen, konfektionieren. Die Tagesdosen betragen 0,6 bis 10 g, unterteilt in 2 bis 3 Einzeldosen. Die Dosierungseinheit beträgt 200 bis 4000 mg.

Zur Herstellung eines Granulats wird OHK mit Füll- und Aromastoffen gemischt, mit Wasser befeuchtet, granuliert und getrocknet.

Zur Herstellung von Filmtabletten wird OHK feucht granuliert, getrocknet und anschließend gesiebt. Sodann werden Fliessregulier-, Schmier- und Sprengmittel beigemengt. Die preßfertige Mischung wird zu Kernen tablettiert und im Anschluß mit einer dünnen, gefärbten Lackschicht überzogen.

Zur Herstellung von Drag´es wird OHK feucht granuliert, getrocknet und gesiebt. Anschließend werden übliche Tablettierhilfsstoffe beigemengt und es wird zu Drag´ekernen verpreßt. Die Kerne werden isoliert, mit einer weißen Deckschicht versehen, gefärbt und poliert.

Zur Herstellung von Pulvern wird OHK zu einem Krustengranulat verarbeitet und anschließend aromatisiert und gesiebt.

Zur Herstellung von Suspensionen wird OHK zusammen mit viskositätserhöhenden Hilfsstoffen in Zuckersirup suspendiert. Die Suspension wird gefärbt, aromatisiert und konserviert.

Fig. 1: Dargestellt ist das Herstellungsschema von OHK gemäß Beispiel 1.

Fig. 2: Dargestellt ist das Herstellungsschema von OHK gemäß Beispiel 2.

Fig. 3. Dargestellt ist die Stimulierung des ³H-Thymidin- Einbaus von 3T3 Fibroblasten mit einem OHK- Extrakt. Die Abszisse zeigt die Konzentration des OHK-Extrakts in µl/ml Kulturmedium. Die Ordinate zeigt den Einbau von ³H-Thymidin in cpm × 10⁴. Die Balken geben die Standardabweichungen der Mittelwerte aus 9 Messungen an; Korrekturkoeffizient 0,917.

Fig. 4: Dargestellt ist die Stimulierung des L-(5-³H)Prolin- Einbaus von 3T3 Fibroblasten durch fötales Kälberserum (---) und durch OHK-Bestandteile (-) Die Abszisse zeigt die Konzentration der untersuchten Probe in µl/ml Kulturmedium, die Ordinate den Einbau von L-(5-³H)Prolin in cpm. × 10³.

Fig. 5: Dargestellt ist die Stimulierung der ³H-Thymidin- Einbaus von Rinderchondrocyten in Abhängigkeit der Dosis von OHK 34/4. Die Abszisse zeigt die Konzentration der untersuchten Proben in µg/ml Kulturmedium, die Ordinate den Einbau von ³H-Thymidin in cpm × 10⁴.

Fig. 6: Dargestellt ist die Stimulierung der Kollagen- Synthese und der Gesamtproteine von Chondrocyten in Monolayer-Kulturen in Abhängigkeit von der OHK-Konzentration. Die Abszisse zeigt die eingesetzte µg-Menge aktives Testprotein pro ml Kultur. Auf der Ordinate ist die µg-Menge neu synthetisiertes Protein x-x bzw. Kollagen o---o pro Kulturansatz angegeben.

Fig. 7: Dargestellt ist die prozentuale Zunahme des Kollagen- Gehalts am Gesamtprotein in Abhängigkeit von der OHK-Dosis.

Fig. 8: Dargestellt ist die Stimulierung des ³H-Thymidin- Einbaus von 3T3 Fibroblasten mit bestrahltem und nicht bestrahltem OHK-Extrakt. Das bestrahlte OHK-Extrakt weist einen Proteingehalt von 690 µg/ml auf (-). Das nicht bestrahlte OHK- Extrakt weist einen Proteingehalt von 670 µg/ml auf (---). Die Abszisse zeigt die Konzentration des OHK-Extraktes in µl/2,5 ml Kulturmedium. Die Ordinate zeigt den Einbau von ³H-Thymidin in cpm.

Fig. 9: Dargestellt ist die Stimulierung des ³H-Thymidin- Einbaus von 3T3 Fibroblasten mit Lencoll®, Lenphos®, Lensol®, Lensol agglomeriert, Oss Pulvit, Mitsubishi Cookies, osteotrophisches Konzentrat, Canzocal, PMC und OHK. Die Abszisse zeigt die Konzentration der untersuchten Probe in µl/ml Kulturmedium, die Ordinate den Einbau von ³H- Thymidin in cpm.

Im untersuchten zellbiologischen System sind nur OHK sowie PMC und Lencoll® aktiv.

Jeweils 1 g der untersuchten Produkte wurden mit 10 ml PBS extrahiert; Aliquots des zentrifugierten Überstandes wurden untersucht.

Fig. 10: Dargestellt ist die prozentuale Änderung der Knochenkortexdicke nach 14 Monaten Behandlung mit Vitamin D₂, Calciumglukonat und mit OHK. Gegenüber Vitamin D₂ zeigt sich bei OHK ein Zuwachs von 11,6%.

Fig. 11: Mittlere Veränderung des Radius-Mineralgehaltes BMC in g/cm OHK-behandelter Patienten (-) und von Kontrollen (---) innerhalb eines Zeitraums von 2 Jahren. Die Balken geben die Standardabweichungen an.

Fig. 12: Mittlere Veränderungen des trabekulären Knochenvolumens (TBV) und der Crista-Iliaca-Cortexdicke (CPT) bei OHK-behandelten Patienten (-) und bei Kontrollen (---) in einem Zeitraum von 2 Jahren. Die Balken geben die Standardabweichungen an.

Fig. 13: Die Ordinate zeigt den Einbau von ³H-Thymidin in cpm, die Abszisse die Konzentration der untersuchten Probe in µg/200 ml Kultur.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von OHK (Verfahren 1)

Als Ausgangsmaterial zur Herstellung von OHK werden Röhrenknochen (Humerus, Femur, Tibia, Radius mit Ulna, Os metacarpale und Os metatarsale) von etwa 3 Monate alten Rinderkälbern (Bos taurus) verwendet.

Die Tiere werden durch amtliche Tierärzte untersucht. Danach werden die Tiere geschlachtet und die Knochen entnommen. Nach dem Entbeinen werden die sauberen Knochen rasch tiefgefroren und bei -20° bis -30°C bis zur Weiterverarbeitung aufbewahrt; vgl. Fig. 1, Ziff. 1.

Vor der Weiterverarbeitung wird überprüft, ob die Knochen noch frisch sind (erkennbar an Geruch und Farbe), ob sie sauber sind und ob es sich um die gewünschten Knochen handelt. Fleisch-, Sehnen- und Knorpelreste werden entfernt.

Im ersten Verfahrensschritt werden 1600 kg (1 Charge) gefrorene Knochen in einem aus korrosionsbeständigen Stahl hergestellten Brechwerk mit einer Sieblochung von 20 mm zerkleinert. Die Partikelgröße der zerkleinerten Knochen beträgt etwa 1 cm. Bei der Zerkleinerung hält man die Temperatur der Knochen unterhalb von 0°C; vgl. Fig. 1, Ziff. 2.

Sodann werden die zerkleinerten Knochen in einem Schaufeltrockner aus korrosionsbeständigem Stahl bei einem Druck von 0,97 bis 0,98 bar dehydratisiert. Die Heizwassertemperatur beträgt anfänglich etwa 90°C und wird im Verlauf der Trocknung abgesenkt auf etwa 40°C. Sobald kein Wasser mehr ins Kondensat-Auffanggefäß überdestilliert (etwa 10 Stunden nach Beginn der Trocknung), wird die Heizung ausgeschaltet und das Knochenpräparat unter vermindertem Druck weiter getrocknet, bis der Restwassergehalt entweder höchstens etwa 10% (vgl. Fig. 1, Ziff. 3a) oder 10 bis 25% (vgl. Fig. 1, Ziff. 3b) beträgt. Bei diesem letzten Trocknungsvorgang soll die Temperatur des Knochenpräparates 40°C nicht übersteigen.

Anschließend wird der pH-Wert des getrockneten Knochenpräparates mit Citronensäure auf 5,0 bis 5,5 eingestellt. Dann wird das getrocknete Knochenpräparat nochmals bei 80 bis 20°C dehydratisiert und die Lipide werden entfernt. Dazu wird entweder Aceton als hydrophiles und lipophiles Lösungsmittel verwendet, oder das getrocknete Knochenpräparat wird zunächst mit Aceton bei Temperaturen von 20 bis 80°C dehydratisiert und sodann in einem zweiten Arbeitsvorgang mit Trichloräthylen bei 20 bis 80°C entfettet. Es wird ein Knochenpräparat erhalten, dessen Restwasser- und Restfettgehalt höchstens etwa 5% beträgt (vgl. Fig. 1, Ziff. 4a und 4b). Danach werden Lösungsmittelrückstände im Wirbelstrom bei 20 bis 80°C und 90 mbar entfernt. Der Lösungsmittelrestgehalt beträgt etwa 1% (vgl. Fig. 1, Ziff. 5).

Das erhaltene Knochenpräparat wird in einer Hammermühle in einem 2 × 20 mm Schlitzsieb gemahlen und auf einer Siebmaschine mit einem oberen Sieb einer Maschenweite von 2,4 mm und einem unteren Sieb einer Maschenweite von 0,34 mm gesiebt. Das auf dem 2,4 mm Sieb zurückbleibende Material wird verworfen, und das durch das 0,34 mm Sieb gesiebte Material wird weiter verwendet. Es wird nochmals in einer Mahlvorrichtung mit einem Lochsiebeinsatz von 0,8 mm gemahlen und auf einer Siebmaschine mit einem Sieb einer Maschenweite von 0,74 mm und einem Sieb einer Maschenweite von 0,34 mm gesiebt. Das auf dem 0,74 mm Sieb verbleibende Material wird verworfen. Das durch das 0,34 mm Sieb gesiebte Material wird gesammelt und nochmals in einer Mahlvorrichtung mit einem Lochsiebeinsatz von 0,8 mm gemahlen. Anschließend wird es auf die vorstehend beschriebene Weise gesiebt. Schließlich wird das gesammelte Pulver mit einem Sieb einer Maschenweite von 0,25 mm gesiebt und in einer Mahlvorrichtung mit einem Lochsiebeinsatz von 0,5 mm gemahlen. Danach wird das gesamte Pulver durch ein Sieb einer Maschenweite von 0,25 mm passiert (vgl. Fig. 1, Ziff. 6).

Die Analysenwerte des erhaltenen OHK-Pulvers sind in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle II

Falls die Analyse ergibt, daß im OHK-Präparat mehr als 10 000 Mikroorganismen pro Gramm enthalten sind, wird das Präparat entweder durch Behandlung mit Äthylenoxid oder durch Bestrahlung mit Gammastrahlen sterilisiert (vgl. Fig. 1, Ziff. 10-12).

Es wird ein zur Herstellung von Arzneimitteln geeignetes OHK erhalten (vgl. Fig. 1, Ziff. 13).

Beispiel 2 Herstellung von OHK (Verfahren 2)

Gemäß Beispiel 1 wird ein zerkleinertes Knochenpräparat mit einer Partikelgröße von höchstens 1 cm hergestellt. Dieses Knochenpräparat wird sodann mit Citronensäure auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 eingestellt und gemäß Beispiel 1 weiter verarbeitet.

Es wird ein OHK-Präparat mit den in Tabelle III beschriebenen Analysenwerten erhalten.

Tabelle III

Beispiel 3 Stimulierung der ³H-Thymidin-Aufnahme von 3T3 Fibroblasten durch OHK

Swiss Mouse 3T3 Fibroblasten (Flow Laboratories) werden in DMEM (Dulbecco′s modified Eagle′s medium, Boehringer Mannheim) gezüchtet. Das Medium ist mit 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin (jeweils Boehringer Mannheim) und mit 3,7 g NaHCO₃/Liter (Merck, Darmstadt) angereichert. Das Medium wurde vorher bei einem mit CO₂ eingestellten pH-Wert von 6,6 steril filtriert. Zur Züchtung der Zellen wird es ferner mit 10% foetalem Kälberserum (Boehringer Mannheim) angereichert. Die subconfluenten Kulturen werden in 90 mm Petrischalen bei 37°C unter einer 5-%igen CO₂-Atmosphäre gezüchtet und zweimal pro Woche transferiert. Dabei werden 4 × 10⁴ Zellen pro 10 ml Kulturmedium und Petrischale ausgesät. Für die nachstehend erläuterten Untersuchungen werden jeweils Zellen aus den Passagen 3 bis 20 verwendet.

Der Test auf ³H-Thymidin-Aufnahme wird nach L. Jiminez de Asua et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72 (1975), 2724-2728) durchgeführt. Somit werden 3T3 Fibroblasten aus den vorstehend beschriebenen Stammkulturen mit einer sterilen Lösung von 0,05% Trypsin/0,02% EDTA abtrypsinisiert. Die Zellen werden in DMEM/10% foetales Kälberserum in einer Konzentration von 4 × 10⁴ Zellen/ml resuspendiert. Jeweils 1 ml Zellsuspension wird in 1,9 cm³ Mikrotiterplatten ausplattiert. Die Zellen werden weitere 4 Tage ohne Mediumwechsel inkubiert. Es bilden sich konfluente Zellrasen aus ruhenden, teilungsinaktiven Zellen. Sodann wird das Medium abgesaugt und durch 1 ml frisches Kulturmedium ohne foetales Kälberserum ersetzt. Ferner werden die auszutestenden Proben zugesetzt.

1 g gemäß Beispiel 1 oder 2 hergestelltes OHK wird in 10 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung ohne Mg und Ca (0,2 g KCL, 8 g NaCl, 2,7 g NahPO₄ · 12H₂O, 0,2 g KH₂PO₄ pro Liter) suspendiert. Nach 2-stündigem Schütteln bei Raumtemperatur wird 15 Minuten bei 2000 × g zentrifugiert.

Sodann werden die vorstehend erhaltenen 3T3-Fibroblasten- Kulturen mit jeweils 2 bis 500 µl des nach der Zentrifugation gewonnenen Überstandes versetzt, der die neutrallöslichen OHK-Bestandteile enthält.

Zur Bestimmung des Nullwertes werden die Kulturen lediglich mit einer gleichen Menge frischem Kulturmedium versetzt. Als positive Kontrolle werden 2 bis 200 µl fötales Kälberserum zugegeben.

Die Test-Kulturen werden schließlich 20 Stunden bei 37°C unter 5 prozentiger CO₂-Atmosphäre inkubiert und dann mit ³H-Thymidin markiert.

Die Markierung erfolgt durch Zugabe von 10µl/ml Kulturmedium/ Bohrung einer sterilen, wäßrigen Thymidinlösung, die 1µCi (Methyl-³H)-Thymidin (Amersham, Großbritannien) und 0,9 µg Methyl-Thymidin (Sigma, V.St.A.) enthält.

Nach Zugabe des ³H-Thymidins wird nochmals 4 Stunden unter den vorstehend genannten Bedingungen kultiviert.

Dann werden die Proben zur Auswertung im Scintillations- Zähler vorbereitet.

Das Kulturmedium wird abgesaugt und der Zellrasen wird mit 0,5 ml einer 0,02prozentigen EDTA/PBS-Lösung gewaschen. Die Zellen werden wie vorstehend beschrieben trypsinisiert bis sie sich vollständig vom Untergrund ablösen. Die suspendierten Zellen werden in einem Mikrotiter-Dynatech- Multimesh-Gerät behandelt, in dem sie automatisch auf Glasfaser- Filter (Whatman 934-AH) übertragen werden. Dabei ist das Gerät wie folgt programmiert:

1. Waschen mit PBS, 2. Fällung mit 5% Trichloressigsäure (Merck, Darmstadt) und 3. Fixieren mit Äthanol. Die Glasfaserfilter werden getrocknet und in Scintillations-Zellröhrchen überführt. Es werden 3 ml Scintillationszellflüssigkeit (7 g Permablend Packard in 1 Liter Triton X-100/ Toluol im Mischungsverhältnis 1 : 3; Merck, Darmstadt) zugegeben und die Radioaktivität der Proben wird in einem LKB-Walla 1217 Rackbeta-Flüssigkeits-Scintillations-Zähler als Zerfälle pro Minute bestimmt.

Die maximale Stimulierung mit OHK erreicht nur etwa die Hälfte der maximalen Stimulierung mit foetalem Kälberserum. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, daß das foetale Kälberserum etwa 60 mal soviel Gesamtprotein enthält wie die OHK-Extrakte. Somit wird die ³H-Thymidin-Aufnahme durch die verwendeten OHK-Extrakte signifikant stärker stimuliert als durch foetales Kälberserum. Die mit OHK erhaltenen Meßergebnisse sind in Fig. 3 zusammengefaßt.

Das beschriebene Testsystem kann auch zur Qualitätsbestimmung der gemäß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen OHK-Präparate verwendet werden. Bei Verwendung von fötalem Kälberserum als positiver Kontrolle, einerseits als innere Kontrolle des zellbiologischen Testsystems und andererseits als Referenzwert für die mit den OHK-Proben erhaltenen Werte, ist es möglich, eine Aktivitätseinheit zur Charakterisierung der biologischen Aktivität der OHK-Präparate zu definieren und auszudrücken. Somit läßt sich die biologische Aktivität der OHK-Präparate standardisieren.

Beispiel 4 Stimulierung der L-(5-³H)Prolin-Aufnahme von 3T3 Fibroblasten und von menschlichem Vorhaut-Fibroblasten durch OHK

Gemäß Beispiel 3, jedoch unter Verwendung von L-(5-³H)- Prolin anstelle von ³H-Thymidin in dem beschriebenen Zellkultursystem läßt sich die Prolin-Aufnahme der kultivierten Zellen bestimmen. Durch diesen Test wird die Proteinsynthese- Rate der kultivierten Zellen bestimmt. Durch Messung und Quantifizierung der von den Zellen aufgenommenen Radioaktivität läßt sich die biologische Aktivität der OHK- Präparate bestimmen. In Fig. 4 ist die Stimulierung der L-(5-³H)Prolin-Aufnahme von 3T3 Fibroblasten mit OHK dargestellt.

Die Fig. 4 zeigt, daß das OHK-Präparat die Proteinsyntheserate in den untersuchten Zellen erheblich steigert.

Beispiel 5 Wirkung von neutral-löslichen Bestandteilen des OHK auf Rinderchondrocyten-Kulturen

Aus den Epihphysenknorpeln foetaler Kälber werden in üblicher Weise Chondrocyten isoliert. 50 000 Zellen werden 4 bis 6 Tage mit jeweils 1 ml mit 10% foetalem Kälberserum angereichertem F12-Medium subkonfluent kultiviert. Gemäß Beispiel 3 werden die erhaltenen Zellkulturen mit den gemäß Beispiel 1 oder 2 erhaltenen OHK-Präparaten 34/4 behandelt. Sodann werden die Zellen gemäß Beispiel 3 mit ³H- Thymidin markiert und die inkorporierte Radioaktivität wird bestimmt.

In Fig. 5 sind die Ergebnisse der ersten Reihe von Experimenten zusammengefaßt. Dargestellt ist der ³H-Thymidin- Einbau der Rinderchondrocyten in Abhängigkeit von der Dosis der Substanzen OHK 34/4.

Aus den Fig. 6 und 7 ist ersichtlich, daß die Gesamtprotein- Synthese und die Kollagen-Syntheserate durch das untersuchte OHK-35/4 stimuliert werden. 34/4 und 35/4 bedeuten Chargen-Nummern.

Beispiel 6 Wirkung der neutral löslichen Komponenten aus OHK auf Knochenzell-Populationen in vitro

Aus Calvarien von 1 Tag alten Wistar-Ratten wurden verschiedene Knochenzell-Populationen gemäß Cohn et al. (Simmons und Kanin (Herausg.), Skeletal Research, an experimental approach, Academic Press, New York, San Francisco, London, Seiten 3 bis 20) durch sequentiellen, zeitabhängigen, enzymatischen Abbau isoliert, wobei jedoch zusätzlich 0,05% Hyaluronidase zusammen mit Kollagenase und Trypsin zur Freisetzung der Zellen aus dem Knochengewebe verwendet wird.

Die während eines jeweils 20-minütigem Abbauvorganges freigesetzten unterschiedlichen Zellpopulationen werden mit römischen Ziffern bezeichnet. Die Bezeichnungen entsprechen der Reihenfolge, in dem die einzelnen Zellfraktionen erhalten werden. Die erste aus den Calvarien freigesetzt Zellpopulation trägt die Bezeichnung I. Die letzte, während einer einstündigen Abbaureaktion freigesetzte Zellfraktion trägt die Bezeichnung L. Funktionellen Tests zufolge handelt es sich bei den Populationen I bis III wahrscheinlich um Zellen des Knochenzellvorläufer-zellpools (Präosteoblasten- ähnlich). Die Zellpopulationen IV bis VI weisen Osteoblasten-ähnliche Merkmale auf. Die Zellpopulationen VII und L können als ruhende Osteoblasten-ähnliche Zellen oder möglicherweise als Osteocysten-ähnliche Zellen betrachtet werden.

10 ml einer Suspension von 1,5 × 10⁵ Zellen/ml in mit 10% foetalem Kälberserum angereichertem MEM-Medium (mit Earle′s Salzen) werden in 250 ml Gewebekultur-Flaschen ausgesät. Nach 9- bis 10-tägiger Inkubation bei 37°C unter einer 5%- igen CO₂-Atmosphäre werden konfluente Zellrasen erhalten. Diese werden mit 0,2% Trypsin abgelöst. Die Zellen werden durch 7-minütiges Zentrifugieren bei 400 × g geerntet. Das erhaltene Zellpellet wird in mit 20% foetalem Kälberserum und 10% DMSO angereichertem MEM-Medium resuspendiert. Die Suspensionen werden bis zur Weiterverwendung in flüssigem Stickstoff eingefroren.

Die einzelnen eingefrorenen Knochenzell-Populationen werden vorsichtig auf 37°C gebracht und in 40 ml mit 20% fötalem Kälberserum angereichertem MEM-Medium verdünnt. Es wird 7 Minuten bei 400 × g zentrifugiert. Die erhaltenen Zellpellets werden in frischem, mit 10% fötalem Kälberserum angereichertem Medium resuspendiert und in Mikrotiterplatten mit 96 Bohrungen bei einer Zelldichte von 7 bis 10 × 10³ Zellen pro Bohrung ausplattiert. Die Zellen werden 2 Tage gezüchtet. Am dritten Tag wird das Kulturmedium gegen ein Medium ausgetauscht, das 1% oder 2% fötales Kälberserum enthält. Nach 24stündiger Inkubation wird das Medium einmal gegen ein Medium ausgetauscht, das 1% oder 2% fötales Kälberserum, 0,5 µCi ³H-Thymidin/ml und neutrallösliche OHK-Komponenten in verschiedenen Konzentrationen enthält. Die Kontrollkulturen werden mit entsprechenden Mengen PBS versetzt.

Durch Versuche mit EDGF wird sichergestellt, daß die verschiedenen Knochenzellkulturen überhaupt auf ein Mitogen reagieren.

Die Knochenzellkulturen werden 24 Stunden unter den vorstehend genannten Bedingungen mit dem ³H-Thymidin enthaltenden Medium inkubiert. Gemäß Beispiel 3 wird der ³H- Thymidin-Einbau ermittelt.

Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt. Jeder Wert entspricht dem Mittelwert aus 5 Versuchen und ist zusammen mit der Standardabweichung angegeben. Die in PBS gelösten OHK-Komponenten werden den Kulturmedien in Mengen von 5 bis 50 µLiter bei einem Gesamtkulturmedium- Volumen von 200 µLiter zugegeben.

Tabelle IV

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß die neutrallöslichen OHK-Komponenten die Proliferation der Knochenzell-Populationen V und VI im Vergleich zu den mit PBS behandelten Kontrollkulturen stimulieren. Die Knochenzell-Populationen I und VII zeigen keine Reaktion. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 13 wiedergegeben.

Beispiel 7

In Tabelle V sind die Ergebnisse von Experimenten zusammengefaßt, bei denen die Wirkung neutrallöslicher OHK- Komponenten (OHK X) auf Rattenhaut-Fibrolasten getestet wurde.

Tabelle V

³H-Thymidin-Einbau von Rattenhaut-Fibroblasten in Abhängig keit verschiedener OHK X-Konzentrationen

Aus den in Tabelle V zusammengefaßten Ergebnissen ist ersichtlich, daß Rattenhaut-Fibroblasten durch OHK X nicht stimuliert werden können.

Aus den in Tabelle IV zusammengefaßten Versuchsergebnissen folgt beim Vergleich mit den in Tabelle V zusammengefaßten Versuchsergebnissen, daß die beobachtete mitogene Aktivität von OHK X für Osteoblasten spezifisch ist.

Beispiel 8 Bestimmung der biologischen Aktivität von bestrahltem OHK

Gemäß Beispiel 1 oder 2 hergestelltes OHK wird mit 25 kGy (2,5 Mrad) bestrahlt. Der Versuch wird analog Beispiel 3 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.

In Fig. 8 sind die Ergebnisse des ³H-Thymidin-Einbaus von 3T3 Fibroblasten bei Stimulierung mit verschiedenen Mengen eines PBS-Extraktes von bestrahltem und nicht bestrahltem OHK zusammengefaßt. Aus Fig. 8 ist ersichtlich, daß die biologische Aktivität des OHK durch Bestrahlung nicht beeinflußt wird.

Beispiel 9 Vergleich der Wirkung von OHK mit der Wirkung von für dasselbe Indikationsgebiet bekannten Präparaten

Je 1 g der zu testenden Substanzen wird eingewogen und in einem mit einem Deckel verschraubbaren Röhrchen mit 10 ml PBS versetzt. Nachfolgend wird 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Es wird 10 Minuten bei 3600 Upm in einer MSE-Tischzentrifuge zentrifugiert, und die klaren Überstände werden abdekantiert. Die Niederschläge werden verworfen. Der Proteingehalt der Lösungen wird nach Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), S. 248) bestimmt. Die Stimulation des ³H-Thymidin-Einbaus in 3T3 Fibroblasten wird gemäß Beispiel 3 durchgeführt und ausgewertet.

In Tabelle VI sind die verglichenen Präparate zusammen mit ihrem extrahierbaren Proteingehalt zusammengefaßt.


Extrahierbarer Proteinanteil/ml Lösung
Lencoll®\|330 µg
Lenphos®	105 µg
Lensol®	3850 µg
Lensol® agglomeriert	4200 µg
Osspulvit®	24 µg
Mitsubishi Cookies®	82 µg
PMC®	400 µg
Osteotrophisches Konzentrat	22 µg
Canzocal®	28,5 µg
OHK	600 µg

In Fig. 9 sind die experimentellen Ergebnisse zusammengefaßt. Inaktive Substanzen heben sich nicht vom Leerwert ab und können somit auch nicht graphisch dargestellt werden.

Aus Fig. 9 ist ersichtlich, daß OHK bei der Stimulierung der NDA-Synthese den Konkurrenzpräparaten deutlich überlegen ist.

Beispiel 10 Einfluß von OHK auf die Knochenheilung im Tierversuch

Die Wirkung von OHK auf die Knochenheilung wird in einer Untersuchung mit 60 erwachsenen Kaninchen ermittelt. Dabei werden mittels Feinpräzisiontstechnik gleich große und gleich lokalisierte Knorpel-Knochendefekte in der distalen Femurepiphyse von beiden Kniegelenken gesetzt.

Die Tiere werden in einer Zufallsverteilung vier Gruppen von je 15 Tieren zugeordnet. Als Kontrolle dient eine unbehandelte Gruppe. Eine erste Gruppe erhält 830 mg OHK (178,0 mg Calcium) pro Tag, die zweite Gruppe erhält 510 mg veraschtes OHK (d.h. Knochenmineral) ohne aktive, organische Wirkstoffe; 178,9 mg Calcium) pro Tag und eine dritte Gruppe erhält 650 mg Calciumcarbonat (189,7 mg Calcium) pro Tag. Die Versuchsanordnung wird in Tabelle VI erläutert.

Tabelle VII

Versuchsanordnung

Vom 7. bis zum 23. Tag nach Defektsetzung werden die Tiere mit einer Reihe von Fluoreszenzmarkern behandelt. Nach 5, 8 und 12 Wochen werden je 5 Tiere getötet. Die histologischen Schnitte werden bei standardisierter Lokalisation und Definition der Schnittebene in der Region des Knochendefekts mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Die Mikrophotographien werden nach einem Indexpunkt- System, basierend auf Intensität der Fluoreszenz, Art und Grad der Defektfüllung und Struktur des neugebildeten Knochens ausgewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

Tabelle VIII

Durchschnittswerte und Standardabweichungen der summierten Indexpunkte nach unterschiedlicher Behandlung und Versuchsdauer

Die drei behandelten Gruppen weisen eine signifikant verbesserte Mineralisierung im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe auf. Die Therapie mit OHK führt im Gegensatz zu den beiden anderen aktiven Behandlungen zu signifikanten Verbesserungen in der Knochendefektheilung.

Aus dem Vergleich der mit OHK und mit veraschtem OHK erzielten Versuchsergebnisse ist ersichtlich, daß die vorteilhafte Wirkung von OHK durch Zerstörung der organischen Komponenten verloren geht.

Beispiel 11 Einfluß von OHK auf die Ultrastruktur des artikulären Chondrocyten im Tierversuch

In einer Versuchsreihe mit Ratten wird der Einfluß von OHK auf die Ultrastruktur des artikulären Chondrozyten in vivo nach Corticoidschädigung untersucht. Dabei wird eine neue, reproduzierbare morphometrische Methode benützt, die eine quantitative Auswertung ermöglicht; vgl. M. Annefeld, Int. J. Tiss. Reac., Bd. VII (4), 273-289 (1958).

Die Experimente werden mit drei Gruppen von jeweils 5 männlichen Wistar-Ratten durchgeführt. Die erste Gruppe ist eine Kontrollgruppe, die unbehandelt bleibt, an die zweite Gruppe wird intramuskulär Dexamethason verabfolgt und an die dritte Gruppe wird Dexamethason intramuskulär verabfolgt und zusätzlich wird OHK oral verabfolgt. Die Versuchsanordnung ist in Tabelle IX zusammengefaßt.

Tabelle IX

Die Tiere werden nach 5-wöchiger Behandlung getötet. Das gesamte Knorpelgewebe von Femur und Tibia beider Kniegelenke wird entfernt. Das Gewebe wird für die Elektronenmikroskopie vorbereitet. 50 Chondrozyten von jedem Tier werden morphometrisch analysiert.

Verglichen mit den Kontrollen zeigen die Dexamethason- behandelten Tiere eine Abnahme der Länge des endoplasmatischen Retikulums und der Gesamtfläche der Golgiapparate ihrer artikulären Chondrozyten sowie einen Anstieg in der Chondrozytenmortalität. Diese elektronenmikroskopischen Befunde beweisen eindeutig eine Schädigung der artikulären Chondrozyten durch Corticosteroide.

Die zusätzlich mit OHK behandelten Tiere zeigen eine deutlich geringere Abnahme des endoplasmatischen Retikulums und der Fläche der Golgiapparate in ihren artikulären Chondrozyten. Die durch Dexamethason erhöhte Mortalitätsrate der Chondrozyten wird durch OHK verringert, und zwar unterhalb des Kontrollwertes. Daneben erhöht OHK auch die Gesamtfläche und die Anzahl der Mitochondrien. Diese Befunde weisen auf eine Steigerung des Metabolismus der Chondrozyten durch OHK nach oraler Verabfolgung hin. Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt.

Tabelle X

Morphometrische Auswertung der Chondrozyten-Ultrastruktur nach einer Versuchsdauer von 5 Wochen

Einfluß von Dexamethason und OHK:
1 = signifikanter Unterschied zwischen Kontrolle und Testgruppen
2 = signifikanter Unterschied zwischen Dexamethason und Dexamethason + therapeutisch behandelten Gruppen,
p = 0,01, n = 250 pro Gruppe.

Aus diesem Versuch ist ersichtlich, daß die mit OHK in zellbiologischen Versuchen (vgl. Beispiele 3 bis 6) in vitro erzielten Ergebnisse auch in vivo gelten. Außerdem zeigen die Ergebnisse, daß OHK die bekannten negativen Effekte von Corticosteroiden auf Knorpel- und Knochenzellen durch Regulation des Zellmetabolismus verhindert.

Beispiel 12 Unterstützung der Knochenheilung durch OHK

In einer Doppelblindstudie wird der Einfluß von OHK gegenüber einem Placebo bei der Knochenbruchheilung klinisch untersucht.

Eine der beiden Medikationen wird statistisch ausgewählt und 97 Fälle mit Tibiaschaftfrakturen werden über 6 Wochen behandelt. Tabelle XI gibt eine Übersicht über das Alter der Patienten und die Art ihrer Behandlung.

Tabelle XI

Die Konsolidierung der Tibiaschaftfrakturen wird nach folgenden Parametern bestimmt:

- Unbeweglichkeit an der Frakturstelle
- Schmerzfreiheit
- Beweglichkeit der gebrochenen Extremität
- Belastbarkeit der gebrochenen Extremität
- Radiologische Befunde.

Bei älteren Patienten erfolgt die Konsolidierung durch Behandlung mit OHK nach etwa 11 Wochen und damit signifikant rascher als bei einer Behandlung mit dem Placebo (14,2 Wochen, p 0,05). Bei den jüngeren Patienten ist die Differenz statistisch nicht gesichert (12,5 gegenüber 11,5 Wochen). Aus diesen Versuchsergebnissen ist, unter Berücksichtigung der bei der Placebo-Gruppe dreifach größeren Anzahl von operationsbedürftigen Heilungskomplikationen, ersichtlich, daß OHK eine geordnete Frakturheilung fördert.

Beispiel 13 Behandlung von Osteoporose mit OHK

In einer kontrollierten Studie wird der Einfluß von OHK auf die Corticoid-induzierte Osteoporose untersucht.

64 Patienten im Alter von mindestens 50 Jahren, an die aufgrund chronischer Polyarthritis Corticosteroide verabfolgt wurden, werden statistisch gleichartigen Behandlungsgruppen zugeordnet. Die Patienten in Gruppe 1 erhalten zusätzlich zu ihrer üblichen Therapie noch 4,9 g OHK täglich. An die Patienten der Gruppe 2 wird kein OHK verabfolgt.

Am Ende der Behandlungsdauer ist der Stammhöhenverlust und die Verminderung der Radiusknochendichte in der OHK- behandelten Gruppe signifikant niedriger als in der Kontrollgruppe. Andere Parameter, z. B. ulnare Knochendichte und Rückenschmerzen, sind in der OHK-behandelten Gruppe gleichfalls deutlich gebessert gegenüber den Kontrollen, erreichen jedoch keine statistische Signifikanz. Die Ergebnisse sind in Tabelle XII zusammengefaßt.

Tabelle XII

Unterschiede in den Osteopenie-Indices nach 1-jähriger zusätzlicher OHK-Therapie

Durch die OHK-Behandlung wird auch die Progression einer Osteopenie bei steroidbehandelten Rheumakranken erfolgreich verhindert. Aus der Untersuchung ist ersichtlich, daß eine OHK-Behandlung bereits mit Beginn der systemischen Corticosteroidbehandlung begonnen werden sollte und man nicht erst abwarten sollte, bis sich eine durch klinische Symptone erkennbare Osteopenie entwickelt hat.

Beispiel 14 Behandlung von Osteoporose mit OHK im Vergleich zu Calcium

In einer klinischen Studie wird die Wirkung von Vitamin D₂, OHK und von Calciumgluconat im Rahmen der Therapiemaßnahmen bei primärer Leberzirrhose, in deren Verlauf es zu einem rapiden Knochenschwund kommt, untersucht.

Vitamin D₂ wird an 65 postmenopausale Frauen mit osteoporotischen Veränderungen bei primärer Leberzirrhose parenteral verabfolgt. Dieses Patientenkollektiv wird statistisch drei Gruppen zugeordnet. Die erste Gruppe besteht aus 22 Patienten und erhält nur Vitamin D₂ (Kontrolle). Die 21 Patienten der zweiten Gruppe enthalten zusätzlich zur Vitamin D₂-Therapie noch 6,6 g OHK täglich. Die 22 Patienten der dritten Gruppe erhalten eine zum an die Patienten der zweiten Gruppe verabfolgten OHK äquivalente Calciumdosis, d. h. 4 Brausetabletten Calciumglukonat täglich.

Nach 14-monatiger Therapie wird festgestellt, daß die parenterale Therapie mit Vitamin D₂ allein nicht genügt, um den mittels Metakarpalindex gemessenen Knochenschwund aufzuhalten, daß ferner die Kombination von Vitamin D₂ + Calciumglukonat gerade ausreichend war, um einen weiteren Knochenverlust zu stoppen und daß nur die Kombination von Vitamin D₂ mit OHK einen statistisch signifikanten Zuwachs von 11,6% des Knochenkortex gegenüber der Kontrolle ergab. Die Versuchsergebnisse sind in Fig. 10 zusammengefaßt.

Aus diesen Versuchsergebnissen ist ersichtlich daß es sich bei OHK nicht nur um ein reines Calciumpräparat handelt.

Beispiel 15 Behandlung von Osteoporose mit OHK

36 Patienten, die wegen chronisch-aktiver Autoimmunhepatitis seit mindestens 1 Jahr mit Prednisolon und Azathioprin behandelt wurden, werden statistisch zwei verschiedenen Gruppen zugeordnet. Die 18 Patienten der ersten Gruppe erhalten während 2 Jahren 6,6 g OHK täglich, die 18 Patienten der Kontrollgruppe erhalten kein OHK.

Durch Photodensitometrie und mit Hilfe von Knochenbiopsien werden die Versuchsergebnisse ermittelt. Nach 2 Jahren ist in der Kontrollgruppe eine statistisch signifikante Verringerung des Radius-Mineralgehaltes BMC ("Single"- Photodensidometrie) und der Crista iliaca-Cortexdicke CPT (Knochenbiopsie) erfolgt (vgl. Fig. 11 und Fig. 12). Bei der Knochenbiopsie wird eine deutliche Verminderung des trabekulären Knochenvolumens (TBV) innerhalb der Kontrollgruppe festgestellt (vgl. Fig. 12). Dagegen bleibt bei Therapie mit OHK der Mineralgehalt des Radius konstant (vgl. Fig. 11), das trabekuläre Knochenvolumen nimmt zu und die Verminderung der Cortexdicke ist statistisch signifikant geringer als innerhalb der Kontrollgruppe (vgl. Fig. 12). Innerhalb der 2-jährigen Behandlungsdauer zeigen 3 Patienten der Kontrollgruppe Wirbelkörperdeformationen, jedoch kein Patient der OHK-Gruppe. 5 Patienten weisen ein trabekuläres Knochenvolumen (TBV) unter der von Meunier postulierten "vertebral fracture threshold" von 11% ± 3% auf, jedoch entwickelt keiner der vier mit OHK behandelten Risikopatienten eine Wirbelkörperfraktur. Dagegen zeigen sich bei 3 Kontrollpatienten (TBV <16%) Wirbelkörperdeformationen, wobei die TBV-Werte unter 11% abfallen.

Beispiel 16 Wirkung von OHK nach Ovarektomie

In einer retrospektiv-kontrollierten Studie wird anhand üblicher knochenspezifischer Parameter (knochenspezifisches Isoenzym der alkalischen Phosphatase - Osteoblastenmarker; Hydroxyprolin im Harn - Osteoklastenmarker; "Tartrat- resistente" saure Phosphatase - Osteoklastenmarker) gezeigt, daß einerseits sofort nach Ovarektomie die Enzymwerte im Serum stark ansteigen (Anzeichen für einen hohen und intensiven Knochenstoffwechsel) und daß andererseits durch eine Therapie mit 7,5 g OHK pro Tag während 9 Monaten die erhöhten Werte des Knochenumsatzes normalisiert werden und damit das Risiko gesenkt wird. Parallel zu den biochemischen Befunden macht sich bei der Verabfolgung von OHK ein durch den Metacarpal-Index bestimmbarer Knochenzuwachs bemerkbar. Der vor der Therapie gemessene Cortikalisschwund von 1,1 ± 0,6%/Jahr verändert sich bei der OHK-Therapie zu einem statistisch signifikant positiven Knochenzuwachs von 0,2 ± 0,3%/Jahr.

Beispiel 17 Computertomographische Bestimmung der Wirkung von OHK bei manifesten Osteoporosen

12 Osteoporose-Patienten (2 Männer, 10 Frauen) werden während eines Jahres täglich mit 7,5 g OHK behandelt und mittels quantitativer Computertomographie untersucht; vgl. P. Ruegsegger et al., J. Comput. Assist. Tomogr. 5 (1981), 384-390. Ausgehend von der Altersstruktur der Patienten würde man im Mittel einen Spongiosadichteverlust von 1 bis 2%/Jahr erwarten.

Bei der OHK-Therapie wird jedoch gefunden, daß nahezu alle behandelten Patienten eine Spongiosazunahme aufweisen. Eine solche Zunahme ist sonst nur bei Natriumfluoridtherapie zu beobachten. Jedoch ist die Zunahme unter Natriumfluorid- Therapie nicht so regelmäßig und kontinuierlich. Bei unbehandelten Patienten ist eine Spontanzunahme der Spongiosa bislang nie beobachtet worden.

Claims

1. Ossein-Hydroxyapatit-Komplex (OHK), gekenn zeichnet durch folgende Analyseparameter der Trockensubstanz: Sinnenprüfung feines bis leicht körniges, beige-graues Pulver mit schwachem Eigengeruch Identität - Nachweis von Calcium und Phosphat - Nachweis von Kollagen Wassergehalt < 7% Glührückstand 51,3-62,7% Calcium 19,2-23,6% Phosphor 8,9-10,9% Kollagen 23,4-28,6% Nichtkollagene Proteine/Peptide 7,2-10,8% Spurenelemente - Nachweis von F, Na, K, Mg, Fe, Zu, Cu und Ni Phosphatase-Aktivität 0,5-15 mE/mg Anomale Toxizität keine Intoleranzanzeichen Gesamtkeimzahl < 10⁴/g Hefen < 10²/g Enterobacteriaceen < 10²/g Spezielle Keimarten abwesend/g

und gekennzeichnet durch folgende biologische Aktivitäten:

a) Stimulierung der DNA-Synthese von Osteoblasten, Chondrocyten und Fibroblasten,
b) Stimulierung der Protein-Synthese von Chondrocyten und Fibroblasten,
c) selektive Stimulierung der Kollagen-Gesamtsynthese von Chondrocyten im Vergleich zur Stimulierung der Gesamtprotein-Synthese,
d) Induktion der Synthese der Proteine x und y in Chondrocyten, und
e) Förderung der Differenzierung von unspezifischen Mesenchym-Zellen zu Chondrocyten bzw. Osteoblasten.

2. Verfahren zur Herstellung des Ossein-Hydroxyapatit- Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Knochen von foetalen bis etwa 12 Monate alten Säugetieren bis zu einer Partikelgröße von höchstens etwa 1 cm zerkleinert,
b) die Knochenpartikel unter vermindertem Druck bei 20 bis 80°C bis zu einem Restwassergehalt von höchstens etwa 10% oder von etwa 10 bis 25% trocknet,
c) das erhaltene Knochenmaterial mit einer Säure auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 einstellt,
d) sodann mit einem hydrophilen und lipophilen Lösungsmit tel bis zu einem Restwasser- und Restfettgehalt von höchstens etwa 5% dehydratisiert und entfettet oder mit einem hydrophilen Lösungsmittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restwassergehalt von höchstens etwa 5% dehydra tisiert und anschließend mit einem lipophilen Lösungs mittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restfettgehalt von höchstens etwa 5% entfettet,
e) das dehydratisierte und entfettete Knochenmaterial un ter vermindertem Druck bei 20 bis 80°C bis zu einem Lö sungsmittelgehalt von höchstens etwa 1% trocknet und
f) das Knochenmaterial zu einer Teilchengröße von etwa 50 bis 300 Mikrometer pulverisiert und sodann sterilisiert.

3. Verfahren zur Herstellung des Ossein-Hydroxyapatit- Komplexes nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Knochen von foetalen bis etwa 12 Monate alten Säuge tieren bis zu einer Partikelgröße von höchstens etwa 1 cm zerkleinert,
b) die Knochenpartikel mit einer Säure auf einen pH-Wert von 5,0 bis 5,5 einstellt,
c) sodann mit einem hydrophilen und lipophilen Lösungsmittel bis zu einem Restwasser- und Restfettgehalt von höchstens etwa 5% dehydratisiert und entfettet, oder mit einem hydrophilen Lösungsmittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restwassergehalt von höchstens etwa 5% dehydratisiert und anschließend mit einem lipophilen Lösungsmittel bei 20 bis 80°C bis zu einem Restfettgehalt von höchstens etwa 5% entfettet,
d) das dehydratisierte und entfettete Knochenmaterial unter vermindertem Druck bei 20 bis 80°C bis zu einem Lö sungsmittelgehalt von höchstens etwa 1% trocknet und
e) das Knochenmaterial zu einer Teilchengröße von etwa 50 bis 300 Mikrometer pulverisiert und sodann sterilisiert.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß man Röhrenknochen verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekenn zeichnet, daß man Röhrenknochen von Rinderkälbern verwen det.

6. Arzneimittel zur oralen Verabreichung, enthaltend den Ossein-Hydroxyapatit-Komplex nach Anspruch 1 und ge gebenenfalls Hilfs- und Zusatzstoffe.

7. Arzneimittel nach Anspruch 6 zur Verwendung bei der Prophylaxe und Behandlung von Osteo arthrose und Osteoporose und bei der Heilung von Knochen brüchen, Knorpel- und Knochendefekten.