DK175488B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af en osseinhydroxyapatitforbindelse - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af en osseinhydroxyapatitforbindelse Download PDFInfo
- Publication number
- DK175488B1 DK175488B1 DK198701963A DK196387A DK175488B1 DK 175488 B1 DK175488 B1 DK 175488B1 DK 198701963 A DK198701963 A DK 198701963A DK 196387 A DK196387 A DK 196387A DK 175488 B1 DK175488 B1 DK 175488B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- ohc
- approx
- bone
- content
- chondrocytes
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/84—Bones; tendons; teeth; cartilage
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
DK 175488 B1
Opfindelsen angår fremgangsmåder til fremstilling af en osseinhydroxyapatitforbindel-se (OHC) til stimulering af chondrocyter og osteoblaster.
Et mikrokrystallinsk hydroxyapatitmiddel (MCHC) til forebyggelse af osteoporosis, 5 der bygger på corticosteroidterapi, kendes allerede; se A. Pines et al., Current Medical Research and Opinion, bind 8, nr. 10, 1984, side 734-742. Midlet omfatter ca. 50 vægt% af et komplekssalt af hydroxyapatit og calciumphosphat. Det indeholder endvidere ca. 26% collagen og ca. 9% ikke-collagenholdige proteiner/peptider. Derudover indeholder det ca. 0;65% natrium samt magnesium og kalium og som sporgrundstoffer 10 fluor, zink, strontium, silicium, jem, rubidium, cæsium og platin. Endelig indeholder midlet glycoseaminoglycaner, citrat og vand. Det vides ikke, hvordan MCHC fremstil les.
Opfindelsens formål er at tilvejebringe en osseinhydroxyapatitforbindelse (OCH) og en 15 fremgangsmåde til fremstilling deraf. Et yderligere formål er at tilvejebringe farmaceutiske midler, der indeholder OHC og er egnet til stimulering (opformering) af chondrocyter og osteoblaster og dermed til profylakse og behandling af osteoarthritis og osteoporosis og til heling af knoglebrud, bruskdefekter og knogledefekter. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Man har fundet frem til, at OHC har en specifik virkning på metabolismen af knogler 2 og brusk, eftersom det indeholder organiske bestanddele i ikke-denatureret tilstand og 3
ligeledes uorganiske bestanddele i fysiologisk afstemte andele. Anvendelse af OHC
4 sikrer, at den menneskelige og dyriske organisme tilføres, stoffer, der er essentielle for 5 skeletsystemet (ikke-collagene knoglespecifikke peptider, lokalt virksomme knogle- og 6 bruskceileregulerende faktorer, calcium og phosphat). OHC understøtter knoglemeta 7 bolisme med en organisk osseinmatrix af collagener og essentielle, knogle-specifikke, 8 ikke-collagene peptider og proteoglycaner, der fremmer knoglegendanrielse og forstær 9 ker inkorporering i knoglerne af de uorganiske hydroxyapatitbestanddele, som er ind 10 lejret i osseinmatrixen. Yderligere stimulerer OHC legemets bruskreparationsmeka- 11 nisme og beskytter bruskvæv mod nedbrydning.
I DK 175488 B1 I
I 2 I
I OHC udviser en karakteristisk biologisk virkemåde på osteoblaster, der er de celler, der I
I er ansvarlige for dannelse af knoglevæv. OHC forstærker formeringen og metabolis- I
I men af osteoblaster og fremmer endvidere differentieringen af ikke-specifikke mesen- I
I chymceller til chondroblaster eller osteoblaster. OHC er således et nyt lægemiddel mod I
I 5 knoglesygdomme af forskellig oprindelse, f.eks. ved primær og sekundær osteoporosis I
I og ved heling af knoglebrud og knogledefekter og til optimering ved proteseindsæt- I
I ning. På grund af de nævnte cytobiologiske egenskaber, der farmakologisk blev be- I
I kræftet in vivo i dyr og klinisk i mennesker, er det klart, at OHC er de almindelige cal- I
I ciumpræparater og alle knoglemel betydeligt overlegen. OHC frembyder et virkeligt al- I
I 10 temativ til de rene knogleresorptionsinhibitorer inden for terapeutiske produkter mod I
I osteoporosis, såsom estrogener og calcitoniner, idet OHC ikke alene hæmmer knogle- I
I resorption, men frem for alt fremmer knoglevækst. OHC adskiller sig fra de eksisteren- I
I de terapeutiske produkter, der på lignende måde stimulerer knoglemetabolisme, f.eks. I
I natriumfluorid og diphosphonater, på grund af den kendsgerning, at den forårsager be- I
I 15 tydelig færre bivirkninger, idet den f.eks. er fri for gastrointestinale bivirkninger og ik- I
I ke forårsager ledsmerter. Diphosphonater har en meget snæver terapeutisk bredde, I
I hvorimod OHC i det væsentlige ikke er toksisk. I
I OHC udviser ydermere en biologisk virkning på chondrocyter, som er ansvarlige for I
I 20 dannelsen og resorption af bruskvævet. Uden tab af deres phenotype stimuleres chon- I
I drocyter af OHC til formering og forøgelse af deres metabolisme, og beskyttes mod I
I iatrogene noxae, såsom corticosteroider. Endvidere fremmer OHC differentiering af I
I uspecifikke mesenchymceller til chondrocyter og øger dermed chondroid metaplasi, en I
I proces, der spiller hovedrollen ved regenereringen af bruskvæv. I
I 25 I
I OHC er derfor særdeles nyttig ved behandlingen af osteoarthritis, hvor antallet af I
I chondrocyter og deres metaboliske aktivitet er nedsat, og hvor regenering af brusk ville I
I kræve ordineret chondroid metaplasi. OHC er endvidere velegnet til behandling af I
I osteoporosis og til understøttelse af helingsprocessen ved knoglebrud og knogle- og I
I 30 bruskdefekter. I
DK 175488 B1 3 OHC's biologiske virkemåde kan in vitro vises ved f.eks., a) stimulering af osteoblasters, chondrocyters og fibroblasters DNA-syntese, 5 b) stimulering af chondrocyters og fibroblasters proteinsyntese, c) selektiv stimulering af collagen-totalsyntesen i chondrocyter sammenlignet med stimulering af den totale proteinsyntese, 10 d) fremkaldelse af syntese af proteinerne x og y i chondrocyter, og e) forøgelse af ikke-specifikke mesenchymcellers differentiering til chondrocyter eller osteoblaster.
15 Ved collagentotalsyntesens stimulering forbliver forholdet mellem collagentype I og II i chondrocytkulturer uforandret i 24 timer, hvorved chondrocytemes phenotype bevares i denne periode.
Den biologiske virkning på DNA-syntese bestemmes ved hjælp af en almindeligvis an-20 vendt måde ved at måle stimuleringen af 3H-thymidinoptagelsen i cellelinier, f.eks. 3T3 fibroblaster; se Jimenez de Asua et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, bind 72 (1975), side 2724-2728. Dette er en almindelig anvendt biologisk teknik til identificering af mitogene stoffer. Det er en fordel, at anvende cellelinier ved denne påvisningsmetode, eftersom cellelinier er nemme at dyrke.
25
Denne undersøgelsesmetode bygger på antagelsen, at ikke-transformerede fibroblaster i cellekulturen udviser to ekstreme vækststadier. I hvilestedet befinder cellerne sig i G<>-Gi-fasen og deler sig derfor ikke. Desuden findes der stadiet med aktiv formering. 1
Overgang fra hvilefasen til formeringsfasen kan reguleres ved hjælp af koncentrationen af essentielle næringsstoffer, serum eller andre vækstfremmende faktorer. OHC inde-
I DK 175488 B1 I
I 4 I
I holder sådanne vækstfremmende faktorer. De sidstnævnte er opløselige i neutralt puf- I
I rede, fysiologiske opløsningsmidler, såsom phosphatpufVet saltopløsning (PBS) eller I
I fysiologisk saltopløsning, og bevirker en kraftig stimulerende, dosisafhængig optagelse I
I af 3H-thymidin i hvilende 3T3 fibroblaster. I
I 5 I
I Den hyppigt anvendte fremgangsmåde til sterilisering af foderstoffer og farmaceutiske I
I præparater ved hjælp af bestråling med gammastråler formindsker ikke den biologiske I
I aktivitet af OHC, som målt ved hjælp af den stimulerende virkning på 3H-thymidinop- I
I tagelsen i 3T3-fibroblaster. I
I 10 I
I Dette undersøgelsessystem kan ligeledes anvendes til at bestemmelse af osteo- I
I blast-DNA-syntesens cellespecifikke stimulering. Der anvendes osteoblastpopulationer, I
I som er tilvejebragt ved hjælp af sekventiel enzymfordøjelse fra rottecalvaria. Disse I
I osteoblastpopulationer repræsenterer forskellige stadier af osteoblastudviklingen; popu- I
I 15 lationer I til III anses for at være af præosteoblastcelletype, populationer IV til VII som I
I osteoblastcelletype og population L for hvilende osteoblasttypeceller eller osteocyter. I
I Neutralt opløseliggjorte OHC-bestanddele har en dosisafhængig stimulerende effekt på I
I osteoblaster af population V og VI. Formering i primære rottefibroblastkulturer, der un- I
I 20 dersøgtes parallelt, stimuleres ikke. Af disse eksperimentelle resultater følger, at de I
I neutralt opløseliggjorte OHC-bestanddele udviser en knoglecellespecifik virkning. I
I Den biologiske virkning på proteinsyntese bestemmes på sædvanlig måde ved at måle I
I stimuleringen af L-(5-3H)-prolinoptagelsen i celler, f.eks. cellelinier, såsom 3T3-fibro- I
I 25 blaster, eller human forhudfibroblaster. Disse metoder bygger på antagelsen, at protein- I
I syntesen i stimulerede celler forøges. Hvis L-(5-3H)-prolin gives til de stimulerede cel- I
I ler i cellekulturmedium, indbygger disse stoffet i de nysyntetiserede proteiner. Efter en I
I given inkubationsperiode måles optagelsen af radioaktivitet, som er et mål for den sti- I
I mulerende virkning. OHC indeholder neutralt opløseliggjorte bestanddele, som har en I
I 30 kraftig stimulerende, dosisafhængig virkning på proteinsyntese i 3T3-fibroblaster og I
I human forhudfibroblaster. I
5 DK 175488 B1
Alkaliphosphataseundersøgelsen udføres som foreskrevet af "Deutsche Gesellschaft fur klinische Chemie", Z. Klin. Chem. og Klin. Biochem., bind 8 (1970), side 658; bind 9 (1971), side 464; og bind 10 (1972), side 182. Phosphataseaktivitet undersøges til kvalitetskontrolformål ved hvert stadie af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
5
Tabel I opsummerer sammensætningen af OHO (opnåede værdier fra ca. 150 portioner) bestemt ved analyse.
Tabel 1 10
Organoleptisk undersøgelse Fint til let granulært, beige-gråt pulver med svag naturlig lugt
Identitet - Calcium og phosphatase identificeret - Collagen identificeret Vandindhold < 7%
Total aske 51,3-62,7%
Calcium 19,2-23,6%
Phosphor 8,9-10,9%
Collagen 23,4-28,6%
Ikke-collagen- proteiner/peptider 7,2-10,8%
Sporgrundstoffer F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu og Ni identificeret
Phosphataseaktivitet 0,5-15 mE/mg
Anormal toksicitet Ingen tegn på intolerence
Totalt mikrobielt indhold <l04/g Gærceller < 102/g
Enterobakteriaceae < 102/g
Specifikke mikrobearter Ingen
I DK 175488 B1 I
I 6 I
I Ifølge opfindelsen udføres følgende trin for at fremstille OHC: I
I Først fjernes knogler fra i fosterstadiet til ca. 12 måneders alderen gamle pattedyr, der I
har været undersøgt af embedsdyrlæger. Efter fjernelse nedfryses de rene knogler hur- I
I 5 tigt og holdes ved ca. -20 til -30°C, indtil de skal anvendes; se fig. 1, kasse 1. Før knog- I
I lerne videre forarbejdes, undersøges de for at se om de stadigvæk er friske, hvilket kan I
I bestemmes ved hjælp af deres lugt og farve. Knoglerne undersøges ligeledes for renhed I
I og for at se, om det er netop disse knogler, der skal anvendes. Om nødvendigt undersø- I
I ges knoglerne for størrelse og form ved sammenligning med en husdyrsanatomibog. I
I 10 Desuden fjernes enhver rest af kød, sener og brusk. I
I Opstår der en hvilken som helst tvivl om dyrets identitet, kan arten også bestemmes I
I ved hjælp af almindelige immunologiske reaktioner, f.eks. fældningsreaktioner. I
I 15 Herefter sønderdeles knoglerne i en knusningsmølle til en partikelstørrelse på maksi- I
malt ca. 1 cm (se fig. 1, kasse 2). Knoglepartikleme tørres herefter under reduceret tryk I
I ved 20-80°C, indtil deres restvandindhold ligger på maksimalt ca. 10% eller mellem ca. I
I 10 til 25% (se fig. 1, kasse 3a og 3b). Det opnåede knoglemateriale indstilles herefter I
I til en pH-værdi på ca. 5,0 til 5,5 ved brug af syre, såsom saltsyre, phosphorsyre, eddi- I
I 20 kesyre, myresyre eller citronsyre. Herefter dehydratiseres og affedtes knoglematerialet I
I ved hjælp af et hydrofilt og lipofilt opløsningsmiddel til et maksimalt restvandindhold I
og restfedtindhold på ca. 5% eller også dehydratiseres materialet først til et maksimalt I
restvandindhold på ca. 5% under anvendelse af et hydrofilt opløsningsmiddel ved 20 til I
I 80°C og herefter affedtes ved 20 til 80°C til et restfedtindhold på maksimalt ca. 5% ved I
I 25 hjælp af et lipofilt opløsningsmiddel (se fig. 1, kasse 4a og 4b). I
I Det resulterende dehydratiserede og affedtede knoglemateriale tørres herefter yderlige- I
re under reduceret tryk ved 20 til 80°C, f.eks. i en hvirvelstrøm, indtil der opnås et I
I maksimalt opløsningsmiddelindhold på ca. 1% (se fig. 1, kasse 5). I
I 30 I
DK 175488 B1 7
Afhængig af anvendelsesformålet for det opnåede knoglemateriale pulveriseres dette herefter på normal måde i male- og sigteapparater til pulvere med komstørrelser, der varierer fra ca. 50 til 300 mikron (se fig. 1, kasse 6).
5 Hvis antallet af mikrober i knoglematerialet overstiger ca. 10.000 per g steriliseres knoglematerialet på den sædvanlige måde, f.eks. ved behandling med ethylenoxid eller bestråling med gammastråler (se fig. 1, kasse 10 til 12). Der opnås OHC, der er velegnet til fremstilling af farmaceutiske medikamenter (se fig. 1, kasse 13).
10 Ved en alternativ udførelsesform for opfindelsen knuses alle pattedyrsknogleme, som beskrevet ovenfor, til en maksimal partikelstørrelse på ca. 1 cm, f.eks. i en knusnings-mølle (se fig. 2, kasse 2). Knoglepartikleme indstilles herefter til en pH-værdi på 5,0 til 5,5 med en syre. Derefter dehydratiseres og affedtes ved anvendelse af et hydrofilt og lipofilt opløsningsmiddel til et maksimalt restvand- og restfedtindhold på ca. 5%, eller 15 først dehydratisere med et hydrofilt opløsningsmiddel ved 20 til 80°C til et maksimalt restvandindhold på ca. 5%, efterfulgt af en affedtning med et lipofilt opløsningsmiddel ved 20 til 80°C til et maksimalt restfedtindhold på ca. 5% (se fig. 2, kasse 3a og 3b).
Det resulterende dehydratiserede og affedtede knoglemateriale tørres herefter yderlige-20 re under reduceret tryk ved 20 til 80°C, f.eks. i en hvirvelstrøm, indtil der opnås et maksimalt opløsningsmiddelindhold på ca. 1% (se fig. 2, kasse 4). Om nødvendigt vi-dereforarbejdes knoglematerialet yderligere som beskrevet ovenfor (se fig. 2, kasse 5 til 11). Hermed opnås OHC, velegnet til fremstilling af farmaceutiske medikamenter (fig.
2, kasse 12).
25
Foretrukne knogler til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er som beskrevet nærmere ovenfor lange knogler, såsom humerus, femur, tibia, radius og ulna, os metacarpale eller os metatarsale. Desuden anvendes fortrinsvis knogler fra kalve (Bos taurus).
30
I DK 175488 B1 I
I 8 I
I Det er indlysende, at det for at undgå at produktet denatureres, er nødvendigt i hvert til- I
I fælde at reducere tørrings- og affedtningstemperaturen, når fugtigheds- og opløsnings- I
I middelindholdet falder. Som allerede nævnt anvendes en maksimal temperatur på 80°C I
I ved dehydratisering og tørring. Efterhånden som vand- og opløsningsmiddelindholdet I
I 5 falder, nedsættes temperaturen, og operationen udføres meget hurtigt. I
I Under dehydratiserings- og tørringsoperationen er trykket maksimalt ca. 400 mbar. I
I Typiske eksempler på egnede lipofile opløsningsmidler er acetone, trichlorethylen, me- I
I 10 thylenchlorid og lavt kogende petroleumsether. Typiske eksempler på egnede hydrofile I
I opløsningsmidler er acetone, ethanol og isopropanol. I
I Den resulterende OHC kan på konventionel måde videreforarbejdes til farmaceutiske I
I produkter til oral administration, såsom granulater, filmbelagte tabletter, kapsler, belag- I
I 15 te piller, pulvere eller suspensioner. Den daglige dosis er på 0,6 til 10 g, delt i to eller I
I tre enkelte doser. Dosisenheden er på 200 til 4000 mg. I
For at fremstille granuler blandes OHC med fyldstoffer og smagsstoffer, fugtes med I
I vand, granuleres og tørres. I
I 20 I
I Ved fremstilling af filmbelagte tabletter granuleres OHC i fugtig tilstand, tørres og sig- I
I tes derefter. Strømningsmidler, smøremidler og desintegrationsmidler iblandes. Bian- I
I dingcn, der nu er færdig til formning, tabletteres og belægges herefter med en tynd, I
I farvet lak. I
I 25 I
For at fremstille belagte piller, granuleres OHC i fugtig tilstand, tørres og sigtes. Heref- I
I ter tilsættes almindelige tabletteringshjælpestoffer, og tabletkememe formes. Disse se- I
pareres, forsynes med et hvidt overtræk, farves og poleres. I
I 30 For at fremstille pulvere forarbejdes OHC til skorpeagtige granuler og aromatiseres I
I herefter og sigtes. I
DK 175488 B1 9
Ved fremstilling af suspensioner suspenderes OHC sammen med hjælpestoffer, der forøger viskositet i sirupper. Suspensionen farves, aromatiseres og konserveres herefter.
5 Fig. I viser skemaet for fremstilling af OHC som i eksempel 1.
Fig. 2 viser skemaet for fremstilling af OHC som i eksempel 2.
Fig. 3 viser OHC-ekstrakts stimulerende virkning på optagelse af 3H-thymidin i 10 3T3-fibroblaster. Abscissen viser koncentrationen af OHC-ekstrakten i μΐ/ml kulturmedium. Ordinaten viser optagelsen af 3H-thymidin i cpm x 104. Bjælkerne giver standardafvigelserne for gennemsnitsværdierne fra ni målinger; korrelationskoefficient er 0,917.
15 Fig. 4 viser stimulering af L-(5-3H)-prolinoptagelse i 3T3-fibroblaster ved behandling med føtalkalveserum (—) og ved behandling med OHC-bestanddele (_). Abscissen giver koncentrationen for de undersøgte prøver i μΐ/ml kulturmedium; ordinaten viser L-(5-3H)-prolinoptagelsen i cpm x 103.
20 Fig. 5 viser stimulering af 3H-thymidinoptagelse i kvægchon drocyter som en funktion af OHC 34/4 dosen. Abscissen viser koncentrationen af de undersøgte prøver i pg/ml kulturmedium, ordinaten 3H-thymidinoptagelsen i cpm x 104.
Fig. 6 viser stimulering af collagensyntesen og total mængde proteiner i chondrocyter i 25 monolagkulturer som en funktion af OHC-koncentration. Abscissen giver pg-mængden af aktiv undersøgelsesprotein, der anvendes per ml kultur. Ordinaten viser pg mængden nysyntetiseret protein (x_x) respektivt collagen (o—o) for hver kulturbatch.
Fig. 7 viser den procentvise forøgelse i collagenindhold i den totale proteinmasse som 30 en funktion af OHC-dosen.
I DK 175488 B1 I
I 10 I
I Fig. 8 viser stimulering af 3H-thymidinoptagelse i 3T3-fibroblaster ved hjælp af bestrå- I
I lede og ikke-bestrålede OHC-ekstrakter. Den bestrålede OHC-ekstrakt udviser et prote- I
I inindhold på 690 pg/ml (_). Den ikke bestrålede OHC-ekstrakt har et proteinindhold I
I på 670 pg/ml (—). På abscissen afsættes koncentrationen af OHC-ekstrakt i μ1/2,5 ml I
I 5 kulturmedium. Ordinaten viser 3H-thymidinoptagelsen i cpm. I
I Fig. 9 viser stimulering af 3H-thymidinoptagelse på 3T3-fibroblaster efter behandling I
I med Lencoll®, Lenphos®, Lensol®, Lensol agglomerat, Oss Pulvit, Mitsubishi Coo- I
I kies, osteotrofisk koncentrat, Canzocal, PMC og OHC. På abscissen afsættes koncen- I
I 10 trationen i de undersøgte prøver i μΐ/ml kulturmedium; ordinaten viser 3H-thymidinop- I
I tagelse i cpm. I
I I det undersøgte cytobiologiske system er kun OHC, og PMC og Lencoll® aktive. I
I 15 1 g af hvert af de undersøgte produkter ekstraheredes med 10 ml PBS; lige store porti- I
I oner af centrifugerede supematanter undersøgtes. I
I Fig. 10 viser den procentvise forandring af knoglehindetykkelse (eng: bone cortex) ef- I
I ter 14 måneders behandling med vitamin D2, calciumgluconat og med OHC. Efter sam- I
I 20 menligning med vitamin D2 kunne der konstateres en forøgelse på 11,6% ved anven- I
I delse af OHC. I
I Fig. 11 illustrerer den gennemsnitlige forandring i spolebenets mineralindhold BMC i I
I g/cm hos patienter, der over en periode på to år er behandlet med OHC (_) og kontrol I
I 25 (—). Standardafvigelser er vist ved bjælkerne. I
I Fig. 12 viser gennemsnitsforandringer i trabeculaknoglevolumenet (TBV) og hindetyk- I
I kelsen af hoftebensranden (CPT) hos patienter, der er behandlet med OHC (_) og kon- I
I trol (—) i en periode over to år. Standardafvigelserne er vist ved bjælkerne. I
I 30 I
DK 175488 B1 11 I fig. 13 viser ordinaten 3H-thymidinoptagelsen i cpm og abscissen koncentrationen i de undersøgte prøver i pg/200 μΐ kultur,
Den foreliggende opfindelse illustreres nærmere i de følgende eksempler.
5 EKSEMPEL 1
Lange knogler (humerus, femur, tibia, radius og ulna, os metacarpale og os metarsale) fra ca. 3 måneder gamle kalve (bos taurus) anvendes som begyndelsesmateriale til 10 fremstilling af OHC.
Dyrene undersøges af embedsdyrlæger, slagtes herefter, og knoglerne fjernes. Efter af-bening nedfryses de rene knogler hurtigt og opbevares ved -20 til -30°C til senere forarbejdning (se fig. 1, kasse 1).
15 Før knoglerne videreforarbejdes undersøges disse for friskhed (hvilket kan konstateres ved deres lugt og farve), for renhed og for at sikre sig, at det er de ønskede knogler. Alt kød, sener og brusk bliver fjernet.
20 I det første trin ved fremgangsmåden knuses 1600 kg (1 batch) frosne knogler i en knusningsmølle fremstillet af rustfrit stål med 20 mm sigtevidde. De knuste knoglers partikelstørrelse er ca. 1 cm. Knoglernes temperatur holdes under 0°C under knusning; se fig. 1, kasse 2. 1 2 3 4 5 6
Herefter dehydratiseres de knuste knogler i en skovletørrer af rustfrit stål ved et tryk på 2 0,97 til 0,98 bar. Det varme vands temperatur, som ved starten befinder sig på ca. 90°C, 3 nedsættes til ca. 40°C under tørringsforløbet. Så snart der ikke destilleres mere vand 4 over i kondensatopsamlingsbeholderen (ca. 10 timer efter tørrings påbegyndelse), af 5 brydes opvarmningen, og knoglematerialet tørres videre under reduceret tryk, indtil 6 restvandindholdet maksimalt er enten på ca. 10% (se fig. 1, kasse 3a) eller 10 til 25%
I DK 175488 B1 I
I 12 I
I (fig. 1, kasse 3b). Ved det sidstnævnte tørringsforløb bør knoglematerialets tempera- I
I tur ikke overskride 40°C. I
I Det tørrede knoglepræparat indstilles herefter med citronsyre til pH mellem 5,0 og 5,5. I
I 5 Det tørrede knoglepræparat dehydratiseres herefter en gang til ved 80 til 20°C, og fedt- I
I stofferne fjernes. Til dette formål anvendes enten acetone, som det hydrofile eller lipo- I
I file opløsningsmiddel, eller også dehydratiseres det tørrede knoglepræparat først med I
I acetone ved temperaturer fra 20 til 80°C og affedtes herefter i en anden proces med I
I trichlorethylen ved 20 til 80°C. Der opnås et knoglepræparat med et restvand- og rest- I
I 10 fedtindhold på maksimalt 5% (se fig. 1, kasse 4a og 4b). Opløsningsmiddelrester fjer- I
I nes herefter i en hvirvelstrøm ved 20 til 80°C og 90 mbar. Det resterende opløsnings- I
I middelindhold ligger på ca. 1% (se. fig. 1, kasse 5). I
I Det fremkomne knoglepræparat formales i en hammermølle med en 2 x 20 mm spalte- I
I 15 sigte og sigtes i et sigteapparat, i hvilket den øvre sigte har en maskevidde på 2,4 mm I
I og den nedre på 0,34 mm. Det på 2,4 mm sigten forblevne materiale kastes bort, og det I
I der gik igennem 0,34 mm sigten anvendes videre. Dette formales en gang til i et forma- I
I lingsapparat med en 0,8 mm perforeret sigteindsats og sigtes på et sigteapparat, hvor I
I den ene sigte har en maskevidde på 0,74 mm og den anden på 0,34 mm. Det på 0,74 I
I 20 mm sigten forblevne materiale kastes bort. Materialet, der sigtes gennem 0,34 mm sig- I
I ten, opsamles og formales en gang til i et formalingsapparat med en 0,8 mm perforeret I
I sigteindsats. Det sigtes herefter på den ovenfor beskrevne måde. Til sidst opsamles I
I pulveret og sigtes gennem en sigte med en maskevidde på 0,25 mm og formales i et I
I formalingsapparat med en 0,5 mm perforeret sigteindsats. Alt pulver passeres gennem I
I 25 en sigte med en maskevidde på 0,25 mm (se fig. 1, kasse 6). I
I Tabel II viser analyseværdieme af det opnåede OHC-pulver. I
I 30 I
DK 175488 B1 13
Tabel II
Organoleptisk undersøgelse Fin til let granuleret, beige-gråt pulver med svag naturlig lugt 1 orden
Identitet - calcium og phosphatase identificeret I orden
Vandindhold <7% 6,3%
Total aske 51,3-62,7% 56,2%
Calcium 19,2 - 23,6% 21,57%
Phosphor 8,9-10,9% 9,71%
Collagen 23,4 - 28,6% 26,4%
Ikke-collagene proteiner/peptider 7,2-10,8% 9%
Sporgrundstoffer F, Na, K, Mg, Fe. Zn, Cu og Ni identificeret I orden
Phosphataseaktivitet 0,5-15mE/mg 3,9mE/mg
Ikke-normal toksicitet Ingen tegn på uforligelighed I orden
Totalt mikrobielt indhold < 104/g ca. 300
Gaerceller/svampe <102/g Ingen
Enterobakteriaceae < 102/g Ingen
Specifikke mikrobe arter Ingen Ingen
Hvis analysen viser, at OHC-præparatet indeholder mere end 10.000 mikroorganismer 5 per g, steriliseres præparatet enten ved behandling med ethylenoxid eller ved bestråling med gammastråler (se fig. 1, kasse 10-12).
Der opnås OHC, velegnet til fremstillingen af farmaceutiske præparater (se fig. 1, kasse 13).
10
DK 175488 B1 I
14 I
EKSEMPEL 2 I
Et knust knoglepræparat med en maksimal partikelstørrelse på 1 cm fremstilles som i I
eksempel 1. Dette knoglepræparat indstilles herefter med citronsyre til en pH-værdi på H
5 5,0 til 5,5 og viderebehandles som i eksempel 1. I
Et OHC-præparat med analytiske data, opført i tabel III, opnås.
Tabel III I
Organoleptisk Fin til let granu- H
undersøgelse teret, beige-gråt H
pulver med svag na- H
turlig lugt I orden H
Identitet - calcium og phos- H
phatase identifi- H
ceret I orden H
- Collagen identi- H
ficeret I orden H
Vandindhold <7$ S,6¾ I
Total aske 51,3-62,7% 56,07% I
Calcium 19,2-23,6% 21,33% H
Phosphor 8,9-10,9% 9,95% I
Collagen 23,4-28,6% 26,2% I
Ikke-collagene H
proteiner/peptider 7,2-10,8% 8,8% H
Sporgrundstoffer F, Na, K, Mg, Fe, H
Zn, Cu og Ni iden- H
tificeret I orden H
Phosphatase- H
aktivitet 0,5-15 mE/rag 5,4 aE/mg H
Ikke norma.l Ingen tegn på H
toksicitet uforligelighed 1 orden H
Total mikrobielt H
indhold <10*/g ca. 10 H
Gærceller/svampe <102/g Ingen H
Enterobakteriaceae <102/g Ingen H
Specifikke mikrobe H
arter Ingen Ingen H
DK 175488 B1 15 EKSEMPEL 3
Swiss mouse 3T3-fibroblaster (Flow Laboratories) dyrkes i DMEM (Dulbecco's modificeret Eagle's medium, Boehringer Mannheim). Mediet suppleres med 100 enheder/ml 5 penicillin, 100 mg/ml streptomycin (begge fra Boehringer Mannheim) og 3,7 g NaH-C03/liter (Merck, Darmstadt), efter først at være blevet indstillet til pH 6,6 med C02 før steril filtrering. Desuden suppleres kulturen med 10% føtal kalveserum (Boehringer Mannheim) til celledyrkning. De neddyppede kulturer vokser i 90 mm petriskåle ved 37°C under 5% C02 tryk, og cellerne dyrkes to gange per uge med en begyndelsespod-10 ning på 4 x 104 celler per 10 ml dyrkningsmedium per petriskål. I de nedenfor beskrevne undersøgelser anvendes i hvert tilfælde celler fra passage 3 til 20.
Undersøgelsen af 3H-thymidinoptagelse udføres som beskrevet af L. Jimenez de Asua et al, (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, bind 72 (1975), side 2724-2728). Swiss mouse 15 3T3-fibroblaster fra de ovenfor beskrevne stamkulturer, forsynes med trypsin fra en steril opløsning af 0,05% trypsin/0,02% EDTA. Cellerne gensuspenderes i DMEM/-10% føtal kalveserum med en koncentration på 4 x 104 celler/ml. Lige store portioner af 1 ml cellesuspension afsættes på 1,9 cm2 mikrotiterplader. Cellerne inkuberes i yderligere 4 dage, uden at medium forandres, og der dannes sammenhængende mono-20 lag af hvilende, ikke-profilerende celler. Mediet suges herefter fra og erstattes med 1 ml frisk kulturmedium uden føtalt kalveserum. Endvidere tilsættes til undersøgelse beregnede prøver.
1 g OHC fremstillet som i eksempel 1 eller 2 suspenderes i 10 ml phosphatpufret salt-25 opløsning uden Mg og Ca (0,2 g KC1, 8 g NaCl, 2,7 g NaHP04 x 12H20,0,2 g K.H2P04 per liter). Efter 2 timers omrystning ved stuetemperatur centrifugeres prøverne i 15 minutter ved 2000 x g.
Lige store mængder på 2-500 μΐ af de klare supematanter, som fås efter centrifugering, 30 og som indeholder de neutralt opløseliggjorte OHC-bestanddele, sættes herefter til de 3T3-fibroblastkulturer, der er tilvejebragt ovenfor.
DK 175488 B1 I
16 I
For at måle blindværdier tilsættes udelukkende en identisk mængde af kulturmedium til I
kulturerne. Som en positiv kontrol tilsættes 2-200 μΐ føtal kalveserum. De til undersø- I
gelse beregnede kulturer inkuberes til sidst i 20 timer ved 37°C under 5% CCVtryk og I
mærkes herefter med 3H-thymidin. Cellerne mærkes radioaktivt ved at sætte 10 μΐ/ml I
5 af kulturmedium per brønd af en steril vandig thymidinopløsning indeholdende 1 μ Ci I
(methyl-3H)thymidin (Amersham, UK) og 0,9 pg methylthymidin (Sigma, USA). I
Efter 3H-thymidinen er blevet tilsat følger yderligere 4 timers inkubationsperiode ved I
de samme betingelser som anført før. I
10 I
Prøverne forberedes herefter til scintillationstælling. Kulturmediet suges fra, og cellela- I
gene vaskes med 0,5 ml 0,02% EDTA/PBS-opløsning. Cellerne forsynes herefter med I
trypsin, som beskrevet ovenfor, indtil disse er fuldstændigt løst fra underlaget. De sus- I
penderede celler anbringes i et mikrotiter Dynatech multimash-apparat, hvor disse au- I
15 tomatisk overføres til glasmikrofiberfiltere (Whatman 934-AH). Apparatet er program-
meret som følger: I
1) PBS-vask; 2) bundfældning med 5% trichloreddikesyre (Merck, Darmstadt); 3) I
ethanol fiksering. Glasmikrofiberfiltrene tørres og overflyttes til scintillationstæller glas. I
20 3 ml scintillationstællervæske tilsættes (7 g Permablend Packard i 1 liter Triton X-100/- I
toluen i forholdet 1:3; Merck, Darmstadt), og radioaktiviteten i prøverne måles som I
henfald per minut i en LKB-Wallac 1217 Rackbeta væskescintillationstæller. I
Maksimal stimulering med OHC, når kun ca. halvdelen af den maksimale stimulering, I
25 som opnås med føtal kalveserum. Dog skal det huskes, at det føtale kalveserum inde- I
holder ca. 60 gange så meget totalprotein som OHC-ekstrakteme. Således stimuleres I
3H-thymidinoptagelsen af de anvendte OHC-ekstrakter signifikant højere, når der an- I
vendes føtal kalveserum. De ved anvendelse af OHC opnåede måleresultater er opført i I
fig. 3. I
30 I
DK 175488 B1 17
Det beskrevne undersøgelsessystem kan også anvendes til måling af de i henhold til eksempel 1 eller 2 opnåede OHC-præparaters kvalitet. Når føtal kalveserum anvendes som en positiv kontrol, på den ene side ved en intern afprøvning af det cytobiologiske undersøgelsessystem og på den anden som en reference for de opnåede værdier med 5 OHC-prøveme, er det muligt at definere og udtrykke en aktivitetsenhed for karakteriseringen af OHC-præparatemes biologiske aktivitet. Dette tillader en standardisering af OHC-præparatemes biologiske aktivitet.
EKSEMPEL 4 10
Prolinoptagelsen i de dyrkede celler kan måles som i eksempel 3, men ved anvendelse af L-(5-3H)prolin i stedet for 3H-thymidin i det allerede beskrevne cellekultursystem.
Ved denne undersøgelse bestemmes proteinsyntesens hastighed i de dyrkede celler, og ved måling og kvalitetsbestemmelse af den i cellerne absorberede radioaktivitet kan 15 OHC-præparatemes biologiske aktivitet bestemmes. Fig. 4 viser stimuleringen af L-(5-3H)prolinoptagelsen i 3T3-fibroblaster ved hjælp af OHC.
Fig. 4 viser, at OHC-præparatet i høj grad forøger proteinsyntesehastigheden i de undersøgte celler.
20 EKSEMPEL 5
Chondrocyter isoleres på sædvanlig måde fra epiphysebrusk fra føtale kalve. 50.000 celler dyrkes neddykket (eng: sub-confluently) i 4-6 døgn, i hvert tilfælde med en 1 ml 25 F12-medium, suppleret med 10% føtalt kalveserum. Som i eksempel 3 behandles de opnåede cellekulturer med de i overensstemmelse med eksempel 1 eller 2 opnåede OHC-præparater 34/4. Cellerne mærkes herefter med 3H-thymidin som i eksempel 3 og den inkorporerede radioaktivitet måles. 1 1 fig. 5 er resultaterne fra de første undersøgelser opsummeret. 3H-thymidin-optagelsen i bovinchondrocyteme vises i forhold til stoffernes OHC 34/4 dosis.
I DK 175488 B1 I
I 18 I
I I fig. 6 og 7 kan ses, at det undersøgte OHC 35/4 stimulerer den føtale proteinsyntese I
og col lagensyntesens hastighed. I
I 34/4 og 35/4 betegner batchserienumre, I
I s I
I EKSEMPEL 6 I
I Som i alt væsentligt beskrevet af Cohn et al. (Simmons og Kanin (udgivere), Skeltal I
I Research, an Experimental Approach, Academic Press, New York, San Francisco, Lon- I
I 10 don, side 3-20) isoleres forskellige knoglecellepopulationer fra en dag gamle Wistar I
I rotte calvaria ved hjælp af sekventiel tidsafhængig enzymfordøjelsesprocedure med den I
undtagelse, at hyaluronidase (0,05%) anvendes som et yderligere enzym sammen med I
I collagenase og trypsin, for at frigøre cellerne fra knoglevævet. I
Μ I
I 15 De forskellige cellepopulationer, der er frigjort i løbet af 20 minutters fordøjelse, num- I
mereres med romertal, svarende til den rækkefølge, med hvilken de enkelte cellefrakti- I
oner er opnået. Den første cellepopulation, der blev frigjort fra calvarieme, benævnes I, I
I mens den sidste cellefraktion, frigjort i løbet af 1 times fordøjelse, mærkes L. Funktio- I
nelle undersøgelser tyder på, at population I til III sandsynligvis repræsenterer celler fra I
20 den knoglecelleforløbende cellepool (præosteoplastlignende). Cellepopulation IV til VI I
I udviser træk med osteoplastlignende kendetegn. Cellepopulationen VII og L kan be- I
I tragtes som hvilende, osteoplastlignende celler eller muligvis som osteocytlignende I
I celler. I
I 25 10 ml suspension af 1,5 x lO5 celler/ml i et med 10% føtal kalveserum beriget MEM- I
I medium (med Earle’s salte) anbringes i 250 ml vævskulturflasker. Efter inkubation i I
I 9-10 døgn ved 37°C under 5% C02 atmosfære opnås sammenhængende cellelag, som I
I opslæmmes med 0,2% trypsin. Cellerne høstes ved hjælp af centrifugering ved 400 x g I
I i 7 minutter. Den resulterende cellepellet resuspenderes i MEM-medium beriget med I
I 30 20% føtal kalveserum og 10% DMSO og suspensionen nedfryses indtil videreanven- I
I delse i flydende nitrogen. I
DK 175488 B1 19
De individuelle frosne knoglepopulationer bringes forsigtigt op til 37°C og optages i 40 ml med 20% føtal kalveserum beriget MEM. Disse centrifugeres i 7 minutter ved 400 x • g, og de resulterende cellepellets gensuspenderes i frisk medium beriget med 10% fø- talt kalveserum og sættes på mikrotiterplader med 96 brønde med en tæthed på 7-10 x 5 103 celler per brønd. Cellerne dyrkes i to døgn. Efter det tredje døgn erstattes kulturme diet med et medium indeholdende enten 1% eller 2% føtalt kalveserum. Efter inkube-ring i 24 timer erstattes mediet igen med frisk medium indeholdende 1% eller 2% føtalt kalveserum, 0,5 μ Ci 3H-thymidin/ml og neutralt opløseliggjorte OHC-bestanddele i forskellige koncentrationer. Til kontrolkultureme sættes tilsvarende mængder PBS.
10
For at sikre, at de forskellige knoglecellekulturer overhovedet reagerer på et mitogen, udføres eksperimenter med EDGF (Epidermal Growth Factor).
Knoglecellekultureme inkuberes i 24 timer under de ovennævnte betingelser med det 15 3H-thymidin indeholdende medium. Mængden af inkorporeret 3H-thymidin måles herefter som i eksempel 3.
Undersøgelsesresultaterne er opført i tabel IV. Hver værdi svarer til middelværdien fra 5 forsøg og er angivet sammen med standardafvigelsen. De i PBS opløste OHC-be-20 standdele sættes til kulturmedier i mængder på 5-50 μΐ ved et totalt kulturmediumvolumen på 200 μΐ.
I DK 175488 B1 I
I 20 I
I Tabel IV I
Knoglecelle- 9H-thymidininkorporering ved stimulering I
I populationer med neutralt opløsel iggjorte OHC-bestand- I
I dele V og X ved tilstedeværelse af I
5 1% FCS* 2% FCS* I
I _(cpm/brønd t standardafvigelse) I
I M I
Kontrol (PBS) 19022 i 1630(5) 27656 i 841(5) I
Op V 11070 t 1160(5) 12394 t 195(5) I
Op X 11800 ± 508(5) 12678 ± 884(5) I
I P-II I
JD Kontrol 19023 i 552(5) 25103 ± 344(5) I
Op V 15440 ± 491(5) 14910 ± 611(5) I
Op X 13161 ± 491(5) 13425 ± 940(5) I
I P-III I
Kontrol 12473 ± 582(5) 15159 ± 588(5) I
Op V 8179 1 433(5) 10105 ± 600(5) I
Op X 6735 ± 455(5) 9676 ± 436(5) I
I 15 tzH I
Kontrol 16482 ± 750(5) 21006 ± 711(5) I
Op V 9445 ± 481(5) 11388 ± 649(5) I
I Op X 6945 + 178(5) 10356 t 539(5) I
I P^V I
Kontrol 18298 ± 774(5) 22677 ± 176(5) I
I Op V 14380 1 746(5) 16115 ± 261(5) I
I Op X 14866 ± 250(5) 18330 i 296(5) I
I 20 I
p-vi I
Kontrol 25789 + 966(5) 37205 ± 2553(5) I
I Op V 23424 ± 1026(5) 28168 ± 711(5) I
Op X 23346 ± 1239(5) 32107 ± 422(5) I
I P-VII I
Kontrol 19405 i 827(5) 26369 ± 1236(5) I
Op V 30189 ± 1327(5) 41293 ± 1769(5) I
I 25 Op x 37498 ± 994(5) 44817 + 728(5) I
I M. I
Kontrol 13378 ± 396(5) 18654 ± 491(5) I
Op V 18677 ± 523(5) 26816 ± 1027(5) I
Op X 28488 ± 1241(5) 33411 ± 1220(5) I
I 30 *FCS = føtal kalveserum I
DK 175488 B1 21
Fra tabel IV kan ses, at de neutralt opløseliggjorte OHC-bestanddele stimulerer prolife-rationen af knoglecellepopulationer V og VI sammenlignet med kontrolkultureme, der er behandlet med PBS. Knoglecellepopulationer I og VII viser ingen reaktion. Resultaterne er gengivet i grafisk form i fig. 13.
5 EKSEMPEL 7 I tabel V vises resultaterne fra undersøgelser, hvor virkningen af neutralt opløseliggjorte OHC-bestanddele (OHC X) undersøgtes på rottehudfibroblaster.
10
Tabel V
3H-thymidininkorporering i rottehudfibroblaster i afhængighed af forskellig OHC X-koncentrationer.
15 3H-thymidininkorporering _(ccm/brønd = standardafvigelse) ingen FCS 450 ± 29 + 15 μΐ PBS 485 ±38 20 + 7,5 μΐ OHC X 343 ±18 + 15,0 μΐ OHCX 582 ±42 + 30,0 μΐ OHC X 618 ±16 1% FCS - 917 ±85 + 15 μΐ PBS 921 ±33 25 + 7,5 μΐ OHCX 606±32 + 15,0 μΐ OHCX 643 ±33 + 30,0 μΐ OHC X 783 ± 79 2% FCS - 1051 ±23 + 15 μΐ PBS 1127 ±51 30 + 7,5 μΐ OHCX 1059±38 + 15,0 μΐ OHCX 920±35
I DK 175488 51 I
I 22 I
I + 30,0 μΐ OHCX 1I40±57 I
Fra resultaterne i tabel V kan ses, at rotteskindfibroblaster ikke kan stimuleres af OHC I
I X. I
I 5 I
I Sammenlignes undersøgelsesresultaterne i tabel IV med undersøgelsesresultaterne i ta- I
I bel V, kan det ses, at den iagttagne mitogene aktivitet af OHC X er specifik for osteo- I
I blaster. I
I lo EKSEMPEL 8 I
I OHC fremstilles som i eksempel 1 eller 2 og bestråles med 25 kGy (2,5 Mrad). Under- I
I søgelsen udføres som i eksempel 3. Resultaterne er vist i fig. 8. I
I 15 Fig. 8 opsummerer resultaterne fra 3H-thymidininkorporering i 3T3-fibroplaster ved I
stimulering med forskellige mængder af en PBS-ekstrakt af bestrålet og ikke-bestrålet I
OHC. 1 fig. 8 kan ses, at bestråling ikke indvirker på OHC's biologiske aktivitet. I
I EKSEMPEL 9 I
I 20 I
I 1 g af hvert af de stoffer, der skal undersøges, afvejes i et med skruelåg forsynet glas, I
I og 10 ml PBS tilsættes. Efter 2 timers rystning ved stuetemperatur centrifugeres i 10 I
I minutter ved 3600 omdrejninger per minut i en MSE-bordcentrifuge. De klare supema- I
I tanter dekanteres, og præcipitateme kastes bort. Proteinindholdet i opløsningerne måles I
I 25 som beskrevet af Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976), side 248). Optagelsen af 3H- I
I thymidin i 3T3-fibroblaster stimuleres som i eksempel 3 og evalueres. I
I I tabel VI vises præparaterne, som blev anvendt ved sammenligning, og deres ekstra- I
I herbare proteinindhold. I
I 30 I
Tabel VI
DK 175488 B1 23 Mængde af ekstraherbar protein/ml opløsning.
5 Lencoll® 330 pg
Lenphos® 105 pg
Lensol® 3850 pg
Lensol® agglomerat 4200 pg
Osspulvit® 24 pg 10 Mitsubishi Cookies® 82 pg PMC® 400 pg
Osteotrofisk koncentrat 22 pg
Canzocal® 28,5 pg OHC (ifølge opfindelsen) 600 pg 15
Undersøgelsesresultaterne er sammenfattet i fig. 9. De inaktive stoffer kan ikke skelnes fra blindprøven og kan derfor ikke afbildes.
Det kan ses i fig. 9, at OHC er de andre produkter mærkbar overlegen til DNA-syntese-20 stimulering.
EKSEMPEL 10 OHC’s virkning på knogleheling undersøges i et forsøg med 60 udvoksede kaniner.
25 Der tilføjes ved hjælp af præcisionsteknik brusk/knogledefekter, som er identisk i størrelse og beliggenhed, i den distale femorale epiphyse i begge knæled.
Dyrene fordeles tilfældigt i 4 grupper på hver 15 dyr. En ubehandlet gruppe tjener som kontrol. Den første gruppe får 830 mg OHC (178,0 mg calcium) daglig, den anden 30 gruppe 510 mg af forasket OHC (dvs. knoglemineral uden aktive, organiske bestandde-
I DK 175488 B1 I
I 24 I
I le; 178,9 mg calcium) daglig og en tredje gruppe 650 mg calciumcarbonat daglig I
I (189,7 mg calcium). I tabel Vil forklares forsøgsplanen. I
I Tabel VII I
I 5 I
I Forsøgsplan I
I Forsøgsgruppe Postoperativ Antal for- Daglig dosis Supplerende I
I forsøgs- søgsdyr per dyr ad- Ca-mængde i I
I 10 varighed ministreret den daglige I
I _p. o._dosis i mg I
I Kontrolgruppe 35 5 I
I 56 5 I
I 84 5 I
I 15 I
I OHC-gruppe 35 5 1 tablet I
I 56 5 @830 mg 178,0 I
I 84 5 I
I 20 OHC-(forasket) 35 5 1 tablet I
I 56 5 @510 mg 178,9 I
I 84 5 I
I CaC03 35 5 1 tablet I
I 25 (Os-Cal) 56 5 @650 mg 189,7 I
I 84 5 I
I Fra døgn 7 til døgn 23 efter tilføjelse af defekterne behandles dyrene med en række I
I fluorescens-markører. Efter henholdsvis 5,8 og 12 uger aflives 5 dyr ad gangen. De hi- I
I 30 stologiske sektioner undersøges i et fluorescensmikroskop ved standardiseret lokalise- I
I ring og definition af snitplan i knogledefektregionen. Mikrofotografieme bedømmes ef- I
DK 175488 B1 25 ter indekspointsystem, baseret på fluorescensintensitet, art og grad af defektopfyldning, og struktur af den nydannede knogle. Resultaterne er opført i tabel VIII.
Tabel VIII 5
Gennemsnit og standardafvigelser af de summerede indekspoint efter forskellig behandling og undersøgelsesvarighed 10 Gruppe 35 døgn 56 døgn 84 døgn
Kontrol 17,8 ±3,6 22,0 ±8,5 16,2 ±2,8 OHC 24,3 ±4,8 31,8 ±1,1 34,3 ±2,4 15 OHC (forasket) 24,4 ±4,2 28,2 ±4,1 25,0± 12,8
CaC03 (Os-Cal) 20,0 ±7,1 27,2 ±6,3 29,0 ±6,1 20 De tre behandlede grupper viser signifikant forbedret mineralisering i forhold til den ubehandlede kontrolgruppe. Terapien med OHC fører i modsætning til de to andre aktive behandlinger til signifikant forbedring af knogledefekthelingen.
Sammenligningen af undersøgelsesresultaterne, der opnås med OHC og med forasket 25 OHC, viser klart, at OHC taber sin fordelagtige virkning, hvis de organiske bestanddele går tabt.
EKSEMPEL 11 30 OHC’s virkning på den artikulære chondrocytultrastruktur efter corticoid beskadigelse undersøges i en række af in vivo-undersøgelser med rotter. En kvantitativ bedømmelse
I DK 175488 B1 I
I 26 |
I er muliggjort ved anvendelsen af en ny, reproducerbar morphometrisk metode; se Μ. I
I Annefeld, Int. J. Tiss. Reac., bind VII [4]), (1958), side 273-289. I
Undersøgelserne udføres med tre grupper bestående hver af 5 han-Wistarrotter. Den I
5 første gruppe er en kontrolgruppe og er ikke behandlet. Den anden gruppe indgives de- I
I xamethason intramuskulært og den tredje indgives dexamethason og ydermere OHC I
I oralt. Forsøgsplanen er anført i tabel IX. I
I Tabel IX I
I 10 I
I Gruppe Dosis per Totalt antal Varighed Antal I
I dyr og uge af de admini- af under- af I
I strerede præ- søgelsen dyr I
I paratdoser i uger I
I 15 I
I Kontrol 5 5 I
Dexamethason 2x0,5 mg i.m. 10 5 5 I
I 20 Dexamethason/2x0,5 mg i.m. 10 5 5 I
I OHC 5x50 mg p.o. 25 5 5 I
I i.m. = intramuskulært; I
I p.o. = oralt I
I 25 I
I Dyrene aflives efter at være behandlet i 5 uger. Alt bruskvæv fra femur og tibia af beg- I
I ge knæled fernes, og vævet forberedes til elektronmikroskopi. 50 chondrocyter fra I
I hvert dyr analyseres morphometrisk. I
I 30 Sammenlignet med kontrollerne viser de med dexamethason behandlede dyr en reduk- I
I tion i længden af det endoplasmatiske reticulum og den totale overflade af Golgi-appa- I
27 DK 175488 B1 ratet i deres artikulære chondrocyter, sammen med en forøget chondrocytmotalitet.
Disse elektronmikroskopundersøgelsesresultater er et klart bevis på, at corticosteroider beskadiger de artikulære chondrocyter.
5 Dyrene, der var behandlet yderligere med OHC, udviser en meget mindre reduktion af det endoplasmatiske reticulum og overfladen af Golgi-apparatet i deres artikulære chondrocyter. De på grund af dexamethason forhøjede motalitetsrater i chondrocyter nedsættes af OHC til et niveau, der ligger endog under det af kontrollen. Samtidig forøger OHC også den totale overflade og antallet af mitochondria. Disse resultater peger 10 på den kendsgerning, at OHC efter oral indgift forøger chondrocytemes metabolisme. Forsøgsresultaterne er anført i tabel X.
Tabel X
15 Morphometrisk bestemmelse af chondrocytultrastruktur efter 5 ugers undersøgelse
Dexamethason
Kontrol Dexamethason
_OHC
20 endoplasmatisk reticulum, total længde, μχη 28,2 1 21,6 23,6
Golgi-apparat, total overflade (μιη2) 2,58 1 2,12 2,71 - 25
Mitochondria antal, 13,1 1 16,1 1 20,4 2 total overflade (pm2) 1,28 - 1,35 1 1,96 2
Cellemotalitet, % 2,17 4,00 1,25
Dexamethason's og OHC's indflydelse: 30
I DK 175488 B1 I
I 28 1
I l = statistisk signifikant forskel mellem kontrol- og testgrupperne, I
I 2 = statistisk signifikant forskel mellem grupperne, der er behandlet med dexamethason I
og sådanne, der både fik dexamethason og terapi, I
I p = 0,01, n = 250 per gruppe. I
I s I
I Af disse undersøgelser fremgår det, at de ved cytobiologiske in vitro undersøgelser I
I med OHC opnåede resultater (se eksempler 3 til 6) også gælder in vivo. Yderligere vi- I
I ser resultaterne, at OHC forhindrer de kendte negative indflydelser af corticosteroider I
I på brusk og knogleceller ved regulering af cellemetabolismen. I
I 10 I
I EKSEMPEL 12 I
I OHC's indflydelse på knoglefrakturheling i forhold til en placebo undersøges klinisk i I
I en dobbeltblindundersøgelse. I
I 15 I
I Efter en tilfældig fordeling behandles 85 tilfælde af tibiaskaftffakturer i 6 uger med et I
I af de to medikamenter. Tabel XI giver et overblik over patienternes alder og behand- I
I lingsart. I
I 20 Tabel XI I
I Antal af patienter I
I Placebo 1400mgOHC/d I
I 25 >55 år 13 13 I
I <55 år 36 23 I
I 49 36 I
I 30 I
I Konsolideringen af tibiaskaftfraktureme bestemmes i henhold til følgende parametre: I
29 DK 175488 B1 a) ubevægelig ved ffaktursiden b) smertefrihed c) bevægelighed af den brudne extremitet d) maksimal belastningsevne af den brudne extremitet 5 e) radiologiske undersøgelsesresultater.
I tilfælde af ældre patienter fremkommer konsolidationen ved behandling med OHC efter ca. 11 uger, og er dermed signifikant hurtigere end ved en behandling med placeboen (14,2 uger, p <0,05). I tilfælde af yngre patienter er differencen ikke statistisk signi-10 fikant (12,5 uger mod 11,5 uger). I betragtning af, at der i placebogruppen findes et antal af operationskrævende helingskomplikationer, der er tre gange højere, fremgår det af disse undersøgelsesresultater, at OHC fremskynder en ordnet frakturheling.
EKSEMPEL 13 15 I en kontrolleret undersøgelse udforskes indflydelsen af OHC på corticoidinduceret osteoporosis.
64 patienter, mindst 50 år gamle, der har modtaget corticosteroider til behandling af 20 rheumatisk arthritis fordeles tilfældigt i statistisk identiske behandlingsgrupper. Patien- . terne i gruppe 1 modtager udover deres sædvanlige behandling 4,9 g OHC dagligt. Ingen OHC gives til patienterne i gruppe 2.
Ved afslutningen af behandlingsperioden er stamhøjdetabet og formindskelsen i radius-25 knogletætheden i den OHC-behandlede gruppe signifikant mindre end i kontrolgruppen. Andre parametre, f.eks. ulnar knogletæthed og rygsmerter, er i den OHC-behandlede gruppe ligeledes betydelig forbedret i forhold til kontrolgruppen, men opnår imidlertid ingen statistisk signifikans. Resultaterne er anført i tabel XII.
30
I DK 175488 B1 I
I 30 I
I Tabel XII I
I Forskellene i osteopenia-indices efter I
I 1 års supplerende OHC-terapi. I
I 5 I
I Kontrol OHC p-værdier I
I Gennemsnitligt tab af I
I stamhøjden i cm ± S.D. 1,16=0,71 0,87=0,58 0,01 <p I
I < 0,05 I
I 10 Gennemsnitligt tab af I
I radial knogletæthed 0,056=0,035 0,043=0,029 p < 0,05 I
I BMC/W ± S.D. I
I Gennemsnitligt tab af I
I 15 ulnar knogletæthed 0,033=0,031 0,030=0,026 n.s. I
I BMC/W ± S.D. I
I Antal af nye hvirvel- I
I legemeffakturer på 4 3 n.s. I
I 20 røntgenbilleder I
I n.s. = ikke signifikant I
I Behandling med OHC er ligeledes resultatgivende med hensyn til at forhindre fremad- I
I 25 skriden af osteopenia ved stereoidbehandlede rheumatiske sygdomme. I disse underso- I
I gelser viser det sig, at OHC-behandling bør begynde så snart systemisk corticosteoid- I
I behandling begynder, uden at vente på de kliniske symptomer, der følger udviklingen I
I af osteopenia. I
I 30 I
31 DK 175488 B1 EKSEMPEL 14 I en klinisk undersøgelse udforskes virkningen af vitamin D2, OHC og calciumgluco-nat som en del af terapiforanstaltningeme ved primær leverchirose, idet sidstnævnte re-5 suiterer i hurtigt knoglesvind.
Vitamin D2 indgives parenteralt til 65 postmenopausale kvinder med osteoporotiske forandringer ved primær leverchirose. Dette patientkollektiv inddeles i 3 grupper på statistisk basis. Den første gruppe omfatter 22 patienter og modtager alene vitamin D2 10 (kontrol). De 21 patienter, der danner den anden gruppe, modtager 6,6 g OHC dagligt udover deres vitamin D2-terapi. Den tredje gruppe bestående af 22 patienter, modtager calcium i en dosis svarende til OHC, der gives til patienter i den anden gruppe, dvs. 4 brusetabletter med calciumgluconat per dag.
15 Efter 14 måneders terapi fastslås det, at den parenterale terapi med vitamin D2 alene ikke er tilstrækkelig, til at standse den ved hjælp af metacarpal indeks målte knoglesvind, endvidere, at kombinationen af vitamin D2 plus calciumgluconat kun lige netop er tilstrækkeligt, for at forhindre et yderligere knogletab, og at alene kombinationen af vitamin D2 med OHC gav en statistisk signifikant tilvækst på 11,6% af knoglebarken 20 sammenlignet med kontrolgruppen. Forsøgsresultaterne vises i fig. 10.
Disse forsøgsresultater viser, at OHC ikke kun udelukkende er et calciumpræparat.
EKSEMPEL 15 25 36 patienter, der har været under behandling for kronisk aktiv autoimmun hepatitis med prednisolon og azathioprin i mindst et år fordeles på statistisk basis i forskellige grupper. De 18 patienter i den første gruppe modtager i 2 år 6,6 g OHC dagligt, de 18 patienter af kontrolgruppen modtager ingen OHC.
30
I DK 175488 B1 I
i 32 I
I Undersøgelsesresultaterne opnås ved hjælp af fotodensitometri og ved hjælp af knogle* I
I biopsi. Efter to år har kontrolgruppen undergået en statistisk signifikant formindskelse i I
I spolebenets BMC-mineralindhold ("enkelt” fotodensitometri) og i cortextykkelsen i I
I hoftebensranden CPT (knoglebiopsi) (se fig. 11 og 12). Knoglebiopsien viser en tydelig I
I 5 formindskelse i det trabeculære knoglevolumen (TBV) (sammenlign fig. 12) hos kon- I
I trolgruppen. Derimod forbliver ved OHC-terapien mineral indholdet i spolebenet kon- I
I stant (sammenlign fig. 11), det trabeculære knoglevolumen tiltager og formindskelsen i I
I cortextykkelsen er statistisk signifikant mindre en ved kontrolgruppen (sammenlign fig. I
I 12). I løbet af den 2-årige behandlingsperiode udviser tre patienter fra kontrolgruppen I
I 10 vertebrale deformationer, men derimod ikke en eneste patient fra OHC-gruppen. Fem I
I patienter viser et trabeculært knoglevolumen (TBV), som ligger under den af Meunier I
I påståede "vertebrale frakturtærskel" på 11 ± 3%, hvorimod ingen af de fire med OHC I
I behandlede risikopatienter udvikler vertebral fraktur. Derimod ses i tre af kontrolgrup- I
I pens patienter (TBV > 16%) vertebrale deformationer med tilsvarende fald i TPV-vær- I
I 15 dier under 11%. I
I EKSEMPEL 16 I
I Ved en tilbagevirkende kontrolleret undersøgelse anvendes sædvanlige knoglespecifik- I
I 20 ke parametre (det knoglespecifikke isoenzym af basisk alkaliphosphatase-osteoblast- I
I markør; hydroxyprolin i urinen - osteoblastmarkør; "tartratresistent" sur phosphatase - I
I osteoblastmarkør) for at vise, at enzymkoncentration i serumet på den ene side stiger I
I stærkt straks efter oophoretomi (et tegn på høj og intensiv knogleomsætning), og at te- I
I rapi med 7,5 g OHC daglig i 9 måneder på den anden side normaliserer forøgede knog- I
I 25 leomsætningsniveauer og dermed nedsætter risikoen. Parallelt til disse biokemiske re-
I sultater, viser knogletilvækst sig efter OHC er administreret, og dette kan måles ved I
I hjælp af metacarpal indeks. Det før terapien målte corticalknoglesvind på 1,1 ±0,6% per I
I år forandrede sig ved OHC-terapien til en statistisk signifikant positiv knogle-tilvækst I
I på 0,2±0,3% per år. I
I 30 I
DK 175488 B1 33 EKSEMPEL 17 11 osteoporosepatienter (2 mænd, 9 kvinder) behandles i to år med 7,5 g OHC dagligt og undersøges ved hjælp af kvantitativ computertomografi; se P. Ruegsegger et al., J.
5 Comput. Assist. Tomogr. 5 (1981), side 384-390. Udgående fra patienternes alder og struktur, ville man forvente, at et tab i spongiøst væv gennemsnitlig ligger på 2,7% per år.
Ved OHC-terapien finder man imidlertid, at næsten alle behandlede patienter viser en 10 lille forøgelse i den spongiøse knoglemasse. En sådan forøgelse har kun været observeret i tilfælde af natriumfluoridterapi, men i det sidste tilfælde var effekten ikke så regelmæssig og kontinuerlig og fandtes kun i nogle patienter (patienter med positiv respons). Nyeste resultater, se M.A. Dambacher et al., Bone 7, 199-205 (1986), viser, at standardterapien ved osteoporosis (natriumfluorid eller kombination af natriumfluorid 15 og calcium) ikke kan standse sygdommens fremadskriden (knogletab kan ikke fuldstændigt inhiberes; forøget vertebral frakturhyppighed) (eng: vertebral crush fracture rate). Spontan trabeculeret knogletilvækst er indtil videre aldrig blevet observeret hos c ubehandlede patienter.
Claims (4)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af en osseinhydroxyapatitforbindelse (OHC), ken- I I 5 detegnet ved de følgende analytiske parametre for det tørre stof: I I Organoleptisk undersøgelse Fint til let granulært, I I beige-gråt pulver med svag I I naturlig lugt I I Identitet - Calcium og phosphatase I I identificeret I I - Collagen identificeret I I Vandindhold <7% I I Total aske 51,3-62,7% I I Calcium 19,2-23,6% I I Phosphor 8,9-10,9% I I Collagen 23,4-28,6% I I Ikke-col lagen- I I proteiner/peptider 7,2-10,8% I I Sporgrundstoffer F, Na, K, Mg, Fe, Zn, Cu I I og Ni identificeret I I Phosphataseaktivitet 0,5-15 mE/mg I I Anormal toksicitet Ingen tegn på intolerance I I Totalt mikrobielt indhold <104/g I I Gærceller < 102/g I I Enterobakteriaceae <102/g I I Specifikke mikrobearter Ingen I —- -— .....IJ I og karakteriseret ved de følgende biologiske virkninger: I I 10 I DK 175488 B1 a) stimulering af DNA-syntesen i osteoblaster, chondrocyter og fibroblaster, b) stimulering af proteinsyntesen i chondrocyter og fibroblaster, 5 c) selektiv stimulering af collagen-totalsyntesen i chondrocyter i forhold til stimulering af den totale proteinsyntese, d) fremkaldelse af syntese af proteinerne x og y i chondrocyter, og 10 e) fremskyndelse af differentiering af ikke-specifikke mesenchymceller til chondrocyter eller osteoblaster, hvilken fremgangsmåde omfatter de følgende trin: 15 a) sønderdeling af knogler fra føtale til ca. 12 måneder gamle pattedyr til en partikelstørrelse på højst ca. 1 cm, b) tørring af knoglepartikleme under reduceret tryk ved ca. 20 til 80°C til et restvandindhold på højst ca. 10% eller ca. 10 til 25%, 20 c) indstilling af det resulterende knoglemateriale til en pH-værdi på 5,0 til 5,5 med en syre, d) derpå dehydratisering og affedtning med et hydrofilt og lipofilt opløsningsmiddel til 25 et restvand- og restfedtindhold på højst ca. 5% eller dehydratisering med et hydrofilt opløsningsmiddel ved 20 til 80°C til et restvandindhold på højst ca. 5% og derefter affedtning med et lipofilt opløsningsmiddel ved 20 til 80°C til et restfedtindhold på højst ca. 5%, 1 e) tørring af det dehydratiserede og affedtede knoglemateriale under reduceret tryk ved 20 til 80°C til et maksimalt opløsningsmiddelindhold på ca. 1%, og I DK 175488 B1 I I 36 I I f) pulverisering af knoglematerialet til en partikelstørrelse på ca. 50 til 300 mikrometer I I og derpå sterilisering. I
2. Fremgangsmåde ifølge krav I, hvori man I I 5 I I a) sønderdeler knogler fra føtale til ca. 12 måneder gamle pattedyr til en partikelstørrel- I I se på højst ca. 1 cm, I I b) indstiller knoglepartikleme til en pH-værdi på 5,0 til 5,5 med en syre, I I 10 I I c) dehydratiserer og affedter med et hydrofilt og lipofilt opløsningsmiddel til et rest- I I vand- og restfedtindhold på højst ca. 5% eller dehydratiserer med et hydrofilt opløs- I I ningsmiddel ved 20 til 80°C til et restvandindhold på højst ca. 5% og herefter affedter I I med et lipofilt opløsningsmiddel ved 20 til 80°C til et restfedtindhold på højst ca. 5%, I I 15 I I d) tørrer det dehydratiserede og affedtede knoglemateriale under reduceret tryk ved 20 I I til 80°C til et maksimalt opløsningsmiddelindhold på ca. 1%, og I I e) pulveriserer knoglematerialet til en partikelstørrelse på ca. 50 til 300 mikrometer og I I 20 derpå steriliserer. I
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvori humerus, femur, tibia, radius og ulna, I I os metacarpale eller os metatarsale anvendes. I I 25 4. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvori humerus, femur, tibia, radius og ulna, I I os metacarpale eller os metatarsale fra slagtekalve anvendes. I
30 I
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE3626414A DE3626414C2 (de) | 1986-08-05 | 1986-08-05 | Präparat zur Stimulierung von Chondrocyten und Osteoblasten (Ossein-Hydroxyapatit-Komplex), Verfahren zu seiner Herstellung und dieses enthaltende Arzneimittel |
DE3626414 | 1986-08-05 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DK196387D0 DK196387D0 (da) | 1987-04-15 |
DK196387A DK196387A (da) | 1988-02-06 |
DK175488B1 true DK175488B1 (da) | 2004-11-08 |
Family
ID=6306689
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DK198701963A DK175488B1 (da) | 1986-08-05 | 1987-04-15 | Fremgangsmåde til fremstilling af en osseinhydroxyapatitforbindelse |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4919931A (da) |
EP (1) | EP0255565B1 (da) |
JP (1) | JPS6344527A (da) |
KR (2) | KR880002897A (da) |
CN (1) | CN1028237C (da) |
AR (1) | AR242589A1 (da) |
AT (1) | ATE77239T1 (da) |
AU (1) | AU604014B2 (da) |
CA (1) | CA1289878C (da) |
DE (2) | DE3626414C2 (da) |
DK (1) | DK175488B1 (da) |
ES (1) | ES2041647T3 (da) |
FI (1) | FI91877C (da) |
GR (1) | GR3005579T3 (da) |
HU (1) | HU205373B (da) |
IE (1) | IE59916B1 (da) |
IL (1) | IL82213A (da) |
NO (1) | NO173786C (da) |
PT (1) | PT84693B (da) |
ZA (1) | ZA872701B (da) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4861590A (en) * | 1986-09-25 | 1989-08-29 | Colgate-Palmolive Company | Sustained release fluoride and calcium composition |
US4859467A (en) * | 1986-09-25 | 1989-08-22 | Colgate-Palmotive Company | Sustained release fluoride composition |
JPH02149618A (ja) * | 1988-11-30 | 1990-06-08 | Kobe Steel Ltd | 加工性に優れた高強度熱延鋼板の製造方法 |
CN1045719C (zh) * | 1993-04-10 | 1999-10-20 | 北京市西城区华新生化技术研究所 | 口服接骨和治骨质疏松液 |
EP0635518B1 (en) * | 1993-07-23 | 2003-10-08 | Kato, Yukio, Prof. | New chondrocyte protein |
WO1996005851A1 (de) * | 1994-08-23 | 1996-02-29 | Dgf Stoess Ag | Verwendung von geschmacksneutralem, hydrolysiertem kollagen und mittel enthaltend dasselbe |
US5788941A (en) * | 1996-01-31 | 1998-08-04 | Steris Corporation | Method of sterilization of bone tussue |
JPH09238291A (ja) * | 1996-02-29 | 1997-09-09 | Sony Corp | メニュー操作方法及び電子機器及びテレビジョン受像機 |
NL1020729C2 (nl) * | 2002-05-31 | 2003-12-02 | Gelatine Smits Beheer B V | Calciumbevattende samenstelling, werkwijze voor het bereiden daarvan, en farmaceutisch preparaat op basis van de samenstelling. |
CN1212126C (zh) * | 2002-07-09 | 2005-07-27 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 纳米羟基磷灰石补钙剂 |
JP4369969B2 (ja) * | 2007-10-26 | 2009-11-25 | 株式会社アールビーエス | 生体適合性材料並びにその製造方法 |
EP2699249B1 (en) | 2011-04-19 | 2016-09-14 | Bioiberica, S.A. | Cartilage product |
RU2478394C1 (ru) * | 2011-11-23 | 2013-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации | Биоматериал для возмещения дефектов костей и способ его получения |
WO2015033211A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-12 | Waitaki Biosciences | High osteocalcin microcrystalline hydroxyapatite for calcium supplement |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE894895C (de) * | 1950-03-06 | 1953-10-29 | Albert Dr Reissner | Verfahren zur Herstellung eines Praeparates zur Anregung der Zahnerhaltung |
US3400199A (en) * | 1965-02-26 | 1968-09-03 | Leslie L. Balassa | Wound-healing cartilage powder |
USRE28093E (en) * | 1962-02-28 | 1974-07-30 | Wound-healing cartilage powder | |
BE650626A (da) * | 1962-02-28 | 1900-01-01 | ||
DE2425266A1 (de) * | 1974-05-24 | 1975-11-27 | Lothar Tischmann | Zum einnehmen bestimmtes naehr- und heilmittel aus tierischer knochen-substanz und verfahren zu seiner herstellung |
DE2840064C2 (de) * | 1978-09-14 | 1989-09-21 | Hans Dr.med. Dr.med.dent. 8000 München Scheicher | Verfahren zur Herstellung von Knochenkontaktschichten |
US4232425A (en) * | 1980-01-15 | 1980-11-11 | Darling & Company | Method of producing stabilized bone |
US4294753A (en) * | 1980-08-04 | 1981-10-13 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein process |
US4455256A (en) * | 1981-05-05 | 1984-06-19 | The Regents Of The University Of California | Bone morphogenetic protein |
ZA816771B (en) * | 1980-10-07 | 1982-10-27 | Lensfield Prod Ltd | Protein production |
US4444752A (en) * | 1982-09-13 | 1984-04-24 | Lescarden Ltd. | Method for treating progressive systemic sclerosis |
US4436720A (en) * | 1983-03-04 | 1984-03-13 | Pakhomov Gennady N | Granulated treatment-and-prophylactic dental preparation possessing anticarious effect |
NZ210699A (en) * | 1984-01-04 | 1989-06-28 | Int Genetic Eng | Isolation of an osteogenic protein of the p3 immunologically related family |
DE3409372A1 (de) * | 1984-03-14 | 1985-09-19 | Dr. Ruhland Nachf. GmbH, 8425 Neustadt | Material zum vitalisieren von implantatoberflaechen |
DE3422466C1 (de) * | 1984-06-16 | 1986-03-20 | Lothar 6750 Kaiserslautern Tischmann | Verfahren zum Herstellen eines eßbaren, proteinhaltigen Knochenmehlpräparates aus frischen Tierknochen |
US4620327A (en) * | 1984-07-05 | 1986-11-04 | Caplan Arnold I | Process of adapting soluble bone protein for use in stimulating osteoinduction |
-
1986
- 1986-08-05 DE DE3626414A patent/DE3626414C2/de not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-01-28 DE DE8787101136T patent/DE3779829T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-28 EP EP87101136A patent/EP0255565B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-01-28 AT AT87101136T patent/ATE77239T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-01-28 ES ES198787101136T patent/ES2041647T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-02-05 US US07/011,504 patent/US4919931A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-14 CN CN87102744A patent/CN1028237C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-15 IE IE98387A patent/IE59916B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-04-15 NO NO871599A patent/NO173786C/no unknown
- 1987-04-15 FI FI871670A patent/FI91877C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-15 CA CA000534786A patent/CA1289878C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-15 AR AR87307298A patent/AR242589A1/es active
- 1987-04-15 PT PT84693A patent/PT84693B/pt unknown
- 1987-04-15 KR KR870003615A patent/KR880002897A/ko not_active Application Discontinuation
- 1987-04-15 AU AU71577/87A patent/AU604014B2/en not_active Expired
- 1987-04-15 HU HU871671A patent/HU205373B/hu unknown
- 1987-04-15 ZA ZA872701A patent/ZA872701B/xx unknown
- 1987-04-15 JP JP62092963A patent/JPS6344527A/ja active Granted
- 1987-04-15 IL IL82213A patent/IL82213A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-04-15 DK DK198701963A patent/DK175488B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-07-29 KR KR87008237A patent/KR960009651B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-09-01 GR GR920401915T patent/GR3005579T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DK175488B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af en osseinhydroxyapatitforbindelse | |
Revell | Pathology of bone | |
DK200600250U4 (da) | Anvendelse af et lanthancarbonat til fremstilling af et lægemiddel | |
Sokoloff | Endemic forms of osteoarthritis | |
Dallari et al. | Total hip arthroplasty after excision arthroplasty: indications and limits | |
Massé et al. | Vitamin B6 deficiency experimentally-induced bone and joint disorder: microscopic, radiographic and biochemical evidence | |
Rubenstein et al. | Crystal-associated arthropathies | |
Follis Jr | A survey of bone disease | |
Merker et al. | The effect of D-penicillamine of the skeletal development of rat foetuses | |
WO2008084283A2 (en) | Andrographis paniculata plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof | |
JP4418106B2 (ja) | ジエノゲストを有効成分とする骨吸収サイトカイン抑制剤 | |
Sevastikoglou | The Early Stages of Osteogenesis in Tissue Culture: A Morphologic and Biochemical Study | |
US10744188B2 (en) | High osteocalcin microcrystalline hydroxyapatite for calcium supplement | |
Vujasinović-Stupar et al. | Supplementation with bio-calcium from shells Pinctada maxima in postmenopausal women with decreased mineral bone density: Pilot study | |
Kold et al. | Qualitative aspects of the incorporation of equine cancellous bone grafts | |
WO2009007774A1 (en) | Asparagus racemosa extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof | |
CN100367952C (zh) | 一种含有l-苏糖酸钙和大豆异黄酮的组合物 | |
Liu et al. | In vivo calvarial bone cell responses to dietary perturbations and the implications for mineral homeostasis | |
WO2008007214A2 (en) | Glycyrrhiza glabra plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof | |
WO2008007216A2 (en) | Psoralea corylifolia plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof | |
WO2008004121A2 (en) | Allium sativum plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof | |
WO2008084282A2 (en) | Punica granatum plant extracts for treating osteoporosis and the extraction process thereof | |
Klein et al. | Differential induction of cell‐mediated mineralization in rat marrow stroma by sera from women of low and high risk for vertebral fracture | |
McCrady | Response surface analysis of rat bone composition changes by dietary calcium and silicon | |
Mine et al. | Proteins and Peptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PUP | Patent expired |