CN1028237C - 一种骨胶原羟基磷灰石化合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种刺激软骨细胞和成骨细胞的组合物,从约12个月龄的哺乳动物胎儿的骨胳中提取此组合物的方法,以及其制剂。本药剂可用于预防和治疗骨关节炎和骨质疏松,并可用于治愈骨折,软骨缺损及骨缺损。
Description
本发明涉及一种可刺激软骨细胞和成骨细胞的骨胶原羟基磷灰石化合物(OHC)。本发明还涉及制造OHC的方法。本发明进一步地涉及到含有OHC的药剂的用途,尤其用于口服时,可预防和治疗骨关节和骨质疏松,并可用以治愈骨折,软骨缺损和骨缺损。
从皮质甾类疗法中得知一种微晶羟基磷灰石组合物(MCHC)可用于预防骨质疏松,见A.Pines等等所著“当代医药研究和见解”8卷,10期,1984,734-742页,本组合物含有大约50%重量比的羟基磷灰石和磷酸钙的复合盐,还含有约26%的骨胶原以及约9%的非骨胶原蛋白/肽,另外还含有0.65%的钠以及镁和钾以及痕量元素氟、锌、锶、硅、铁、铷、铯和铂,最后还含有葡糖胺聚糖、柠檬酸盐和水。而对于如何制造MCHC都是一无所知的。
本发明的目的是提供一种骨胶原羟基磷灰石化合物(OHC)及其制造方法。本发明的另一目的是提供含有OHC化合物的复方药剂,本药剂可刺激软骨细胞和成骨细胞,以预防和治疗骨关节炎和骨质疏松,并可用以治愈骨折,软骨缺损和骨缺损。
据发现,OHC对骨和软骨的新陈代谢有特殊作用,因其含有以非变性状态存在的有机成分和以生理平衡比例存在的无机成分。使用OHC可以保证向人类和动物机体的骨略***提供必需物质(非胶原骨特有肽,局部骨和软骨细胞的活性调节因子,钙和磷)。OHC提供骨胶原的有机骨胶原质以及必需的骨质特有的,非胶原肽以及蛋白质聚糖,以支持骨的新
陈代谢。OHC还促进骨质再生并能增强对包埋在骨胶原质内的骨羟基磷灰石无机成分的掺入。OHC还可刺激体内软骨的修复机能并可防止软骨组织的退化。
OHC对成骨细胞具有一种生物作用的特性,这些成骨细胞主要负责骨组织的生成,OHC加强了成骨细胞的增生和代谢,进而促进了非特异性***对软骨细胞或成骨细胞的分化。因此OHC是治疗不同病源骨疾病的一种新药,如可治疗第一期和第二期的骨质疏松,可治愈骨折,骨缺损,以及可作为骨修补术用药。从所述的OHC的细胞生物学特性看,OHC在动物体内有药理作用,对人有临床治疗作用,OHC明显地优于钙类制剂以及所有骨粉食品。对于治疗骨质疏松,OHC药品提供了一种真正可以取代骨重吸收抑制剂的物质,如***和降钙素。OHC不仅抑制了骨的重吸收,而且促进了骨的生长。不同于现存的一些药品,这些药品也可刺激骨的新陈代谢,如氯化钠和二膦酸,OHC显然副作用较小,如无胃肠道反应和关节疼痛等付作用。二膦酸的治疗范围较窄,而在此范围内,OHC实际上是无毒的。
另外,OHC对软骨细胞产生出一种生物作用,这些软骨细胞主要负责软骨组织的形成和重吸收。软骨细胞受到OHC刺激不失去表型并能增生和增加代谢,还可预防用药(如:皮质类固醇激素)后所致的软骨方面的疾病。另外,OHC促进了非特异性***对软骨细胞的分化以此促进软骨的组织变形,这是在软骨组织中起重要作用的过程。
OHC对于治疗骨关节炎具有突出疗效,骨关节炎减少了软骨细胞的数量以及降低了它们的代谢活性,而软骨组织的再生需要有序的软骨组织。OHC还适于治疗骨质疏松,并可治愈骨折、骨和软骨的损伤。
OHC的生物活性可以在体外鉴定,例如:
a).对于成骨细胞,软骨细胞和成纤维细胞的DNA合成的刺激作用,
b).对于软骨细胞和成纤维细胞的蛋白合成的刺激作用,
c).与对总蛋白合成的刺激作用相比较,对于软骨细胞的骨胶原总合成的选择性刺激作用,
d).对于软骨细胞中的蛋白X和蛋白Y的合成的诱导作用,
e).促进非特异性***对软骨细胞或成骨细胞的分化,
在OHC刺激骨胶原总合成物时,Ⅰ型骨胶原与Ⅱ型骨胶原在骨细胞培养基中的比例可以一直保持不变,尽管时间已超过了24小时,但仍可保护软骨细胞的表型。
用一种普通的方法测定作用于DNA合成时的生物活性,即测定细胞株对3H-胸腺嘧啶核甙摄入的刺激,细胞株如3T3纤维组织细胞;见Jimene de Asua等等所著“美国自然学术科学方法”,72卷(1975),2724-2728页。这是鉴定细胞***物质所用的常规生物技术方法。因细胞株易于培养,在鉴定方法中使用细胞株是十分便利的。
本试验方法是根据以下考虑设计的:细胞培养基中的未转化、纤维组织母细胞具有两种极端生长阶段。静止阶段时,细胞处以G0-G1状态,因此不会***。另一个是活跃的增殖阶段。必要营养物、浆液或其它生长促进因子可以调节静止阶段向增殖阶段转化的过程。OHC即含有如此的生长促进因子,因此将OHC溶于中性缓冲生理盐水溶剂中,如磷酸缓冲盐水(PBS)或生理盐水中,本溶液具有一种高刺激性,用药剂量与静止期的3T3纤维组织母细胞吸收3H胸腺嘧啶核
相关。
为测定3T3纤维组织母细胞由于刺激作用而吸收3H胸腺嘧啶核甙时,使用常规消毒方法即γ-射线照射食物和药品制剂,并不会消弱OHC的生物活性。测定OHC对于成骨细胞的DNA合成物的细胞特异性刺激作用时,也可采用上述试验方法。通过一系列的酶解试验,可以获得鼠颅盖成骨细胞的类群,成骨细胞的类群可代表成骨细胞成熟的各个不同阶段:类群Ⅰ-Ⅲ视为前成骨细胞型,类群Ⅳ-Ⅶ视为成骨细胞型,类群Ⅴ视为静止期成骨细胞。
中性的可溶解的OHC成分的给药剂量取决于OHC对Ⅴ和Ⅵ的成骨细胞刺激所产生的影响,在平行试验中,鼠成纤维细胞初始培养相的增生不受刺激,随后,从试验中可发现中性可溶性的OHC成分具有骨细胞的特殊活性。
用一种常规方法确定对蛋白质合成的生物效应,即测定细胞,如3T3成纤维细胞,人***成纤维细胞,对L-(S-3H)-脯氨酸的摄入刺激,此方法是根据以下考虑设计的:受刺激的细胞蛋白合成增加。如果在培养基上供给受刺激细胞L-(S-3H)脯氨酸,这些脯氨酸就会掺入到新合成的蛋白质中。一段培养期之后,可以测定放射摄入的量,这就是测定OHC刺激效果的方法,OHC含有高刺激性能的中性可溶的成分,用药剂量取决于3T3纤维组织母细胞和人类***纤维组织母细胞的蛋白合成。
测定碱性磷酸酶的方法记载在Gesellschaft Fur Klinische Chemie所著“2.Klin化学与Klin生化”中,8卷(1970),P658;9卷(1971),P464,10卷(1972)P182.测定磷酸酶活性的目的主要是为了在试验各阶段中控制其质量。
表Ⅰ总结了OHC组合物(从150次所需原料量所获得)分析测定的结果。
表Ⅰ
感官测试 细微颗粒状的带有不明显
自然气味的米灰色粉末
鉴定 钙和磷酸酶的鉴定
胶原的鉴定
水含量 <7%
灰的总量 51.3-62.7%
钙 19.2-23.6%
磷 8.9-10.9%
胶原 23.4-28.6%
非胶原蛋白/肽 7.2-10.8%
微量元素 氟、钠、钾、镁、铁、锌、铜、
镍的鉴定
磷酸酶活性 0.5-15m E/毫克
非正常毒性 有耐受力
微生物总含量 <104/克
酵母 <102/克
肠细菌 <102/克
特异性微生物种类 无
根据本发明,用下列方法步骤制备OHC:
先将官方兽医检查过的12个月龄的哺乳动物胎儿的骨头剔下,然后将清洁过的骨头迅速冷冻,温度保持在-20℃--30℃;见图1,第1格,在进行下一步骤之前,先要检查骨头是否新鲜,有无变味和变色,并检查骨头是否清洁、符合要求。必要时还要检查其形状和大小以确证是家畜哺乳动物的骨胳。要去除任何残存的肌肉、腱以及软骨。
如果对动物的鉴定吃不准,也可以用常规免疫反应进行特殊鉴定,例如沉淀反应。
将骨头置于一个碾碎机中,碾碎成最大限度为1厘米左右的颗粒(见图1,第2格)。下一步将骨头颗粒在20-80℃下减压干燥,直到其残存水分含量到达最大限度10%-25%之间(见图1,第3a和3b格)。用酸,例如盐酸,磷酸,醋酸,甲酸或柠檬酸调节骨料的PH值到5.0-5.5左右。然后用亲水和亲脂的溶剂对骨料进行脱水和脱脂处理,直到残存水分和脂肪的含量为5%左右,或者先用亲水溶剂在20-80℃温度下脱水至残存水分含量的最大限度为5%左右,然后再用亲脂溶剂在20-80℃温度下脱脂至残存脂肪含量的最大限度为5%左右。(见图1,第4a和4b格)
然后再将所得的脱水和脱脂的骨料在20-80℃温度下减压进一步干燥,例如在一个旋涡流中,直到水的含量的最大限度是1%(见图1,第5格)
根据应用的要求,将所得骨料在粉碎机中研磨至颗粒大小为50-300微米不等的粉末(见图1,第6格)
如果每克骨料中的微生物数目超过了10,000,应该用常规方法进行消毒,例如用环氧乙烷处理或用γ-射线照射(见图1,第10-12格)。即可获得适于制备药剂用的OHC。(见图1,第3格)
本发明中的制备方法也可以采用另一种形式,将上述所说哺乳动物的
骨头在一个碾碎机中粉碎,直至颗粒形状的最大限度为1厘米左右(见图2第2格)。然后用酸调节骨粒的PH值到5.0-5.5。然后再用亲水剂和亲脂剂对骨粒进行脱水和脱脂处理,直至残余的水和脂的含量的最大限度为5%左右,或者先用脱水剂在20-80℃温度下进行脱水处理。直至残余水量的最大限度为5%左右,然后再用脱脂剂在20-80℃温度下进行脱脂处理,直至残余脂肪量的最大限度为5%左右。(见图2,第3a和3b格)
所得脱水和脱脂的骨料在20-80℃的温度下减压进一步干燥,例如在一个旋涡流中,直至水分含量的最大限度为10%左右(见图2,第4格)。必要的话,骨料可参照上述步骤继续加工。(见图2,第5格至第11格)。可获得适于制备药剂的OHC。本发明方法所使用的骨头,较适合的是长骨,如肱骨、股骨、胫骨、桡骨、尺骨、掌骨或蹠骨,小牛的骨头更为适用。
很明显,为了防止产品变性,有必要在每次操作中,当湿度和脂肪含量降低后马上降低干燥和脱脂的温度,脱脂和干燥的温度的最大限度是80℃。因此当水和脂肪含量落下后,马上降低温度,并且操作时要非常迅速。
进行脱水和干燥时,压力的最大限度为400毫巴左右。
典型适用的亲脂剂如:丙酮,三氯乙烯,二氯甲烷、低沸点石油醚。典型适用的亲水溶剂如:丙酮、乙醇,以及异丙醇。
可将所得OHC用常规方法制成口服药剂,如:颗粒剂、包膜片剂、胶囊、包衣药丸、粉剂或混悬剂。每日剂量0.6~10克,每日2或3次,每次200~4000毫克。
制备OHC颗粒剂:OHC与填充剂,调味剂相混合,用水湿润,制成颗粒并干燥。
制备OHC包膜片剂:将OHC制成颗粒并干燥,然后过筛。再与芳香剂、润滑剂,崩解剂相混合,混合物放在模子里压成片,用薄的颜色涂层包衣。
制备OHC包衣药丸:先将OHC制成颗粒,干燥并过筛,然后加入制片剂的辅料,将药丸核心成型,将核心分开,分别以白色涂料,着色、抛光。
制备OHC粉剂:将OHC制成有硬皮的细粒,加芳香剂并过筛。
制备OHC混悬剂,将OHC与可增加粘稠度的辅剂一起混悬于糖蜜中,制成混悬剂,再着色和加入芳香剂,保存。
图1表示例1中制备OHC的方案
图2表示例2中制备OHC的方案
图3表示受OHC提取物刺激后3T3纤维组织母细胞吸收3H胸腺嘧啶核甙的情况,横座标以微升/毫升的形式表示OHC提取物在培养基中的浓度,纵座标以每分钟计数×104的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收。小方块表示9个测定数的平均值的偏差标准:改正系数0.917。
图4表示当受胎牛血清(……)和OHC成分(-)刺激时,3T3纤维组织母细胞吸收L-(5-3H)蛋白的情况。横座标以微升/毫升的形式表示试验样品在培养基中的浓度。纵座标以每分钟计数×103的形式表示吸收L-(5-3H)脯氨酸的情况。
图5表示当34/4剂量的OHC作用于牛的软骨细胞时,其吸收3H胸腺嘧啶核甙的情况。横座标以微升/毫升的形式表示试验样品在培养基中的浓度。纵座标以每分钟计数×104的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收。
图6表示当OHC浓度刺激时,骨胶原合成和软骨细胞总蛋白在单层培养基中的情况。横座标表示每毫升培养基所用的分析蛋白活性的微克量。纵座标表示新合成蛋白的微克量X-X,新合成的骨胶原微克量0-0。
图7表示一次剂量的OHC作用时,骨胶原在总蛋白中含量增加的百分比。
图8表示当受照射的和未照射的OHC提取物刺激时,3T3纤维组织母细胞吸收3H胸腺嘧啶核甙的情况。受照射的OHC提取物的蛋白含量
为690微克/毫升,未受照射的OHC提取物的蛋白含量为670微克/毫升。横座标以微升/25毫升的形式表示OHC提取物在培养基中的浓度。纵座标以每分钟计数的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收。
图9表示当lencoll,lenphos,lensol,聚集的lensol,Oss Pnlvit,mitsnbishi Cookies,骨营养浓缩物,Conzocal,PMC和OHC刺激时,3T3纤维组织母细胞吸收3H胸腺嘧啶核甙的情况。横座标以微升/毫升的形式表示试验样品在培养基中的浓度。纵座标以每分钟计数的形式表示3H胸腺嘧啶核甙的摄入。
在所查的这些细胞生物制剂中,只有OHC、PMC和lencoll具有活性。
从每种调查物中各取出1克,用10毫升的磷酸缓冲生理盐水萃取,离心出的上层清液部分用作试验。
图10表示用维生素D2、葡萄糖酸钙、OHC治疗后14个月,骨皮质浓度百分比的变化。与维生素D2相比较,使用OHC时可增加疗效11.6%。
图11表示用OHC和对照物治疗病人两年以上,放射性无机物含量BMC的平均数的变化,以克/厘米的形式表示。小格子表示偏差的标准。
图12表示用OHC和对照物治疗病人,在两年期间内骨小粱的容积(TBV)和额嵴皮质的浓度变化的平均值,小格子表示偏差的标准。
图13的纵线以每分钟计数的形式来表示3H胸腺嘧啶核甙的吸收,横座标表示所查样品在培养基中的浓度,以微克/200毫升来表示。
以下实例可对发明作更详细地说明。
例1
OHC的制备(方法1)
从约3个月龄的小牛身上剔下长骨(肱骨、股骨、胫骨、桡骨、尺骨、掌骨和蹠骨),以此作为制备OHC的原料。
先将官方兽医检查过的动物宰杀,剔下骨头,然后将清洁过的骨头迅速冷冻起来,温度保持在-20℃--30℃,直至进行下一步处理;(见图1,第1格)。
在进行下一步处理之前,先检查骨头是否新鲜(由它们的气味和颜色辨别),是否清洁,并保证它们确实是所需要的骨头。去除任何残存的肉、筋腱和软骨。
第一步,先将1600公斤冷冻的骨头放在带有20毫米筛孔的不锈钢碾碎机中。碎骨粒的大小约为1厘米左右。碾磨时,将骨头的温度保持在0℃以下,(见图1,第2格)。
下一步,将磨碎的骨头放在不锈钢叶片干燥器中,在0.97-0.98巴压力下进行脱水处理,在干燥过程中,热水的最初温度是90℃,然后降到40℃很快就没有更多热水会进入冷凝收集器(干燥开始后10小时左右),停止加热并在减压下进一步干燥骨头,直至残留水分含量的最大值为10%左右(见图1,3a格)或10%-25%(图1,3b格),在以后的干燥过程中,骨头的温度不应超过40℃。
用柠檬酸调节干燥骨头的PH值至5.0-5.5。再一次把干燥的骨头放在20-80℃下进行脱水处理,并去除类脂化合物,为此或者将丙酮做为脱水剂和脱脂剂,或者先用丙酮在20-80℃下对干燥的骨头进行脱水,再用三氯乙烯溶液在20-80℃温度下脱脂。所得的骨头,其中的水含量和脂肪含量的最大值为5%(见图1,第4a和4b格)。在20-80℃的温度下和90毫巴的压力下,在一个旋涡流内去除残余溶剂。残余溶剂的含量是1%左右(见图1,第5格)
将所得骨头放在一个具有2×20mm长眼筛网的锤式研磨机内研磨,并在一个过筛机上过筛,过筛机的上层筛网的筛眼规格为2.4毫米,下层筛网的筛眼规格为0.34毫米。弃去留在2.4毫米筛网上的骨料,再通过0.34毫米筛网过筛。再将其放入一个具有0.8毫米冲孔筛板***的研磨机中研
磨,并在一个具有0.74毫米规格筛眼的筛网和0.34毫米规格筛眼的筛网的过筛机上过筛。弃去留在0.74毫米筛网上的骨料,再将骨料通过0.34毫米的筛网过筛,收集骨料并再一次在一个具有0.8毫米冲孔筛板***的研磨机中进行研磨,再将其用上述方法过筛,最后收集粉末并用一个具有0.25毫米规格筛孔的筛网过筛,再将其置于一个具有0.5毫米冲孔筛板***的研磨机上研磨。再将所有粉末通过一个具有0.25毫米规格筛眼的筛网进行过筛(见图1,第6格)。
表二列出了所得OHC粉末的分析数值。
表Ⅱ
感官测试 细微颗粒状的带有不明显
自然气味的米灰色粉末 正常
鉴定 钙和磷酸酶的鉴定 正常
胶原的鉴定 正常
水含量 <7% 6.3%
灰的总量 51.3-62.7% 56.2%
钙 19.2-23.6% 21.57%
磷 8.9-10.9% 9.71%
胶原 23.4-28.6% 26.4%
非胶原蛋白/肽 7.2-10.8% 9.0%
微量元素 氟、钠、钾、镁、铁、
锌、铜、镍的鉴定 正常
磷酸酶活性 0.5-15m E/毫克 3.9me/毫克
非正常毒性 有耐受力 正常
微生物总含量 <104/克 大约300
酵母/霉菌 <102/克 无
肠细菌 <102/克 无
特异性微生物种类 无 无
如果分析结果表明OHC组合物每克含有多于10,000的微生物,那么或者用环氧乙烷处理消毒或者用γ-射线照射(见图1,第10-12格)
可获得适于制备药剂的OHC。
例2 OHC的制备(方法2)
用例1中的方法将骨头粉碎成最大限度为1厘米左右的颗粒。然后用柠檬酸调节骨粒的PH值为5.0~5.5,并参照例1进一步处理。
表Ⅲ列出了OHC组合物的分析数据。
表Ⅲ
感官测试 细微颗粒状的带有不明显
自然气味的米灰色粉末
正常
鉴定 钙和磷酸酶的鉴定 正常
胶原的鉴定 正常
水含量 <7% 6.6%
灰的总量 51.3-62.7% 56.07%
钙 19.2-23.6% 21.33%
磷 8.9-10.9% 9.95%
胶原 23.4-28.6% 26.2%
非胶原蛋白/肽 7.2-10.8% 8.8%
微量元素 氟、钠、钾、镁、铁、
锌、铜、镍的鉴定 正常
磷酸酶活性 0.5-15m E/毫克 5.4mE/毫克
非正常毒性 有耐受力 正常
微生物总含量 <104/克 大约10
酵母/霉菌 <102/克 无
肠细菌 <102/克 无
特异性微生物种类 无 无
例3
受OHC刺激时3T3纤维组织母细胞对3H胸腺嘧啶核甙的吸收在DMEM(Dnlbeco′s改良的Eagles基,Boehninger Mannhei
m)中培养瑞士小鼠的3T3纤维组织母细胞。用CO2首次调节PH值到6.6之后,进行无菌消毒之前,给培养基补充100单位/毫升的青霉素,100毫克/毫升的链霉素(二者都出自Boehringer Mannbeim)以及3.7克NaHCO3/升(Merck,Darmstadt),另外再补充10%的小牛血清用于细胞培养。将此融合培养基放在90毫米的培养皿中于37℃的温度5%的CO2压力下生长,细胞每周进行二次传代培养,初始接种为每培养皿每10毫升培养基4×104细胞在下列的每个试验中,用的是3代至20代的传代细胞。进行3H胸腺嘧啶核甙吸收试验所使用的方法记载在L.Jimener de Asua等所著“美国国家科学院科学进展“72卷(1975)2724~2728页。瑞士鼠3T3成纤维细胞取自上述的培养基、用0.5%胰蛋白酶/0.02%EDTA对细胞进行胰酶解,酶解液用无菌水配制。将细胞混悬于DMEM/10%胎牛血清中,浓度是4×104细胞/毫升。取1毫升细胞混悬液涂布在1.9平方厘米微量滴定盘上。细胞培养4天,不更换培养基,便形成了静止期的非增殖细胞的融合单层。然后,吸出培养基,再加入1毫升无胎牛血清的新鲜培养基和测试用的样品。
取1克如例1和例2中方法所制备的OHC混悬于10毫升除去镁和钙的磷酸缓冲盐水(每升含0.2克氯化钾,8克氯化钠,2.7克磷酸氢钠,12分子水,0.2克磷酸二氢钾)中。于室温振摇2小时之后,于2000×g离心样品15分钟。分离出2~500微升的含有中性可溶性OHC成分的上层清液,将其加入到上述的3T3纤维组织母细胞的培养基中。
为了做空白测定试验,将同样质量的新鲜培养基加入到培养基中,再加入2-200微升的胎牛血清做为对照。
将分析所用的培养基最后置于37℃,5%CO2压力下培养20小时,然后与3H胸腺嘧啶核甙混合。
参照以下方法对细胞进行放射性标记:每1毫升的培养基里加入10微升的含1微居里(甲基-3H)胸腺嘧啶核甙(Amcrsham)和0.9微克的
甲基胸腺嘧啶核甙(Sigma美国)和英国的无菌胸腺嘧啶水溶液。
加入3H胸腺嘧啶核甙后,在上述的条件下再进行4小时培养。
然后用闪烁计数器测试样品。先吸出培养基,再用0.5毫升的0.02%EDA/PBS溶液洗细胞层,然后再参考上述方法对细胞进行胰酶解处理,直至细胞完全分离。将混悬的细胞放在一个装置中进行处理,装置会将细胞自动地输送到玻璃微纤维器(Whatman 934-AH)中去,仪器工作程序如下:
1)用PBS洗2)用5%三氯醋酸(Merck Darmstadt)沉淀;3)乙醇固定,干燥玻璃微纤维滤器,并转送至闪烁器管瓶内,加入3毫升的液体闪烁器cocktail液(7克Permablend Packard溶于1升1∶3比例的Tritenx-100/甲苯
在一台LK3-Wallac 1217 Rackbeta液体闪烁计数器上测量样品每分钟蜕变的放射性。
用OHC刺激所测定的最大值仅仅约为用胎牛血清刺激所测定的最大值的一半。然而,要记住胎牛血清含有的总蛋白相当于OHC提取物所含有的6倍,这样,用OHC提取物刺激时吸收了3H胸腺嘧啶核甙就要比起用胎牛血清时有效的多。用OHC所获得的测定结果记录在图Ⅲ中。
此套分析方法也可用于测定OHC组合物的质量。当把胎牛血清做为对照物时,这即可作为细胞生物学分析***的内部检查,也可作为OHC样品所得到的数值的一个参考,这样就可以给OHC组合物的生物活性特征定义,并表示活性单位,以此作为OHC组合物的生物活性的标准。
例4
受OHC刺激时3 T3纤维组织母细胞和人类***纤维组织母细胞对L-(5-3H)脯氨酸的吸收。
采用例3中的方法测定培养细胞对脯氨酸吸收,但是,在已述的细胞培养方法中,将3H胸腺嘧啶核甙换成L-(5-3H)脯氨酸。这种测量方法可确定被培养细胞蛋白合成率,而且通过对细胞放射性的定量测定,
可以确定OHC组分的生物学活性,图4表明,受OHC刺激时,3 T3纤维组织母细胞对L-(5-3H)脯氨酸的吸收。
图4表明OHC组合物实质上在所查的细胞内增加了蛋白合成率。
例5
OHC的中性可溶性成分对牛的软骨细胞培养的作用
用常规方法从胎牛的骺软骨中分离软骨细胞。将50,000个细胞分开生长4-6天,每个培养基内1毫升的F12基质,再补充10%的胎牛血清。参照例3的方法,所制成的培养基再用OHC组合物34/4处理,OHC组合物是根据例1或例2中的方法所获得的,参考例3,用3H胸腺嘧啶核甙与细胞混搅然后测量其掺入的放射性。
图5表明了第一次试验的结果。图表示牛软骨细胞摄入3H-胸腺嘧啶核甙时OHC34/4的剂量特性曲线。
从图6和图7看,很明显,所查的OHC35/4刺激了总蛋白的合成以及骨胶原合成率。
34/4和35/4表示每批处理的顺序号码。
例6.
中性可溶性的OHC成分对活体外骨细胞类群的作用。
方法基本上采用Cohm等等(Simmons和Kann版)所著“骨胳”的研究,一种试验方法(学术出版社,纽约,旧金山,伦敦P3-20)除了使用0.05%透明质酸酶作为一种附加酶和胶原酶,胰蛋白酶一起使细胞从骨组织中释放出来以外,还可使用一种依赖于连续时间的酶的消化方法,从1天的Wister鼠颅盖中分离出各种骨细胞群体。
在20分钟时间的消化过程中释放出各种细胞群体,用罗马数字按顺序标出这些细胞群体,即可得到个体的细胞部分。将最先从颅骨中释放出的细胞群体称为Ⅰ,将在1小时消耗过程内最后释放出的细胞部分称为L,功能试验表明,群体Ⅰ至群体Ⅲ可能代表母源骨细胞池(类似于前成骨细
胞),细胞群体Ⅳ至Ⅵ表明具有类似成骨细胞的特征,或者也许就是类似骨细胞的细胞。
取10毫升的1.5×105细胞/ml MEM基质(带有Earles盐)的混悬液,再补充10%的胎牛血清,将其放于250毫升的组织培养瓶中,于37℃5%的CO2压力下培养9~10天,可获得联合的细胞层,再将其与0.2%的胰蛋白酶一起制成混悬液,混悬液于400×g离心7分钟,以获得细胞,将所得到细胞小团再悬浮于用20%胎牛血清和10%DMSO补充的MEM基质中,在液氮中冰冻悬浮液直至下一步使用时。
将单独的冷冻细胞群体仔细地在37℃下培育并悬浮于40毫升的用20%胎牛血清补充的MEM中,将混悬液于400×g时离心7分钟,再将所得细胞小团悬浮于用10%胎牛血清补充的新鲜培养基中,并将其灌注入96眼微量滴定板,每眼有密度为7-10×103的细胞。培养细胞两天,第三天用含有1%或2%胎牛血清的基质替换培养基,培养24小时后,再用含1%或2%胎牛血清和0.5微居里3H胸腺嘧啶核甙以及不同浓度的中性可溶性OHC成分的新鲜基质替换。将适量的PBS加入到对照培养基中。
使用EDGF(表皮生长因子)是为了确定不同骨细胞培养物细胞***的实际反应。
将骨细胞培养物在上述条件下用含有3H胸腺嘧啶核甙的基质培养24小时,然后参照例3方法测定3H胸腺嘧啶核甙的掺入量。
试验结果列于表Ⅳ,其中每个数值是从五次试验中获得的,并列出标准偏差数,将溶解于PBS的OHC成份加到培养基质中,OHC的量为5~50微升,培养基的总量为200微升。
表Ⅳ
骨细胞群体 用中性可溶性OHC成分Ⅴ和Ⅹ刺
激时,3H胸腺嘧啶核甙结合的百
分比1%FCS*2%FCS*
(每分钟计数/眼±标准±偏差数)
P-Ⅰ
对照 (PBS) 19022±1630(5) 27656±841(5)
Op V 11070±1160(5) 12394±195(5)
Op X 11800±508(5) 12678±884(5)
P-Ⅱ
对照 19023±552(5) 25103±344(5)
Op V 15440±491(5) 14910±611(5)
Op X 13161±491(5) 13425±940(5)
P-Ⅲ
对照 12473±582(5) 15159±588(5)
Op V 8179±433(5) 10105±600(5)
Op X 6735±455(5) 9676±436(5)
P-Ⅳ
对照 16482±750(5) 21006±711(5)
Op V 9445±481(5) 11388±649(5)
Op X 6945±178(5) 10356±539(5)
P-Ⅴ
对照 18298±774(5) 22677±176(5)
Op V 14380±746(5) 16115±261(5)
Op X 14866±250(5) 18330±296(5)
P-Ⅵ
对照 25789±966(5) 37205±2553(5)
Op V 23424±1026(5) 28168±711(5)
Op X 23346±1239(5) 32107±422(5)
P-Ⅶ
对照 19405±827(5) 26369±1236(5)
Op V 30189±1327(5) 41293±1769(5)
Op X 37498±944(5) 44817±728(5)
P-L
对照 13378±396(5) 18654±491(5)
Op V 18677±523(5) 26816±1027(5)
Op X 28488±1241(5) 33411±1220(5)
*FCS=胎牛血清
很明显,从表Ⅳ可以看出,与用PBS处理过的对照培养物相比,中性可溶性的OHC成分刺激了骨细胞群体Ⅴ和Ⅵ的增殖。骨细胞群体Ⅰ和Ⅶ没有任何反应,试验结果还写在图13的图表中。
例7
表Ⅴ列出了试验结果,其中分析了中性可溶性OHC成分(OHCX)对于鼠皮肤纤维组织母细胞的作用。
表Ⅴ
3H-胸腺嘧啶核甙的结合
(每分钟计数/眼±标准偏差数)
没有FCS 450±29
+15μl PBS 485±38
+7.5μl OHC X 343±18
+15.0μl OHC X 618±16
1% FCS 917±85
+15μl PBS 921±33
+7.5μl OHC X 606±32
+15.0μl OHC X 643±33
+30.0μl OHC X 783±79
2% FCS 1051±23
+15μl PBS 1127±51
+7.5μl OHC X 1059±38
+15.0μl OHC X 920±35
+30.0μl OHC X 1140±57
不同浓度的OHCX对鼠纤维组织母细胞掺入3H胸腺嘧啶核甙的反应。
从表Ⅴ所到的结果可看出,OHCX不能刺激鼠皮肤纤维组织母细胞。
如果将表Ⅳ所列的试验结果与表Ⅴ所列的试验结果相比较,很明显,所观察到的OHCX的促细胞***剂的活性只专一于成骨细胞。
例8
紫外线照射过的OHC的生物活性的测定
用25千戈瑞(2.5兆拉德)的紫外线照射OHC,然后参照例3中方法进行实验,图8表示试验结果。
用不同量的紫外线照射过的和未经紫外线照射过的OHC的PBS抽提物刺激3 T3纤维组织母细胞,3H胸腺嘧啶核甙掺入的结果列于图8,从中可以看出紫外线照射并不影响OHC的生物活性。
例9
用于同一领域适应症的OHC和已知制剂的疗效比较
将每种要分析的物质各称出一克,放入一个螺旋顶小瓶中,并加入10毫升的PBS,于室温振摇2小时后,再用一台MSE台式离心机以每分钟3600转的速度离心10分钟,滤出上清液,弃去沉淀。用Bradford[生化分析72(1976)248页]所述的方法测定溶液的蛋白含量,参照例3的方法刺激3 T3纤维组织母细胞对3H胸腺嘧啶核甙的摄入并对此作出评价。
表Ⅵ列出了参加比较的制剂及它们可提取的蛋白含量。
表Ⅵ
提取蛋白的量/毫升溶液
Lencoll 330 μg
Lenphos 105 μg
Lensol 3850 μg
Lensol agglomerated 4200 μg
Osspulvit 24 μg
Mitsubishi Cookies 82 μg
PMC 400 μg
Osteotrophic Concentrate骨营养浓缩剂 22 μg
Canzocal 28.5 μg
OHC 600 μg
图9总结了试验的结果。非活性物质与空白没有区别,因此没有加以表述。
从图9中可看出,在刺激DNA合成方面,OHC明显优于其它的制剂。
例10
在动物试验中OHC对骨愈合的作用
用60只成年兔子进行研究以确定OHC对骨愈合的作用。在兔子股骨末端的双膝关节骺部,用精确的方法制造软骨或骨形状大小相同的损伤。再将动物按随机抽样的方法分成4组,每组15只动物。未经任何处理的一组为对照组。第一组每日给予830mg的OHC(178.0mg钙),第二组每日给予510mg灰末的OHC(没有活性有机成份的骨矿物质,178.9mg钙),第三组每日给予650mg的碳酸钙。表Ⅶ详述了试验设计。
表Ⅶ
试验设计
试验组分 术后持 试验动物 每只动物 每日剂量中
续时间 的数量 日口服剂 附加的钙的
的实验 量 量以毫克表示
对照组 35 5 - -
56 5
84 5
OHC 35 5 1 tablet
84 5@830mg 178.0
OHC 35 5 1 tablet
(已成灰的) 56 5@510mg 178.9
84 5
CaCO 35 5 1 tablet
(Os-Cal) 56 5@650mg 189.7
84 5
从造成损伤后的第七天至第23天,给动物标上一系列的萤光记号。5,
8,12个星期之后,分别处死5只动物。用萤光显微镜观察动物组织的切片,切片取自同一标准的骨损伤限定的部位。通过萤光显微镜上的指针读数来判定试验结果,指针读数是根据萤光的密度、自然度和填补骨损伤的程度以及新骨生长的结构而变化调节的。表Ⅷ列出了结果。
Table Ⅷ
取决于不同的处理和试验持续
时间的指针读数总和的平均数
和标准偏差
组分 35 days 56 days 84 days
对照 17.8±3.6 22.0±8.5 16.2±2.8
OHC 24.3±4.8 31.8±1.1 34.3±2.4
OHC
(已成灰的) 24.4±4.2 28.2±4.1 25.0±12.8
CaCO
(Os-Cal) 20.0±7.1 27.2±6.3 29.0±6.1
用三种制剂处理的组与对照组相比,具有明显改善的矿物化作用。在骨损伤的愈合方面,用OHC治疗的组比其它两组的疗效还明显。
比较用OHC处理的和用灰末OHC处理的两组试验结果,可以清楚看出,如果破坏了有机成份,那也就失去了OHC的有效作用。
例11
在动物试验中OHC对关节软骨细胞的超微结构的作用。
在使用肾上腺类皮质素造成骨损伤后,进行一系列的兔子试验以观察OHC对关节软骨细胞的超微结构的作用。可使用一种新的,能再现生物形态的测定法进行定量测定。见M.Annefeld,“组织反应杂志”Ⅶ卷(1958),273~289页。
进行试验时,将鼠分成三组,每组5只公鼠第一组是对照组,不进行任何处理。第二组肌肉注射***,第三组肌肉注射***再口服OHC。表Ⅸ是试验设计。
表Ⅸ
组分 每只动物 给予的药物 调查的持续时 动物数目
的剂量 剂量的总数 间以周表示
对照 - - 5 5
***2×0.5mg i.m 10 5 5
***/2×0.5mg i.m 10 5 5
OHC 5×50mg p.o 25 5 5
i.m.=肌肉地
p.o.=口服
将用药五周后的动物处死。从双侧膝关节的股骨头和径骨头切除下所有软骨组织,进一步制备成为电镜观察所用的切片。用形态测定法分析取自每只动物体的50个软骨细胞。
与对照组相比较,用***处理过的动物的内胞浆网状体长度和关
节软骨细胞的golgi组织的总面积都缩小了,而同时软骨细胞的死亡率却增加了。这些都证明了皮质类固醇对关节软骨细胞有损害。
而另用OHC处理的动物,内包浆网状体长度和关节软骨细胞的golgi组织总面积的缩小却少得多。OHC降低了软骨细胞的死亡率,甚至低于对照物死亡率水平。而***却增加了细胞的死亡率。同时,OHC还增加了线粒体的总面积和线粒体的数目。这些发现都说明了一个事实:口服OHC以后可增加软骨细胞的代谢。表Ⅹ列出了试验结果。
表Ⅹ
试验持续5周之后,用形态测定法测定软骨细胞超微结构。
对照物 *** ***-OHC
内胞浆网状体
总长度,微米 28.2 1 21.6 -23.6 -
golgi组织
总面积(微米) 2.58 1 2.12 -2.71 2
线粒体数目 13.1 1 16.1 1 20.4 2
总面积(微米) 1.28 - 1.35 1 1.96 2
细胞死亡率% 2.17 4.00 1.25
***和OHC的影响
1=对照物和试验组分之间统计数字有重大差别。
2=用***处理过的组分和用***处理过再用OHC治疗过
的组分之间统计数字有重大差别。
p=0.01,n=250每组
从此试验中还可看出,用OHC在体外进行细胞生物试验所得结果与在体内的效力相等。结果还表明OHC保护了皮质类固醇调节软骨和成骨细胞的新陈代谢的作用。
例12
使用OHC以支持骨的愈合
用双盲法进行临床试验,以观察OHC与安慰剂对骨折愈合的影响。
用随机抽样的方法给85例径骨骨干骨折的病人服两种药中的一种,治疗期是六周。表Ⅺ列出了病人的年龄和治疗类型。
表Ⅺ
病人的数目
安慰剂 1’400mg OHC/d
>55岁 13 13
<55岁 36 23
49 36
根据以下参数测定径骨干骨折的愈合。
a)骨折位置不变
b)无痛
c)骨的折断端固定
d)折断端的最大负载
e)放射线透视的发现。
较老年的病人,用OHC治疗后约11周骨头就坚实了这说明比使用安慰剂的效果更迅速(14.2周,P<0.05)。而较年青的病人的区别在于没有有效统计数字(12.5周与11.5周相对)。试验结果很明显,给予安慰剂时,骨折愈合手术中的并发症数目要高三倍,因此OHC可促使骨折规律性地愈合。
例13
用OHC治疗骨质疏松
在一个有对照物的试验中,调查OHC对肾上腺皮质素所引起的骨质疏松的作用。
用随机抽样的方法将64名50岁以上的患风湿性关节炎并接受皮质类固醇治疗的病人分成几组,组1的病人在他们常规治疗的基础上再每日口服4.9克OHC,组2病人不服OHC。
在治疗末期,用OHC治疗的组的病人骨干高度缩小程度以及桡骨骨质密度减少程度比起对照组要低的多。另外的参数,例如用OHC治疗的病人的尺骨骨质密度和背部的疼痛比起对照组要大大改善了,但还未达到统计的有效数字。结果列于表ⅩⅡ。
表ⅩⅡ
用OHC治疗一年之后骨质稀少指数的差别
对照物 OHC P值
骨干高度减少的平均 1.16=0.71 0.87=0.58 0.01<P<0.05
数厘米±标准偏差数
桡骨骨质密度减少的 0.056=0.035 0.043=0.029 P<0.05
平均数B
±标准偏差数
尺骨骨质密度减少的 0.033=0.031 0.030=0.026 n.s
平均数
±标准偏差数
放射拍片查出的新的 4 3 n.s
脊 骨骨折的数目
n.s=没有意义
用OHC治疗,可成功地免除因类固醇治疗风湿所引起的骨质稀少病症的发展。从实验中可明显看出,用OHC治疗应该与用皮质类固醇***治疗一起开始,不要等到已显出骨质稀少的临床症状后再开始。
例14
OHC与钙剂相比,对于骨质疏松的治疗。
原发性肝硬化后期可出现迅速的骨损失的症状,进行一项临床试验以调查将维生素D、OHC以及葡萄糖酸钙作为治疗肝硬化药物的一部分的情况。
选择65名患有原发性肝硬化并有骨质疏松变化的已绝期的妇女,用非肠道途径给予维生素D。再将这些病人在统计学基础上分成三组,第一组22名病人,仅用维生素D,第二组21名病人,除用维生素D外,每日再给予6.6克OHC。第三组22名病人,给予相当于OHC用药剂量的钙剂,即每日4片葡萄糖酸钙泡腾片。
治疗14个月后,用掌骨指数方法测定,发现非肠道透径用维生素D不足以阻止骨质丧失,而合并应用维生素D和葡萄糖酸钙也只能停止进一步地骨质丧失,唯有合并应用维生素D和OHC时,与对照组相比,可以使
骨皮质增加11.6%。试验结果列于图10。这些试验表明OHC不只是一种纯的钙剂。
例15
用OHC治疗骨质疏松
将36名患有慢性活动性自体免疫肝类并用氢化***和硫唑嘌呤进行治疗一年以上的病人,按统计学要求分成两组,给第一组的18个病人每日服6.6克OHC,治疗期2年。另一组18个病人作为对照组不服OHC。
用光电测密度术以及骨的活组织检验的方法得到试验结果。两年后,对照组的桡骨BMC矿物质含量(“单一”光电测密度术)以及额嵴CPT的皮质厚度(骨的活组织检查)都减少了(见图11和图12)。通过活组织检验还发现骨小梁容积(TBV)也明显地缩小了(见图12)。另一方面,经过OHC治疗的病例,桡骨的矿物质含量保持不变,骨小梁的容积却增加了,而皮质厚度降低的程度较之对照组都要少得多。在两年治疗期内,对照组中有3个病人脊椎变形了,而OHC组中却没有1人。5名病人的骨小梁容积(TBV)低于Mennier所要求的“脊椎断裂限度”11%±3%,而用OHC治疗过的4名病人中约有一例有脊椎断裂的危险性。而三例对照组的病人(TBV)16%都发生了脊椎变形,并伴随有TBV水平下降低于11%。
例16
卵巢切除术后OHC的作用
使用常规的骨特异性参数(碱性磷酸酶的骨特异性同功酶-成骨细胞标记;尿中的羟基蛋白-破骨细胞标记;“抵抗酒石酸”酸性磷酸酶-破骨细胞标记)来表示:卵巢切除术后,一方面血清中酶的水平急剧上升(骨的更新代谢高而且强)。另一方面,每日给予病人7.5克的OHC,治疗9个月,使骨的新陈代谢水平增加趋于正常化,从而降低了病人危险性。与生化试验所发现的情况相同,服用OHC时骨增生,这可通过掌骨
指数验证。用OHC治疗前测得骨皮质每年损失1.1±0.6%,用OHC治疗可使骨增生,一个统计意义上的增生值是每年0.2±0.3%。
例17
用计算机断层X线摄影测定OHC对骨质疏松的作用。
选择11例骨质疏松病人(2男,9女),每日服75克OHC治疗两年,再用计算机定量断层X线摄影进行检查。参见P.Ruegsegger等等所著,“计算机辅助断层X线摄影术杂志”,5(1981),384~390页。根据病人的年龄结构,预期海绵体密度每年平均损失2.7%。
用OHC治疗的所有病人实际上骨质海绵体增加量很小。据观察,这种增加还仅仅发生于另外用氟化钠治疗的病人中,而且这种增加作用也是不规则和不持久的,而且只在某些病中发现(反应者)。最近的结果(见M.A.Dambacher等等所著“骨骼”7,199-205,1986)表明骨质疏松的标准疗法(氟化钠或合并应用氟化钠和钙剂)并不能够阻止疾病的发展(不能完全抑制骨质丧失,脊断裂率增加)。迄今为止,还从未看到未经治疗的病人有自动增加骨小梁容积的趋向。
Claims (4)
1、制备一种骨胶原羟基磷灰石化合物(OHC)的方法,该化合物具有下面干燥物质的分析参数:
感官测试 细微颗粒状,带有不明显自然口味的米灰色粉末,
鉴定 一钙和磷酸酶的鉴定
一胶原的鉴定
水的含量<7%
总灰 51.3-62.7%
钙 19.2-23.6%
磷 8.9-10.9%
胶原 23.4-28.6%
非胶原性蛋白/肽 7.2-10.8%
微量元素 氟、钠、钾、镁、铁、锌、铜、镍的鉴定
磷酸酶活性 0.5-15mE/毫克
非正常毒性 有耐受力
微生物总含量 <104/克
酵母 <102/克
肠细菌 <102/克
特异性微生物种类 没有
以及下面的生物活性:
a)刺激成骨细胞软骨细胞和成纤维细胞的DNA合成;
b)刺激软骨细胞和成纤维细胞蛋白合成;
c)与刺激总蛋白的合成相比较,选择性地刺激了软骨细胞的骨胶原总蛋白的合成;
d)诱导软骨细胞中的蛋白X和蛋白Y的合成;
e)促进非特异性间叶细胞对软骨细胞或骨细胞的分化,
其特征在于下面的步骤:
a)将约12个月龄的哺乳动物胎儿的动物骨碾碎成最大1厘米左右尺寸的颗粒;
b)于20-80℃的温度下减压干燥骨颗粒,直至残存水含量约10%或10%-25%;
c)用酸调节骨料的pH值到pH5.0-pH5.5;
d)用亲水剂和亲脂剂进行脱水和脱脂,直到残存的水含量和脂含量最大值为5%,或者只用亲水剂于20℃-80℃下进行脱水直到残余水含量最大值约为5%。然后再用亲脂剂于20-80℃下进行脱脂,直到残存脂肪含量最大值约为5%;
e)于20℃-80℃温度下减压干燥已脱水和脱脂的骨料,直到溶剂的最大含量约为1%;
f)将骨料粉碎成50-300微米大小的颗粒,然后消毒。
2、根据权利要求1中所述的方法,其中
a)将约12个月龄的哺乳动物胎儿的动物骨碾碎成最大1厘米左右尺寸的颗粒;
b)用酸调节骨料的pH值为5.0-5.5;
c)用亲水剂和亲脂剂进行脱水和脱脂,直到残存的水含量和脂含量最大值为5%,或者只用亲水剂于20℃-80℃下进行脱水直到残余水含量最大值约为5%。然后再用亲脂剂于20-80℃下进行脱脂,直到残存脂肪含量最大值约为5%;
d)于20℃-80℃温度下减压干燥已脱水和脱脂的骨料,直到溶剂的最大含量约为1%;
e)将骨料粉碎成50-300微米大小的颗粒,然后消毒。
3、根据权利要求1或2中所述的方法,其中使用的骨头为长骨。
4、根据权利要求1或2中所述的方法,其中使用的骨头为牛小腿的长骨。
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