DE3606231C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Messen der in einer
Probe enthaltenen Gesamtproteinmenge durch elektrophoretische
Auftrennung der auf einen Träger aufgebrachten Probe, bei dem
die zu untersuchende Probe nach erfolgter Auftrennung angefärbt
wird und die Konzentrationen der einzelnen Komponenten durch
lichtelektrische Abtastung ermittelt werden.
Die quantitative Bestimmung einer Proteinmenge in einer Probe
durch Ermittlung eines integrierten Konzentrationswertes eines
elektrophoretischen Bildes ist z. B. bekannt aus H.R. Maurer,
"Disk-Elektrophorese", Verlag W. de Gruyter, Berlin 1968,
Seiten 78-85.
Aus der Literaturstelle "Methoden der qualitativen und quantitativen
Immunelektrophorese", Behring Institut (Behringwerke
AG), Dez. 1975, Seiten 10-15 ist es ferner bekannt, auf einen
Träger neben einer zu untersuchenden Probe eine Standardprobe
aufzubringen, um grob quantitative Proteinverschiebungen abschätzen
zu können.
Bei üblichen bekannten Elektrophorese-Apparaturen werden Teil-
oder Fraktions-Bildmuster, die Bilder der (Protein)-Fraktionen
Albumin (Alb), α₁-Globulin (α₁-G), α₂-Globulin (α₂-G), β-Globulin
(β-G) und γ-Globulin (γ-G) wiedergeben, die auf die Fraktionen
dieser Proteinkomponenten entfallenden prozentualen Anteile
und der A/G-Wert (Verhältnis von Albumin zu Globulin)
allgemein in einem Versuchsbericht aufgezeichnet. Heutzutage
wird Wert darauf gelegt, Schwankungen der Absolutmenge der jeweiligen
Proteinkomponenten zusätzlich zu Schwankungen der prozentualen
Anteile der Fraktionen, die die relativen Mengen der
betreffenden Proteinkomponenten darstellen, zu überwachen. Es
wird daher in der Praxis die Gesamtproteinmenge einer Probe mit
Hilfe eines getrennten biochemischen Analysegerätes gemessen
und die gemessene Gesamtproteinmenge in den Elektrophorese-Apparat
eingegeben; die Absolutmengen der betreffenden Substanzen
der Probe werden durch Multiplizieren der prozentualen Anteile
der Fraktionen mit der Gesamtproteinmenge berechnet. Die
so berechneten Absolutmengen werden ebenfalls in dem Versuchsbericht
ausgedruckt.
Das Messen der Gesamtproteinmengen der jeweiligen Proben mit
Hilfe des getrennten biochemischen Analysegerätes und das Eingeben
der so gemessenen Gesamtproteinmengen in die Elektrophorese-Apparatur
ist jedoch sehr umständlich und es können Fehler
bei der Identifizierung von Proben auftreten. Außerdem wird auf
diese Weise die Anzahl Proben, die mit Hilfe des biochemischen
Analysegerätes analysiert werden können, um Eins vermindert.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues und nützliches
Verfahren zum Messen der Gesamtproteinmenge mit Hilfe
einer Elektrophorese-Apparatur bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß im Rahmen
eines Verfahrens des eingangs angegebenen Typs auf dem Träger
zusätzlich zu der zu untersuchenden Probe eine Standardprobe
aufgebracht wird, so daß unterschiedliche Anfärbungsgrade
der einzelnen Komponenten bei der Ermittlung der Einzelkonzentrationen
und damit auch bei der Ermittlung der Gesamtproteinmenge
erfaßbar sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt somit folgende Stufen:
Erzeugen elektrophoretischer Bilder einer Standardprobe mit einer bekannten Gesamtproteinmenge sowie der zu untersuchenden Probe mit unbekannter Gesamtproteinmenge,
Ermitteln des integrierten Konzentrationswertes aus dem elektrophoretischen Bild der Standardprobe,
Ermitteln des integrierten Konzentrationswertes (Menge) aus dem elektrophoretischen Bild der zu untersuchenden Probe und Ermitteln der unbekannten Proteinmenge der zu untersuchenden Probe in Übereinstimmung mit der bekannten Gesamtproteinmenge der Standardprobe und den integrierten Werten für die Konzentrationen in der Standardprobe und der zu untersuchenden Probe aus den elektrophoretischen Bildern.
Erzeugen elektrophoretischer Bilder einer Standardprobe mit einer bekannten Gesamtproteinmenge sowie der zu untersuchenden Probe mit unbekannter Gesamtproteinmenge,
Ermitteln des integrierten Konzentrationswertes aus dem elektrophoretischen Bild der Standardprobe,
Ermitteln des integrierten Konzentrationswertes (Menge) aus dem elektrophoretischen Bild der zu untersuchenden Probe und Ermitteln der unbekannten Proteinmenge der zu untersuchenden Probe in Übereinstimmung mit der bekannten Gesamtproteinmenge der Standardprobe und den integrierten Werten für die Konzentrationen in der Standardprobe und der zu untersuchenden Probe aus den elektrophoretischen Bildern.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens wird der integrierte Konzentrationswert aus dem
elektrophoretischen Bild erhalten durch zweidimensionales
optisches Abtasten des elektrophoretischen Bildes,
um ein Bildsignal zu gewinnen, Eingeben des Bildsignales in
einen logarithmischen Verstärker um einen Absorptionswert zu
erhalten bzw. abzuleiten, der proportional ist der Konzentration
des Proteins in der Probe und Integrieren des Absorptionswertes
über das gesamte elektrophoretische Bild.
Die Erfindung wird nachfolgend mit Bezug auf die beigefügten
Zeichnungen näher erläutert. Es sind dargestellt in:
Fig. 1 eine schematische Seitenansicht einer Ausführungsform
einer für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten
Elektrophorese-Apparatur;
Fig. 2 eine schematische Draufsicht der räumlichen Anordnung
eines linearen Bildsensors (einer linearen Bildsensor-Reihe)
relativ zum in Fig. 1 gezeigten Träger;
Fig. 3 ein Blockdiagramm einer Ausführungsform einer datenverarbeitenden
Schaltung und
Fig. 4, 5, 6 und 7 Diagramme zur Erläuterung der in Fig. 3 gezeigten
Schaltung.
In einer Elektrophorese-Apparatur, die bevorzugt für das erfindungsgemäße
Verfahren verwendet wird, wird eine Anzahl von
Testproben (zu untersuchenden Proben), beispielsweise dreißig
Testproben, auf einen Träger aus Celluloseacetat mit Hilfe einer
Auftragevorrichtung (Applikator) mit dreißig Auftragsspitzen
aufgebracht. Dann wird der Träger, nach dem Anfärben,
Entfärben und Trocknen, in ein Densitometer eingegeben, um
nacheinander die Absorption der elektrophoretischen Bilder der
Testproben zu messen.
Fig. 1 zeigt schematisch den prinzipiellen Aufbau des Densitometers
der für das erfindungsgemäße Verfahren brauchbaren Elektrophorese-Apparatur.
Der Träger (1), der zuvor angefärbt, entfärbt
und getrocknet worden ist, wird mit Hilfe der Aufgabewalzen
(2a und 2b) in den Licht messenden Bereich (4) eingebracht,
der Decalin (3) enthält, um den Träger (1) transparent zu machen.
Der Träger (1) wird dann mit Hilfe der Photometervorrichtung
(5) photometrisch ausgewertet und darauf mit Hilfe der
Austragswalzen (6a, 6b) ausgetragen. Die Photometervorrichtung
(5) umfaßt eine Lichtquelle (5a), die unter dem Träger (1) angeordnet
ist und Licht abgibt sowie einen linearen (Festkörper-)
Bildsensor (5b), der über dem Träger (1) angeordnet ist.
Der lineare Bildsensor (die lineare Bildsensor-Reihe) (5b)
kann eine lineare CCD (ladungsgekoppelte Schaltung) oder Photodioden-Reihe
sein und ist senkrecht zur Durchlaufrichtung (a)
des Trägers angeordnet, wie in Fig. 2 gezeigt.
Bei der vorliegenden Ausführungsform wird angenommen, daß die
dreißig Proben gleichzeitig auf den Träger (1) aufgetragen
werden. Unter diesen Proben ist die in der Aufgabenrichtung
erste Probe die Probe mit bekannter Gesamtproteinmenge; die
verbleibenden neunundzwanzig Proben sind die zu untersuchenden
Testproben mit unbekannten Gesamtproteinmengen. In Fig. 2 ist
das elektrophoretische Bild der Standardprobe mit (7a) bezeichnet
und die elektrophoretischen Bilder der Testproben sind mit
(7b) bezeichnet. Erfindungsgemäß wird der integrierte Konzentrationswert
eines elektrophoretischen Bildes abgeleitet bzw.
ermittelt, indem der Träger (1) stufenweise in Richtung (a)
bewegt wird.
Fig. 3 ist ein Blockdiagramm, das eine Ausführungsform einer
datenverarbeitenden Schaltung zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens zeigt. Bei der vorliegenden Ausführungsform
sollen verschiedene Arten von Proteinkomponenten, die in Serumproben
von Personen enthalten sind, analysiert werden. Der Träger
(1), der elektrophoretische Bilder von Standard- und Testserumproben
trägt, wird durch den in Fig. 1 gezeigten Densitometer
mit der Photometer-Vorrichtung (5) umfassend die Lichtquelle
(5a) und den linearen Bildsensor (5b) mit konstanter Geschwindigkeit,
beispielsweise 8 mm/s geführt. Ein photoelektrisch
umgewandeltes Ausgabe-Bildsignal aus dem linearen Bildsensor
(5b) wird synchron mit der stufen- bzw. schrittweisen
Bewegung des Trägers (1) von einem Abtast- und Haltekreis (11)
übernommen. Das so abgetastete und festgehaltene Signal wird
durch einen Log-Verstärker (12) verstärkt und in ein Signal umgewandelt,
das die optische Absorption bzw. die Extinktion
eines elektrophoretischen Bildes wiedergibt, wobei die Extinktion
ihrerseits der Proteinkonzentration der Probe proportional
ist. Darauf wird das Extinktionssignal mit Hilfe eines
A/D-Wandlers 13 in digitale Abtastsignale umgewandelt. Die so
erhaltenen digitalen Signale werden unter der Steuerung eines
zentralen Prozessors (CPU) (14) in einen Speicher (15) eingegeben
und dort gespeichert, nachdem die erforderliche Signalverarbeitung
wie Glätten und Null-Abgleichung zur Korrektur der
Schwankungen der Grundlinie aufgrund der Fluktuation der Lichtintensität
vorgenommen worden ist. Die Apparatur umfaßt weiterhin
eine Tastatur (16) und einen Bildschirm (CRT) (17) zum Eingeben
und Überwachen verschiedener Befehle, Daten und Bilder.
Bei der vorliegenden Ausführungsform wird eine bekannte Gesamtproteinmenge
(TP₁), die in der Standardprobe enthalten ist, mit
Hilfe der Tastatur (16) und des Bildschirms (CRT) (17) in den
Speicher (15) eingegeben.
Während der Träger (1) stufenweise eingebracht wird, werden
durch photometrische Auswertung des elektrophoretischen Bildes,
im Speicher (15) dreidimensionale Daten der Extinktion des
elektrophoretischen Bildes gespeichert, wie in Fig. 4 erläutert
ist. Darauf werden die im Speicher (15) gespeicherten Proben
in die jeweiligen (Einzel-)Proben getrennt, wie in Fig. 5
gezeigt ist und integrierte Konzentrationen (D₁, D₂ . . . DN) der
elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und der Testproben
werden berechnet. Allgemein kann der integrierte Wert (D) der
Konzentration wiedergegeben werden durch
wobei Dÿ die Daten sind, die beim i-ten Schritt aus einem das
j-te Licht empfangenden Element des linearen Bildsensors (5b)
erhalten werden. Allgemein ist der Extinktionswert, der durch
optisches Abtasten des auf dem Träger erzeugten elektrophoretischen
Bildes erhalten wird, proportional der Proteinkonzentration.
Infolgedessen ist der integrierte Wert D des gesamten
elektrophoretischen Bildes einer Probe proportional der Konzentration
des in der Probe enthaltenen Gesamtproteins. Dann werden
die bekannte Menge Gesamtprotein der Standardprobe und die
unbekannte Menge Gesamtprotein der Testprobe mit TP₁ bzw. TPi
bezeichnet und die integrierten Werte der Konzentration der
elektrophoretischen Bilder der Standardprobe und der Testprobe(n)
mit D₁ und Di angegeben. Daraus ergibt sich folgende
Gleichung (2).
Dies bedeutet, daß die unbekannte Menge Gesamtprotein TPi gemäß
der obigen Gleichung (2) berechnet werden kann, wenn die integrierten
Konzentrationswerte D₁ und Di der elektrophoretischen
Bilder der Standardprobe und der Testprobe ermittelt sind und
die bekannte Menge Gesamtprotein TP₁ gegeben ist.
Wie allgemein bekannt setzt sich das elektrophoretische Bild
einer Probe zusammen aus Teil- oder Fraktionsbildern der verschiedenen
Proteinkomponenten, d. h. Albumin, α₁-Globulin, α₂-Globulin,
β-Globulin und γ-Globulin. Es hat sich gezeigt, daß
diese Substanzen mit einer Färbeflüssigkeit unterschiedlich
stark angefärbt werden. Wird beispielsweise Ponceau-3R als Färbeflüssigkeit
verwendet, so ist die Konzentration des Fraktionsbildes
von Albumin höher als diejenige von γ-Globulin. Bei
der vorliegenden Ausführungsform werden, um den Unterschied im
Anfärbegrad der jeweiligen Proteinkomponenten auszugleichen, Farbkorrektur-Koeffizienten
kAlb, kα ₁-G, kα ₂-G, kβ -G und kγ -G, eingeführt,
die entsprechend dem Farbstoff und der bei der photometrischen
Auswertung angewandten Wellenlänge bestimmt werden
können. Diese Koeffizienten werden vorab mit Hilfe der Tastatur
(16) in den Speicher (15) eingegeben. Weiterhin wird das elektrophoretische
Bild in Fraktionsbilder aufgeteilt und es werden
integrierte Konzentrationswerte der jeweiligen Fraktionsbilder
dAlb, dα ₁-G, dα ₂-G, dβ -G und dγ -G, wie in Fig. 6 erläutert,
abgeleitet bzw. ermittelt. Dann wird der korrigierte Integrationswert
der Konzentration D′ des elektrophoretischen Bildes
berechnet gemäß der folgenden Gleichung unter Anwendung der
Korrekturkoeffizienten.
D′ = kAlb · dAlb + kα₁-G · dα₁-G + kα₂-G · dα₂-G + kβ -G · dβ -G + kγ -G · dγ -G (3)
Daraus wird die Gesamtproteinmenge der Testprobe TPi mit Hilfe
der folgenden Gleichung
ermittelt bzw. berechnet.
In der folgenden Tabelle 1 werden beispielhaft Farbkorrektur
koeffizienten angegeben.
Das elektrophoretische Bild kann in Übereinstimmung mit verschiedenen
Verfahren in die jeweiligen Teil- oder Fraktionsbilder
aufgeteilt werden. Gemäß einer Ausführungsform der Teilungsmethode
werden folgende Schritte durchgeführt, um die integrierten
Werte der Konzentration für die jeweiligen Teil-Bilder
zu erhalten:
- (a) es wird eine Mitten-Abtastlinie aus allen Abtastlinien ausgewählt;
- (b) Fraktionspunkte werden auf der Mitten-Abtastlinie ermit telt;
- (c) Fraktionslinie, die durch die Fraktionspunkte gehen, werden senkrecht zur Abtastlinie gezogen; und
- (d) Konzentrationswerte innerhalb der durch die Fraktionslinien geteilten Bereiche werden integriert, um die integrierten Konzentrationswerte für die jeweiligen Proteinkomponenten zu erhalten.
Gemäß einer anderen Methode der Aufteilung des elektrophoretischen
Bildes werden folgende Schritte ausgeführt:
- (a) eine elektrophoretische Expansionslänge (Linie) (L) wird für jede Abtastlinie ermittelt durch Vergleich der Absorptions- bzw. Extinktionswerte mit einem Schwellenwert (S), wie in Fig. 7 gezeigt;
- (b) die elektrophoretische Expansionslänge (L) wird in Längen für die einzelnen Fraktionen geteilt, und zwar im Verhältnis bzw. proportional zu Standard-Fraktionsbildlängen;
- (c) Konzentrationswerte innerhalb der jeweiligen Fraktionslängen werden integriert, um integrierte Werte der Bereiche der Fraktionen entlang den jeweiligen Abtastlinien zu erhalten; und
- (d) die integrierten Werte der jeweiligen Proteinkomponenten für die jeweiligen Abtastlinien werden akkumuliert, um die integrierten Werte der jeweiligen Fraktions- oder Teilbilder zu erhalten.
Wenn Proben auf den Träger mit Hilfe der Aufbringevorrichtung
aufgebracht werden, die eine Anzahl von Aufbringespitzen aufweist,
unterscheiden sich die einzelnen Probenmengen auf dem
Substrat etwas voneinander. Weiterhin schwankt der Grad der
Anfärbung je nach der Lage der Proben im Färbegefäß. Bei der
vorliegenden Ausführungsform werden, um die erwähnten Schwan
kungen auszuschalten, zweite oder sekundäre Korrekturkoeffizienten
(K₁, K₂. . . KN) eingeführt, um die Schwankungen in den
aufgebrachten Mengen der Proben auf dem Träger zu kompensieren.
Die zweiten Korrekturkoeffizienten können in folgender Weise
abgeleitet bzw. erhalten werden: Zunächst wird die Standardprobe
mit bekannter Menge an Gesamtprotein mit Hilfe von allen
dreißig Aufbringespitzen des Applikators auf den Träger aufgebracht,
und der Träger wird der Elektrophorese unterworfen, wobei
dreißig elektrophoretische Bilder derselben Standardprobe
erzeugt werden. Dann werden diese elektrophoretischen Bilder
photoelektrisch abgetastet, um integrierte Konzentrationswerte
der elektrophoretischen Bilder (d₁, d₂ . . . dN) zu erhalten.
Dieser Arbeitsgang wird einmal oder mehrere Male durchgeführt.
Im letzteren Falle werden die mehrfachen integrierten Konzentrations
werte für jeweilige elektrophoretische Bilder gemittelt,
um einen integrierten Konzentrations-Mittelwert für die
jeweiligen Aufbringespitzen zu erhalten. Dann werden die auf
diese Weise für alle elektrophoretischen Bilder erhaltenen integrierten
Konzentrationswerte (d₁, d₂ . . . dN) gemittelt, um
einen integrierten Bezugs-Konzentrationswert (dR) zu erhalten.
Darauf werden die Korrekturkoeffizienten (K₁, K₂ . . . KN) berechnet,
indem jeweils der integrierte Bezugs-Konzentrationswert
(dR) durch den jeweiligen integrierten Konzentrationswert
(d₁, d₂ . . . dN) geteilt wird.
In der folgenden Tabelle 2 sind die tatsächlichen Werte für die
Korrekturkoeffizieten (K₁, K₂ . . . KN) angegeben, die in der
oben erläuterten Weise erhalten worden sind.
Zu beachten ist, daß wenn ein Korrekturkoeffizient (Ki) für
eine Aufbringspitze des Applikators größer ist als 1,00, die
von dieser Aufbringspitze aufgebrachte Menge einer Probe größer
ist als die durchschnittliche Menge. Infolgedessen kann ein integrierter
Konzentrationswert (Di) kompensiert werden, indem Di
durch Ki geteilt wird.
Die Korrekturkoeffizienten (K₁, K₂ . . . KN) können im Speicher
(15) mit Hilfe der Tastatur (16) und des Bildschirms (CRP) (17)
gespeichert werden oder sie können berechnet und im Speicher
(15) mit Hilfe des Prozessors (14) automatisch gespeichert
werden. In diesem letzteren Falle genügt es, daß die Bedienungsperson
in den Prozessor (14) einen Befehl für den Vorgang
der Berechnung und Speicherung der Korrekturkoeffizienten ein
gibt.
Nachdem die Korrekturkoeffizienten (K₁, K₂ . . . KN) in der oben
erläuterten Weise im Speicher (15) gespeichert worden sind,
werden Testproben mit unbekannten Mengen an Gesamtprotein auf
den Träger aufgebracht zusammen mit der Standardprobe mit der
bekannten Gesamtproteinmenge; darauf wird der Träger der Elektrophorese
unterworfen und es werden elektrophoretische Bilder
auf dem Träger erzeugt. Dann werden die elektrophoretischen
Bilder der Testproben und der Standardprobe optisch abgetastet
und die integrierten Konzentrationswerte der jeweiligen elektrophoretischen
Bilder (D₁, D₂ . . . DN) berechnet. Darauf wird
die Gesamtproteinmenge einer Testprobe (TPi) entsprechend der
folgenden Gleichung berechnet.
Die so berechneten Gesamtproteinmengen der Testproben werden in
der Diskette bzw. dem Floppy-Disk (18) gespeichert.
Bei der vorliegenden Ausführungsform werden aus allen im Speicher
(15) gespeicherten Absorptions- bzw. Extinktionswerten der
Testproben Absorptionswerte auf Abtastlinien ermittelt, die
durch Mittellinien der jeweiligen elektrophoretischen Bilder
der Testproben laufen. Dann werden die prozentualen Anteile der
Fraktionen und die Verhältnisse A/G aus diesen herausgenommenen
Absorptionswerten berechnet und in der Diskette (18) gespeichert.
Gleichzeitig werden die Mengen der jeweiligen Proteinkomponenten
berechnet, indem die prozentualen Anteile der Fraktionen
mit der gemäß Gleichung 6 berechneten Gesamtproteinmenge
multipliziert werden, und anschließend in der Diskette (18)
gespeichert. Schließlich werden die herausgenommenen Absorptionswerte
normalisiert. Die obigen Arbeitsgänge werden für die
aufeinanderfolgenden, auf dem Träger erzeugten elektrophoretischen
Bilder der Testproben durchgeführt und die Gesamtproteinmengen,
prozentualen Anteile der Fraktionen, A/G-Verhältnissse,
Mengen der jeweiligen Proteinkomponenten und normalisierten Ab
sorptionswerte für alle neunundzwanzig Testproben in der Diskette
(18) gespeichert. Darauf werden die Gesamtproteinmenge,
die prozentualen Anteile der Fraktionen, das A/G-Verhältnis,
die Mengen der jeweiligen Proteinkomponenten und die elektrophoretischen
Bildmuster mit Hilfe des Druckers (19) unter
Steuerung des Prozessors (14) in einem Versuchsbericht ausge
druckt.
Wie oben erläutert, wird bei der vorliegenden Ausführungsform
die Standardproben mit bekannter Gesamtproteinmenge zusammen mit
den Testproben auf den Träger aufgebracht und die unbekannten
Gesamtproteinmengen der Testproben werden aus der bekannten Ge
samtproteinmenge der Standardprobe, dem integrierten Konzentrationswert
des elektrophoretischen Bildes der Standardprobe, den
integrierten Konzentrationswerten der elektrophoretischen Bilder
der Testproben und den ersten und zweiten Korrekturkoeffizienten
für die Korrektur von Unterschieden bzw. Schwankungen
in den den Anfärbebedingungen und den Träger aufgebrachten
Mengen der Proben erhalten. Infolgedessen können die
Gesamtproteinmengen der Testproben immer genau quantitativ ermittelt
werden.
Die beschriebenen Ausführungsformen lassen sich modifizieren:
Beispielsweise umfaßt bei der obigen Ausführungsform das Densitometer den linearen Bildsensor, aber es kann (auch) ein einzelnes lichtempfangenes Element in der Hauptabtastrichtung zusammen mit der Lichtquelle synchron mit der schrittweisen Bewegung des Trägers bewegt werden, um das Raster-Abtasten zu bewirken. Weiterhin kann Gebrauch gemacht werden von einem zweidimensionalen Bildsensor und einer Objektivlinse um ein Bild eines elektrophoretischen Bildes einer Probe auf dem Bildsensor zu erzeugen. In diesem Falle kann der Abstand der stufen- oder schrittweisen Bewegung des Trägers länger und somit die Steuerung für die Bewegung einfacher sein.
Beispielsweise umfaßt bei der obigen Ausführungsform das Densitometer den linearen Bildsensor, aber es kann (auch) ein einzelnes lichtempfangenes Element in der Hauptabtastrichtung zusammen mit der Lichtquelle synchron mit der schrittweisen Bewegung des Trägers bewegt werden, um das Raster-Abtasten zu bewirken. Weiterhin kann Gebrauch gemacht werden von einem zweidimensionalen Bildsensor und einer Objektivlinse um ein Bild eines elektrophoretischen Bildes einer Probe auf dem Bildsensor zu erzeugen. In diesem Falle kann der Abstand der stufen- oder schrittweisen Bewegung des Trägers länger und somit die Steuerung für die Bewegung einfacher sein.
Weiterhin kann eine Bedingung eines elektrophoretischen Bildes,
die von verschiedenen Faktoren abhängt, beispielsweise ungleichmäßiges
Aufbringen der Probe, aufgrund der Absorptions-
(Extinktions-)Werte beurteilt werden und, wenn die Bedingungen
des elektrophoretischen Bildes als schlecht beurteilt werden,
kann auf die Berechnung der Gesamtproteinmenge verzichtet werden.
Die Bedingung bzw. der Zustand des elektrophoretischen
Bildes kann mit Hilfe verschiedener Methoden beurteilt werden.
Beispielsweise werden Maximalwerte, Mittelwerte oder integrierte
Werte von Absorptionswerten aller Abtastlinien ermittelt und
ein Muster aus den so erhaltenen Werten erstellt. Dann wird
eine Länge des Musters, gesehen in der Eingaberichtung des
Trägers, nachgewiesen bzw. ermittelt und mit einer Standard
länge verglichen, oder es wird eine Anzahl von Beugungs- bzw.
Biegungspunkten des Musters nachgewiesen und mit einem Standardwert
verglichen.
Ergibt die Berechnung eine außerordentlich hohe oder niedrige
Gesamtproteinmenge, so braucht diese Menge nicht ausgedruckt zu
werden oder sie wird mit einem Hinweis ausgedruckt, daß es sich
um einen abnormalen Wert handelt.
Bei der obigen Ausführungsform wird ein integrierter Konzentrationswert
weiterhin abgeleitet bzw. erhalten durch Integrieren
der Absorptionswerte des gesamten elektrophoretischen Bildes.
Es ist jedoch auch möglich, einen integrierten Konzentrationswert
durch Integrieren von Absorptionswerten einer einzelnen
Abtastlinie, die durch das Zentrum des elektrophoretischen
Bildes geht, zu berechnen.
Darüber hinaus werden bei der obigen Ausführungsform einer Standardprobe
mit bekannter Gesamtproteinmenge und Testproben mit
unbekannten Gesamtproteinmengen auf ein und denselben Träger
aufgebracht und die nicht bekannten Gesamtproteinmengen der
Testproben werden aus der bekannten Gesamtproteinmenge der
Standardprobe, dem integrierten Konzentrationswert des elektrophoretischen
Bildes der Standardprobe und den integrierten
Konzentrationswerten der elektrophoretischen Bilder der Testproben
berechnet. Jedoch braucht die Standardprobe nicht immer
auf den Träger aufgebracht zu werden. In einem solchen Falle
werden Teilmengen von mehreren Standardproben mit unterschiedlichen
bekannten Gesamtproteinmengen auf mehrere Träger aufgebracht
und es wird eine Eichkurve oder ein Umwandlungs-(Konversions-)Koeffizient
ermittelt, der eine Beziehung zwischen einer
Gesamtproteinmenge und einem integrierten Konzentrationswert
des elektrophoretischen Bildes wiedergibt. Dann werden lediglich
Testproben auf einen Träger aufgebracht und die Gesamtproteinmengen
der Testproben aus der Eichkurve oder dem Umwandlungs
koeffizienten ermittelt bzw. bestimmt. In diesem Falle
werden vorzugsweise Eichkurven oder Umwandlungskoeffizienten
für jeweilige Aufbringespitzen der gleichen Proben-Aufbringevorrichtung
aufgestellt.
Wie oben im einzelnen erläutert wird erfindungsgemäß die Gesamt
proteinmenge einer Probe aus einem elektrophoretischen Bild
ermittelt, das durch die Elektrophorese-Apparatur erzeugt worden ist.
Es kann daher auch zeitraubende Arbeitsgänge, wie das
Analysieren der Gesamtproteinmengen von Testproben mit Hilfe
des biochemischen Analysegerätes und Eingeben der durch die
Analyse erhaltenen Gesamtproteinmengen in die Elektrophorese-
Apparatur, verzichtet werden. Infolgedessen kann das biochemische
Analysegerät sehr viel wirksamer ausgenutzt werden.
Claims (5)
1. Verfahren zum Messen der in einer Probe enthaltenen Gesamt
proteinmenge durch elektrophoretische Auftrennung der
auf einen Träger aufgebrachten Probe, bei dem die zu untersuchende
Probe nach erfolgter Auftrennung angefärbt
wird und die Konzentrationen der einzelnen Komponenten
durch lichtelektrische Abtastung ermittelt werden,
dadurch gekennzeichnet, daß
auf dem Träger zusätzlich zu der zu untersuchenden Probe
eine Standardprobe aufgebracht wird, so daß unterschiedliche
Anfärbungsgrade der einzelnen Komponenten bei der
Ermittlung der Einzelkonzentrationen und damit auch bei
der Ermittlung der Gesamtproteinmenge erfaßbar sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß man das durch
elektrophoretische Auftrennung gewonnene elektrophoretische
Bild zweidimensional abtastet und das zweite elektrische Signal
über das gesamte elektrophoretische Bild integriert.
3. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, daß man das elektrophoretische
Bild linear entlang einer Mittellinie des elektrophoretischen
Bildes abtastet und das zweite elektrische Signal
entlang der Mittellinie des elektrophoretischen Bildes inte
griert.
4. Verfahren nach Anspruch 2,
dadurch gekennzeichnet, das Korrekturkoeffizienten
entsprechend der Lichtwellenlänge, mit der das elektrophoretische
Bild optisch abgetastet wird, bestimmt werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein elektrophoretisches Bild der Standardprobe und mehrere
elektrophoretische Bilder von mehreren zu untersuchenden Proben
auf dem gleichen Träger erzeugt und die Schwankungen innerhalb
der auf den Träger aufgebrachten Probenmengen korrigiert wer
den.
Applications Claiming Priority (1)
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---|---|---|---|
JP60036606A JPH065227B2 (ja) | 1985-02-27 | 1985-02-27 | 電気泳動装置による総蛋白値の定量方法 |
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ID=12474455
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DE19863606231 Granted DE3606231A1 (de) | 1985-02-27 | 1986-02-26 | Verfahren zum messen des gesamtproteingehaltes einer probe mit hilfe eines elektrophoretischen bildes |
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Country | Link |
---|---|
US (1) | US4666578A (de) |
JP (1) | JPH065227B2 (de) |
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