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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Analyse
einer sehr kleinen Menge von Analyten eines weiten Bereichs, insbesondere
Biopolymeren wie etwa Proteinen oder Nukleinsäuren, mit hoher Geschwindigkeit
und in hoher Auflösung,
und ist auch eine Vorrichtung für
diesen Zweck. Genauer ist sie eine Vorrichtung, die sich auf ein
Mikrochip-Elektrophoreseverfahren, das einen Mikrochip verwendet,
bezieht. Der Mikrochip wird hergestellt, indem eine Nut zum Zuführen einer
Flüssigkeit
auf die Oberfläche
von wenigstens einem eines Paares von transparenten Plattenteilen
ausgebildet wird. Das andere Plattenteil ist mit Löchern an
Stellen versehen, die den Nuten entsprechen. Diese Plattenteile
werden unter Einwärtspositionierung der
Nut miteinander verklebt, wodurch mittels der Nut ein Trennkanal
ausgebildet wird. Durch Auffüllen
des Trennkanals mit einer Migrationsflüssigkeit, Eingeben einer Probe
in ein Ende desselben und Anlegen einer Migrationsspannung an den
Trennkanal wird die Probe im Trennkanal elektrophoresiert.
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Beschreibung des Standes
der Technik
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Im
Falle einer Analyse einer sehr kleinen Menge an Protein oder Nukleinsäure wird
eine Elektrophoresevorrichtung, wie etwa eine Kapillar-Elektrophoresevorrichtung,
allgemein verwendet. Bei der Kapillar-Elektrophoresevorrichtung wird ein Migrationspuffer
in eine Glaskapillare mit einem Innendruchmesser von nicht mehr
als 100 μm
gefüllt.
Eine Probe wird an einem Ende eingeführt, gefolgt von dem Anlegen
einer hohen Spannung an der Kapillare, um den Analyten in der Kapillare
wandern zu lassen. Die Kapillare, die eine große Oberfläche in Bezug auf ihr Volumen,
d. h., hohe Kühleffizienz,
hat, gestattet das Anlegen einer hohen Spannung und kann eine sehr
kleine Menge einer Probe, wie etwa einer DNA, mit hoher Geschwindigkeit
in hoher Auflösung
analysieren.
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Die
Kapillare ist jedoch infolge ihres kleinen Durchmessers zerbrechlich,
obwohl sie üblicherweise durch
eine Polymidbeschichtung geschützt
wird. Der Benutzer muss daher extrem sorgfältig arbeiten, wenn die Kapillare
ausgetauscht wird. Aus diesem Grund wurde ein Kapillar-Elektrophoresechip,
genannt Mikrochip, vorgeschlagen. Dieser Mikrochip wird durch Verbinden
von zwei Substraten ausgebildet, wie dies in D. J. Harrison et al.,
Anal. Chim. Acta 283 (1993), Seiten 361 bis 366 beschrieben ist.
Die 1A bis 1C zeigen ein
Beispiel eines solchen Mikrochips. Dieser Mikrochip besteht aus
einem Paar transparenter Substrate (etwa Glasplatten 51 und 52).
Schneidende Elektrophorese-Kapillarnuten 54 und 55 sind
an einer Oberfläche
des Substrats 52 ausgebildet, während Reservoire 53 an
dem Substrat 51 als Löcher
an Stellen vorgesehen sind, die den Enden von Nuten 54 bzw. 55 entsprechen.
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Bei
Verwendung dieses Mikrochips sind die Substrate 51 und 52,
wie in 1C gezeigt, so überlappt, dass
eine elektrophoretische Pufferlösung
aus irgendeinem Reservoir 53 in Nuten 54 und 55 eingegeben
wird. Nachfolgend wird eine Probe in das Reservoir 53,
das einem Ende einer kürzeren
Nut 54 entspricht, eingegeben, während ein Paar von Elektroden
zwischen Reservoiren 53, die den beiden Enden der Nut 54 entsprechen,
zum Anlegen einer hohen Spannung zu einer vorgeschriebenen Zeit
an die Probeneingabe, eingesetzt ist. Auf diese Weise wird die Probe
in die Nut 54 herein zerstreut.
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Danach
wird ein weiteres Paar von Elektroden zwischen Reservoiren 53,
die den beiden Enden der längeren
Nut 55 entsprechen, zum Anlegen einer Migrationsspannung
eingesetzt. Die Probe, die am Schnittpunkt 56 zwischen
Nuten 54 und 55 zugegen ist, wird in der Nut 55 elektrophoresiert.
Ein Detektor, wie etwa ein Ultraviolett-Sichtbarlichtphotometer,
ein Fluoreszenzphotometer oder ein elektrochemischer Detektor wird an
einer korrekten Stelle zur Nut 55 zur Feststellung der
getrennten Komponenten angeordnet.
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Herkömmliche
Mikrochip-Elektrophoresevorrichtungen, die optische Detektoren zur
Feststellung von Bestandteilen verwenden, benutzen einen laserinduzierten
Fluoreszenznachweis als Nachweismittel. Keine Vorrichtung führt einen
Nachweis durch Absorption in einem ultraviolett-sichtbaren Bereich
durch. Wenn Ultraviolett-Sichtbarabsorptionsnachweis anzuwenden
ist, ist er als Verfahren des Einführens von einfallendem Licht
senkrecht zu einem Kanal und Feststellens von Zielkomponenten, die
eine bestimmte spezifische Position eines Nachweisteils durchlaufen,
mit Mitteln, wie etwa einer Photozelle, denkbar, womit eine Trennung
auf ähnliche
Weise, wie bei einer herkömmlichen
Kapillar-Elektrophoresevorrichtung bestätigt wird.
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Wenn
Licht in einen Mikrochip senkrecht zu seiner Oberfläche im Falle
einer Kapillar-Elektrophorese eingeführt wird, lässt sich eine optische Weglänge von
nur ungefähr
20 μm gewinnen,
was ungefähr
2/5 dessen bei einer herkömmlichen
Kapillar-Elektrophorese ist. Auch ist bei der herkömmlichen
Kapillar-Elektrophorese die optische Weglänge (ungefähr 50 μm) so kurz, dass ihre schlechte
Empfindlichkeit trotz ihrer hohen Auflösung ein ernster Nachteil ist.
Es ist zwar denkbar, einen Kanal eines Zellenteils aufzublähen, um
die optische Weglänge
zu erhöhen,
wie dies bei einer Blasenzelle oder dergleichen beobachtet wird,
es ist aber immer noch schwierig eine ausreichende optische Weglänge zu verwirklichen.
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Ein
Mikrochip-Elektrophoreseverfahren gemäß dem Oberbegriff von Anspruch
1 und ein Mikrochip-Elektrophoreseverfahren gemäß dem Oberbegriff von Anspruch
2 sind aus WO 97/30347 A bekannt, die Stand der Technik gemäß Art. 57(3)
EPÜ ist.
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WO
93/14389 A beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung für den Extinktionsnachweis,
welches eine Zylinderlinse und Filter aufweist. Die Trennungen aus
Kapillar-Elektrophorese werden online durch Fokussieren eines Lichtbündels in
Form einer Lichtlinie oder Lichtbahn auf den Kapillarkanal festgestellt.
Die Verwendung einer Glaskapillare in einem Mikrochip für Elektrophoresevorrichtungen
ist beispielsweise aus FAN Z. H. et al: „Micromachining of capillary
electrophoresis injectors and separators on glass chips and evaluation of
flow at capillary intersections",
Analytical Chemistry, Bd. 66, Heft 1, 1. Januar 1994, Seiten 117-184, XP000426228
bekannt.
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ÜBERBLICK ÜBER DIE ERFINDUNG
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Dementsprechend
ist die vorliegende Erfindung dafür gedacht, die Nachweisempfindlichkeit
bei der Mikrochip-Elektrophorese zu verbessern.
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Die
Erfindung ist wie in den Ansprüchen
1 und 2 definiert.
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Ein
typischer Mikrochip umfasst ein Paar von transparenten Plattenteilen.
Eine Nut zur Zufuhr einer Flüssigkeit
ist an einer Oberfläche
von wenigstens einem der Plattenteile ausgebildet, das andere Plattenteil ist
mit Löchern
an Stellen, die der Nut entsprechen, versehen, und diese Plattenteile
werden unter Einwärtsrichten
der Nut miteinander verbunden, womit durch die Nut ein Trennkanal
ausgebildet wird.
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Zur
Gewinnung von Migrationsmustern längs des Trennkanals, während das
Anlegen der Migrationsspannung gestoppt wird, umfassen die Lichteinstrahlmittel
eine Lichtquelle und ein optisches System, welches einen vorgeschriebenen
Bereich des Trennkanals mit linearkondensiertem Licht bestrahlt.
Die Lichtnachweismittel umfassen eine Anzahl von Photodetektoren,
welche längs
des Trennkanals zur gleichzeitigen Feststellung von Licht aus Probenkomponenten
in dem Trennkanal, die mit Licht durch die Lichteinstrahlmittel
bestrahlt worden sind, angeord net sind. Der Datenverarbeitungs/Steuerteil
führt wiederholt
Messungen mit den Lichtnachweismitteln durch, wobei die Messsignale
in jedem Photodetektor akkumuliert werden.
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Bei
einem aktualisierten Aufbau umfassen die Lichteinstrahlmittel eine
Lichtquelle, welche sich längs des
Trennkanals erstreckt, und eine Zylinderlinse, welche so angeordnet
ist, dass Licht in der Breitenrichtung längs des Trennkanals kondensiert
und Licht aus der Lichtquelle in den Trennkanal eingeführt wird.
Die Lichtnachweismittel umfassen eine Zylinderlinse, die so angeordnet
ist, dass Licht in der Breitenrichtung längs des Trennkanals kondensiert
und aus dem Trennkanal zu den Photodetektoren geleitet wird.
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Zur
Gewinnung von Migrationsmustern längs des Trennkanals, während das
Anlegen der Migrationsspannung gestoppt wird, umfassen die Lichteinstrahlmittel
eine Lichtquelle und ein optisches System, welches den Trennkanal
mit einem Lichtbündel
bestrahlt. Die Lichtnachweismittel umfassen einen einzelnen Photodetektor,
welcher so angeordnet ist, dass er Licht von der Probe im Trennkanal
durch Licht von den Lichteinstrahlmitteln nachweist. Eine Anordnung,
welche die Lichteinstrahlmittel und die Lichtnachweismittel enthält, und
der Mikrochip können
eine Relativbewegung längs
des Trennkanals durchführen.
Der Datenverarbeitungs/Steuerteil bewegt diese Anordnung oder den
Mikrochip wiederholt längs
des Trennkanals, um Nachweissignale mit den Lichtnachweismitteln
an jeder Stelle des Trennkanals zu akkumulieren.
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Die
Lichtnachweismittel sind so eingerichtet, dass sie Lichtabsorption
durch Probenkomponenten im Trennkanal nachweisen. Entweder die Lichteinstrahlmittel
oder die Lichtnachweismittel weisen spektroskopische Mittel auf,
die eine Wellenlänge
zur Messung der Extinktion auswählen.
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Die
Anzahl der Messwiederholungen zur Sammlung von Information wird
vorzugsweise automatisch berechnet und durch den Datenve rarbeitungs/Steuerteil
gesteuert. Hierzu umfasst der Datenverarbeitungs/Steuerteil eine
Berechnungsformel, welche einen Diffusionskoeffizienten der Probe
und einen Peakverschlechterungsgrad als Parameter zur Berechnung
der Anzahl von Messwiederholungen durch Lichteinstrahlung in den
Trennkanal enthält,
und berechnet automatisch die Messwiederholungszahl und steuert
die wiederholte Messung durch Eingabe solcher Parameter.
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Als
konkretes Beispiel zur Berechnung der Anzahl von Messwiederholungen
enthält
der Datenverarbeitungs/Steuerteil die folgende Berechnungsformel
zur Gewinnung einer Zeit t' bis
zu einer Verschlechterung der Anzahl theoretischer Böden auf
N' als eine Zeit,
die eine wiederholte Messung gestattet. t' = (L2/N' – σ2)/2D
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Der
Datenverarbeitungs/Steuerteil berechnet die Anzahl von Messwiederholungen
auf der Grundlage der Zeit t'.
In obiger Formel stellt L eine Länge
des Trennkanals (Kapillare), σ eine
Standardabweichung des Peak und D den Diffusionskoeffizienten dar.
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In
einem weiteren Beispiel zur Berechnung der Anzahl von Messwiederholungen
enthält
der Datenverarbeitungs/Steuerteil die folgende Berechnungsformel
zur Gewinnung einer Zeit t' bis
zu einer Verschlechterung der Anzahl theoretischen Böden auf
N' als eine Zeit,
die eine wiederholte Messung gestattet. t' = L2(1/N' – 1/N)/2D
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Der
Datenverarbeitungs/Steuerteil berechnet die Anzahl von Messwiederholungen
auf der Grundlage der Zeit t'.
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Wenn
die an den Trennkanal angelegte Migrationsspannung nach vollständiger Trennung
der Zielkomponenten beseitigt wird, wirkt auf die getrennten Komponenten
anders als bei der Flüssigchromatographie keine
Trägheitskraft;
die Komponenten werden auf natürliche
Weise zerstreut und verbleiben im Kanal. Die Lichtnachweismittel
messen wiederholt die Absorption mit Licht, das auf den Gesamtkanal
aufgebracht wird, oder die Fluoreszenz in diesem Zustand. Die Stellung
eines jeden Photodetektors der Lichtnachweismittel entspricht derjenigen
des Kanals, weshalb die Lichtintensität an jeder Stelle des Kanals
gemessen und wiederholt akkumuliert wird. Während die Komponenten im Kanal
auf natürliche
Weise während
der Messung zerstreut werden, ist das Signal/Rausch-Verhältnis 17,3,
wobei angenommen ist, dass es etwa 2,5 Sekunden bis zur Verschlechterung
der Peakform um ungefähr
90 % im Sinne der Anzahl theoretischer Böden dauert. Eine Akkumulation
wird in dieser Zeitdauer 300 Mal durchgeführt, wie später noch beschrieben wird.
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Bei
dem herkömmlichen
Verfahren des Vorsehens eines Detektors an einem Teil eines Trennkanals zur
Feststellung von Zielkomponenten, die diesen Ort durchlaufen, ist
die Analyse erst abgeschlossen, wenn die Trennung abgeschlossen
ist und die letzte Zielkomponente diesen Ort durchläuft. Bei
der vorliegenden Erfindung andererseits kann eine Messung in dem
Zeitpunkt ausgeführt
werden, zu dem die letzte Zielkomponente vollständig abgetrennt ist, wodurch
die Messzeit verkürzt
wird.
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Es
ist möglich,
durch Wiederholung der Messung und Akkumulieren der Messwerte das
Signal/Rausch-Verhältnis
zu verbessern, wodurch die Nachweisempfindlichkeit verbessert wird.
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Während beim
bekannten Nachweisverfahren die Peakbreite eines Elektropherogramms
mit abnehmender Migrationsgeschwindigkeit zunimmt, sind mittels
der vorliegenden Erfindung die Zielkomponenten bei der gleichen
Migrationszeit, weshalb ein elegantes Elektropherogramm mit regulären Peakbreiten
gewonnen werden kann.
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Da
die Anzahl der Messwiederholungen automatisch berechnet wird, ist
es nicht erforderlich, manuell komplizierte Rechnungen durch zuführen, weshalb
ein fehlerhaftes Arbeiten durch Fehlberechnung nicht bewirkt wird.
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Die
vorstehenden und weitere Aufgaben, Merkmale, Aspekte und Vorteile
der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen
Beschreibung und den beigefügten
Zeichnungen deutlicher werden.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1A und 1B sind
Draufsichten, die transparente Plattenteile zeigen, die einen Mikrochip
gemäß dem Stand
der Technik und der vorliegenden Erfindung bilden, und 1C ist
eine Vorderansicht, die den zusammengebauten Mikrochip zeigt;
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2 ist
eine schematische perspektivische Ansicht, die eine Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zeigt;
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3 ist
ein Schaltbild, welches ein Photozellenfeld bei der Ausführungsform
zeigt;
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4 ist
ein Blockdiagramm, welches ein Steuersystem bei der Ausführungsform
zeigt;
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5 ist
ein Flussdiagramm, welches das Arbeiten der Ausführungsform wiedergibt;
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6A ist
eine schematische Vorderansicht, welche einen Trennkanal bei Anhalten
der Trennung und ein Photozellenfeld in der Ausführungsform zeigt, 6B ist
ein Wellenformdiagramm, welches ein Chromatogramm der Ausführungsform
zeigt, und 6C ist ein Wellenformdiagramm,
welches ein Elektropherogramm des Standes der Technik zeigt; und
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7 ist
ein Flussdiagramm, welches das Arbeiten einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung zeigt.
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BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN
AUSFÜHRUNGSFORMEN
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2 zeigt
eine Vorrichtung gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung. Mikrochip 5 ist in 1C gezeigt.
Um einen konstanten Bereich seines Trennkanals 55 zu bestrahlen,
wird Licht einer Lichtquelle 1 längs des Trennkanals 25 linear
ausgedehnt und durch Zylinderlinse 2 in paralleles Licht
umgewandelt. Eingeführt
in ein Bandpassfilter 3, wird das vom Bandpassfilter 3 durchgelassene
Filter zu einer bestimmten Wellenlänge gemacht, wird durch Zylinderlinse 4 kondensiert
und in den Trennkanal 55 des Mikrochips 5 eingeführt. Zylinderlinse 6 ist
an einer gegenüberliegenden
Seite des Mikrochips 5 vorgesehen, um das vom Trennkanal 55 durchgelassene
Licht zu kondensieren, und das mit der Zylinderlinse 6 kondensierte
Licht wird in ein Photozellenfeld 7 eines Lichtdetektors
eingeführt
und nachgewiesen. Die Zylinderlinsen 2, 4 und 6, das
Bandpassfilter 3 und das Photozellenfeld 7 sind
kürzer
als, aber im Wesentlichen identisch in der Länge zu dem Trennkanal 55.
Das Photozellenfeld 7 umfasst 512 Photodioden, welche linear
entlang der Längsrichtung
des Trennkanals 55 als Nachweiselemente angeordnet sind.
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Das
Bandpassfilter 3, welches auf der Lichteinstrahlseite bei
dieser Ausführungsform
angeordnet ist, kann alternativ auch auf der Lichtnachweisseite,
d. h., im Lichtweg zwischen Mikrochip 5 und Photozellenfeld 7 angeordnet
sein.
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Das
Photozellenfeld 7 hat einen in 3 gezeigten
Schaltungsaufbau. Das Photozellenfeld 7 hat ungerade Photodioden 11 und
gerade Photodioden 12, welche abwechselnd auf Geraden angeordnet
sind. Die Gesamtzahl der Photodioden 11 und 12 ist
512. Das Photozellenfeld 7 ist ferner mit 512 Blindphotodioden 13 versehen,
welche die gleiche Charakteristik wie die für die Messung verwendeten Photodioden 11 und 12 haben.
Aus MOS-FETs bestehende Schaltelemente 14 sind mit den
Photodioden 11, 12 bzw. 13 verbunden.
Ein ungerades Schieberegister 15 oder ein gerades Schieberegister 16 ist
mit jedem Schaltelement 14 verbunden, so dass EIN- und
AUS-Zustände
eines jeden Schaltelements 14 durch ein Signal aus dem
Schieberegister 15 oder 16 geschaltet werden.
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Bezugszeichen 17 und 18 bezeichnen
Betätigungssignaleingangsanschlüsse des
geraden bzw. ungeraden Schieberegisters 15 und 16,
Bezugszeichen 19 und 18 bezeichnen gerade bzw.
ungerade Rücksetzsignaleingangsanschlüsse, Bezugszeichen 21 und 22 bezeichnen
Ausgangsanschlüsse
für die
ungeraden bzw. geraden Photodioden 11 und 12,
Bezugszeichen 23 und 24 bezeichnen Ausgangsanschlüsse für die Blindphotodioden 13 und
Cv bezeichnet Kondensatoren.
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Die
Elektrophoresevorrichtung umfasst einen in 4 gezeigten
Steuerteil 40, der diese elektrophoretische Vorrichtung
steuert. Steuerteil 40 ist durch einen eine CPU enthaltenden
Mikrocomputer, einen RAM und einen ROM gebildet. Eingänge 17 bis 20 des
Photozellenfelds 7 sind mit dem Steuerteil 40 verbunden. Ausgänge 21 bis 24 des
Photozellenfelds 7 sind mit dem Steuerteil 40 über einen
Verstärker 41 und
A/D-Wandler 42 verbunden. Ferner sind mit dem Steuerteil 40 ein
Steuerpult 43 mit Tasten für einen Bediener zur Eingabe
von Befehlen und eine Bildröhre
(Kathodenstrahlröhre)
für Anzeigen,
ein X-Y-Drucker 44 zum Auftragen von Messergebnissen sowie
eine Spannungsquelle 34 verbunden.
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Bei
dieser Ausführungsform
wird Licht aus der Lichtquelle 1 durch die Zylinderlinse 2 in
Parallellicht umgewandelt, durchläuft das Bandpassfilter 3 zur
Umwandlung in Licht mit nur einer speziellen Wellenlänge und
wird auf den Trennkanal 55 des Mikrochips 5 durch
die Zylinderlinse 4 kondensiert. Das den Trennkanal 55 durchlaufende
Licht wird durch die Zylinderlinse 6 erneut in paralleles
Licht umgewandelt und auf das Photozellenfeld 7 gegeben.
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Das
Arbeiten dieser Ausführungsform
wird nun unter Bezugnahme auf das in 5 gezeigte
Flussdiagramm beschrieben.
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Wenn
ein Programm gestartet wird, wird eine Initialisierung durchgeführt, um
eine Spannungsquelle 34 in einen EIN-Zustand zu bringen
und einen Drucker 44 auf seine Anfangsposition zu setzen
(Schritt S1). Der Bediener stellt Trennparameter, wie etwa eine
Probeneinführungszeit,
eine Probeneinführungsspannung und
eine Migrationsspannung, über
das Steuerpult 43 ein (Schritt S2). Dann stellt der Bediener
Messparameter, wie etwa eine Migrationsendzeit (= Akkumulationstartzeit)
und eine Akkumulationszeit ein (Schritt S3). Das Programm wartet
auf einen Startbefehl (Schritt S4).
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Wie
bei der herkömmlichen
Mikrochip-Elektrophorese bringt der Bediener eine Probe ein und
drückt einen
Startknopf des Steuerpults 43. Eine elektrophoretische
Trennung wird begonnen und die Migrationsspannung am Trennkanal 55 des
Mikrochips 5 beruhend auf den Parametern, die im Programm
eingestellt worden sind, angelegt (Schritt S4 und S5). Damit wird
die Probe in den Trennkanal 55 bewegt und getrennt.
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Wenn
die eingestellte Migrationszeit abgelaufen ist (Schritt S6), werden
Zielkomponenten im Trennkanal 55 getrennt. Es wird angenommen,
dass Zielkomponenten a, b, c und d, wie in 6A gezeigt,
getrennt werden. Kapillar-Elektrophorese (identisch mit dieser Mikrochip-Elektrophorese)
ist durch die Tatsache gekennzeichnet, dass, wenn eine für die Elektrophorese
angelegte hohe Spannung weggenommen wird, Komponenten in einer Kapillare
in situ, ohne Einfluss durch eine Trägheitskraft, verbleiben. Daher
werden die Komponenten a, b, c und d auf natürliche Weise zerstreut. Eine
Messung wird gemäß der im
Schritt S3 vorgenommenen Einstellung begonnen (Schritt S7). Jede
Photodiode des Photozellenfelds 7 entspricht dabei einer
Stelle des Ka nals 55. Das Photozellenfeld 7, welches
mit den 512 Photodioden versehen ist, die in Abständen von 25 μm angeordnet
sind, hat eine Länge
von 12,8 mm. Dementsprechend werden Lichtabsorptionsbilder in einer
Auflösung
von 25 μm
im Bereich der Länge
von 12,8 mm des Trennkanals 55 gewonnen. Die in 6A gezeigten
Trennzustände
werden als Ultraviolett-Absorptionsbilder, wie sie in 6B gezeigt
sind, gewonnen.
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Der
Steuerteil 40 tastet das Photozellenfeld 7 wiederholt
ab und führt
eine Akkumulation durch, wodurch das in 6B gezeigte
Signal/Rausch-Verhältnis
rasch zunimmt (Schritte S7, S8 und S9). Wenn die Akkumulation abgeschlossen
ist, gibt der Steuerteil 40 die Messergebnisse auf den
Drucker 44 aus (Schritt S10) und schaltet zum Beenden des
Programms die Spannungsquelle 34 ab (Schritte S11 und S12).
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Die
Zeit für
eine wiederholte Messung kann mit einem Standard des Verschlechterungsgrads
der Anzahl theoretischer Böden
N entschieden werden. Die Anzahl theoretischer Böden N wird beim Beenden der Elektrophorese
durch natürliche
Diffusion verschlechtert. Bei Beenden mit einer Verschlechterung
von beispielsweise 10 % kann das Abtasten ungefähr 300 Mal durchgeführt werden,
wobei angenommen ist, dass eine Wiederholzeit von 2,5 s vorliegt
und eine einzelne Abtastung 8 ms benötigt (wie später noch
beschrieben wird) und das Signal/Rausch-Verhältnis
um den Faktor 17,3 erhöht
ist. Das Signal/Rausch-Verhältnis
wird im Falle einer Abtastung mit höherer Geschwindigkeit oder
von Analysekomponenten mit kleinen Diffusionskoeffizienten weiter
erhöht.
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6C zeigt
ein Elektropherogramm, das durch Feststellen von Zielkomponenten,
die eine spezifische Position eines Nachweisteils bei herkömmlicher
Kapillar-Elektrophorese durchlaufen, gewonnen ist. Verglichen mit
dem in 6B gezeigten, sind das Signal/Rausch-Verhältnis kleiner,
die Messzeit länger
und die Peakbreiten von Komponenten mit geringen Migrationsgeschwindigkeiten
größer.
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Die
Anzahl der Messwiederholungen, die nach Beenden des Anlegens der
Migrationsspannung zulässig
ist, wird beschrieben.
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Im
Allgemeinen wird die Anzahl theoretischer Böden N durch eine Kapillar-(Trennkanal-)Länge L und eine
Standardabweichung σ von
Peaks folgendermaßen
ausgedrückt: N = (L/σ)2 (1)
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Nimmt
man an, dass die Kapillarlänge
L gleich 2 cm und die Anzahl theoretischer Böden N 1000 ist, dann ist σ2 = 4/10000
≒ 1/2500eine Anzahl theoretischer
Böden N' nach t' Sekunden gerechnet
vom Beenden des Anlegens der Migrationsspannung lässt sich
folgendermaßen
ausdrücken: N' = L2/(σ2 + σ'2) (2)wobei σ' die Standardabweichung
der Peaks nach t' Sekunden
gerechnet vom Beenden des Anlegens der Migrationsspannung darstellt.
Wenn D einen Diffusionskoeffizienten und t Zeit darstellt, wird
die natürliche
Diffusion eines gelösten
Stoffes in einem Lösungsmittel
folgendermaßen
ausgedrückt: σ2 =
2Dt (3)
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Daher
ist, N' = L2/(σ2 +
2Dt') (4)
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Daher
ist die Zeit vor Verschlechterung der Anzahl theoretischer Böden N auf
den Wert N', d.
h., die Zeit t',
während
welcher eine wiederholte Messung vor Verschlechterung der Anzahl
theoretischer Böden
N auf den Wert N' möglich ist,
folgende: t' = (L2/N' – σ2)/2D (5)
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Wenn
die Zeit t', während welcher
eine wiederholte Messung möglich
ist, gewonnen ist, lässt
sich die Anzahl der Abtastungen leicht berechnen, da die für eine einzelne
Abtastung des Photozellenfelds 7 nötige Zeit offensichtlich ist.
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Tabelle
1 veranschaulicht für
einige Lösungsstoffbeispiele
Zeiten vor der Reduktion der Anzahl theoretischer Böden auf
(N'/N). Tabelle
1
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Es
ist bekannt, dass ein gelöster
Stoff in einem Lösungsmittel
nur natürliche
Diffusion verursacht, wenn während
der Migration in Kapillar-Elektrophorese
die Migrationsspannung beseitigt wird. Im Falle einer abtastenden
Ultraviolett-Extinktionsmessung parallel zum Trennkanal 55 unter
Beseitigung der angelegten Spannung ist eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses
in Entsprechung zur Anzahl der Abtastungen zu erwarten.
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Wenn
ein Photodiodenfeld-Detektor für
einen Hochgeschwindigkeitsflüssigkeitschromatographen
als das Photozellenfeld 7 verwendet wird, beträgt die für das Abtasten benötigte Zeit
8 ms. Ein gelöster
Stoff mit Ultraviolettabsorption hat allgemein ein Molekulargewicht
von wenigstens 100, und die Anzahl theoretischer Böden N eines
solchen gelösten
Stoffs wird nicht auf mehr als 90 % für wenigstens 2,5 Sekunden verschlechtert.
Nimmt man an, dass die Abtastung 300 Mal in 2,5 Sekunden durchgeführt wird,
lässt sich
das Rauschen n',
welches durch 300-maliges Abtasten erreicht wird, im Verhältnis zum
Rauschen n der Messung einer einzelnen Abtastung folgendermaßen ausdrücken: N' =
n/(300)1/2
= n/17,3
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Es
lässt sich
also eine Verbesserung des Signal/Rausch-Verhältnisses mit dem Faktor 17,3
erwarten.
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Wenn
die Wiederholzeit durch Einsetzen numerischer Werte für die Parameter
in den Ausdruck (5) gewonnen wird, lässt sich die Anzahl der Abtastungen
entscheiden. Diese Berechnung ist jedoch kompliziert und erfordert
eine zeitraubende manuelle Berechnung durch den Bendiener vor der
Messung, was zu einer fehlerhaften Handhabung bewirkt durch Fehlberechnung,
führen
kann. Gemäß einer
weiteren bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist der Ausdruck (5) im Steuerteil 40 gespeichert,
der ein Rechner zur automatischen Durchführung dieser Berechnung mit
einfachem Eingeben notwendiger Parameter in den Steuerteil 40 ist.
Die dabei durchgeführten
Vorgänge
sind im Flussdiagramm der 7 beschrieben.
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Wenn
ein Programm gestartet wird, wird eine Initialisierung durchgeführt, um
die Spannungsquelle 34 in einen EIN-Zustand zu bringen
und den Drucker 44 in seine Ausgangsstellung einzustellen
(Schritt S1). Der Bediener benutzt dann das Steuerpult 43 (Schritt
S2) zur Einstellung der Trennparameter, welche die Probeninjektionszeit,
die Probeninjektionsspannung und die Migrationsspannung enthalten.
Auch enthalten sind die Messparameter für die Migrationsendzeit (=
Akkumulationstartzeit) und die Akkumulationszeit.
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Der
Bediener gibt dann die Parameter zur Entscheidung der Abtastanzahl,
d. h., den Diffusionskoeffizienten D, die Kapillarlänge L und
den zulässigen
Grad an Verschlechterung (entsprechend dem Wert n') der Anzahl theoretischer
Böden N,
die durch die Wartezeit durch die wiederholte Messung bewirkt wird,
ein (Schritt S3). Das Programm wartet dann auf eine Startbefehl
(Schritt S4).
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Ähnlich zur
allgemeinen Mikrochip-Elektrophorese injiziert der Bediener die
Probe und drückt
den Startknopf des Steuerpults 42. Die elektrophoretische
Trennung der Probe wird gemäß dem Programm
gestartet und die Migrationsspannung an den Trennkanal 55 des
Mikrochips 5 auf der Grundlage der eingestellten Parameter
angelegt (Schritte S4 und S5). Damit wird die Probe in den Trennkanal 55 bewegt
und getrennt. Wenn die eingestellte Migrationszeit endet (Schritt
S6), sind Zielkomponenten im Trennkanal 55 getrennt.
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Die
Messung im Photozellenfeld 7 wird durch die folgenden Schritte
gewonnen: eine erste Abtastung wird durchgeführt (Schritt S7) und die Standardabweichung σ von Probenpeaks
auf der Grundlage der Messergebnisse gewonnen, wobei diese zur Berechnung
der Anzahl von Abtastungen anhand des Ausdrucks (5) verwendet werden
(Schritt S8). Das Photozellenfeld 7 wird mit der berechneten
Anzahl von Abtastungen wiederholt abgetastet und die Ergebnisse
werden akkumuliert (Schritt S9). Nach Abschluss der Akkumulation
werden Messergebnisse auf den Drucker 44 ausgegeben (Schritt
S10) und die Spannungsquelle 43 abgeschaltet, womit das
Programm endet (Schritte S11 und S12).
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Aus
der Beziehung des Ausdrucks (1) lässt sich der Ausdruck (5) folgendermaßen umformen: t' = L2(1/N'-1/N)/2D (5a)
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Bei
der Berechnung der Anzahl von Abtastungen während Schritt S8 kann die Anzahl
theoretischer Böden
N des Probenpeaks auf der Grundlage der Messergebnisse der ersten
Abtastung gewonnen werden.
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Wenn
der zulässige
Verschlechterungsgrad der Anzahl theoretischer Böden N durch die Anzahl theoretischer
Böden N
bei der ersten Messung bestimmt worden ist und über die Länge L des Trennkanals 55 entschieden
worden ist, ist der vom Bediener eingegebene Parameter nur der Diffusionskoeffizient
D. Ferner kann der Diffusionskoeffizient D auch bestimmt werden,
wenn über
eine Zielprobe und ein Lösungsmittel
entschieden worden ist, wodurch die Anzahl der Abtastungen ohne
Eingabe eines Parameters automatisch berechnet werden kann.
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Als
weitere Ausführungsform
kann das Abtasten für
Messungen wiederholt werden, indem Lichteinstrahlmittel einer Messvorrichtung
mit einer Lichtquelle und einem optischen System, welche einen Trennkanal mit
einem bündeligen
Licht bestrahlen, vorgesehen werden, wobei Lichtnachweismittel mit
einem einzelnen Photodetektor, welcher zur Feststellung von Licht
von einer Probe im Trennkanal durch Licht von den Lichteinstrahlmitteln
positioniert ist, vorgesehen werden. Entweder werden die Lichteinstrahlmittel
und die Lichtnachweismittel noch unfixiert längs des Trennkanals eines Mikrochips
gehaltert, oder der Mikrochip soll längs des Trennkanals in Bezug
auf die Lichteinstrahlmittel und die Lichtnachweismittel beweglich
sein. Im Falle wandernder Riesenmoleküle, wie etwa DNAs, oder bei
Verwendung einer Gelflüssigkeit
als Pufferlösung
ist es denkbar, dass Diffusion (natürliche Diffusion) einer Probe
kaum stattfindet und die Akkumulation ohne Hochgeschwindigkeitsabtastung
durchgeführt
werden kann.
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Die
vorliegende Erfindung wurde im Einzelnen beschrieben und dargestellt,
es versteht sich jedoch, dass dies nur als Veranschaulichung und
Beispiel und nicht als die Erfindung einschränkend zu verstehen ist, welche
nur durch die beigefügten
Ansprüche
beschränkt
wird.
