DE10065227A1

DE10065227A1 - Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Eigelb-Antikörpern aus Vogeleiweiß und Verwendung von dadurch erhaltenen Eigelb-Antikörpern

Info

Publication number: DE10065227A1
Application number: DE2000165227
Authority: DE
Inventors: Victor Chiou
Original assignee: Good Biotech Corp
Current assignee: Good Biotech Corp
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2002-07-11

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Dotter-Anitkörpern aus Vogeleidotter durch ein adsorptionschromatografisches Verfahren unter Verwendung eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absorptionsmittels, um die gewünschte Trennung von wässriger Fraktion und Lipidfraktion auszuführen und ein Aussalzungsverfahren, durch das die Dotter-Antikörper unterschiedlich ausgefällt werden. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung neben den hierdurch hergestellten Dotter-Antikörper auch verschiedene Verwendungsformen für solche Dotter-Antikörper.

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen Isolierung und Reinigung von Antikörpern aus Dotter, im besonderen IgY(ΔFc)-Antikörper aus Vogeleidotter, und den daraus hergestellten Antikörpern. Die vorliegende Erfindung betrifft eine Methode zur Isolierung und Reinigung von Antikörpern aus Vogeleidotter durch ein adsorptionschromatografisches Verfahren unter Verwendung eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absorptionsmittels, um die gewünschte Trennung von wässriger Fraktion und Lipidfraktion auszuführen und ein Aussalzungsverfahren, durch das die Dotter-Antikörper unterschiedlich ausgefällt werden. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Dotter-Antikörper in quantitativen oder qualitativen Immunoassays oder bei der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zu einem ätiologisch Agens von Interesse führen.

2. Hinterrund der Erfindung

Die Verwendung von Antikörpern ist in vielen biologischen Untersuchungen und klinischen Anwendungen weit verbreitet. Die gebräuchlichste Quelle für polyklonale Antikörper sind Seren, die aus hyperimmunisierten Säugetieren gewonnen werden. Antikörper, die man aus derartigen Immunseren erhält, gehören einer Gruppe von Proteinen mit der Bezeichnung "Immunglobuline" an, unter denen das Immunglobulin G (IgG) am häufigsten vorkommt. Das IgG-Molekül besteht aus drei Domänen, nämlich zwei Fab-Regionen und einer Fc- Region. Die Fab-Region ist hauptsächlich an der Antigenbindung beteiligt. Obwohl die Fc- Region nicht an ein Antigen binden kann, kontrolliert sie mehrere biologische Aktivitäten eines Antikörpers, wie beispielsweise Komplementbindung und Fc-Rezeptor-Bindung.

Auf dem Gebiet der Immundiagnose ist ein intaktes IgG-Molekül für die Verwendung in Nachweissystemen und immunologischen Assays ungeeignet, wenn Seren von Säugetieren beteiligt sind, da die Fc-Region eines IgG-Moleküls in der Lage ist, an Fc-Rezeptoren zu binden, das Komplementsystem zu aktivieren und mit dem rheumatoiden Faktor in Seren von Säugern zu reagieren. Das Entfernen der Fc-Region eines IgG-Moleküls führt häufig zu einer Verringerung dieser Beeinträchtigung (E. Lamoyi, Methods in Enzymology 121: 652-663, (1986)).

Einige der vorgeschlagenen Möglichkeiten zur Verwendung von Antikörpern in der Immuntherapie beinhalten die Behandlung von Patienten, die mit Bakterientoxinen oder Schlangengiften vergiftet wurden (siehe, z. B. U.S. 5,340,923 und U.S. 5,601,823) und den Schutz von neugeborenen Ferkeln vor einer tödlichen Darmbakterieninfektion (siehe, z. B. H. Brussow et al., J. Clin. Microbiol. 25: 982 (1987); und C. O. Tacket et al., New Eng. J. Med. 318: 1240 (1988)). Da das Fc-Fragment eines Antikörper-Moleküls als der Teil des Immunglobulins bekannt ist, der die meisten antigenen Eigenschaften besitzt (E. M. Akita et al., J. Immunol. Methods. 162: 155-164 (1993)), wird durch dessen Abspaltung, aus der die Bildung eines F(ab')2-Fragmentes resultiert, die Zahl möglicher allergener Stellen auf dem Immunglobulin-Molekül beträchtlich verringert und diese Abspaltung ist daher für den Menschen oder das Tier vorteilhaft, der/das Immunglobuline verabreicht bekommt.

Kürzlich wurde gezeigt, dass das divalente F(ab')2-Antikörper-Fragment in immundiagnostischen Tests nützlicher (M. Muratsugu et al., J. Colloid Interface Sci. 147: 378 (1991); und J. L. Ortega-Vinuesa et al., J. Immunol Methods 90: 29 (1996)) und für die Entwicklung von Immunoassays an denen Säugetier-Seren beteiligt sind, besser geeignet ist als das Ausgangs-IgG.

Dennoch fand das F(ab')2-Antikörper-Fragment keine so breite Verwendung in klinischen immundiagnostischen Kits wie man erwarten würde. Dies mag an den Schwierigkeiten und der Kostenineffektivität der Massenproduktion der F(ab')2-Antikörper-Fragmente gelegen haben, die herkömmlicherweise als Pepsinverdauung von IgG und anschließender Reinigung mittels Chromatographie gemacht wird.

Enten und ihre phylogenetisch nahen Verwandten sowie einige Reptilien, wie beispielsweise Schildkröten, besitzen drei Arten von Serumimmunglobulinen: ein makromolekulares Immunglobulin IgM (800 kDa bei Enten), sowie zwei niedrigmolekulare Isotypen IgG mit Sedimentationskoeftizienten von 7,8 S (180 kDa bei Enten) bzw. 5,7 S (130 kDa bei Enten) (E. R. Unanue et al., J. Exp. Med. 121: 697-714 (1965); H. M. Grey, J. Immunol. 98: 811-819 (1967); und B. Zimmermann et al., Biochemistry 10: 482-448 (1 translators note: should probably read: 482- 484") (1971)). Vogel-IgG wird oft IgY genannt, weil es im Dotter vorhanden ist. Das 5,7 S IgY, das kürzere schwere Ketten enthält, gleicht in seiner Struktur und Antigenwirkung dem F(ab')₂-Fragment des 7,8 S IgY (Fig. 1), um beide IgY-Isotypen darzustellen führt diese Tatsache zur Benennung von IgY (entsprechend dem 7,8 S IgY) und IgY(ΔFc) (entsprechend dem 5,7 S IgY) (K. E. Magor et al., J Immunol. 149: 2627-2633 (1992)).

Studien, die mit infizierten oder experimentell immunisierten Vögeln durchgeführt wurden, zeigten, dass den Entenantikörpern eine Reihe von biologischen Wirkfunktionen fehlen, einschließlich der Komplementbindung und Fc-Rezeptor-Bindung, ohne dass sie ihre Bindeaktivität an die entsprechenden Antigene verlieren (G. W. Litman et al., Immunochemistry 10: 323 (1973); und T. E. Toth et al., Avian Dis. 25: 17-28 (1981)). Dies könnte durchaus vom offensichtlichen Fehlen der Fc-äquivalenten Region des IgY(ΔFc)- Antikörpers herrühren, der mengenmäßig den Hauptbestandteil in der Antikörper-Antwort von Enten ausmacht. Daher wird angenommen, dass der IgY(ΔFc)-Antikörper, der scheinbar ein strukturelles und funktionelles Analogon des F(ab')₂-Fragments ist, enorme Vorteile bei der immunologischen Verwendung bieten würde, wenn ein vielversprechendes Verfahren für die Herstellung des Antikörpers entwickelt und die geeigneten physikalischen Voraussetzungen für seine Aktivität identifiziert werden könnten.

Es wurde berichtet, dass Vogeleidotter-Antikörper, genauso wie Säuger-Antikörper, nützliche Eigenschaften, sowohl für die Forschung als auch für die klinische Anwendung, besitzen (siehe z. B. U.S. 5,340,923; U.S. 5,585,098; U.S. 5,601,823; und U.S. 5,976,519). Dotter, den man von einer Legehenne erhält, ist kostengünstiger, sowie einfacher und sicherer zu handhaben, verglichen mit Seren von hyperimmunisierten Säugern. Noch wichtiger ist, dass die Dotter-Antikörper die genaue Prüfung unter den heutigen Tierschutzvorschriften bestehen können (A. Polson et al., Immunol. Commun. 9: 475 (1980); und B. Gottstein et al.,(2 translators note: should probably read: "Z. Parasitenkunde 71: 273 (1985")). Diese Tatsachen legen eine mögliche Verwendung von Dotter als kommerzielle Quelle für Antikörper nahe.

Jedoch machen hohe Mengen an fetthaltigen Substanzen, wie z. B. Fettsäuren, Cholesterin und Lecithin, die im Dotter enthalten sind, die Isolierung von Dotter-Antikörpern zur schwerfälligen und arbeitsreichen Aufgabe. So wurden beispielsweise wasserlösliche Fällungsmittel, einschließlich Agar, Pektin (Japanese Kokai No. 64-38098, veröffentlicht am 8. Februar 1989), Dextransulfat (J. C. Jensenius et al., J. Immunol. Methods 46: 63 (1981)), Naturgummi (H. Hatta et al., J. Food Science 53: 425(1988) und Polyethylenglycol (PEG) (A. Polson et al., Immunol Invest. 14: 323 (1985); siehe auch U.S. 4,550,019 erteilt an A. Polson) genutzt, um wasserunlösliche Biomoleküle, hauptsächlich Fette und Dottergranula, auszufällen und dabei eine wasserlösliche Fraktion zu ernten, die die Dotter-Antikörper in Hülle und Fülle enthält. A. Hassl et al., entwickelten zur weiteren Isolierung von Dotter- Antikörpern aus einer PEG-gereinigten Fraktion ein zweistufiges Chromatographieverfahren, bestehend aus hydrophober Wechselwirkungschromatographie und einer Größenausschluss chromatographie (A. Hassl und H. Aspock, J Immunol. Methods 110: 225 (1988)). Akita et al., beschrieben eine verbesserte Methode zur Isolierung von IgY, bei der Dotter-Antikörper aus Hühnereiern extrahiert wurden, indem der Dotter mit einem großen Volumen an Wasser verdünnt und der daraus entstandene Überstand dann der Größenausschlusschromatographie und/oder der Ionenaustauschchromatographie unterzogen wurde (E. M. Akita et al., J. Immunol. Methods. 160: 207 (1993); und E. M. Akita und S. Nakai, J Food Sci. 57: 629 (1993)).

Dennoch konzentrieren sich alle diese Studien und Patente lediglich auf die Isolierung der gesamten Dotter-Antikörper-Population (die zu mindest IgY und IgY(ΔFc) einschließt) aus Vogeleiern, anstatt auf die alleinige Reinigung des IgY(ΔFc)-Antikörpers. Da der IgY(ΔFc)- Antikörper außerdem nur in Vögeln vorkommt, die zur Ordnung der Anseriformes (Entenvögel) gehören, die Ente und Gans einschließt, und da der Fettgehalt im Dotter von Entenvögeln höher ist als in Hühnervögeln, wie beispielsweise Huhn und Truthahn, stellen die beschriebenen herkömmlichen Methoden keine Anregung für eine erfolgreiche Reinigung des IgY(ΔFc)-Antikörpers dar.

Daher besteht auf diesem Gebiet der Bedarf an einem schnellen, kostengünstigen Verfahren mit hohem Durchsatz, das die einfache Isolierung des gewünschten IgY(ΔFc)-Antikörpers aus dem Antikörper-Pool des Vogeleies, unter Aufrechterhaltung der Aktivität, bietet. Der gründlich gereinigte IgY(ΔFc)-Antikörper könnte als neuartiger F(ab')₂-Antikörper in verschiedenen immundiagnostischen und immuntherapeutischen Anwendungen eingesetzt werden.

Es wurde umfassend geforscht, um die industriellen Anforderungen für die oben genannten Dotter-Antikörper zu erfüllen. Nun wurde überraschenderweise gefunden, dass eine erfolgreiche Isolierung von Dotter-Antikörpern aus Vogeleidotter einfach, durch ein adsorptionschromatographisches Verfahren unter Verwendung eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absorptionsmittels und/oder durch ein einfaches Aussalzungsverfahren, das zwischen verschiedenen Isotypen der Dotter-Antikörper unterscheidet, erreicht werden kann. Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können hochgereinigte Dotter-Antikörper, besonders der hochgereinigte IgY(ΔFc)-Antikörper, einfach, mit hoher Ausbeute und in sparsamer Art und Weise erhalten werden und stehen gebrauchsfertig für eine große Vielzahl von immunologischen Anwendungen zur Verfügung.

3. Beschreibung der vorliegenden Erfindung

Dementsprechend ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur selektiven Isolierung von Antikörper-Isotypen aus Dotter zur Verfügung zu stellen, das folgende Schritte umfasst:

a) Gewinnung einer wässrigen Fraktion des Dotters aus einem Geflügelei;
b) Gewinnung eines Hauptanteils eines ersten Antikörper-Isotyps aus der wässrigen Fraktion von Schritt (i) durch Aussalzen der wässrigen Fraktion mit einem ersten nichtdenaturierenden Salz einer ersten Konzentration; und
c) Aussalzen des Hauptanteils eines zweiten Antikörper-Isotyps aus der übriggebliebenen wässigen Fraktion von Schritt (ii) durch Anpassen der übriggebliebenen wässigen Fraktion von Schritt (ii) mit einem zweiten nichtdenaturierenden Salz einer zweiten Konzentration;

unter der Voraussetzung, dass wenn das erste und zweite nichtdenaturierende Salz gleich ist, die erste und zweite Konzentration verschieden ist.

Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Isolierung von Antikörpern aus Dotter, wobei ein Absorptionsmittel verwendet wird, um die Mehrheit an Fetten und caseinhaltigen Substanzen zu entfernen, die normalerweise im Dotter vorhanden sind.

Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren zur Isolierung von Dotter-Antikörpern bereit, das folgende Schritte umfasst:

a) Entfernen der wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula aus dem Dotter von Geflügeleiern unter gleichzeitiger Gewinnung einer mit Wasser mischbaren Fraktion, die die Dotter-Antikörper enthält;
b) Durchleiten der mit Wasser mischbaren Fraktion durch eine stationäre Phase, die eine ausreichende Menge eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absoptionsmittels enthält und die fähig ist, die mit Wasser mischbaren, fetthaltigen Substanzen aufzunehmen, die normalerweise im Dotter vorhanden sind;
c) Sammeln der Lösung, die durch die stationäre Phase gelaufen ist; und
d) Gewinnung der Dotter-Antikörper aus der Lösung von Schritt (c).

Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein alternatives Verfahren zur Isolierung von Antikörpern aus dem Dotter bereit, das folgende Schritte umfasst:

a) Entfernen der wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula aus dem Dotter von Geflügeleiern unter gleichzeitiger Gewinnung einer mit Wasser mischbaren Fraktion, die die Dotter-Antikörper enthält;
b) Durchleiten der mit Wasser mischbaren Fraktion durch eine stationäre Phase, die eine ausreichende Menge eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absoptionsmittels enthält und die fähig ist, die mit Wasser mischbaren, fetthaltigen Substanzen aufzunehmen, die normalerweise im Dotter vorhanden sind;
c) Eluieren der stationären Phase, um das Eluat zu erhalten; und
d) Gewinnung der Dotter-Antikörper aus dem Eluat von Schritt (c).

Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine reichliche Menge eines ausgewählten Isotyps der Dotter-Antikörper, inbesondere der IgY(ΔFc)-Antikörper, der für verschiedene industrielle Anwendungen verwendet werden kann, in einer sparsamen, effizienten und zeitsparenden Art und Weise hergestellt werden.

Es ist weiterhin Gegenstand der Erfindung, Verwendungsmöglichkeiten des derart hergestellten IgY(ΔFc)-Antikörpers in Klinik und Forschung zur Verfügung zu stellen. Neben der Kosteneffizienz und der einfachen Herstellung hat der erfindungsgemäße IgY(ΔFc)- Antikörper die Vorteile, dass er nicht mit dem Komplementsystem und den rheumatoiden Faktoren in Säuger-Seren reagiert und dass er gegenüber dem IgG von Säugern nur geringe Kreuzreaktivität zeigt, und ist damit für die Verwendung in immunologischen Assays besonders geeignet, bei denen Säuger-Seren beteiligt sind, da es nur zu geringfügigen Beeinträchtigungen kommt. Der Fachmann wird es hoch schätzen, dass der IgY(ΔFc)- Antikörper für die Verwendung in Klinik, Forschung und auf anderen Gebieten als einzelne Reagenz oder als aktiver Bestandteil in einem kommerziellen Kit vorhanden sein kann.

Ein weiterer besonderer Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung eines Reagenz, das einen IgY(ΔFc)-Antikörper umfasst, der nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt und in einem Immunoassay zur Untersuchung eines gewünschten, ätiologischen Agens verwendet wird.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

Die oben genannten sowie weitere Ziele und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden in Verbindung mit der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den begleitenden Abbildungen offensichtlich, wobei:

Fig. 1 eine SDS-PAGE Analyse zeigt, wobei die Rückhaltefähigkeit für Antikörper von vier Absoptionsmitteln verglichen wird: Spur 1, der teilweise aufgereinigte Antikörperextrakt; Spur 2, die Lösung, die durch 0,3% Rauchquarz gelaufen ist; Spur 3, die Lösung, die durch 3% Silicadioxid gelaufen ist; Spur 4, die Lösung, die durch 3% Celitdiatomit gelaufen ist; Spur 5, die Lösung, die durch 3% Celitdiatomit hyflo-Cel gelaufen ist; Spur 6, die Lösung, die durch 5% Celitdiatomit hyflo-Cel gelaufen ist;

Fig. 2 Ergebnisse von Elektrophoresen zeigt, wobei die mit Rauchquarz als Absorptionsmittel gereinigten Dotter-Antikörper auf einem 8% SDS-Polyacryamidgel aufgetrennt wurden: Spur 1, die teilweise gereinigte Antikörperlösung; Spur 2, die Lösung, die durch 2% Rauchquarz gelaufen ist; Spur 3, Eluat vom Rauchquarzpellet; Spur 4, das Antikörper-Produkt, das im ersten Fällungsschritt mit 21% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt wurde; und Spur 5, das Antikörper-Produkt, das im zweiten Fällungsschritt mit 31% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt wurde;

Fig. 3 Ergebnisse von Elektrophoresen zeigt, wobei die mit Celitdiatomit als Absorptionsmittel gereinigten Dotter-Antikörper auf einem 8% SDS-Polyacryamidgel aufgetrennt wurden: Spur 1, die teilweise gereinigte Antikörperlösung; Spur 2, Celitdiatomit- Filtrat; Spur 3, das Antikörper-Produkt, das im ersten Fällungsschritt mit 21% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt wurde; Spur 4, das Antikörper-Produkt, das im zweiten Fällungsschritt mit 31% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt wurde; und Spur 5, das Antikörper- Produkt, das im zweiten Fällungsschritt mit 16% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt wurde; und

Fig. 4 Ergebnisse von Elektrophoresen zeigt, wobei die mit Rauchquarz als Absorptionsmittel gereinigten Dotter-Antikörper auf einem 8% SDS-Polyacryamidgel aufgetrennt wurden: M, Molekulargewichtsmarker; Spur 1, die teilweise gereinigte Antikörperlösung; Spur 2, die Lösung, die durch 0,3% Rauchquarz gelaufen ist; Spur 3, Eluat vom Rauchquarzpellet; Spur 4, das Antikörper-Produkt, das mit 21% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt wurde; und Spur 5, das Antikörper-Produkt, das durch Affinitätschromatographie aufgereinigt wurde.

Die Dotter-Antikörper kommen im Vogel-Serum und den Eiern, die von den Vögeln gelegt werden, im Überfluß vor. Jedoch wird wie oben beschrieben die Anreicherung der Antikörper aus dem Ei aus Kostengründen bevorzugt. Die Legehenne überträgt beide Isotypen, sowohl IgY als auch IgY(ΔFc) vom Serum in den Dotter. Im großen und ganzen enthält jedes Entenei im Dotter etwa 1-4 mg IgY/ml und etwa 3-12 mg IgY(ΔFc)/ml und deshalb wird geschätzt, dass die Antikörper-Gesamtmenge, die in einem Ei enthalten ist, aus 15-80 mg IgY und 45- 240 mg IgY(ΔFc) besteht. Das große Volumen des Dotters, das hergestellt wird, übersteigt wesentlich das Volumen an Serum, das man auf sichere Art und Weise von den Vögeln über einen beliebigen Zeitraum erhalten kann. Außerdem kann die Gewinnung von Dotter- Antikörpern in großem Umfang durchgeführt werden, ohne große Kosten zu verursachen.

In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur effizienten Isolierung von Dotter-Antikörpern bereit gestellt, in welchem die sogenannte "Adsorptionschromatographie" oder "differentielle Aussalzung", die alleine oder in Kombination miteinander als kritische Schritte während der Isolierung agieren.

Der Begriff "Adsorptionschromatographie", wie er hier verwendet wird, richtet das Interesse auf ein Trennverfahren, das die Verwendung einer stationären Phase einschließt, um gezielt die gewünschten Lösungen aus der mobilen Phase aufzunehmen. Nach einem Teilpunkt der vorliegenden Erfindung, agiert ein wasserunlösliches, ungeladenes Absoptionsmittel als aktiver Bestandteil in der stationären Phase und fängt mit Wasser mischbare, fetthaltige Verunreinigungen auf, die normalerweise im Dotter vorhanden sind.

Das absorptionschromatographische Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung folgt bevorzugt nach einem Verfahren der teilweisen Aufreinigung, das durchgeführt wird, um die Mehrheit an wasserunlöslichen Biomolekülen und großen Granula, sowie die Mehrheit an unerwünschten Proteinen aus dem Dotter zu entfernen. In der vorliegenden Erfindung kann jedes herkömmliche Verfahren, das diesen Zweck wirksam erfüllt, verwendet werden. Beispielhaft für so ein Verfahren wird die Verwendung eines wasserhaltigen Puffers oder Wasser eingeschlossen, um die mit Antikörpern angereicherte wässrige Fraktion zu erhalten und zudem die Verwendung von PEG, Dextransulfat, oder Naturgummi, um die unerwünschten Substanzen auszufällen.

In einer bevorzugen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Dotter zuerst vom Eiweiss getrennt und dann mit destilliertem Wasser gewaschen, um so viel Albumin wie möglich zu entfernen. Die den Dotter umgebende Vitellinschicht wird durchstochen und die abgetrennte Dotterfraktion wird mit einer wirksamen Menge an wasserhaltigem Puffer oder Wasser verdünnt, um eine Dotter-Suspension zu erhalten. Der gesammelte Dotter wird vorzugsweise mit einer wässrigen Pufferlösung oder destilliertem Wasser in einem Verhältnis 1 : 2 bis etwa 1 : 40 Volumen% verdünnt, besonders bevorzugt liegt das Verhältnis zwischen 1 : 5 und 1 : 30 Volumen-%. Es wird berichtet, dass der pH-Wert während des Stadiums der teilweisen Aufreinigung ein entscheidender Faktor ist (E. M. Akita und S. Nakai, J. Food Sci. 57 : 629 (1993)). Um am meisten Dotter-Antikörper wiedergewinnen zu können wird der pH- Wert bevorzugt in einem Bereich zwischen pH 5 und pH 7 eingestellt. In diesem Schritt wird eine Temperatur zwischen 0°C und 60°C bevorzugt. Die Dotter-Suspension wird sanft geschüttelt, um eine homogene Mischung zu erhalten, anschließend lässt man sie eine Zeitspanne stehen, die für die Bildung von wässriger und nicht wässriger Fraktion ausreichend ist. Die wasserunlöslichen Bestandteile, einschließlich wasserunlöslicher Biomoleküle, wie beispielsweise Lipoproteine, Phospholipide, Sterole und ähnliches werden dann durch Zentrifugation aus der wässrigen Dotter-Suspension entfernt. Der verbleibende Überstand, der die Antikörper enthält kann dann vom dickflüssigen Präzipitat durch Abschütten, Absaugen oder ähnliche, dem Fachmann bekannte Verfahren abgetrennt werden.

Normalerweise ist der Fettgehalt der mit Wasser mischbaren Fraktion, die damit erhalten wird, noch so hoch, dass es für die Weiterbehandlung ungünstig ist. Um den Großteil, der noch in der mit Wasser mischbaren Fraktion verbliebenen, fetthaltigen Substanzen aufzunehmen wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine stationäre Phase, die ein wasserunlösliches, ungeladenes Absorptionsmittel enthält, in ausreichender Menge mit der mit Wasser mischbaren Fraktion inkubiert. Die passenden Absorptionsmittel sind nicht begrenzt auf, schließen aber folgende ein: Rauchquarz, amorphen Quarz, Silicadioxid, Kieselgel, Silikate, diatomeenhaltige Erde, Fuller's Erde, Talkum, Tonerden, aktivierten Kohlenstoff, Aluminiumoxid, Titanoxid, und andere synthetische oder natürliche Tonarten, die die Fähigkeit besitzen, Fette physikalisch aufzunehmen. Besonders bevorzugte Absorptionsmittel sind Rauchquarz, Silicadioxid und diatomeenhaltige Erde. Der Arbeitsanteil des Absorptionsmittels in der mit Wasser mischbaren Fraktion kann, den chemischen Eigenschaften der gewählten Absorptionsmittel entsprechend, über ein breites Spektrum schwanken. Wird Rauchquarz im vorliegenden Verfahren verwendet, dann wird es, basierend auf dem Volumen der zu behandelnden mit Wasser mischbaren Fraktion, bevorzugt in einer Gewichtskonzentration von genau oder höher als 0,1% zugegeben, wobei noch genauer ein Spektrum zwischen 0,3 und 5,0% Gewichtsanteil bevorzugt wird. Wird Silicadioxid oder diatomeenhaltige Erde als Absorptionsmittel verwendet, dann wird die Absorptionschromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung, basierend auf dem Volumen der zu behandelnden, mit Wasser mischbaren Fraktion, bevorzugt mit einer Gewichtskonzentration höher als 1% durchgeführt, wobei noch genauer ein Spektrum zwischen 3 und 20% Gewichtsanteil bevorzugt wird.

Die Absorptionschromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung kann, solange wie die Menge an fetthaltigen Substanzen, die auf der Oberfläche der Absorptionsmittel zurückbleibt zufriedenstellend ist, nach jeder herkömmlichen Art und Weise ausgeführt werden, wie beispielsweise Behandlung der mit Wasser mischbaren Fraktion mit einem Absorptionsmittel im Batch-Verfahren oder Verwendung einer mit dem Absorptionsmittel bepackten Chromatographiesäule zum Beschicken mit der mit Wasser mischbaren Fraktion. Die Reaktionszeit und -temperatur während der Behandlung sind für das Ergebnis nicht ausschlaggebend, und eine Reaktionstemperatur von 4 bis 30°C und eine Reaktionszeit von 10 bis 60 Minuten sind gewöhnlich ausführbar. Obwohl das Absorptionsverfahren, wenn nötig mehrmals, aber immer mit frischem Absorptionsmittel, wiederholt werden kann, ist eine Behandlung gewöhnlich ausreichend. Wenn man nach dem vorliegenden Verfahren vorgeht, dann können Fette und die meisten nicht fetthaltigen Substanzen erfolgreich in zwei nicht mischbaren Fraktionen aufgetrennt werden.

Abhängig von der Fähigkeit des ausgewählten Absorptionsmittels Immunglobuline einzufangen, können die Dotter-Antikörper entweder aus einem Eluat, das von der stationären Phase heruntergelöst wurde oder aus der "Durchflußlösung" wiedergewonnen werden, wobei der Begriff, wie er hier verwendet wird, die Lösung darstellen soll, die die stationäre Phase durchläuft. Wie in den bevorzugten Ausführungsformen aus dem Text gezeigt, sind die Dotter-Antikörper hauptsächlich in der stationären Phase zu finden, wenn Rauchquarz oder Silicadioxid als Absorptionsmittel verwendet wird, während diatomeenhaltige Erde als Absorptionsmittel mehr als 90% der Antikörper in der Durchflußlösung zurücklässt.

Die Wahl einer bestimmten Methode mit der Dotter-Antikörper eluiert werden, kann vom Fachmann bestimmt werden. Um die Dotter-Antikörper von der stationären Phase abzulösen ohne dabei viel von den fetthaltigen Substanzen mitabzutrennen, kann gewöhnlich eine Elutionslösung verwendet werden, die bei einen pH-Wert - niedriger als pH 4 oder höher als pH 8 - gepuffert ist oder die ein chaotropes Salz enthält, so dass ein Eluat entsteht, das Antikörper enthält. Der Begriff "Eluat", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Lösung, die die gewünschten Substanzen enthält, nachdem diese durch ein Elutionsmittel von der stationären Phase abgetrennt wurden. Der Begriff "chaotropes Agens" oder "Chaotrop" bezieht sich auf eine Chemikalie, die in der Lage ist in einem Protein, wie beispielsweise einem Antikörper, eine Konformationsänderung zu bewirken und die deshalb häufig als proteindenaturierendes Agens bekannt ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung können die meisten der gebundenen Antikörper mit jedem neutralen Puffer, der eine mittlere Konzentration (< 1 M) eines chaotropen Agens enthält, erfolgreich abgelöst werden. Nach der Elution wird in den meisten Fällen durch Entfernen des Chaotrops die native Proteinstruktur wiederhergestellt.

Zu den geeigneten Elutionsmitteln gehören unter anderem 0,1 M Glycin-HCl, pH 2,3; 0,1 M Glycin-HCl, pH 10,0; 6 M Guanidinium-HCl, pH 3,0; 3,0 M Kaliumchlorid; 5 M Kaliumchlorid; 3,5 M Magnesiumchlorid; 1-3 M Ammonium/Natrium/Kaliumthiocyanat und 6 M Harnstoff. Im Hinblick auf die Aktivität der gewonnenen Antikörper ist jedoch ein neutraler, chaotrophaltiger pH-Puffer mittlerer Ionenstärke, wie beispielsweise gepuffertes 3 M Natriumthiocyanat in 20 mM MES-Puffer (pH 5,8) oder 20 mM Tris(hydroxymethyl)- aminomethan (pH 7,5) besser für die Durchführung der Erfindung geeignet. Der aktive Zustand der gewonnenen Antikörper kann einfach wiederhergestellt werden, indem beispielsweise eine ausgedehnte Dialyse gegen einen schwach sauren, nicht chaotrophaltigen Puffer mit niedriger Ionenstärke durchgeführt wird.

Gemäß eines Aspektes der vorliegenden Erfindung können das Eluat oder die Durchflußlösung, die mit den Antikörpern angereichert sind, sofort einem differentiellen Aussalzungsverfahren unterzogen werden, um die Isotypen der Dotter-Antikörper aufzutrennen.

Der Begriff "Aussalzen", wie er hier verwendet wird, behält seine bekannte Bedeutung in der Proteinchemie und bezieht sich auf das Hinzufügen eines nichtdenaturierenden Salzes oder mehrerer Salze zu einer Mischung oder Produktionscharge, um die Löslichkeit der Proteine zu verringern, was zu deren Fällung oder Verklumpung führt. Der Begriff "differentielles Aussalzen" bedeutet, dass zwei oder mehrere Proteine aus einer Mischung, durch Verändern der Konzentration des zugegebenen Salzes oder der Salze, in dem Aussalzungsverfahren unterschiedlich gefällt oder verklumpt werden. In der vorliegenden Erfindung sind die Isotypen der Dotter-Antikörper (i. e. IgY und IgY(ΔFc)) die Proteine, die unterschiedlich gefällt werden sollen. Beispiele für nichtdenaturierende Salze, die zur Fällung von Dotter- Antikörpern verwendet werden können, schließen unter anderem NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, KCl, CaCl₂, und MgSO₄ ein. Na₂SO₄ oder (NH₄)₂SO₄ sind bevorzugte nichtdenaturierende Salze, wobei (NH₄)₂SO₄ am meisten bevorzugt wird. Die Salzkonzentration zur differentiellen Fällung der Isotypen der Dotter-Antikörpern hängt von der Art des Salzes ab und kann von einem Fachmann durch einfache Tests bestimmt werden. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in der (NH₄)₂SO₄ verwendet wird, wird basierend auf dem behandelten Volumen des Eluates oder der Durchflußlösung, zuerst IgY bei einer Salzkonzentration zwischen genau 21% (w/v) und weniger ausgesalzt, während IgY(ΔFc) erst ausfällt, wenn die Salzkonzentration auf bis zu 31% (w/v) erhöht wird. Der Fachman sollte wissen, daß die Abfolge der Fällung der zwei Antikörper-Isotypen abhängig vom gewählten Salz verschieden sein kann. Die gemeinsame Verwendung von zwei oder mehr Salzarten im vorliegenden Verfahren ist ebenso durchführbar, i. e. zuerst Fällung des ersten Isotyps mit einem Salz, gefolgt von einer zweiten Fällung des zweiten Isotyps mit einem anderen Salz. Das differentielle Aussalzungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung vollendet einen Hauptpunkt der vorliegenden Erfindung beispielhaft, i. e.; die wesentliche Abtrennung der gewünschten IgY(ΔFc)-Antikörper aus der gesamten Dotter- Antikörperpopulation, die aus beiden Isotypen - IgY und IgY(ΔFc) - besteht.

Wenn Antikörper mit höherem Reinheitsgrad hergestellt werden sollen, dann können die gefällten Antikörper in einem geeigneten Puffersystem nochmals aufgelöst und einem zusätzlichen Reinigungsverfahren unterzogen werden, wie beispielsweise der Größenausschlußchromatographie, der hyrophoben Wechselwirkungschromatographie, der Ionenaustauschchromatographie und der Immunoaffinitätschromatographie.

Der Begriff "Immunoaffinitätsreinigung" oder "Immunoaffinitätschromatographie", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Art von Auftrennungsverfahren, die auf den Bindungsmerkmalen von Antikörpern an ein bestimmtes Antigen basiert. Das bedeutet, dass die Antikörper, die unter einer bestimmten Bedingung an ein bestimmtes Antigen binden, von den unter dieser Voraussetzung ungebundenen Antikörpern getrennt werden. Die vorliegende Erfindung erwägt, zur Entfernung unwichtiger Proteine, vor allem der nicht antigenbindenden Immunglobuline, die Verwendung einer Immunoaffinitätschromatographie.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Immunoaffinitätsreinigung unter Verwendung einer "Antigen-Matrix" durchgeführt, die ein Antigen umfasst, das auf einem unlöslichen Träger befestigt wird. Die Art des Trägers spielt für die erfindungsgemäße Immunoaffinitätsreinigung keine entscheidende Rolle. Jedes herkömmliche Trägermaterial, das sich für die kovalente Anlagerung eines Antigens eignet und das inert ist, gegenüber der Wechselwirkung zwischen dem gewünschten Antikörper und dem darauf befestigten Antigen, kann verwendet werden. Normalerweise besteht der Träger aus quervernetzter Agarose oder quervernetztem Dextran, wie beispielsweise CNBr-aktivierter Sepharose 4B, die von Pharmacia vertrieben wird.

Die durch die differentielle Aussalzung gereinigten Antikörper werden in einem "Bindungspuffer" gelöst und auf die Antigen-Matrix aufgebracht, so dass die Immunkomplexe zwischen dem befestigten Antigen und den Dotter-Antikörpern gebildet werden. Jegliches Puffersystem, das gegenüber der Antigen-Antikörper-Wechselwirkung inert bleibt und das in der Lage ist, die gewünschten Bedingungen für die Bindung aufrechtzuhalten, ist für die vorliegende Erfindung geeignet. Vorzugsweise wird der Bindungspuffer aus einer Gruppe ausgewählt, die sich aus einem Phosphatpuffer, einem MES (2-[N-Morpholino]Ethan-Sulfonsäure)-Puffer und einem bis-Tris-Puffer zusammensetzt, wobei der MES-Puffer in einer Konzentration von 20 mM am meisten bevorzugt wird.

Die Immunoaffinitätsreinigung wird bevorzugt in einer schwach sauren Umgebung mit niedriger Ionenstärke durchgeführt, i. e., bei einem pH-Wert zwischen pH 4 und pH 7 und einer Ionenstärke unter 50 mM. Man lässt die Antikörper mit dem befestigten Antigen noch besser bei einem pH-Wert zwischen pH 5 und pH 6, am besten zwischen pH 5,6 und pH 5,8 interagieren. Die Dotter-Antikörper können von der Antigenmatrix mit Hilfe eines chaotropen Salzes oder bei einem pH-Wert - niedriger als pH 4 oder höher als pH 8 - abgelöst werden. Die Aktivität der gesammelten Antikörper kann, durch beispielsweise eine ausgedehnte Dialyse gegen einen schwach sauren Puffer mit niedriger Ionenstärke, der kein Chaotrop enthält, wiederhergestellt werden. Der gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellte IgY(ΔFc)-Antikörper aktiviert weder das Komplementsystem, noch bindet er an den rheumatoiden Faktor in Säuger-Seren. Die immunologische Kreuzreaktivität zwischen IgY(ΔFc) und dem IgG von Säugern ist nicht stark ausgeprägt. Daher stellt die Erfindung ebenso eine neue Art von Antikörper bereit, der für die Verwendung in Klinik und Forschung geeignet ist.

Die Erfindung bietet außerdem eine große Vielzahl an Verwendungsmöglichkeiten des erfindungsgemäß hergestellten IgY(ΔFc)-Antikörpers in Klinik und Forschung.

So bietet die vorliegende Erfindung beispielsweise ein Verfahren zur Immunisierung von kranken Tieren (einschließlich Geflügel, Nutzvieh und Haustieren) oder Menschen, indem dem Patienten eine therapeutische Menge des erfindungsgemäßen IgY(ΔFc)-Antikörpers verabreicht wird, um ihn vor verschiedenen ätiologischen Agenzien, einschließlich Mikroorganismen wie Bakterien, nativen, rekombinanten oder peptidsynthetischen Viren, Pilzen, Protozoen, Nematoden und ähnlichem, und proteinhaltigen und nicht proteinhaltigen Substanzen wie Allergenen, Toxinen, tierischen Giften, Hormonen, oder allen anderen Immunogenen zu schützen, die in der Lage sind eine Immunantwort auszulösen. Vorzugsweise wird der gereinigte IgY(ΔFc)-Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger wie Wasser, Salzlösung und ähnlichem verabreicht.

Der erfindungsgemäße IgY(ΔFc)-Antikörper kann außerdem zum Nachweis eines interessierenden, ätiologischen Agens verwendet werden, was beispielsweise pathogene oder nichtpathogene Organismen wie Escherichia coli, Salmonella enterinitis, und andere bakterielle Organismen; native, rekombinante oder peptidsynthetische Hormone wie Östrogen, Progesteron, Thyroxin und ähnliches; einen Haupthistokompatibilitätskomplex und ähnliches; einen nativen, rekombinanten oder peptidsynthetischen Tumormarker wie alpha- Fetoprotein, ein prostataspezifisches Antigen und ähnliches; einen Krankheitsstadiummarker wie C-reaktives Protein, Ferritin und ähnliches einschließt, und in einer Körperprobe wie Flüssigkeiten, Gewebe, Zellextrakt und ähnlichem, die vom Menschen oder von Tieren stammen kann, stattfinden kann. Bei Verwendung des erfindungsgemäß erhaltenen IgY(ΔFc)- Antikörpers kann ein interessantes, ätiologisches Agens, quantitativ und qualitativ, mit Hilfe jeglichem herkömmlichen, dem Fachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise dem Ouchterlony-Verfahren (MO), der Einzelradialimmunodiffusion (SRID), der Immunoelektro phorese (IEP), dem Radioimmunoassay (RIA), dem enzymgekoppelten Immuntest (ELISA), dem Western Blot (WB), dem turbidimetrischen Immunoassay (TIA) oder dem partikelverstärkten immunoturbidimetrischen Assay, einem enzymatischen Immunoassay, einem nephelometrischen Immunoassay, einem chemilumineszenten Immunoassay, einem Immuno-Gold-Assay oder einem immunochromatographischen Assay, nachgewiesen werden.

Der IgY(ΔFc)-Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch an den Gebrauch in Biochips und Biosensoren angepasst.

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung lediglich erläutern und nicht deren Umfang einschränken.

Beispiel 1 Immunisierungsverfahren zur Stimmulierung einer spezifischen Antikörperherstellung

Zwölf 16 Wochen alte Hausenten (Anas platyrhynchos var, domestica) wurden zur Antikörper- und Eiproduktion einzeln gehalten. Den Enten wurde eine erste, subkutane Injektion mit 1-5 mg/ml des menschlichen C-reaktiven Proteins (CRP; gereinigt von menschlichem Aszites) verabreicht, das in Phosphatpuffer, pH 7,5 mit gleichem Volumen an komplettem Freund'schen Adjuvans emulgiert war. Die Konzentration des Antigens lag im allgemeinen im Bereich von 1 bis 5 mg/ml. Nach der ersten Injektion bekamen die jungen Entenweibchen alle zwei Wochen drei weitere Injektionen von 1-5 mg des Antigens. Eine Woche später wurden die Eier gesammelt, markiert und bei 4°C gelagert, bis sie zur Extraktion und Reinigung der Antikörper weiterverarbeitet wurden. Die Nachimpfungen wurden während des Experiments alle vier Wochen durchgeführt. Am siebten Tag nach jeder Auffrischungsimpfung wurden Blutproben genommen. Jede Blutprobe wurde zentrifugiert und das daraus entstandene Serum gesammelt.

Beispiel 2 Extraktion der Antikörper aus Entendotter

Die gesammelten Dotter, die von den Eiern der hyperimmunisierten Enten aus Beispiel 1 stammen, wurden sorgfältig mit einem schwachen Strahl destilliertem Wasser gewaschen, um das Albumin zu entfernen. Das Dottervolumen wurde gemessen und dann wurde der Dotter sorgfältig mit der zehnfachen Menge destilliertem Wasser gemischt. Die Mischung wurde dann für mindestens zwei Stunden unter 4°C gehalten und dann mit 10,000 rpm in einer Hitachi CR22F Zentrifuge eine Stunde lang zentrifugiert. In den Zentrifugengefässen entstand eine helle Überstandsschicht und eine halbfeste, geschmeidige Schicht.

Beispiel 3 Behandlung mit Absorptionsmittel

Zum Rohextrakt aus Beispiel 1 fügt man eines der folgenden Absorptionsmittel hinzu: 2% (w/v) Rauchquarz (erhältlich von Sigma), 3% (w/v) Silicadioxid (Sigma), 3% (w/v) Celitdiatomit (erhältlich von Celite Corporation), und 3 oder 5% (w/v) Celitdiatomit hyflo- Cel (Celite Corporation). Die erhaltene Suspension wurde unter leichtem Rühren für 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach Ende der Inkubationszeit wurden die Absorptionsmittel bei 4°C und 20,000 rpm in einer Hitachi CR22F Zentrifuge abgetrennt, und die Überstände und die Pellets getrennt geerntet. 10 µl Proben aus jedem Überstand wurden einer nichtreduzierenden Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen.

Wie auf Fig. 1 zu sehen, hat Rauchquarz im quantitativen Bereich, bezogen auf die Menge der an das Absorptionmittel gebundenen Antikörper, die beste Adsorptionsaktivität, so dass nahezu kein einziger Antikörper in der Durchflußlösung zurückgelassen wurde. Silicadioxid zeigt eine etwas geringere Affinität gegenüber Immunglobulinen, was möglicherweise auf die geringere Porösität (und daher eine kleinere Oberfläche) im Vergleich mit Rauchquarz zurück zuführen ist. Im Gegensatz dazu wurden von jeglicher Art diatomaeenhaltiger Erde, weniger als 10% der Dotter-Antikörper eingefangen.

Beispiel 4 Differentielle Aussalzung der Dotter-Antikörper

Das Pellet aus Rauchquarz, das in Beispiel 3 erhalten wurde, wurde mit 2,5 M Natriumthiocyanat (pH 7,5) behandelt, um die gebundenen Antikörper herunterzulösen. Das verbleibende Eluat wurde zuerst mit Ammoniumsulfat in einer Konzentration von etwa 21% (w/v) bezogen auf das Volumen des Eluates gefällt, danach in einer zweiten Fällung durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Konzentration von etwa 31% (w/v). Die gefällten Antikörper wurden in phosphatgepufferter Saline (PBS) gelöst. Eine analytische SDS-PAGE wurde auf einem 8%igen nichtreduzierenden Acrylamidgel gemacht, wobei 2237 µg des Rohextraktes von Beispiel 2 (Spur 1); 10 µl der Durchflußlösung, die in Beispiel 3 geerntet wurde (Spur 2); 1122,25 µg des Eluates vom Rauchquarzpellet (Spur 3); und 153 µg und 372,85 µg des Antikörperproduktes, das nach erstem und zweitem Fällungsschritt erhalten wurde (Spur 4 und Spur 5 jeweils); aufgetragen wurden. Das Ergebnis ist in Fig. 2 gezeigt. Die Ausbeute in Prozent und der Reinheitsgrad wurden mittels densitometrischer Analyse des Gels festgestellt und in Tabelle 1 zusammengefasst.

Tabelle 1

Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, werden die erzeugten IgY(ΔFc) Antikörper mit einer Ausbeute von etwa 76% (72,05 mg/119,86 mg × 100%) und einem Reinheitsgrad von mehr als 96% gewonnen. Noch wichtiger ist, dass das vorliegende Reinigungverfahren vorteilhafterweise zur wesentlichen Abtrennung des gewünschten IgY(ΔFc)-Antikörpers aus der Gesamtpopulation der Dotter-Antikörper führt, die hauptsächlich aus sowohl IgY als auch IgY(ΔFc) besteht.

Beispiel 5 Immunoaffinitätsreinigung von Dotter-Antikörpern

Der Rohextrakt aus Beispiel 2 wurde, um sich die Fähigkeit diatomaeenhaltiger Erde, Fette zurückzuhalten und Antikörper abzustossen, zu Nutze zu machen, auf eine Filtrierungssäule aufgebracht, die zu 10% Gewichtsanteilen bezogen auf das zugegebene Volumen des Extraktes, mit Celitdiatomit bepackt war. Die Lösung, die durch die Säule floss wurde geerntet und einer ersten Fällung mit 21% (w/V) Ammoniumsulfat bezogen auf das Volumen der Durchflusslösung unterzogen. Die gefällten Antikörper wurden gesammelt und der Überstand in zwei Teile aufgeteilt. Die eine Hälfte des Überstands wurde mit Ammoniumsulfat in einer Konzentration von etwa 31% (w/v) gefällt, während die andere Hälfte mit 16% (w/v) Natriumsulfat gefällt wurde. Die gefällten Antikörperprodukte wurden in PBS aufgenommen. Eine analytische SDS-PAGE wurde auf einem 8%igen nichtreduzierenden Acryamidgel durchgeführt, wobei 2012,5 µg des Rohextraktes aus Beispiel 2 (Spur 1); 1678 µg der Durchflusslösung, die nach der Celitdiatomitfiltrierung erhalten wurde (Spur 2); 94,9 µg des Eluates, das im ersten Fällungsschritt erhalten wurde (Spur 3); und jeweils 169,65 µg und 357,75 µg der Antikörperprodukte, die im zweiten Fällungsschritt mit 31% Ammoniumsulfat und 16% Natriumsulfat erhalten wurden (Spur 4- 5) aufgetragen wurden. Das Ergebnis ist in Fig. 3 dargestellt. Die Ausbeute in Prozent und der Reinheitsgrad wurden mittels densitometrischer Analyse des Gels festgestellt und in Tabelle 2 zusammengefasst.

Tabelle 2

Wie in Tabelle 2 dargestellt, werden die verbleibenden IgY(ΔFc)-Antikörper mit hohen Ausbeuten und einem Reinheitsgrad von etwa 77% (wenn Natriumsulfat im zweiten Fällungsschritt verwendet wurde) und 69% (wenn Ammoniumsulfat im zweiten Fällungsschritt verwendet wurde) jeweils wiedergewonnen.

Beispiel 6 Immunoaffinitätsreinigung von Dotter-Antikörpern

Es wurde eine Lösung des C-reaktiven Proteins (CRP) in 0,1 M Carbonatpuffer mit pH 8,5 in einer Konzentration von 5 mg/ml hergestellt. CNBr-aktivierte Sepharose 4B von Pharmacia wurde zuerst mit der zehnfachen Menge des Matrixvolumens einer 1 mM kalten Salzsäure gewaschen und dann mit der zweifachen Menge des Matrixvolumens der CRP-Lösung über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Antigenmatrix wurde für zwei Stunden bei 4°C in einer Lösung von 0,5 M Ethanolamin in 20 mM Tris-HCl (pH 8,5) im Verhältnis 1 : 1 (v/v) resuspendiert, um die verbleibenden Stellen zu blockieren, die mit Proteinen reagieren können. Die Antigenmatrix wurde dann mit PBS gewaschen, das 0,02% Natriumazid enthielt und bei 4°C aufbewahrt.

Die Entenantikörper aus Beispiel 4, die mit 21% (w/v) Ammoniumsulfat gefällt wurden und die nach vorhergehender Beschreibung hergestellte Antigenmatrix wurden verwendet. 1 ml der Antigenmatrix wurde auf eine herkömmliche Säule gegeben und mit 20 mM MES (2-[N- Morpholino]Ethan-Sulfonsäure)-Puffer (pH 5,8) durchtränkt. Die Antigenmatrix liess man mit 0,25 ml der Antikörper, die im gleichen Bindepuffer vorlagen, reagieren. Die Antigenmatrix wurde solange mit Bindepuffer gewaschen bis das Abwasser im wesentlichen proteinfrei war. Die gebundenen Antikörper wurden sofort mit 6 M Guanidinium-HCl abgelöst, und nach der abgeschlossenen Elution wurde ihre optische Dichte bei 280 nm gemessen. Die SDS-PAGE-Analyse, die in Fig. 4 gezeigt wird, zeigt, dass die affinitäts gereinigten Antikörper hauptsächlich aus dem IgY(ΔFc)-Antikörper bestehen, der durch eine Einzelbande auf dem Gel dargestellt wird.

Alle in der vorliegenden Beschreibung zitierten Patente und Literaturstellen sind hiermit durch ihre Referenz in ihrer Gesamtheit miteinbezogen. Im Falle von Widersprüchen ist die vorliegende Beschreibung, einschließlich der Begriffserklärungen, maßgebend.

Obwohl die Erfindung in Bezug auf die vorhergehenden, spezifischen Ausführungsformen beschrieben wurde, sollte angemerkt werden, dass möglicherweise verschiedene für den Fachmann offensichtliche Modifikationen und Änderungen gemacht werden können, ohne dass dabei vom Sinn und Umfang der Erfindung abgewichen wird.

Claims

1. Verfahren zur selektiven Isolierung von Antikörper-Isotypen aus dem Dotter, das folgende Schritte umfasst:

a) Gewinnung einer wässrigen Dotter-Fraktion aus einem Geflügelei;
b) Gewinnung eines Hauptanteils eines ersten Antikörper-Isotyps aus der wässrigen Fraktion von Schritt (i) durch Aussalzen der wässrigen Fraktion mit einem ersten nichtdenaturierenden Salz einer ersten Konzentration; und
c) Aussalzen des Hauptanteils eines zweiten Antikörper-Isotyps aus der übriggebliebenen wässigen Fraktion von Schritt (ii) durch Anpassen der übriggebliebenen wässigen Fraktion von Schritt (ii) mit einem zweiten nichtdenaturierenden Salz einer zweiten Konzentration;

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste und das zweite nichtdenaturierende Salz unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, KCl, CaCl₂, und MgSO₄ gewählt wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Konzentration höher ist als die erste, wenn erstes und zweites Salz dasselbe ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei gilt, wenn (NH₄)₂SO₄ als einziges nichtdenaturierendes Salz verwendet wird, dann soll basierend auf dem Volumen der wässrigen Fraktion aus Schritt (i) und der verbleibenden wässrigen Fraktion aus Schritt (ii), die erste Konzentration nicht höher sein als etwa 21% (w/v) und die zweite Konzentration etwa 31% (w/v) ausmachen.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenn (NH₄)₂SO₄ als erstes nichtdenaturierendes Salz verwendet wird, die erste Konzentration basierend auf dem Volumen der wässrigen Fraktion aus Schritt (ii) nicht höher ist als etwa 21% (w/v) und die zweite Konzentration, basierend auf dem Volumen der wassrigen Fraktion aus Schritt (iii), erreicht wird durch Zugabe von etwa 16% (w/v) Na₂SO₄ als zweites nichtdenaturierendes Salz.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Antikörper-Isotyp IgY und der zweite Isotyp IgY(ΔFc) ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Fraktion aus Schritt (i) durch eine Vorbehandlung gewonnen wird, die folgende Schritte einschliesst:

a) Entfernen der wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula aus dem Dotter eines Geflügeleies unter gleichzeitiger Gewinnung einer mit Wasser mischbaren Fraktion, die die Dotter-Antikörper enthält;
b) Einleiten der mit Wasser mischbaren Fraktion in eine stationäre Phase, die eine ausreichende Menge eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absorptionsmittels enthält, das in der Lage ist, die mit Wasser mischbaren, fetthaltigen Substanzen aufzunehmen, die normalerweise im Dotter vorhanden sind; und
c) Gebrauchsfertiges Sammeln der wässrigen Fraktion, als der Lösung, die durch die stationäre Phase gelaufen ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei der entfernende Schritt (a) das Verdünnen des Dotters mit einer ausreichenden Menge eines Verdünnungsmittels einschliesst, das aus einer Gruppe ausgewählt wurde, die aus einer wässrigen Pufferlösung und Wasser besteht und außerdem das gleich im Anschluss mit dem erhaltenen verdünnten Dotter durchgeführte Auftrennungsverfahren, wobei auch die wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula abgetrennt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die ausreichende Menge des Verdünnungsmittels im Verhältnis 1 Volumenteil des Dotters zu 5 bis etwa 30 Volumenteilen des Verdünnungsmittels beträgt.

10. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Absorbtionsmittel aus einer Gruppe ausgewählt wird, die Rauchquarz, Silicadioxid und diatomeenhaltige Erde umfasst.

11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei zusätzlich ein Schritt zur Elution der wässrigen Fraktion enthalten ist, um ein Eluat zu erhalten, das als wässrige Fraktion zu gebrauchen ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Eluat von der stationären Phase durch ein chaotropes Salz abgelöst wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das chaotrope Salz aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus 4 M Guanidinium-HCl und 1-3 M Natriumthiocyanat besteht.

14. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Eluat aus der stationären Phase bei einem pH- Wert abgelöst wird, der niedriger als pH 4 oder höher als pH 8 ist.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dem ein oder mehrere Aufreinigungsverfahren folgen, die aus der Gruppe bestehend aus Grössenausschlusschromatographie, hydrophober Wechsel wirkungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Immunoaffinitätschromato graphie ausgewählt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Aufreinigungsverfahren die Immunoaffinitätschromatographie ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Immunoaffinitätschromatographie bei einem pH- Wert zwischen pH 4 und pH 7 und bei einer Ionenstärke unter 50 mM durchgeführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Immunoaffinitätschromatographie bei einem pH- Wert zwischen pH 5,6 und pH 5,8 durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Dotter von einem Geflügelei stammt, das von einer Legehenne stammt, die mit einem ausgewählten Antigen immunisiert worden war.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Legehenne ein Entenvogel ist.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Legehenne eine Ente ist.

22. Verfahren zur Isolierung von Dotter-Antikörpern aus dem Dotter, das folgende Schritte umfasst:

a) Entfernen der wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula aus dem Dotter eines Geflügeleies unter gleichzeitiger Gewinnung einer mit Wasser mischbaren Fraktion, die die Dotter-Antikörper enthält;
b) Einleiten der mit Wasser mischbaren Fraktion in eine stationäre Phase, die eine ausreichende Menge eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absorptionsmittels enthält, das in der Lage ist, die mit Wasser mischbaren, fetthaltigen Substanzen aufzunehmen, die normalerweise im Dotter vorhanden sind; und
c) Sammeln der Lösung, die durch die stationäre Phase gelaufen ist, und
d) Gewinnung der Dotter-Antikörper aus der Durchflusslösung von Schritt (c).

23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei der entfernende Schritt (a) das Verdünnen des Dotters mit einer ausreichenden Menge eines Verdünnungsmittels einschliesst, das aus einer Gruppe ausgewählt wurde, die aus einer wässrigen Pufferlösung und Wasser besteht und außerdem das gleich im Anschluss mit dem erhaltenen verdünnten Dotter durchgeführte Auftrennungsverfahren, wobei auch die wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula abgetrennt werden.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die ausreichende Menge des Verdünnungsmittels im Verhältnis 1 Volumenteil des Dotters zu 5 bis etwa 30 Volumenteilen des Verdünnungsmittels beträgt.

25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Absorbtionsmittel diatomeenhaltige Erde ist.

26. Verfahren nach Anspruch 22, wobei Schritt (d) die folgenden Unterschritte enthält:

a) Gewinnung eines Hauptanteils eines ersten Antikörper-Isotyps aus der Durchflusslösung aus Schritt (c) durch Aussalzen der Durchflusslösung aus Schritt (c) mit einem ersten nichtdenaturierenden Salz einer ersten Konzentration; und
b) Aussalzen des Hauptanteils eines zweiten Antikörper-Isotyps aus dem übriggebliebenen Produkt von Schritt (i) durch Anpassen des übriggebliebenen Produktes von Schritt (i) mit einem zweiten nichtdenaturierenden Salz einer zweiten Konzentration;

27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das erste und das zweite nichtdenaturierende Salz unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, KCl, CaCl₂, und MgSO₄ gewählt wurde.

28. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die zweite Konzentration höher ist als die erste, wenn erstes und zweites Salz dasselbe ist.

29. Verfahren nach Anspruch 26, wobei gilt, wenn (NH₄)₂SO₄ als einziges nichtdenaturierendes Salz verwendet wird, dann soll basierend auf dem Volumen der Durchflusslösung aus Schritt (i) und dem verbleibenden Produkt aus Schritt (ii), die erste Konzentration nicht höher sein als etwa 21% (w/v) und die zweite Konzentration etwa 31% (w/v) ausmachen.

30. Verfahren nach Anspruch 28, wobei wenn (NH₄)₂SO₄ als erstes nichtdenaturierendes Satz verwendet wird, die erste Konzentration basierend auf dem Volumen der Durchflusslösung aus Schritt (ii) nicht höher ist als etwa 21% (w/v) und die zweite Konzentration, basierend auf dem Volumen des verbleibenden Produktes aus Schritt (iii), erreicht wird durch Zugabe von etwa 16% (w/v) Na₂SO₄ als zweites nichtdenaturierendes Salz.

31. Verfahren nach Anspruch 26, wobei der erste Antikörper-Isotyp IgY und der zweite Isotyp IgY(ΔFc) ist.

32. Verfahren nach Anspruch 22, dem ein oder mehrere Aufreinigungsverfahren folgen, die aus der Gruppe bestehend aus Grössenausschlusschromatographie, hydrophober Wechsel wirkungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Immunoaffinitätschromato graphie ausgewählt werden.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei mindestens ein Aufreinigungsverfahren die Immunoaffinitätschromatographie ist.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die Immunoaffinitätschromatographie bei einem pH- Wert zwischen pH 4 und pH 7 und bei einer Ionenstärke unter 50 mM durchgeführt wird.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Immunoaffinitätschromatographie bei einem pH- Wert zwischen pH 5,6 und pH 5,8 durchgeführt wird.

36. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Legehenne ein Entenvogel ist.

37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Legehenne eine Ente ist.

38. Verfahren zur Isolierung von Dotter-Antikörpern aus dem Dotter, das folgende Schritte umfasst:

a) Entfernen der wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula aus dem Dotter eines Geflügeleies unter gleichzeitiger Gewinnung einer mit Wasser mischbaren Fraktion, die die Dotter-Antikörper enthält;
b) Einleiten der mit Wasser mischbaren Fraktion in eine stationäre Phase, die eine ausreichende Menge eines wasserunlöslichen, ungeladenen Absorptionsmittels enthält, das in der Lage ist, die mit Wasser mischbaren, fetthaltigen Substanzen aufzunehmen, die normalerweise im Dotter vorhanden sind; und
c) Eluieren der stationären Phase, um ein Eluat zu bekommen
d) Gewinnung der Dotter-Antikörper aus dem Eluat von Schritt (c).

39. Verfahren nach Anspruch 38, wobei der entfernende Schritt (a) das Verdünnen des Dotters mit einer ausreichenden Menge eines Verdünnungsmittels einschliesst, das aus einer Gruppe ausgewählt wurde, die aus einer wässrigen Pufferlösung und Wasser besteht und außerdem das gleich im Anschluss mit dem erhaltenen verdünnten Dotter durchgeführte Auftrennungsverfahren, wobei auch die wasserunlöslichen Biomoleküle und Granula abgetrennt werden.

40. Verfahren nach Anspruch 39, wobei die ausreichende Menge des Verdünnungsmittels im Verhältnis 1 Volumenteil des Dotters zu 5 bis etwa 30 Volumenteilen des Verdünnungsmittels beträgt.

41. Verfahren nach Anspruch 38, wobei das Absorbtionsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Rauchquarz und Silicadioxid ausgewählt wurde.

42. Verfahren nach Anspruch 41, wobei bei Schritt (c) die Antikörper von der stationären Phase durch ein chaotropes Salz oder bei einem pH-Wert abgelöst werden, der niedriger als pH 4 oder höher als pH 8 ist.

43. Verfahren nach Anspruch 42, wobei das chaotrope Salz aus einer Gruppe ausgewählt wird, die aus 4 M Guanidinium-HCl und 1-3 M Natriumthiocyanat besteht.

44. Verfahren nach Anspruch 38, wobei Schritt (c) die folgenden Unterschritte enthält:

a) Gewinnung eines Hauptanteils eines ersten Antikörper-Isotyps aus dem Eluat aus Schritt (c) durch Aussalzen des Eluats aus Schritt (c) mit einem ersten nichtdenaturierenden Salz einer ersten Konzentration; und
b) Aussalzen des Hauptanteils eines zweiten Antikörper-Isotyps aus dem übriggebliebenen Produkt von Schritt (i) durch Anpassen des übriggebliebenen Produktes von Schritt (i) mit einem zweiten nichtdenaturierenden Salz einer zweiten Konzentration;

45. Verfahren nach Anspruch 44, wobei das erste und das zweite nichtdenaturierende Salz unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus NaCl, Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄, KCl, CaCl₂, und MgSO₄ gewählt wurde.

46. Verfahren nach Anspruch 44, wobei die zweite Konzentration höher ist als die erste, wenn erstes und zweites Salz dasselbe ist.

47. Verfahren nach Anspruch 44, wobei gilt, wenn (NH₄)₂SO₄ als einziges nichtdenaturierendes Salz verwendet wird, dann soll basierend auf dem Volumen des Eluates aus Schritt (i) und des verbleibenden Produktes aus Schritt (ii), die erste Konzentration nicht höher sein als etwa 21% (w/v) und die zweite Konzentration etwa 31% (w/v) ausmachen.

48. Verfahren nach Anspruch 44, wobei wenn (NH₄)₂SO₄ als erstes nichtdenaturierendes Salz verwendet wird, die erste Konzentration basierend auf dem Volumen des Eluates aus Schritt (i) nicht höher ist als etwa 21% (w/v) und die zweite Konzentration, basierend auf dem Volumen des Produktes aus Schritt (ii), erreicht wird durch Zugabe von etwa 16% (w/v) Na₂SO₄ als zweites nichtdenaturierendes Salz.

49. Verfahren nach Anspruch 44, wobei der erste Antikörper-Isotyp IgY und der zweite Isotyp IgY(ΔFc) ist.

50. Verfahren nach Anspruch 38, dem mindestens ein Aufreinigungsverfahren folgt, das aus der Gruppe bestehend aus Grössenausschlusschromatographie, hydrophober Wechsel wirkungschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Immunoaffinitätschromato graphie ausgewählt wurde.

51. Verfahren nach Anspruch 50, wobei mindestens ein Aufreinigungsverfahren die Immunoaffinitätschromatographie ist.

52. Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Immunoaffinitätschromatographie bei einem pH- Wert zwischen pH 4 und pH 7 und bei einer Ionenstärke unter 50 mM durchgeführt wird.

53. Verfahren nach Anspruch 52, wobei die Immunoaffinitätschromatographie bei einem pH- Wert zwischen pH 5,6 und pH 5,8 durchgeführt wird.

54. Verfahren nach Anspruch 38, wobei die Legehenne ein Entenvogel ist, der mit einem ausgewählten Antigen immunisiert worden ist.

55. Verfahren nach Anspruch 54, wobei die Legehenne eine Ente ist.

56. Ein IgY(ΔFc)-Antikörper, der im wesentlichen frei von einer Fc-ähnlichen Region ist, und der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1-55 hergestellt ist.

57. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Antikörper enthält, der durch ein Verfahren nach den Ansprüchen 1-55 hergestellt wurde und an eine pharmazeutisch verträgliche Trägermatrix gebunden ist.

58. Ein Verfahren zur Immunisierung einer Person, das die Verabreichung einer Zusammensetzung nach Anspruch 57 an die Person beinhaltet.

59. Kit für einen Immunoassay, der den Antikörper aus Anspruch 56 enthält.

60. Kit aus Anspruch 59, wobei der Immunoassay aus einer Gruppe bestehend aus einem enzymatischen Immunoassay, einem turbidimetrischen Immunoassay, einem partikel verstärkten immunoturbidimetrischen Assay, einem Einzelradialimmunodiffusionsassay, einem Radioimmunoassay, einem nephelometrischen Immunoassay, einem chemilumineszenten Immunoassay, einem Immuno-Gold-Assay, einem immunochromatographischen Assay, einem Western Blot Assay und einem Ouchterlony-Verfahren, ausgewählt wurde.