DE3485994T2

DE3485994T2 - Herstellung und kennzeichnen von hybridoma antikoerpern spezifisch gerichtet gegen gemeinsame determinanten zwischen naheliegenden aber unterschiedlichen proteinen.

Info

Publication number: DE3485994T2
Application number: DE8484901131T
Authority: DE
Inventors: Frimann Berg
Original assignee: Cytoclonal Pharmaceutics Inc
Current assignee: Exegenics Inc
Priority date: 1983-02-04
Filing date: 1984-02-03
Publication date: 1993-06-09
Anticipated expiration: 2004-02-04
Also published as: DE3485994D1

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft die Beschreibung, Herstellung und Charakterisierung neuer spezifischer hybridomaler/monoklonaler Antikörper, die gemeinsame antigene Determinanten unter den nahe verwandten Proteinen erkennen, die dem HuIFN-α-System angehören, unabhängig davon, ob sie nativ (in vivo oder in vitro) oder mittels rekombinanter DNA-Techniken (Gentechnik) oder mittels Peptidsynthese hergestellt sind.

Stand der Technik

Interferone sind heute allgemein als eine wichtige Gruppe biologischer Proteine bekannt, die Zellen oder ganze Organismen gegenüber einem Angriff von Viren Resistenz verleihen (die sogenannte antivirale Aktivität, vgl. Stewart (1980)). Ferner spielen Interferone eine bedeutsame Rolle bei der Regulation des Immunsystems in vivo und in vitro, zusammen mit zahlreichen anderen sogenannten nicht-viralen Aktivitäten, wie Retransformation transformierter Zellen, Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen, etc., vgl. beispielsweise Vilceck et al. (1980). Aus diesen Gründen ist das Interferonsystem während des letzten Jahrzehnts intensiv untersucht und zahlreiche Befunde berichtet worden (vgl. Stewart (1980), Berg (1982)).
Einige der größten, während des Beginns der Interferonforschung beobachteten Schwierigkeiten waren die bei der Aufreinigung und Charakterisierung der Interferonproteine aufgetauchten Schwierigkeiten. Es wurde davon ausgegangen, daß in dem humanen System lediglich eine Proteinspezies existiert, es wurde jedoch später von verschiedenen Forschern, z. B. Berg et al. (1975), Stewart (1980), Berg (1982), gezeigt, daß in dem humanen System tatsächlich drei Haupttypen des Interferons existieren: humanes Leukozyten-Interferon (HuIFN-α), humanes Fibroblasten-Interferon (HuIFN-β) und humanes Immun-Interferon (HuIFN-γ).
HuIFN-α ist nunmehr vollständig gereinigt worden. Ursprünglich ging man davon aus, daß es lediglich aus einer einzigen Einheit besteht, aber im Zuge der fortschreitenden Aufreinigung hat sich später gezeigt, daß HuIFN-α aus mindestens 6-7 verschiedenen Interferon-Proteinspezies besteht, und es wurde letztlich gezeigt, daß mindestens 13 Spezies existieren (Berg et al. (1980), (1982a, b). Diese Spezies wurden gleichzeitig gereinigt, indem traditionelle Techniken (wie Gelfiltration und dergleichen) mit Antikörper-Affinitätschromatographie unter Verwendung von Antikörpern aus Kaninchen kombiniert wurden. Die reine Spezies wurde anschließend wiederum als Immunogen eingesetzt, wobei "monospezifische" Kaninchen-Antikörper gegen die Interferonproteine durch Einsatz lediglich einer einzigen Interferonspezies (z. B. 20 000 Spezies) als Immunogen produziert wurden. Damit waren die monospezifischen, polyklonalen Kaninchen-Antikörper in der Lage, sämtliche Spezies des huIFN-α gleichzeitig zu reinigen, wenn sie in einer Antikörper-Affinitätssäule eingesetzt wurden. Diesem Ansatz wurde von anderen gefolgt, die Immunglobuline einsetzten, welche von Hybridomzellen produziert worden waren (z. B. Secher et al. (1980)). Dieses Verfahren wies jedoch einen schwerwiegen den Nachteil auf: lediglich ein Teil der Interferonproteine wurde an die Hybridomsäule gebunden (vgl. Berg et al (1982, b)). Gewöhnlich wurde eine Hälfte der Interferon-Aktivität in der Waschlösung gefunden, während die andere Hälfte an die Säule gebunden war (und in spezifischer Weise eluiert werden konnte). Es bestand daher - zumindest was die Messungen mit Hilfe des Maus-Hybridom-Systems betrifft - im allgemeinen die Vorstellung, daß HuIFN-α keine gemeinsame antigene Determinante enthalten könnte.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wendet sich diesem Problem zu. Es wird im folgenden dargelegt, daß es nunmehr tatsächlich möglich ist, von Hybridomzellen produzierte Antikörper (Immunglobuline) zu gewinnen, die für mindestens eine antigene Determinante spezifisch sind, welche den 12 Spezies des humanen Interferon-α gemeinsam sind, welche in dem humanen System Aktivität zeigen und Molekulargewichte von mindestens 16 000 im SDS-PAGE besitzen, wobei eine Spezies mit einem Molekulargewicht von 16 600 ausgenommen ist, die von Berg et al. beschrieben ist (1982a und 1982b). Die Erfindung ist neu und im Vergleich mit dem früheren Erkenntnisstand überraschend. Die Folgerungen aus den vorliegen den Erfindungen sind immanent:
sämtliche Proteine, die zu HuIFN-α gehören und sämtliche aus Bakterien abgeleitete, mittels gentechnischer Verfahren erhaltene HuIFN-α-Spezies werden dieses Immunglobulin binden (welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es, wie mit einer Antikörpern Affinitätschromatographie gezeigt wurde, sämtliche Spezies von HuIFN-α bindet), wodurch ein universeller Ansatz zur Aufreinigung sämtlicher Spezies von HuIFN-α, seien sie nativ oder bakteriell (Plasmid) abgeleitet, erstmalig erfunden worden ist. Es liegt ferner im Rahmen der Erfindung, andere Hybridomsysteme (vom Murinsystem abgesehen) zu verwenden, die Hybridomantikörper (oder die wesentlichen Teile davon) der oben definierten Spezifität liefern. Beispielsweise wird vorhersehbar, daß das Rattensystem in der Zukunft ebenfalls eingesetzt werden wird.
Die besagten Immunglobuline könnten ebenso durch die nunmehr gut bekannten gentechnischen Verfahren produziert werden, beispielsweise mittels Hybridomzellen, die die besagten Immunglobuline produzieren, indem zunächst die richtige mRNA isoliert wird (deren Spezifität mittels sehr gut bekannter Standardverfahren untersucht/gemessen/isoliert werden kann, wie beispielsweise in Methods in Enzymology, Band 68 (1981), Recombinant Techniques, dargestellt ist). Die gereinigte mRNA, welche auf ihre richtige Spezifität in Oozyten (mit Hilfe einer semi-festen Bindungsanalyse des translatierten Produkts - siehe Materialien und Methoden der vorliegenden Anmeldung) untersucht werden kann, kann anschließend mittels reverser RNA-Transkriptase in cDNA transformiert werden, und nach Erstellung einer Plasmid-Bibliothek durch Einbau der besagten cDNA in relevante Plasmide, kann die korrekt klonierte durch Screening unter der Voraussetzung gefunden werden, daß aus der korrekten mRNA (identifizert/isoliert/beschrieben wie oben dargelegt) eine Sonde hergestellt werden kann, vgl. Weissmann (1982). Es liegt ferner im Rahmen der vorliegenden Erfindung, lediglich Teile der Immunglobuline herzustellen, welche die gewünschte Spezifität aufweisen.
Die besagten Immunglobuline werden sehr nützlich sein bei verschiedenen immunologischen Analysen, bei denen beispielsweise ELISA-(Enzym-Immun-)- oder RIA-(Radioimmun-)-Techniken oder dergleichen eingesetzt werden, bei denen die Anwesenheit eines monoklonalen Antikörpermoleküls (oder Teile davon) mit der oben genannten Spezifität wesentlich ist. Die besagten Immunglobuline können daher bei Immunassays zum Nachweis von Interferonproteinen (oder Teilen derselben) mittels herkömmlicher Techniken (vgl. beispielsweise Methods in Enzymology, Band 70, Teil A, 1980) sehr nützlich sein.
Es wird ferner möglich sein, die Anwesenheit von Interferonrezeptoren (welche zuvor Interferonproteine oder Teile derselben erhalten haben) oder dergleichen nachzuweisen, da diese Einheiten durch die oben genannten Antikörper ebenfalls erkannt werden können.

Beste Ausführungsformen der Erfindung

Es wird davon ausgegangen, daß eine der Gründe für den Erfolg bei der Gewinnung der besagten Hybridomzellen-Antikörper mit den bemerkenswerten Bindungseigenschaften in dem Verfahren zur Herstellung der Antigenpräparationen gesehen werden kann, die aus mit SDS stabilisierten, hochaufgereinigten Interferonproteinen bestehen (vgl. Berg et al. (1980), (1982a)). In der Anwesenheit von SDS wird ein wichtiger Faktor bei der Präsentation der Proteine für die immunkompetenten Zellen gesehen, da die fraglichen Proteine (z. B. Interferonspezies) sämtliche ihrer antigenen Determinanten in Gegenwart von SDS (die Proteine können ebenfalls mit SDS behandelt werden, bevor sie mit den immunkompetenten Zellen konfrontiert werden) aufgrund der denaturierenden Eigenschaft von SDS exponieren, wodurch andernfalls verborgene Determinanten vollständig exponiert werden. Es liegt ferner im Rahmen der Erfindung, die Proteine im allgemeinen mit SDS vor (oder gleichzeitig) der Durchführung der Immunisierung zu behandeln, wobei der Zweck dieses Vorgehens darin liegt, mehr verborgene antigene Determinanten zu erhalten, die andernfalls nicht erkannt werden. Durch Einsatz dieses "SDS-Ansatzes" während der Immunisierung ist zu erwarten, daß die Hybridomzellen- Antikörper gegen die häufigsten Determinanten (d. h. diejenige oder solche, die unter sämtlichen Proteinen am häufigsten vorkommen, die zu einer Proteinmischung gehören, welche aus verwandten, aber dennoch unterschiedlichen Proteinen zusammengesetzt ist) häufiger gefunden werden, wenn ein derartiger denaturierender Ansatz im Verlauf der Herstellung des relevanten Immunogens (umfassend Proteine, z. B. reine Spezies von HuIFN-α) eingesetzt wird. Dieses allgemeine Prinzip ist - bis auf das Murinsystem - ebenfalls auf andere Hybridomzellensysteme anwendbar.
Die oben genannten Befunde korrelieren sehr gut mit der gut bekannten, auf der Genebene existierenden Homologie der für HuIFN-α kodierenden Gene, vgl. Weissmann et al. (1982). Da einige Bereiche als konstant bekannt sind (vgl. Weissmann et al. (1982)), wird davon ausgegangen, daß diese Hybridomzelle, welche durch die bloße Fähigkeit definiert ist, sämtliche Spezies von HuIFN-α zu erkennen, wahrscheinlich eine spezifische Determinante erkennt, die in einem solchen Bereich lokalisiert ist, der sämtlichen zu den HuIFN-α Spezies gehörenden Interferonspezies gemeinsam ist. Es wird ferner davon ausgegangen, daß der besagte Antikörper ebenfalls MuIFN-α mit derselben Determinante erkennen könnte, welche zu der besagten Spezifität der besagten Antikörper geführt hat. Es ist derzeit nicht bekannt, wie weiträumig diese Determinante innerhalb des Interteronsystems verteilt sein könnte (Arbeiten schreiten fort).
Hinsichtlich der Immunisierung, der Isolierung einer Milzlymphozytenmischung, der Fusion und Hybridisierung, der Kultivierung von Hybriden und der Auswahl und der Subklonierung von Hybriden, die den gewünschten Antikörper produzieren, und der Isolierung dieser Hybride oder der entsprechenden Antikörper wird der Leser auf zahlreiche, zuvor veröffentlichte Beschreibungen, wie beispielsweise Kohler et al. (1975), (1976), Lovborg (1982), Methods in Enzymology, Band 70, (1980), Secher et al. (1980), Cellular Immunology, Bände 1-3 (1978), Kennett, McKern & Bechtol (1980), verwiesen.
Die meisten der Plasmazytom-Zelllinien, die zur Herstellung von Hybridomzellen verwendet werden, und einige Antikörper produzierende Hybridomzellen sind von öffentlichen Zellhinterlegungszentren, wie beispielsweise dem Salk Institute, Gell Distribution Center, P.O. Box 1809, San Diego, Ca. 921912, USA, oder anderen vergleichbaren Stellen erhältlich. Die vorliegende, in dieser Erfindung verwendete Zelllinie wurde erhalten von Human Genetic Mutant Gell Repository in New Jersey, siehe Abschnitt: Zellen. Die Zellen werden im allgemeinen in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mit einem hohen Anteil Glukose (4, 5 g pro Liter) oder in RPMI 1640 kultiviert. Die Zugabe von Glukose zu RPMI 1640 bis zu 4, 5 g pro Liter verbessert das Wachstum bei höheren Dichten. Die Zellen werden in einer stationären Suspensionskultur bei einer Konzentration von 10&sup5;-10&sup6; Zellen pro ml gehalten. Der optimale Zustand einer für die Fusion zu verwendenden Kultur ist eine hohe Lebensfähigkeit (d. h. größer als 90%) mit 3-8·10&sup5;-Zellen pro ml. Für eine genauere Beschreibung der experimentellen Details wird der Leser beispielsweise auf Lovborg (1982) und Kennett et al. (1980) verwiesen.
Ein Test auf Mykoplasmen wurde stets durchgeführt, da von anderen gezeigt worden war, daß die Anwesenheit von Mykoplasmen eine erfolgreiche Hybridisierung leicht verhindern kann. Sämtliche Myelomzellen wurden stets 1-3 Tage vor ihrem Einsatz untersucht. Die Zellen wurden lediglich dann für die Fusion vorgesehen, wenn der Test sich als absolut negativ erwies.
Der Einbau des Mycoplasmentests in die Hybridisierungsexperimente führte zu einer deutlichen Verbesserung der Anzahl positiver Hybridomzellen, die in den Fusionsexperimenten erhalten wurden, und bestätigt daher ähnliche Beobachtungen einiger anderer Gruppen (vgl. Lovborg (1982)).

Experimenteller Teil

Interferon-Titrationen

Sie wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben unter Einsatz von beispielsweise VERO-Zellen und VSV als Challenge-Viren (vgl. z. B. Berg et al. (1980)). Sämtliche Einheiten sind in Form internationaler Einheiten dargestellt (69/19 B, MRC, UK). Sofern sehr geringe Mengen an Interferon nachzuweisen waren, wurde das sogenannte bovine System, umfassend BMDK-Zellen und VSV, verwendet, da es sich als extrem zuverlässig und sehr empfindlich herausstellte. Es konnte eine so niedrige Interferonaktivität wie 0,1 Einheiten leicht nachgewiesen werden. Daher wurde dieses System bei der semi-Neutralisierung der Hybridom-Überstände weitgehend eingesetzt.

Herstellung des Immunogens

Rohes humanes Leukozyten-Interferon wurde gereinigt mittels Gelfiltration, gefolgt durch eine Antikörper-Affinitätschromatographie, die beinahe reine Interferonproteine mit einer spezifischen Aktivität von 108 Einheiten pro mg Protein lieferte. Die Rückgewinnung betrug etwa 75%. Das gesamte Eluat aus einem typischen Experiment enthielt 5·10&sup6; Einheiten, die in Aliquots von jeweils 100 000 Einheiten unterteilt (in 0,1 ml Elutionspuffer enthaltend 0,1% SDS) und bis zur Verwendung bei -20ºC gehalten wurden (stabil für mindestens S Monate), vgl. Berg et al. (1980).
Manchmal wurden auch weniger gut gereinigte Präparationen von Leukozyten-Interferon verwendet (einschl. SDS).

Immunisierung

Die Balb/c-Mäuse - vorzugsweise weibliche Mäuse - wurden wie folgt immunisiert: Die erste Injektion (100 000 Einheiten) wurde mit Freund's Adjuvans (F.A.) gemischt und intraperitoneal (I.P.) verabreicht. Die folgenden 5-8 Injektionen wurden als wöchentliche Injektionen gegeben, aber bestanden lediglich aus 30 000 Einheiten, wobei kein F.A. eingeschlossen wurde. Nach 5-8 Injektionen entwickelten die Mäuse Antikörper gegen HuIFN-α (nachgewiesen durch den "traditionellen" Neutralisationstest (vgl. Neutralisationstests) im Bereich von 200-2000 neutralisierenden Einheiten/ml, vgl. Berg (1982)). Diese Form der Schätzung führte im Vergleich mit dem semi-festen Neutralisationsverfahren (siehe unten), welches sich als sehr viel empfindlicher erwies, sehr häufig zu bedeutend niedrigeren Werten. Zwei bis fünf Tage vor der Fusion erhielten die Mäuse als Boosterdosis insgesamt 100 000 Einheiten, wobei die eine Hälfte I.P. und die andere Hälfte in Form subkutaner (S.C.) Injektionen ohne F.A. verabreicht wurden.

Neutralisierung von Antikörpern gegen HuIFN-α

Das einfache ("traditionelle") Verfahren zur Neutralisierung von Interferon besteht aus dem Mischen gleicher Volumina von Interferonproteinen, die eine vorher bestimmte Menge an Interferoneinheiten enthalten, mit der fraglichen Antikörperprobe unter Anwendung mehrerer Verdünnungsstufen, vgl. z. B. Berg (1982). Mit Hilfe dieses Verfahrens werden jedoch lediglich solche Antikörper erkannt, die mit den antigenen Determinanten reagieren, die sich nahe den biologischen Determinanten des Interferonmoleküls befinden. Daher ist es, wie von Berg (1982) ausgeführt, durchaus möglich, daß sich ein großer Teil der Antikörper bei einer ausschließlichen Anwendung des "traditionellen" Neutralisierungsverfahrens der Identifizierung entziehen wird.
Um diese Probleme zu überwinden, wurden verschiedene ELISA-Tests unter Berücksichtigung dessen angewendet, daß beispielsweise Antikörper von Schafen gegen HuIFN-α (hergestellt aus teilweise gereinigtem HuIFN-α durch Ethanolfällung, vgl. Stewart (1980)) sämtliche Spezies von HuIFN-α bindet. Daher wurden Immunplatten (NUNC-Dänemark) zunächst mit IgG-Lösungen aus einem Antiinterferon-Schafsserum und dann mit reinen Interferonproteinen überzogen, und nach einer geeigneten Inkubation wurden die Proben aus den Hybridomzellen und schließlich Antimaus-IgG-Galaktosidase-Konjugate von Kaninchen zugegeben, wie im einzelnen beispielsweise in Methods in Enzymology, Band 70, Teil A (1980), beschrieben. Es stellte sich jedoch heraus, daß durch dieses Verfahren zu viele falsch-positive Ergebnisse in dem Sinne erhalten wurden, daß ELISA-positive fiberstände sich in dem semifesten Neutralisierungstest (siehe unten) nicht als positiv darstellten.

Semi-fester Neutralisierungstest

Dieses Verfahren wurde entwickelt, um ELISA-positive Proben zu untersuchen. Der Test nutzt den Vorteil der einfachen Tatsache, daß ein gegen HuIFN-α gerichtetes "mögliches" Antikörpermolekül an das Interferonmolekül binden wird. Daher kann, wenn man den "möglichen" Antikörper vor der Zugabe einer exakten, aber kleinen Menge Interferon, vorzugsweise insgesamt so wenig wie 0,1 Einheiten (siehe den Abschnitt der Titration von Interferon), zunächst immobilisiert (was durch einen anderen Antikörper erfolgen kann, welcher gegen den "möglichen" Antikörper gerichtet ist), ein sehr kleiner Tropfen in dem Interferontiter (Gehalt) leicht unter Einsatz des "bovinen" Systems nachgewiesen werden.
Dieses System erwies sich gegenüber dem ELISA-System als überlegen. Das folgende Verfahren wurde angewendet:
1. Beschichtung mit Antimaus-Immunglobulin von Kaninchen (DAKO-PATT, Dänemark) unter Verwendung von 300 ug/ml in PBS, einschließlich 0,05% Natriumazid (N.A.), 1 Stunde lang bei 37ºC. Umstellung auf 4ºC für mindestens 24 Stunden (oder mehrere Wochen).
2. Dreimaliges Waschen mit PBS einschl. 0,05% Natriumazid einschließlich Tween 80 (0,05%), dem sogenannten Waschpuffer.
3. Absättigen der ungebundenen Stellen der Immunplatten mit 2% Ovalalbumin in PBS (Sigma) bei Raumtemperatur für 2 Stunden.
4. Dreimaliges Waschen mit Waschpuffer.
5. Zugabe von 100 ul Überstand der zu untersuchenden Hybridomkultur zu der Vertiefung. Inkubieren für 24 Stunden bei Raumtemperatur (einschl. 0,05% Natriumazid).
6. Zweimaliges Waschen mit Waschpuffer.
7. Zweimaliges Waschen mit Waschpuffer (ohne jegliches Natriumazid).
8. Zugabe von 100 ul Interferonlösung (z. B. als native Interferone), enthaltend insgesamt 0,1 Einheit (siehe Abschnitt bezüglich Interferontitration) für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
9. Übertragen der Mischung (100 ul) auf MDBK-Zellen in Mikrovertiefungen, welche zuvor unter Anwendung derselben Mikrotiterplatten zur Konfluenz kultiviert wurden, wie sie für die Interferontitrationen verwendet wurden (NUNC, Dänemark) und 20 Stunden langes Inkubieren bei 37ºC (5% CO&sub2;).
10. Zugabe von VSV in einer vorher bestimmten Konzentration, was nach 24 Stunden zu einem unterschiedlichen CPE-Wert in kultivierten Kontrollzellen führte, die kein Interferon erhielten.
11. Gewöhnliches Auswerten der Mikrotiterplatten (siehe Abschnitt: Interferontitration und die darin genannten Referenzen) unter Berücksichtigung dessen, daß dann, wenn die Zellen in einer Vertiefung zerstört sind, der Überstand des ursprünglichen Hybridomklons (Kultur) Antikörper enthielt, welche in der Lage waren, HuIFN-α zu binden (Entfernen). Dieses Ergebnis kennzeichnet daher einen positiven Klon.

Klonieren und weiteres Kultivieren positiver Hybridomzellen

Positive Klone, die wie oben beschrieben identifiziert wurden, wurden in mehrere Subklone unter Anwendung der "limitierten Verdünnungstechnik" unter Einsatz von konditioniertem Medium und Nährschichten (peritoneale Makrophagen von Balb/c-Mäusen), wie von Lovborg (1982) detailliert beschrieben, unterteilt. Sämtliche subklonierten Hybridomzellen wurden regelmäßig auf ihre Bindungsaktivität untersucht und die Zellen wurden bei anhaltend positivem Befund weiter kultiviert, bevor sie Balb/c-Mäusen (I.P.) injiziert wurden, welche zuvor eine immunstimulierende Substanz (z. B. Pristan, 4-6 Tage vorher) erhalten hatten. Nach 5-15 Tagen (abhängig von der Menge injizierter klonierter Zellen) können neue Hybridomazellen der korrekten Spezifität zusammen mit großen Volumina Ascitesflüssigkeit, die den gewünschten Antikörper in einer extrem hohen Konzentration (etwa mehr als 95% aller vorhandenen Immunglobuline weisen die gewünschte Spezifität auf) geerntet werden. Die Hybridomzellen werden im Anschluß an eine Zentrifugation von der Ascitesflüssigkeit abgetrennt und können nun für eine weitere Injektion von neuen Mäusen (Balb/c-Mäuse) eingesetzt werden, wodurch mehr Ascitesflüssigkeit zusammen mit mehr Hybridomzellen erhalten werden kann, usw., wobei zu berücksichtigen ist, daß die aus einer Maus geernteten Hybridomzellen zur Produktion von 20 neuen Mäusen verwendet werden können, die jeweils ungefähr dieselbe Anzahl Hybridomzellen liefern, wie die erste. Die Hybridomzellen können auch in vitro in Rollflaschen unter Anwendung der relevanten Bedingungen, wie sie bereits detailliert von Lovborg (1982) beschrieben sind, kultiviert werden, wobei prinzipiell dieselben Zellen und Antikörper erhalten werden, wie sie oben unter Anwendung des Maussystems (in vivo) beschrieben wurden.

Isolierung von Anti-IFN- Immunglobulin

Da es bekannt ist, daß die in Ascitesflüssigkeiten gebildeten Antikörper in hohem Maße empfänglich für einen proteolytischen Abbau durch die in der Ascitesflüssigkeit vorhandenen proteolytischen Enzyme sind, wurden die geernteten Ascitesflüssigkeiten zunächst auf +4ºC gekühlt und zentrifugiert (um Hybridomzellen und andere Zelltrümmer zu entfernen), bevor sie mit Ammoniumsulfat behandelt werden, wodurch die Immunglobuline gefällt wurden. Diese Isolierung wurde unmittelbar nach Ernte der Ascitesflüssigkeiten durchgeführt. Die mittels Ammoniumsulfat gefällten Immunglobuline wurden bei -20ºC aufbewahrt. Vor der Titration wurde ein kleines Aliquot in z. B. 5 ml Medium gelöst und gegen 1 Liter PBS dialysiert, bevor es mit dem semi-festen Neutralisierungstest untersucht wurde. Die Immunglobuline wurden weiter gereinigt durch traditionelle Verfahren wie Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie und dergleichen.

Zellen

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendete Maus-Myelomzellinie wird wie folgt charakterisiert: Maus-Myelom, Linie P3 x 63 NS1, HPRT-Mangel, produziert Kappa, nicht Immonuglobulin-sekretierend. Das Medium enthält 4500 mg Glukose pro Liter.
Die obige Linie wurde von The Human Genetic Mutant Cell Repository (unter der Katalognummer GM3573), Copewood and Davies Street, Camden, New Jersey, 08103, USA, erhalten. (NIH Publication Nr. 81-20011, überarbeitet im Oktober 1981).

Medium

Die Myelomzellen wurden in einem Medium kultiviert, welches dieselbe Zusammensetzung aufweist, wie sie von zahlreichen anderen Forschern, z. B. Lovborg (1982), beschrieben wurde, unter Einsatz von RPMI 1640, 10% Kälberserum (neugeboren), enthaltend Penicillin, Streptomycin, Gentamycin zusammen mit Na-Pyruvat usw., wie beispielsweise von Lovborg (1982) beschrieben.

Aufbewahrung der Hybridomzellen

Die Ascitesflüssigkeiten, die die Hybridomzellen der gewünschten Spezifität enthalten, werden aus mehreren Mäusen (siehe Abschnitt: Klonieren und Kultivieren von Zellen) mittels Zentrifugation geerntet und einmal mit RPMI 1640 gewaschen und zentrifugiert. (Der verbleibende Rest der Ascitesflüssigkeit wird behandelt wie anderswo beschrieben, siehe Abschnitt: Isolierung von Immunglobulinen). Etwa 40·106 Zellen werden in 5 ml frischem Eagle's Medium (einschl. 20% Kälberserum) resuspendiert, wobei dem Ansatz ein gleicher Teil 19-20% DMSC in RPMI 1640 (Dimethylsulfoxid, Merck & Co.) tröpfenweise (10 Tropfen pro Minute) der Suspension unter Mischen zugegeben werden, um einer lokalen Erwärmung (welche für die Hybridomzellen schädigend sein könnte) vorzubeugen. Nach dem Mischen wird die die Hybridomzellen umfassende Suspension in 1 ml Ampullen, welche verschlossen und 24 Stunden lang bei 4ºC aufbewahrt werden, abgefüllt, wonach sie in einen N&sub2;-Behälter überführt werden, wodurch die Ampullen mit 1ºC pro Minute abgekühlt werden (gemäß den Anweisungen des Herstellers, welcher den sogenannten "Linde-Behälter" herstellt). Die Zellen in den Ampullen werden schließlich in flüssigem Stickstoff aufbewahrt, vgl. Lovborg (1982).

Auftauen der Zellen

Eine Ampulle wird durch Eintauchen in ein 37ºC warmes Wasserbad aufgetaut. Die Zellen werden nach Zentrifugation in neuem Medium resuspendiert und gezählt und auf einen Titer von 10&sup4;-10&sup5; Zellen pro ml eingestellt. Das Medium wird nach 24 Stunden oder möglicherweise früher gewechselt, wenn die Zellen sich bereits angeheftet haben. Das weitere Kultivieren ist detailliert von Lovborg (1982) beschrieben. Alternativ werden die aufgetauten Zellen (aus der Ampulle) direkt einer Balb/c-Maus injiziert (I.P.), wodurch neue Zellen und Ascitesflüssigkeit (enthaltend den gewünschten Antikörper) innerhalb von 3-7 Tagen (in Abhängigkeit der Menge injizierter Zellen) geerntet werden können.

Mykoplasmen-Test

Primäre humane Amnionzellen (erhalten von der gynäkologischen Abteilung) werden auf kleine Abdeckplatten (aus Glas) ausgesät, wobei die Abdeckplatten nach Anheftung fertig zum Gebrauch sind (die Zellen sollten sich nicht gegenseitig berühren, da eine Konfluenz die Empfindlichkeit zu verringern neigt). Die aus den Myelomzellen bestehende Probe wird auf die Oberfläche der Abdeckplatte aufgebracht (etwa 10 bis 15 Tropfen der Probe) mittels einer Pasteurpipette, und die (die Probe enthaltende) Abdeckplatte wird sorgfältig in eine Plastikfolie eingewickelt, um eine Verdampfung zu vermeiden. Sofern die ursprüngliche aus Myelomzellen bestehende Probe mit Mykoplasmen infiziert gewesen wäre, würden dieselben Mykoplasmen auch die Amnionzellen infizieren. Normalerweise weisen die letztgenannten keine Infektionen mit Mykoplasmen auf, sofern sie frisch verwendet werden. (Vgl. Kontrollkulturen). Am darauffolgenden Tag werden die Kulturen 2 Stunden lang mit "Hoechst Stain" gemäß den Färbevorschriften des Herstellers (Hoechst, BR Deutschland) gefärbt: 1-2 Körnchen des Farbstoffes werden in 5 ml Puffer bei pH 5,5 gelöst. Lediglich ein paar Tropfen sollten für die Färbung eingesetzt werden, da sich der pH-Wert (5,5) unterhalb des physiologischen Bereichs (7,2) bewegt. Das Färbemittel wird 2 Stunden lang mit den Zellen inkubiert, wonach die Zellen mit Methanol fixiert und getrocknet werden. Sofern die Amnionzellen mit den Mykoplasmen (von der ursprünglichen Probe stammend) infiziert worden sind, werden kleine fluoreszierende Partikel mit einem Fluoreszenzmikroskop deutlich sichtbar und zeigen eine Infektion mit Mykoplasmen an. Wenn keine fluoreszierenden Partikel gefunden werden, ist es zu keiner Infektion gekommen. Eine Kontrollkultur (d. h. lediglich Amnionzellen) läuft ebenfalls mit. (Die letztere sollte negativ sein). Wenn in den Myelomzellen Mykoplasmen gefunden wurden, wurden sie verworfen und frische, von Mykoplasmen freie Myelomzellen wurden dem Zell-Gefrierschrank (Flüssigstickstoffbehälter) entnommen.

Beispiel 1

Eine weibliche Balb/c-Maus wurde immunisiert, wie im Abschnitt: Immunisierung (siehe ebenfalls Abschnitt: Herstellung von Immunogenen) beschrieben unter Einsatz von 100 000 Einheiten HuIFN-α (stabilisiert mit SDS) einschl. F.A., gefolgt von den üblichen wöchentlichen, 30-40 000 Einheiten umfassenden Zugaben (I.P.), und 3 Tage vor der Fusion erhielt die Maus schließlich eine Boosterdosis von 100 000 Einheiten wie zuvor beschrieben. Während der Dauer der Immunisierung wurden die "traditionellen" Neutralisationstiter (siehe Abschnitt: Neutralisierung) erhalten: Tabelle 1 Neutralisationstiter der immunisierten Mäuse Woche Neutralisationseinheiten/ml Serum
Nachdem die Fusion der Milzzellen aus dem immunisierten Tier mit den NS1-Zellen (siehe Abschnitt: Zellen) durchgeführt worden war, wurde die Anwesenheit von 62 lebenden Klonen durch mikroskopische Untersuchungen festgestellt (in Costar-Trägern, NUNC, Dänemark; vgl. Lovborg (1982)). Sämtliche Überstände (62) wurden durch das semi-feste Neutralisierungsverfahren (siehe besagter Abschnitt) untersucht und lediglich zwei (teilweise) positive Klone wurden gefunden. Die zwei Klone wurden weiter kultiviert und subkloniert, wobei während dieses Vorgehens (siehe Abschnitt: Klonieren und weiteres Kultivieren positiver Hybridomzellen) ein positiver Klon aufgrund eines Fehlers während des Klonierens verloren ging, der andere (LO-22) wurde weiter in Balb-c-Mäusen, wie zuvor beschrieben, propagiert, wodurch 5,5 ml Acsitesflüssigkeit zusammen mit einer großen Anzahl Hybridomzellen (nach 4 Wochen im Anschluß an die Injektion (I.P.) der primären subklonierten Hybridomzellen, die insgesamt auf 1000 geschätzt wurden, erhalten wurden. Nach der Isolierung wurden die suspendierten Zellen wie zuvor beschrieben 10 neuen Balb/c-Mäusen injiziert, und nach 7 Tagen wurde 65 ml Ascitesflüssigkeit zusammen mit einer großen Anzahl Hybridomzellen geerntet. Einige von ihnen waren gefroren und dienen als Stammkultur, andere wurden in neue Mäuse transplantiert. Sämtliche zellfreien Ascitesflüssigkeiten wurden gefällt und isoliert, wie im Abschnitt: Isolierung von Anti-HuIFN-α-Immunglobulinen beschrieben. (Mehrere Gramm wurden in dieser Stufe isoliert).
Während der obigen Experimente wurden semi-feste Neutralisierungsassays simultan durchgeführt. Die ersten beiden positiven Klone neutralisierten das native humane Leukozyten-Interferon (aus Virus-induzierten "buffy coats") lediglich teilweise, obgleich die Überstände der primären Hybridomkulturen mehr als 100-fach verdünnt werden konnten, ohne einen Endpunkt zu erreichen. Dieselbe Tendenz, auf einem sehr viel höheren Niveau, wurde festgestellt, wenn der LO-22 als Ascitestumor kultiviert wurde: bei einer Verdünnung von mehr als 10&sup7; wurde immer noch eine partielle Neutralisierung/Bindung beobachtet. (Siehe das semi-feste Neutralisierungsverfahren). Zu einem frühen Zeitpunkt dieser Experimente führten die mit dem semi-festen Bindungsassay erhaltenen oben genannten Bindungsergebnisse zu der Vorstellung, daß die Zellen des LO-22 lediglich einen Teil der Spezies von HuIFN-α erkennen können, was den Ergebnissen anderer Gruppen (vgl. Secher et al. (1980), Allan et al. (1980), Berg (1982)) entspricht und allgemein als wissenschaftlicher Konsenz anerkannt wurde.
Um mehr detaillierte und präzise Informationen über die Bindungsfähigkeiten des LO-22-Hybridom-Antikörpers zu erhalten, wurde entschieden, eine Antikörper-Affinitätschromatographie unter der Berücksichtigung durchzuführen, daß man lediglich von der Hälfte oder weniger des aufgetragenen Leukozyten-Interferons erwartet, das sie binden (vgl. die auf Seite 15 beobachtete partielle Neutralisierung).
Die Immunglobuline aus 3 ml Ascitesflüssigkeit der ursprünglichen Maus (welche lediglich etwa 1000 Zellen I.P. erhalten hatte) wurden isoliert (siehe Abschnitt: Isolierung von Anti-IFN-α-Immunglobulinen) und an CNBr-aktivierte Sepharose gekoppelt (vgl. Berg (1977), Berg et al. (1980)), wie zuvor beschrieben. Die equilibrierte Säule wurde mit 90 ml rohem, nativem humanen Leukozyten-Interferon beladen und nach einem gründlichen Waschen wurde die Säule mittels eines niedrigen pH-Wertes eluiert. Die folgenden überraschenden und unerwarteten Ergebnisse wurden erhalten, siehe Tabelle 2: 96% des Interferons wurde aus der ursprünglichen Interferonpräparation (Input) entfernt. Basierend auf den mit den semi-festen Neutralisierungstests (siehe Tabelle 1) erhaltenen Ergebnissen hätte man das beinahe gegenteilige Ergebnis erwartet (d. h. von lediglich einer Portion wurde erwartet, daß sie durch die LO-22-Säule gefangen wird (z. B. 30%)). Tabelle 2 Antikörper-Affinitätschromatographie mit LO-22 Säule Volumen ml IFN-Einheiten humanes Syst. IFN-Einheiten bovines Syst. Wiedergewinnung % Input Waschflüssigkeit Eluat
Um die Bindungseigenschaften der LO-22-Säule weiter zu analysieren, wurde die Waschflüssigkeit (bestehend aus 2,0·10&sup5; humanen Interferoneinheiten, vgl. Tabelle 2) auf etwa 4 ml konzentriert (mittels Sucrose und Dialyse, vgl. Berg et al (1980)), bevor sie wieder auf die LO-22-Säule geladen wurde. Die zweite Waschflüssigkeit wurde sowohl im humanen als auch bovinen System titriert und die folgenden Ergebnisse wurden erhalten: weniger als 100 Einheiten (bovin) wurden nachgewiesen, wohingegen etwa 50 000 Einheiten (human) nachgewiesen wurden. Darüber hinaus war die zweite Waschflüssigkeit (bestehend aus etwa 50 000 humanen Einheiten) in der Lage, Anti-HuIFN-β im Rahmen des traditionellen Neutralisierungstests (siehe Abschnitt: Neutralisierung) vollständig zu neutralisieren. Das gereinigte Eluat der Tabelle 2 (bestehend aus 2,8·10&sup6; Einheiten (human)), war nicht in der Lage, das besagte Anti-HuIFN-β in einem analogen Neutralisierungstest überhaupt zu neutralisieren. Damit bestehen die in der zweiten Waschflüssigkeit gefundenen 50 000 Einheiten (human) aus einer anderen Spezies, nämlich HuIFN-β. Die obigen Resultate stimmen vollkommen überein mit beispielsweise Vilcek et al. (1977) und Berg (1982).
Das Eluat aus der LO-22-Säule (Tabelle 2) wurde auf einem analytischen Dünnschicht SDS-PAGE (unter Einsatz von Gradientengelen, 12%-24%, 25 cm lang, vgl. Berg et al. (1980), (1982a), (1982b)) analysiert, und es wurde ein im Vergleich mit den zuvor veröffentlichten Berichten identisches Muster der HuIFN-α-Spezies beobachtet. Somit wurden sämtliche Spezies von HuIFN-α gesehen (es war in der besonderen, in diesem Experiment verwendeten Charge keine "bovine" Spezies anwesend (vgl. Berg et al. (1982a), (1982b)). Das SDS-PAGE wurde gefärbt und die individuellen Banden herausgeschnitten und titriert und eluiert, wie zuvor von Berg et al. (1980), (1982a), (1982b) beschrieben, und die folgenden Ergebnisse wurden erhalten (Tabelle 3): Tabelle 3 Biologisches Profil eines mittels SDS-PAGE erhaltenen LO-22-Eluats Streifen Nr. Interferoeinheiten (WISH-Zellen) humane Einheiten Interferoeinheiten (BDVK-Zellen) bovine Einheiten
Es wurde bei allen 12 Spezies gefunden, daß sie sich in dem üblichen Molekulargewichtsbereich von 16.000-25.000 bewegen, was den zuvor beschriebenen Berichten betreffend die Lokalisierung und Anzahl der in einer HuIFN-α-Präparation anwesenden Spezies (Berg et al. (1982a), (1982b)) vollkommen entspricht. Wahrscheinlich ist die LO-22-Säule ebenfalls in der Lage, nicht zuvor nachgewiesene Spezies von HuIFN-α mit einem höheren Molekulargewicht zu erkennen, da Interferonaktivität enthaltende Fraktionen ebenfalls um 30.000 herum gefunden wurden (Fraktion 14, 15 und 16 lieferten 600 humane Einheiten/1000 bovine Einheiten, 1400/1800 bzw. 60/180). Diese Fraktionen werden derzeit eingehender untersucht.
Die obigen Ergebnisse (aus der Antikörper-Affinitätschromatographie) stehen irgendwie im Widerspruch zu den Ergebnissen, die mit dem semi-festen Neutralisierungsverfahren (Tabelle 1) erhalten wurden, die lediglich ein partielles Binden der Spezies von HuIFN-α an LO-22-Immunglobulin anzeigen. Momentan wird davon ausgegangen, daß der Grund für diesen Widerspruch auf der Qualität des beim Beschichten der Immunplatten verwendeten Antimaus- Immunglobulins von Kaninchen basiert (siehe Abschnitt: semifestes Neutralisierungsverfahren).
Die von den LO-232-Hybridomzellen produzierten Immunglobuline wurden als zur IgG-Klasse gehörend charakterisiert durch Ouchterloni-Tests, bei denen mehrere Fraktionen der Ascitesflüssigkeiten (und Überstände aus kultivierten LO-22-Zellen) gegen Antimaus-Immunglobuline aus Kaninchen (DAKO-PATT, Dänemark; Behring Werke, BR Deutschland) oder Antimaus-IgG F(ab)&sub2; aus Ziegen (Cappel) oder Anti-IgM (schwere Kette) der Ziege (Cappel) untersucht wurden. Mehrere Kontrollen wurden eingeschlossen (die NS1-Zellen lieferten erwartungsgemäß alleine keine positive Reaktion gegen beispielsweise IgG). Ein schweres Präzipitat wurde insbesondere zwischen den Hybridoma-Antikörpern LO-22 und dem Antimaus-IgG F(ab)&sub2;-Antiserum der Ziege (Cappel) gesehen.

Anmerkungen zum Beispiel 1

Die obigen, detailliert beschriebenen Experimente haben das Folgende bestätigt:
1. Die LO-22-Hybridom-Antikörper-Säule erkennt (bindet) sämtliche Spezies von HuIFN-α mit den spezifischen Charakterisierungen, die dem HuIFN-α-System angehören. (Vgl. Berg (1982), Berg et al. (1980), (1982a), (1982b)).
2. Das humane Fibroblasten-Interferon HuIFN-β, von dem bekannt ist, daß es in geringen Mengen in einer rohen Aufbereitung von humanem Leukozyten-Interferon vorhanden ist (es ist gezeigt worden, daß etwa 1-2% der gesamten Interferonaktivität der Spezies HuIFN-β angehört; vgl. Bert et al. (1975)), wird nicht erkannt von der LO-22-Hybridom-Antikörper-Säule.

Industrielle Anwendbarkeit

Die monoklonalen Antikörper/Hybridomzellen (und die entsprechenden Hybridomzellen einschließlich abgeleiteter Hybridzellen), die in der Lage sind, Proteine (oder Teile derselben) zu erkennen, die antigenisch dem humanen Leukozyten-Interferon-System (HuIFN-α) angehören, können als "universelle" Antikörper zur Aufreinigung und Charakterisierung von sämtlichen oben genannten Proteinen, die dem HuIFN-α-System angehören, eingesetzt werden.

Claims

1. Kontinuierliche Zelllinie, die Hybridomazellen umfaßt, die in der Lage sind, monoklonale Antikörper zu produzieren, die für mindestens eine antigene Determinante spezifisch sind, die den 12 humanen α-Interferon-Spezies gemeinsam sind, die Aktivität im Humansystem zeigen und die Molekulargewichte von mindestens 16 000 im SDS-PAGE besitzen, wobei eine Spezies mit einem Molekulargewicht von 16 600 ausgenommen ist, die von Berg et al. in Human Lymphokines, Academic Press, N. Y. 1982, S. 397-416 beschrieben ist, erhältlich durch:

a) Immunisieren eines Tieres mit einem primären Immunogen, das humane α-Interferon-Proteine, vermischt mit einer effektiven Menge Natriumdodecylsulfat, um diese Proteine zu denaturieren, umfaßt und

b) nachfolgende Entnahme von mindestens einer antikörperproduzierenden Zelle aus diesem Tier und Fusionieren des genetischen Materials aus dieser Antikörper produzierenden Zelle mit einer unsterblichen Zelle, um die Hybridomazelle zu bilden.

2. Monoklonaler Antikörper, der für mindestens eine der antigenen Determinanten spezifisch ist, die den 12 humanen α-Interferon-Spezies gemeinsam sind, die Aktivität im Humansystem zeigen und die Molekulargewichte von mindestens 16 000 im SDS-PAGE besitzen, wobei eine Spezies mit einem Molekulargewicht von 16 600 ausgenommen ist, die von Berg et al. in Human Lymphokines, Academic Press, N. Y. 1982, S. 397-416 beschrieben ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer Hybridomazelle, die in der Lage ist, monoklonale Antikörper zu bilden, die für mindestens eine der antigenen Determinanten spezifisch sind, die den 12 humanen α-Interferon-Spezies gemeinsam sind, die Aktivität im Humansystem zeigen und die Molekulargewichte von mindestens 16 000 im SDS-PAGE besitzen, wobei eine Spezies mit einem Molekulargewicht von 16 600 ausgenommen ist, die von Berg et al. in Human Lymphokines, Academic Press, N. Y. 1982, S. 397-416 beschrieben ist, welches die Schritte

b) nachfolgende Entnahme von mindestens einer antikörperproduzierenden Zelle aus diesem Tier und Fusionieren des genetischen Materials aus dieser Antikörper produzierenden Zelle mit einer unsterblichen Zelle, um die Hybridomazelle zu bilden, umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die effektive Menge Natriumdodecylsulfat zwischen etwa 0,01 Vol.% und etwa 5 Vol.% des Immunogens beträgt.

5. Verwendung der Hybridomazellen nach Anspruch 1 zum Nachweisen von humanem α-Interferon in einer menschlichen Körperflüssigkeit, welche die Schritte umfaßt:

a) Anregen der Hybridomazellen zur Produktion der monoklonalen Antikörper;

b) Kontaktieren der monoklonalen Antikörper mit der menschlichen Körperflüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie das humane α-Interferon enthält; und

c) Bestimmen, ob eine Bindung zwischen den monoklonalen Antikörpern und der menschlichen Körperflüssigkeit stattfindet,

6. Verwendung der monoklonalen Antikörper nach Anspruch 2 zum Nachweisen von humanem α-Interferon in einer menschlichen Körperflüssigkeit.