DK165119B - Antibiotiske forbindelser betegnet ll-f28249alfa, beta, gamma, delta, epsilon, zeta, eta, theta, iota, kappa, my og ny og pharmaceutisk or pharmakologisk acceptable salte deraf samt fremgangsmaade til deres fremstilling - Google Patents

Description

DK 165119B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte, antibiotiske forbindelser, betegnet som LL-F28249a, β, nr, S, e, ζ, η, $ i L r K i β og v, pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte deraf samt en fremgangsmåde til deres frem-5 stilling ved fermentering af et næringsmedium med stammen af mikroorganismen Streptomyces cyaneogriseus, underart noncyanogenus LL-F28249, NRRL nr. 15773.

De her omhandlede antibiotiske forbindelser, LL-F28249a, β, τ, 5, e, C/ Vt 11 Kr β og v er ejendom-10 melige ved det i den kendetegnende del af kravene 1-12 angivne .

De her omhandlede antibiotiske forbindelser er anvendelige til forebyggelse, behandling og bekæmpelse af helmin-tiske, arthropod-ektoparasitiske og acaridale infektioner 15 hos varmblodede dyr ved indgift af en effektiv mængde af midler indeholdende de her omhandlede forbindelser eller blandinger deraf, såsom fermenteringsvæsken, hele mæsken eller de pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte deraf. Plantenematoder bekæmpes også effektivt ved hjælp 20 af sådanne midler, som også er effektive insekticide midler.

De ovenfor omtalte sygdomme afstedkommer ikke blot ødelæggende virkninger, men udgør også alvorlige økonomiske problemer og tab for landbrugerne, der avler kødproducerende dyr, såsom svin, får, kvæg, geder, kaniner og fjerkræ. Des-25 uden er sådanne sygdomme årsag til stor bekymring, når det drejer sig om selskabsdyr som heste, hunde og katte. Selv om disse sygdomme har været kendt i mange år, og der findes præparater til behandling og/eller forebyggelse af sådanne sygdomme, er der ifølge opfindelsen tilvejebragt en fuld-30 stændig ny række aktive forbindelser, der er isoleret ud fra en hidtil ukendt mikroorganisme, og som er egnede til forebyggelse, behandling eller bekæmpelse af disse sygdomme.

I US patentskrift nr. 3.950.360 er der omtalt visse antibiotiske stoffer, der fås ved dyrkning af en Streptomy-35 cesmikroorganisme, idet disse forbindelser er anvendelige som insekticider og acaricider; men i relation til de karak- •

DK 165119B

2 teristika, der identificerer en sådan mikroorganisme, er den ovenfor omtalte mikroorganisme S. cyaneogriseus distinkt, og dens aktive komponenter er afledt ud fra helt forskellige mikroorganismer. Endvidere angår en hel serie US patentskrif-5 ter visse forbindelser, der fremstilles ved fermentering af Streptomyces avermitilis, en organisme, der klart adskiller sig fra ovennævnte S. cyaneogriseus (US patentskrifterne nr. 4.171.314, 4.199.569, 4.206.205, 4.310.519 og 4.333.925) .

US patentskrift nr. 4.423.209 angår en fremgangsmåde til 10 omdannelse af nogle af disse mindre ønskelige komponenter til de mere foretrukne.

Endelig er der i US patentskrift nr. 4.346.171 beskrevet en række antibiotisk aktive forbindelser, betegnet milbemyciner, hvoraf milbemycin D er særligt aktiv. Disse 15 milbemyciner fremstilles ved fermentering af Streptomyces-stammen B-41-146.

De her omhandlede antibiotiske forbindelser, betegnet LL-F28249a, β, ττ, δ, e, C, η, θ, c, κ, μ og ο, fremkommer ved fermenteringen af en nyopdaget og tidligere ikke-dyrket 20 mikroorganisme, nemlig Streptomyces cyaneogriseus, underart noncyanogenus NRRL 15773.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i den kendetegnende del af krav 13 angivne.

Ved dyrkningen af ovennævnte organisme dannes også 25 den fra DK patentansøgning nr. 4180/85 kendte forbindelse faktor F, i det følgende betegnet LL-F28249X.

Stammen henhører under slægten Streptomyces på basis af morfologi og cellekemi (indhold af L-isomeren af diamin-opimelinsyre). Stammens morfologi og fysiologiske data pla-30 cerer den i nærheden af S. cyaneogriseus, repræsenteret ved ISP 5534 (ATCC 27426). Derpå foretages sammenligninger mellem dannelsen af grå, opløselige luftmyceliumpigmenter på medier (Tabel I) og spiralformede kæder af glatte konidier (3-25 sporer-pr. kæde). Den foreliggende stamme er negativ over 35 for blåt, opløseligt pigment, hvor sammenligningsstammen ISP 5534 er positiv. Stammerne har lignende reaktioner ved ISP-

DK 165119 B

3 carbonhydratudnyttelsesprøverne, der er positive over for arabinose, fructose, glucose, rhamnose og xylose, roen er negative over for inositol, mannitol, raffinose og saccharose (ISP 5534 let positiv). Imidlertid er stammerne forskellige 5 på flere punkter (tabel II) ud af 53 ved Gordonprøverne.

Disse forskelle understøtter teorien om, at det er en specifik underart af S. cyaneogriseus, som ved fermentering giver forbindelserne LL-F28249a-u.

4

DK 165119 B

Tabel I

Sammenligning af F 28249 og ISP 5534 på ISP-morfologi-prøvemedier (numrene er fra NBS-ISCC) 5 Medium_F 28249_ISP 5534_ Gær-malt A.m.^ middelgrå lys til middelgrå (ISP 2) (265) (264-265) V.m. lys brunlig (75) lysbrunlig-hvid til dyb gulbrun sortagtig blå (188) 10 S.p. lysebrun lysebrun

Uorgani- A.m. lys olivengrå (112) middelgrå (265) ske salr til middelgrå (265) te sti- V.m. dyb grå til sort grå-purpuragtig blå velse (266-267) (204) 15 (ISP 4) S.p. grålig-gullig- intet brun

Glycerol A.m. 263 (hvid) til gul- 263 (hvid) til lyse-aspara- lig-grå (93) grå (264) gin V.m. sort (267) til lys grå-purpuragtig blå 20 (ISP 5) olivenbrun (96) (203-204) S.p. let brunlig lys gullig-grå

Havremel A.m. gulgrå (93) intet (ISP 3) V.m. farveløs farveløs _S.p. let gullig intet 25 1) A.m. - luftmycelium V.m. - vegetativt mycelium S.p. - opløseligt pigment 30 35 5

DK 165119 B

Tabel II

Sammenligning af Lederle F 28249 med ISP 5534 (Gordonprøver) _F 28249 ISP 5534_ 5 Dyrket på/ved

Salicin + 10° + 45° +

Produktion af 10 urease +

Decarboxylering af mucate - +

Syreproduktion raffinose - + 15 saccharose - +

Begge stammer har følgende reaktioner:

Positiv Hydrolyse af casein, hypoxanthin, xanthin, tyrosin, adrenin, kartoffelstivelse, gelatine og esculin.

Produktion af phosphatase Følsomhed over for lysozym

Decarboxylering af acetat, citrat, lactat, ma-lat, oxalat og propionat

Syreprodukt ud fra arabinose, cellobiose, dek-strin, fructose, galactose, glucose, glycerol, lactose, mannose, α-methyl-D-glucosid, rhamnose, salicin og trehalose.

Negativ Produktion af nitratreduktase 30 Decarboxylering af benzoat og tartrat

Syre ud fra adonitol, dulcitol, erythritol, inositol, mannitol, sorbitol, β-methyl-D-xylosid.

Vækst på 5% NaCl.

35

DK 165119B

6 m

Hed den foreliggende opfindelse er der tilvejebragt antibiotiske forbindelser, som er effektive til bekæmpelse af helmintiske, arthropod-ektoparasitiske og acaricide infektioner hos varmblodede dyr, især kødproducerende dyr, 5 såsom fjerkræ, kvæg, får, svin, kaniner samt husdyr, såsom heste, hunde og katte.

Forbindelserne er tillige anvendelige til bekæmpelse af skadelige insekter.

. Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus-kulturen 10 (LL-F28249 deponeret under NRRL nr. 15773), som producerer forbindelserne LL-F28249a, β, -r, 6, é, ζ, η, 9, t, κ, λ, μ og ν, er blevet isoleret ud fra eukalyptussand i det sydlige Australien.

Det har vist sig, at disse forbindelser produceres 15 ved fermentering af et næringsmedium indeholdende mikroorganismestammen Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15773. Som aktive komponenter kan anvendes ikke blot selve forbindelserne LL-F28249a, LL-F28249/?, LL-F28249*r/ LL-F282495, LL-F28249e, LL-F28249C, LL-F28249n, LL-F28249S, 20 LL-F28249t, LL-F28249ic, LL-28249X, LL-28249y og LL-F282491), men også fermenteringsvæske og hele mæsken af mikroorganismen.

Strukturen af og stereokemien i LL-F28249 er ikke fuldt klarlagt, men de foreslåede strukturer vises nedenfor.

25 30 t: 35

DK 165119B

7

5 0H

cH3 /VR" 10 r3 '^N CH3 Χΐ “ X X· R5 \ 3 T ch3 or2 20 LL-F28249a-y 25 30 35

DK 165119 B

8

X

υυουυυουοουο O II II II II II II I il II ii ii ii

i XXXXXXXXXEXX

so o ouocjoocjcjoo.o x x x x x x x x x x x υυυουοχυυοαο

CQ l I I l I I CJ i I I ' I

I XXXXXXII X X X X X

<υυυουυυυουοο

III I I I I I I

CM CM CM N Μ N N N CM

Λοχχχ xxxxx.x aioao ooaaa o + 111 i i i i i i «η O O O .o o o o o o cd i i i i i i i i i

X

o vO CM CO co

es X XX

O O O

in X

ci O XX

co

X

o cocococococococmcooococo •<TXXXXXXXX = = 3= = escjcjouuoua ooao co x υ η η η n co co co cm oo co coco χ χ x x xxxxxxx ί^υοοοχοοοουυυ «η «η π ^ η

CM XX XXX

βίχχουχχχ = = υου

CM CM CM CM CM CM CM

χ*·*ν ^ ^ co ro co co co co coco

X XXXXX XX

CJ U U CJ CJ O OU~ w co co co ^ cm —' co —' w p-ι XXXXXXXXXX XX Oiooo'oooaouaaa . Sett J- *0 U U> C φ s v s< Zi.

P ciC'O'O'CiO'O'O'C'CiO'C' "ΜΓΜΓ^Γ'σ'Τ'Τ'Τ'Τ'Τ'Τ'Τ'Τ Qj CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

Scocococooooocoooooooeoco

O CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM

& CttCuCttlJuCiikiCLitaCtiCt* it* it* δ 1 I i I I I I I I I II

DK 165119B

9

ch3 II

/CH2

10 T CH

„ CH3 \H

H3C ^ CH3 ; il V°

15 f>vS

OH

20 LL-F28249v 25 30 35

DK 165119B

10 På tegningen viser fig. 1 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspek-trum af forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, fig. 2 et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum 5 for forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, fig. 3 et karakteristisk proton-kernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, i CDCI3-opløsning.

fig. 4 et karakteristisk carbon-13-kernemagnetisk 10 resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-28249a, NRRL 15773, i CDC13-opløsning, fig. 5 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249a, NRRL 15773, fig. 6 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspék-15 trum for forbindelsen betegnet LL-F28249/3, NRRL 15773, fig. 7 et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249/3, NRRL 15773, fig. 8 et karakteristisk protonkernemagntisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F282490, NRRL 20 15773, i CDCI3, fig. 9 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249/?, NRRL 15773, fig. 10 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249-r, NRRL 15773, 25 fig. 11 et karakteristisk infrarødt absorptionsspek trum for forbindelsen LL-F28249-T, NRRL 15773, fig. 12 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen LL-F28249-T, NRRL 15773, i CDCI3, 30 fig. 13 et karakteristisk carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249nr, NRRL 15773, i CDCI3, fig. 14 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249-T, NRRL 15773, 35 fig. 15 et karakteristisk ultraviolet absorptions spektrum for forbindelsen betegnet LL-F282495, NRRL 15773,

DK 165119 B

11 fig. 16 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F282495, NRRL 15773, i CDC13, fig. 17 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum 5 for forbindelsen betegnet LL-F282495, NRRL 15773, fig. 18 et karakteristisk ultraviolet absorptions-spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249e, NRRL 15773, fig. 19 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249e, NRRL 10 15773, i CDCI3, fig. 20 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249e, NRRL 15773, fig. 21 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249f, NRRL 15773, 15 fig. 22 et karakteristisk protonkernemagnetisk reso nansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249C, NRRL 15773, i CDCI3, fig. 23 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249C, NRRL 15773, 20 fig. 24 et karakteristisk ultraviolet absorptions spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249T), NRRL 15773, fig. 25 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249n, NRRL 15773, i CDCI3, 25 fig. 26 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-28249n, NRRL 15773, fig. 27 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F282490, NRRL 15773, fig. 28 et karakteristisk protonkernemagnetisk reso-30 nansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249#, NRRL 15773, i CDCI3, fig. 29 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F282495, NRRL 15773, _fig. 30 et karakteristisk ultraviolet absorptions-35 spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249i, NRRL 15773,

DK 165119B

12 fig. 31 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249i, NRRL 15773, i CDC13, fig. 32 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum 5 for forbindelsen betegnet LL-F28249t, NRRL 15773, fig. 33 et karakteristisk carbon-13 kernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249/8, NRRL 15773, i CDCI3-opløsning, - fig. 34 et karakteristisk ultraviolet absorptions-. 10 spektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249K, NRRL 15773, fig. 35 et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249K, NRRL 15773, fig. 36 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249jc, NRRL 15773, 15 ’ fig. 37 et karakteristisk protonkernemagnetisk reso nansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249k, NRRL 15773, fig. 38 et karakteristisk carbon-13 kernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249k, NRRL 20 15773, fig. 39 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249X, NRRL 15773, fig. 40 et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249X, NRRL 15773, 25 fig. 41 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249X, NRRL 15773, fig. 42 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249X, NRRL 15773, 30 fig. 43 et karakteristisk carbon-13 kernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249X, NRRL 15773, fig. 44 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249m, NRRL 15773, 35 fig. 45 et karakteristisk infrarødt absorptionsspek trum for forbindelsen betegnet LL-F28249/*, NRRL 15773,

DK 165119 B

13 fig. 46 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249m, NRRL 15773, fig. 47 et karakteristisk protonkernemagnetisk reso-nansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249m, NRRL 5 15773, fig. 48 et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249u, NRRL 15773, fig. 49 et karakteristisk infrarødt absorptionsspek-trum for forbindelsen betegnet F28249i>, NRRL 15773, 10 fig. 50 et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249u, NRRL 15773, fig. 51 et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249u, NRRL 15773, og 15 fig. 52 et karakteristisk carbon-13 kernemagnetisk resonansspektrum for forbindelsen betegnet LL-F28249i>, NRRL 15773.

Det har vist sig, at ovennævnte forbindelser samt fermenteringsvæsken og helmæsken af denne mikroorganisme 20 er særlig effektive til bekæmpelse af helmintiske, arthro-pod-ektoparasitiske og acaridale infektioner hos kødproducerende dyr, såsom kvæg, får, svin, kaniner, fjerkræ, såsom kyllinger, kalkuner, ænder, gæs, vagtler og fasaner, samt husdyr.

25 De kan derfor anvendes til forebyggelse, bekæmpelse eller behandling af sådanne infektioner hos varmblodede dyr ved indgift oralt, parenteralt eller topisk af en profylaktisk, pharmaceutisk eller terapeutisk effektiv mængde fermenteringsvæske eller helmæsk af mikroorganismen Strep-30 tomyces cyaneogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, eller af de her omhandlede forbindelser, betegnet LL-F28249a-u, som identificeret og karakteriseret her i beskrivelsen, eller de pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte deraf (kollektivt omtalt som aktivt stof).

35 Selv om indgift af forbindelsen eller fermenterings- væske/helmæsk (herefter væske eller mæsk) i reglen sker

DK 165119 B

14 mest praktisk i eller* med foderet eller i drikkevandet, kan ovennævnte forbindelser, væske eller mæsk, eller phar-maceutisk eller pharmakologisk acceptable salte deraf også indgives til individuelle værter i form af tabletter, store 5 doser, geler, kapsler eller lignende eller ved injektion i form af en pasta, gel, pellet eller opløsning. Disse sidstnævnte indgiftsmetoder er naturligvis ikke så praktiske til behandling af større grupper dyr, men de er ganske praktiske til brug i mindre målestok eller på individuel basis.

10 Når antibiotika LL-F28249a, β, 7, 5, e, ζ, rj, $, t, k, λ, μ eller υ eller fermenteringsvæsken eller helmæsken af Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus NRRL 15773 anvendes til profylaktisk eller terapeutisk behandling af anthelmintiske, arthropod-ektoparasitiske og acaridale in-15 fektioner hos dyr og fjerkræ, er i reglen ca. 0,05 til 500,0 ppm og fortrinsvis 0,1 til 300 ppm af midlet, væsken eller mæsken som beskrevet ovenfor, indgivet i dyrets foder eller drikkevand, effektivt til at forebygge, bekæmpe eller behandle sådanne infektioner hos dyrene.

20 Foderet med tilsat medicin, der kan anvendes ved en sådan behandling fremstilles i reglen ved omhyggelig iblanding af ca. 0,00001 til ca. 0,01 vægt% antibiotikum eller den ovenfor beskrevne væske eller mæsk med et næringsmæssigt afbalanceret foder, f.eks. det i nedenstående eksempler 25 beskrevne foder.

Når forbindelserne og/eller væsken eller mæsken anvendes til forebyggelse eller bekæmpelse af helminter, ar-thropod-ektoparasitter og acarider, fremstilles det aktive middel først som en dyrefoder-forblanding. Forblandingen 30 indeholder i reglen en forholdsvis stor procentdel af det aktive stof og blandes i reglen med dyrets foder umiddelbart før indgift. Om ønsket kan foderforblandingen også anvendes som topdressing på dyrets dagsration.

-Foderforblandinger eller -koncentrater, der kan be-35 nyttes ved en sådan behandling, kan fremstilles ved iblanding af ca. 0,1 til 5,0 vægt% af de ovenfor identificerede

DK 165119B

15 forbindelser, væske eller mæsk eller pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte deraf med ca. 99,9 til 95 vægt% af et passende bærestof eller fortyndingsmiddel.

Bærere, der er egnet til fremstilling af fodersup-5 pieringssammensætninger, omfatter f.eks. lucernemel, sojabønnemel, bomuldsfrøoliemel, hørfrøoliemel, natriumchlorid, calciumcarbonat, calciumsulfat, majsmel, sukkerrørsmelasse, urinstof, benmel, majskolbemel og risskalmel. Bæreren fremmer eii i det væsentlige ensartet fordeling af det aktive 10 stof i det færdige foder, hvori tilskuddet blandes. Det udfører således en vigtig funktion ved at sikre en passende fordeling af det aktive stof, dvs. ca. 0,1 til 100 ppm deraf, i hele foderet. Dette svarer til 0,00001 til 0,01 vægt% aktivt stof i det færdige foder. I praksis tilsættes et 15 halvt til flere kg forblanding pr. ton foder for at opnå det ønskede niveau af antibiotikum eller væske eller mæsk i det færdige foder.

Hvis tilskuddet eller forblandingen anvendes som topdressing til foderet, hjælper det ligeledes med til at 20 sikre ensartet fordeling af det aktive stof over den øverste del af det supplerende foder.

Eftersom forbindelserne ifølge opfindelsen og disses pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte er forholdsvis uopløselige i vand, er det i reglen ønskeligt, 25 når en sådan forbindelse eventuelt indgives i dyrets drikkevand, at opløse det aktive stof i et organisk opløsningsmiddel, f.eks. methanol, ethanol, acetone, DMSO, oleinsyre, linolsyre eller propylenglycol, og iblande opløsningen en lille smule surfactant og/eller dispergeringsmiddel for at 30 sikre opløsning og/eller dispersion af det aktive middel i dyrets drikkevand.

Når behandlingen af et mindre antal af de større kødproducerende dyr er nødvendig for at bekæmpe parasitiske infektioner af disse, er det bedst, at midlerne LL-F28249ct, 35 β, ί , 6, e, f, η, θ, i, le, λ, μ og υ, væske eller mæsk eller pharmaceutisk eller pharmakologisk acceptable salte deraf

DK 165119 B

16 indgives oralt på daglig basis til værtsdyret i form af en medicinholdig gel.

De her omhandlede, antibiotiske forbindelser udviser også nematodicid aktivitet over for plantenematoder, hvilket 5 er påvist ved deres effektivitet til bekæmpelse af den frit levende jordbundsnematode C. elegans. Sammensætninger indeholdende disse aktive stoffer til bekæmpelse af plantenematoder kan oparbejdes enten som væsker eller fugtelige pulvere. Flydende sammensætninger omfatter ca. 5-20% væ/væ 10 aktivt stof (aktivt middel, fermenteringsvæske, helmæsk eller salte) med passende mængder af et opløsningsmiddel, f.eks. methanol, ethanol, acetone eller acetonitril, og resten vand. Fugtelige pulvere omfatter ca. 5-20% væ/væ aktivt middel, ca. 1-10% surfactant og inaktive bærere, 15 f.eks. lerarter, vermiculit eller kønrøg. Der påføres ca. 0,1-1,4 kg/ha på planternes løv, den jord, hvori de gror, eller i deres stammer.

Forbindelserne er også aktive som topiske insekticider, mavegifte og systemiske insekticider og er særlig ef-20 fektive til bekæmpelse af insekter af ordenerne Lepidop-tera, Coleoptera, Homoptera, Diptera og Thysanoptera. Desuden bekæmpes plantemider, acarider, med forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse.

Ved en sådan anvendelse påføres forbindelserne i 25 reglen som fortyndede, faste eller flydende sammensætninger på formeringsområderne, føde eller levested for sådanne insekter og/eller acarider. Påføringsmængden på sådanne arealer udgør ca. 0,01 til ca. 8,0 kg/ha, fortrinsvis ca.

0,05 til ca. 0,5 kg/ha.

30 Surfactanter, der kan anvendes i fugtelige pulvere, omfatter dem, der almindeligvis anvendes til tilberedninger af sådanne fugtelige pulvere, fortrinsvis alkylbenzensul-fonatnatriumsalte. Bentonit, ler eller blandinger deraf er foretrukne bærere.

35 yderligere har de aktive stoffer ifølge opfindelsen også vist systemisk insekticid aktivitet mod M. ovinus hos

DK 165119B

17 får.

I praksis er i reglen ca. 0,02 mg/kg/dag til ca.

3;0 mg/kg/dag effektivt til bekæmpelse af parasitinfektioner hos kvæg, får og svin samt husdyr. Til længere tids brug 5 kan der anvendes mængder helt ned til 0,002 mg/kg legems-vægt/dag.

Også i praksis indgives ca. 0,1 mg/kg til 100 mg/kg til dyr inficeret med helminter.

De fysiokemiske karakteristika for a, β, ύ. S, e, 10 C, η,θ, i, κ,λ,/iog v-komponenterne af LL-F28249 er angivet nedenfor.

LL-F28249tt; (a) Molekylvægt: 612 (FAB-MS).

(b) Molekylformel: C36H5208.

26 15 (c) Specifik optisk rotation: [<*]D = +133 ± 3° (C = 0,3, acetone).

(d) Ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig.

1/ = 244 nm (€ 28.000).

max ' ' (e) infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig. 2 20 (KBr-skive): 3439, 2960, 2925, 1714, 1454, 1374, 1338, 1171, 1120, 996 og 967 cm"1.

(f) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i tegningens fig. 3.

(g) Carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) 25 som vist i tegningens fig. 4 og opregnet i tabel III.

(h) Elektronanslagsspektrum som vist i fig. 5 med målte m/z-værdier og foreslåede grundstofsammensætninger som vist i tabel IV, opnået ved 30 massemålinger med høj opløsningsevne.

LL-F28249B: (a) Molekylvægt: 584 (FAB-MS) .

(b) Molekylformel: c34H4g08.

~ (c) Specifik optisk rotation: [ot]^6 = +125* 35 (C = 0,3, acetone).

DK 165119B

18 (d) Ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig.

6, UV^3°H = 244 nm (e = 25.600).

(e) Infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig. 7 (KBr-skive): 3520, 2910, 1735, 1717, 1450, 1375, 5 1335, 1180, 1170, 1119, 993 og 727 cm-1.

(f) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i tegningens fig. 8.

(g) Carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i tegningens fig. 33 og opregnet i tabel 10 IVA.

(h) Elektronanslagsspektrum som vist i fig. 9 med målte m/z-værdier og foreslåede grundstofsammensætninger som vist i tabel V, opnået ved massemålinger med høj opløsningsevne.

15 LL-F28249+; (a) Molekylvægt: 598 (FAB-MS).

(b) Molekylformel: C^HsoOg.

(c) Specifik optisk rotation: [a]26 = +150 ± 4° (C = 0,3, acetone).

20 (d) Ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig.

10, υν^χ011 = 244 nm (e 27·100)· (e) Infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig.

11 (KBr-skive): 3510, 2910, 1735, 1715, 1452, 1375, 1338, 1182, 1172, 1119 og 995 cm”1.

25 (f) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i fig. 12.

(g) Carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i tegningens fig. 13 og opregnet i tabel VIA.

30 (h) Elektronanslagsspektrum som vist i fig, 14 med målte m/z-værdier og foreslåede grundstofsammensætninger som vist i tabel VII, opnået ved massemålinger med høj opløsningsevne.

LL-F282496: 35 (a) Molekylvægt: 616 (EI-MS), (b) Molekylformel 055115209,

DK 165119 B

19 (c) HPLC-retentionsvolumen på 14,0 ml i systemet vist i tabel VIII.

(d) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) som vist i fig. 15.

5 (e) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i fig. 16.

(f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.

17.

LL-F28249£t 10 (a) Molekylvægt: 598 (EI-MS), (b) Molekylformel C35H5g08, (c) HPLC-retentionsvolumen på 14,8 ml i systemet vist i tabel VIII.

(d) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) som 15 vist i fig. 18.

(e) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i fig. 19.

(f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.

20.

20 IiL-F28249f I

(a) Molekylvægt: 598 (EI-MS).

(b) Molekylformel C35H50O3.

(c) HPLC-retentionsvolumen på 16,0 ml i systemet vist i tabel VIII.

25 (d) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) som vist i fig. 21.

(e) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i fig. 22.

(f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.

30 23.

LL-F2824977.: (a) Molekylvægt: 612 (EI-MS) .

(b) Molekylformel: C36H5208, - (c) HPLC-retentionsvolumen på 23,5 ml i systemet 35 vist i tabel VIII.

DK 165119B

20 (d) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) som vist i fig. 24, (e) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i fig. 25, 5 (f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.

26.

LL-F28249&; (a) Molekylvægt: 626 (EI-MS).

• (b) Molekyl formel: C37H54O8.

. 10 (c) HPLC-retentionsvolumen på 24,5 ml i systemet vist i tabel VIII.

(d) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) som vist i fig. 27.

(e) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) 15 som vist i fig. 28.

(f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.

29.

LL-F28249t: (a) Molekylvægt: 626 (EI-MS).

20 (b) Molekylformel C37H54O8.

(c) HPLC-retentionsvolumen på 26,0 ml i systemet vist i tabel VIII.

(d) Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol) som vist i fig. 30.

25 (e) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i fig. 31.

(f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig. 32.

LL-F28249K! (a) Molekylvægt: 584 (EI-MS).

30 (b) Molekylformel: C35H52O7.

26 (c) Specifik optisk rotation, [a]D = +189° (C = 0,165, acetone).

(d) Ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig.

34, UV^30H = 241 nm (E 20.400).

35 (e) Infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig.

35 (KBr-skive).

DK 165119B

21 (f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.36.

(g) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i fig. 37.

(h) Carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) 5 som vist i fig. 38 og opregnet i tabel IX.

LL-F28249X: (a) Molekylvægt: 626 (FAB-MS).

(b) Molekylformel C37H54O3.

(c) Specifik optisk rotation, [a]26 = +145* 10 (C = 0,23, acetone).

(d) Ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig.

39' Wmax°H = 244 nm (E 30·000)· (e) Infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig.

40 (KBr-skive).

15 (f) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.

41.

(g) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i fig. 42.

(h) Carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) 20 som vist i fig. 43 og opregnet i tabel X.

LL-F28249a: (a) Molekylvægt: 612 (EI-MS).

(b) Molekylformel ¢371155()7.

(c) Ultraviolet absorptionsspektrum som vist i fig.

25 44, UV^3°H = 241 nm (E 16.800).

(d) Infrarødt absorptionsspektrum som vist i fig.

45 (KBr-skive).

(e) Elektronanslagsmassespektrum som vist i fig.

46.

30 (f) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i fig. 47.

LL—F28249u: (a) Molekylvægt: 592 (EI-MS).

~ (b) Molekylformel ¢35114307.

35 (c) Specifik optisk rotation, [a]26 “ +131* (C = 0,325, acetone).

DK 165119B

22 (d) Ultraviolet absorptionsspektre som vist i fig.

48/ UVmax°H = 256 nra (E 20·500)/ 358 nm (E 8-830).

(e) Infrarødt absorptionsspektre som vist i fig.

49 (KBr-skive).

5 (f) Elektronanslagsmassespektre som vist i fig.

50.

(g) Protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) som vist i fig. 51.

(h) Carbon-13-kernemagnetisk resonansspektre (CDCI3) 10 som vist i fig. 52 og opregnet i tabel XI.

15 20 25

DK 165119 B

23 tr L s O U fv, p| N N CS M I? i? £* 4Γ 8383888BB8BB88B88Bo (1| -i-l

+J

CO

rQ

3

CO

4J

^ ® r- *«· r- ^ .- - - - .-- - ^ - - *- CO S J' m ,« W η ω U3* UI 'T « Μ N * ‘Λ n -4

CD

•Η g ΰ <u os « **

CN

ro

CM

Pm C · nj « H iH U ·

H O

h m r-i (0 g ϋ &»

g I g J

*ΙΓ'5 α·σσ = c g g g ^ σ S S S S S S

ro O 3 w o rH U -P r * 04 Ti ro S m i-l Vt 9 2 U ®

•p -S Q rH

^ m U £ ftf (C m . 0 3 u Q v X) Cn H,, CO ^ ri jH S cd co

-H cn B U

X -* co * r- cn cm U3 m cn <= f' ^ ^ ^ ^ t id 4J -P

w Λ- *~ V- a a\ ya Q\ co cn M5-i co Είη<Νσ^Γ-Γ-'Γ·οηο«®α®®22 ^ ih « & X E^^^^rnr^r-iCMCN^HONCor^r^vovo vw βΗ +) Μ Λ ‘d a o) a) o S +) 4J 3 Æ rH nj « 0) > o 4-1 X 4J Ό II —- QJ Ν’ S tr O^pn^^^ro^o-CMro^inror;^^- u cd u 24

O

DK 165119B

Tabel IV

Massemålinger ved stærk opløsning for LL-F28249a _m/z_Grundstofsammensætning 5 612,3705 c36h5208 594,3543 p36H50°7 576,3472 c36h48°6 484,3211 C30H44O5 10 482,2648 ^29^38^6 466,3097 C30H42°4 448,2987 C30H40°3 442,2375 . C26H3406 15 425,2327 C26H3305 354,2181 C23H30O3 314^1877 C20H26°3 - 278,1144 C15HI8O5 20 265,1786 C16H2503 248,1405 *-15^20^3 247,1705 c16h23°2 237,1838 ^*15^25^2 219,1740 *-15^230 25 151;0753 C9HU02 30 35

Tabel IVA

Carbon-13 NMR-data for LL-F28249B

25

DK 165119 B

o

Kemisk skift Kemisk skift

Carbon (ppm) Carbon (ppm) 5 1 173,3 18 68,3 2 142,6 19 67^8 3 139,5 20 67,7 10 4 137,7 21 48,4 5 137,3 22 45,7 6 133,9 23 41,0 7 123,8 24 40,8 15 8 123,4 25 36,1 9 120,3 26 35,9 ** 10 120,2 27 34;7 11 118.0 28 22.3 20 7 > '12 99,7 29 19,8 13 80,2 30 15,5 14 79,4 31 13,8 25 15 76,7 32 13,1 16 69,2 33 10,8 17 68,6 30 * Med feltet fra TMS, CDCl^-opløsning ** To uopløste signaler 35

O

DK 165119B

26

Tabel V

Massemåling ved stærk opløsning LL-F28249P

m/z_Grundstofsammensætning 5 .584,3388 C34H48O8 / 566;3306 C34H4607 456,2864 C28H40Os 442,2391 C26H3406 10 · 438,2780 <-28®38®4 425^2331. ^ C26H3305 354,2187 C23H30O3 314,1858 C20H26O3 15 278,1168 C15H1805 237,1491 C14H2103 219,1380 C14Hi902 . 209,1534 c13h21°2 191,1418 C13H190 20 ' 151,0750 CgH1102 25 30 35 27

O

DK 165119B

Tabel VI

Carbon-13 NMR-data for LL-F28249Y

Kemisk skift"^ Kemisk skift

Carbon_(ppm)_ Carbon_(PP.m.)- 5 1 173,6 19 68,3 2 142,4 20 67,9 3 139 j 9 21 57;7 4 137,3 22 48,5 5 136,0 23 45,8 10 6 134,0 24 41,2 7 123,8 25 ' 40,8 8 123,6 26 36,2 9 120,4 27 36,1 10 119,6 28 36,0 15 11 118,5 29 34,8 12 99,8 30 22,3 13 80,5 31 19,9 14 77,8 32 15,5 .

15 77,0 33 13,8 20 16 76,8 84 13,1 17 69,3 35 10,8 18 68,6 25 1} Med feltet fra TMS, CDCl-j-opløsning.

30 35

O

DK 165119B

28

Tabel VII

Hassemåling ved stærk opløsning for LL-28249γ m/z_Grunds t o f s ammens ætn ing 5 598^,3543 ^35^50^8 580,3422 ¢35^48^7 562,3292 C35H46°6 496,2824 C30H40O6 10 484,2440 C28H36O7 478,2687 ¢30^38^5 456,2576 C27H36°6 438,2772 C28H38O4 15 425,2341 C26H33O5 420,2651 ^28^36^3 354,2199 G23H30O3 314,1875 ^20^26^3 292,1307 c16h20°5 20 288,2075 G19H28O2 248,1397 G15H20O3 237,1490 G14H21O3 219,1382 C3.4H39O2 25 209,1544 C13H21O2

191,1435 G13H19O

151,0759 ^911^^02 30 35

DK 165119 B

29

Tabel VTTT

HPLOretentionsvoluminer for 5 LL-F28249g, i, ε , c· n > ff -Q9~

Forbindelse Retentionsvolumen (ml) LL-F28249 α 19,8 LL-F28249 6 14;0 LL-F28249 ε 14,8 10 LL-F28249 ζ 16,0 LL-F28249 η 23,5 LL-F28249ff 24,5 LL-F28249 ^ 26,0 15 * Systemet omfatter en kolonne 3/9 mm x 30 cm pakket med C^g omvendt-fase-pakning fremkaldt med methanol/vand = 80:20 ved 1,0 ml/minut, påvisning sker ved absorbans ved 254 nm.

20 25 30 35

Tabel IX

DK 165119 B

30

Carbon-13-NMR-data for LL-F28249fc

Kemisk skift* Kemisk Skift 5 Carbon_(ppm)_Carbon_(ppm)_ 1 173,9 19 56,7 2 140,7 20 48,4 3 138.,3 21 47,7 •4 136,6 22 41,1 10 5 136,5 23 40,6 6 133,8 14 37,1 7 124,7 . 25 36,3 8 124,4 26 36,0 9 123,8 27 35,9 15 10 120,1 28 34,6 11 118,5 29 22,0 12 99,7 30 19,3 13 77,2 31 16,0 14 76,6** 32 13,8 20 15 76,5 33 13,3 16 69,3 34 13,1 17 68,6 35 10,7 18 67,3 25 * Med feltet fra TMS, CDClg-Opløsning.

** Sammenfaldende med CDCl^-signaler.

30 35

Tabel X

31

DK 165119 B

Carbon-13-NMR-data for LL-F28249^ T. . . , . 1 Kemisk Skift

Kemisk skift 5 Carbon lppm)_Carbon_<PPm) 1 173;6 19 68,3 2 142,5 20 67,3 3 139,8 21 57,3 10 4 137,4 22 48,6

5 137, 2 23 45,S

6 136,0 24 41,2 7 130,7 25 40,3 15 ' 8 123.6 26 36,1 2 9 120,3 27 36,0 . 10 119,7 28 34,9 20 11 118i6· 29 26r 12 99,8 30 23,0 2 13 80,5 31 22,4 14 77,7 32 20,0 25 15 77,6 33 15,7 16 76,7 34 14,0 17 69,3 35 11,1 18 68,6 30 35

Med feltet fra TMS, CDCl^-opløsning.

2

To uopløste signaler.

32

DK 165119B

Tabel XI

Carbon- 13-NMR-data for LIi-F28249^

Kemisk skift* Kemisk skift 5 Carbon_(ppm)_Carbon_(ppm) 1 167,4 18 69,4 2 150,5 19 68,7 3 142,9 20 68,3 10 4 142, 0 21 48,4 5 137f2 ** 22 41,0 ** 6 132,1 23 35,9 7 130.7 24 35.6 15 8 125,8 25 35,5 9 125,5 26 34;4 10 124,2 27 29,7 20 11 123 , 7 28 26,8 12 123,2 29 22,9 13 121,3 30 22,8 14 118,0 31 22,1 25 15 100,0 32 15P3 16 76,7 33 13,9 17 74.6 34 -11,0 30 * Med feltet fra TMS, CDCl^-opløsning. ijfe To uopløste signaler, 35

Tabel XII

33

DK 165119B

Chromatografiske data TLC HPLC -retentionstid 5 Komponent relativ Rf_(minutter) α 1,00 13T8 ' β 0,797 9,3 γ 1,42 12τ6 10 d 0,758 10,4 e 1.06 10,9 ζ 1,12 11,5 η 1,03 16,2 15 8 1,27 17,3 i 1,27 18,2 κ 1,83 24,7 λ 1,56 19,1 20 1 μ 1,92 38,0 ν 1,95 42,3 25 * "Analtech Silica Gel GHLF", 250 μια, fremkaldt med ethyl- acetat/methylenchlorid = 1:3, påvisning ved forkulning med H2S04.

** "Altex® Ultrasphere ODS", 5 μπι 4,6 mm x 25 cm, fremkaldt med 85% methanol i vand ved 1,0 ml/minut, påvist ved 30 absorbans ved 254 nm.

35 *

DK 165119 B

34

Den anvendte organisme opbevares i The Culture Collection of Medical Research Division, American Cyanamid Company, Pearl River, New York, som kultur nr. LL-F28249.

En levende kultur af denne nye mikroorganisme er blevet 5 indleveret hos The Patent Culture Collection Laboratory, Northern Regional Research Center, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois 61604, og er indgået i dets permanente samling. Den er frit tilgængelig for offentligheden under deponeringsnummer NRRL 15773.

10 Til fremstilling af disse antibiotika kan også anven des naturligt forekommende mutanter af denne organisme samt mutanter frembragt ud fra denne organisme ved hjælp af forskellige mutagene metoder, der er kendt af fagfolk, f.eks. udsættelse for nitrogensennep, røntgenbestråling, ultraviolet 15 bestråling, Ν'-methyl-Ν'-nitro-N-nitrosoguanidin eller ac-tiophager. Det er også meningen at medtage inter- og in-traspecifikke genetiske rekombinanter fremstillet ved genteknologi, som er kendt af fagfolk, såsom konjugation, trans-duktion og genteknologiske metoder. Afgørende er blot, at 20 de anvendte mutanter har væsentligt samme egenskaber som NRRL 15773.

Almene fermenterinasbetinaelser Dyrkning af Streptomyces cyaneogriseus noncyaneo-25 genus, NRRL 15773, kan foregå i en lang række forskellige flydende dyrkningsmedier. Sådanne medier omfatter en as-similerbar carbonkilde, f.eks. dextrin, saccharose, melasse eller glycerol, en assimilerbar nitrogenkilde, .f.eks. protein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyrer eller 30 majsstøbevæske, og uorganiske anioner og kationer, f.eks. kalium, natrium, ammonium, calcium, sulfat, carbonat, phos-phat eller chlorid. Sporelementer, f.eks. bor, molybden og kobber, tilføres som urenheder fra andre bestanddele i medierne. Gennemluftning i tanke og kolber sker ved at presse 35 steril luft gennem eller ned på overfladen af fermenteringsmediet. Yderligere bevægelse i tankene sker med et mekanisk

DK 165119B

35 skovlhjul. Der kan, om nødvendigt, tilsættes et antiskum-memiddel, såsom siliconeolie.

Opfindelsen vil i det følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler.

5

Eksempel 1

Fremstilling af podestof

Et typisk medium, der anvendes til dyrkning af de forskellige stadier podestof, fremstilles efter følgende 10 opskrift:

Dextrose 1,0%

Dextrin 2,0% Gærekstrakt 0,5% NZ-amin 0,5% 15 Calciumcarbonat 0,1%

Vand op til 100,0%

Mediet steriliseres. En portion på 100 ml af dette sterile medium i en kolbe inokuleres med mycelieafskrab fra en skråagar af Streptomyces cyaneogriseus noncyanogenus 20 NRRL 15773. Mediet rystes derpå kraftigt på en roterende ryster i 48-72 timer ved 28’C, hvilket giver primært podestof. Dette primære podestof anvendes derpå til at pode 1 liter af ovennævnte sterile medium, som derpå dyrkes aerobt ved 28·C i 48 timer, hvorved man får sekundært podestof.

25

Eksempel 2 Fermentering

Der fremstilles et fermenteringsmedium med følgende sammensætning: 30 Dextrin 1,0%

Sojapepton 1,0%

Melasse 2,0%

Calciumcarbonat 0,1%

Vand op til 100,0% 35 Dette medium steriliseres, og derpå inokuleres en portion på 30 liter med 1 liter af det sekundære podestof

DK 165119B

36 fremstillet som beskrevet i eksempel l. Fermenteringen sker ved 30eC med en steril luftstrøm på 30 liter/minut, modtryk 1,56 kg/cm2 og omrøring med et skovlhjul, der roterer med 500 omdr./min., i 91 timer, på hvilket tidspunkt mæsken 5 høstes.

Eksempel 3

Isolering af LL-F28249o:. β oa nr I alt 26 liter af den høstede helmæsk, der er frem-10 stillet som beskrevet i eksempel 2, blandes med 1500 g diatoméjord og filtreres. Myceliekagen vaskes med 5 liter vand, og filtrat og vaskevæske kasseres. Myceliekagen blandes med 10 liter methanol i en time, filtreres derpå og vaskes med 5 liter methanol. Methanolekstrakten og methan-15 olvaskevæsken kombineres og inddampes til en vandig remanens på ca. 1-2 liter. Denne vandige remanens blandes med det dobbelte volumen methylenchlorid og blandes i en halv time. Methylenchloridfasen fraskilles og inddampes derpå til en sirup, hvilket giver 27 g råmateriale.

20 Disse 27 g råmateriale opløses i en blanding af meth- ylenchlorid og methanol, filtreres gennem vat og vandfrit natriumsulfat og inddampes derpå, hvilket giver 7,0 g af en olie.

En portion på 170 g silicagel opslæmmes i 12,5% eth-25 ylacetat i methylenchlorid og hældes op til dannelse af en kolonne på 2,5 x 58 cm. Olien opløses i 12,5% ethylacetat i methylenchlorid og påføres kolonnen. Kolonnen fremkaldes med samme opløsningsmiddelblanding. Den mobile' fase løber med 1,3 ml/min. til at begynde med, og der opsamles 15 mi-30 nutters fraktioner. Strømningshastigheden nedsættes til ca. 0,5 ml/min. efter 10 fraktioner, således at fraktionerne 1-10 er på 20 ml aftagende ensartet til ca. 10 ml, og fraktionerne 11-98 er på ca. 7 ml. Ved fraktion 99 forøges strømningshastigheden, således at der fås 25 ml fraktioner på 10 35 minutter. Der opsamles i alt 105 fraktioner. Disse fraktioner afprøves med tyndtlagschromatografi i ethylacetat/methylen-

DK 165119B

37 chlorid = 1:1.

Fraktionerne 30-54 kombineres og inddamps, hvilket giver 1,08 g olie, der indeholder LL-F28249nr.

Fraktionerne 55-62 kombineres og inddampes, hvilket 5 giver 150 mg faststof indeholdende LL-F28249a og β.

De 150 mg faststof indeholdende LL-F28249a og β chro-matograferes med præparativ HPLC ved hjælp af en omvendt--fase-kolonne ("Whatman® C8", 2,2 x 50 cm), fremkaldt med 80% vol/vol methanol i vand. Strømningshastigheden er ca. 10 10 ml/min., og der indsamles 2 minutters fraktioner.

Fraktionerne 58-59 kombineres, methanolet afdampes, der tilsættes tert.butanol, og blandingen lyophiliseres, hvilket giver 60 mg rent LL-F28249a.

Fraktionerne 40-43 kombineres, methanolet afdampes, 15 og den tiloversblevne, vandige suspension ekstraheres med methylenchlorid, hvilket efter inddampning giver 10 mg rent LL-F28249/J.

De 1,08 g olie, der indeholder LL-F28249ir, opløses i 10% ethylacetat i methylenchlorid og påføres en kolonne 20 (2,5 x 50 cm) pakket med silicagel. Kolonnen fremkaldes med 10% ethylacetat i methylenchlorid, idet der elueres med en strømningshastighed på 2 ml/min. og opsamles 12 minutters fraktioner. Fraktionerne 19-29 kombineres og inddampes til en remanens, som renses ved præparativ omvendt-fase-25 chromatografi som beskrevet for a- og β-komponenterne. Fraktionerne 55-62 kombineres, methanolet afdampes i vakuum, der tilsættes tert.butanol, og blandingen lyophiliseres, hvilket giver 60 mg rent LL-F28249t.

30 Eksempel 4

Fermentering i stor målestok Et podestof af Streptomyces cyaneogriseus noncyano-genus, NRRL 15773, fremstilles som beskrevet i eksempel 1, idet der anvendes 100 ml primært podestof til fremstilling 35 af 10 liter sekundært podestof.

Der foretages to gange 300 liters fermentering som

DK 165119B

38 beskrevet i eksempel 2,' idet der anvendes 10 liter af ovennævnte sekundære podestof til hver 300 liter fermenterings-medium. Efter 118 timer hestes mæsken.

5 Eksempel 5

Isolering af LL-F282496. e. f, n. S og t I alt 450 liter hæstet mæsk fra de to 300 liters fermenteringer, der er beskrevet i eksempel 4, behandles som beskrevet i eksempel 31 s første del, hvilket giver et 10 råmateriale som en sirup.

Denne sirupsagtige remanens vaskes med hexan for at fjerne ikke-polære materialer, og de tiloverblevne 9 g uopløseligt materiale underkastes "Sephadex® LH-20"-adskil-lelseschromatografi.

15 Den chromatografiske kolonne fremstilles med 9 liter "Sephadex® LH-20", der i forvejen er kvældet i methanol, således at der dannes en kolonne på 10 x 100 cm. Kolonnen bringes i ligevægt, ved at der ledes ca. 4800 ml mobil fase (methylenchlorid/hexan/methanol = 10:10:1) igennem den med 20 en strømningshastighed på 5 ml/min. De 9 g uopløseligt materiale kommes på kolonnen i 50 ml mobil fase. Et indledende forløb på 2150 ml fås med en strømningshastighed på 5 ml/min. Strømningshastigheden forøges derpå til 8 ml/min., og der opsamles fraktioner hver 45 minutter.

25 Fraktionerne 4-7 kombineres, og opløsningsmidlerne afdampes i vakuum, hvilket giver en remanens på 1,9 g.

Denne remanens chromatograferes på en kolonne af 200 g silicagel (2,5 x 83 cm), idet der anvendes 10% ethyl-acetat i methylenchlorid som elueringsmiddel. Strømnings-30 hastigheden er ca. 2 ml/min., og der opsamles fraktioner hver 12 minutter.

Fraktionerne 65-67 og 73-79 kombineres sammen, og opløsningsmidlerne afdampes i vakuum, hvilket giver 250 ml remanens.

35 Disse 250 mg remanens underkastes præparativ omvendt- -fase-chromatografi som beskrevet i eksempel 3, men der

DK 165119B

39 anvendes 75% methanol i vand som den mobile fase. Strømningshastigheden er ca. 10 ml/min. Den første portion på 2000 ml af eluatet kasseres, derpå opsamles 72 fraktioner med 2 minutters mellemrum. Efter at endnu en portion eluat 5 er kasseret (mellem 300 og 400 ml), opsamles igen fraktioner, men med mellemrum på 2,5 minutter.

Fraktionerne kombineres med mellemrum på 2,5 minutter. Fraktionerne kombineres som anført nedenfor. De kombinerede fraktioner får lov at inddampe i et stinkskab natten 10 over, og derpå ekstraheres komponenterne over i methylen-chlorid. Efter afdampning af opløsningsmidlet opnås ca. 1 ml af hver ren komponent.

Komb. fraktioner Forbindelse 15 7-10 LL-F282495 19-22 LL-F28249e

28-31 LL-F28249C

81-83 LL-F28249n 86-88 LL-F282498 20 93-95 LL-F282491

Eksempel 6

Isolering af LL-F28249K, λ. u oo v I alt 390 liter fermenteringsmæsk, høstet fra fer-25 menteringer foretaget som beskrevet i eksempel 2, oparbejdes i alt væsentligt som beskrevet i første afsnit af eksempel 3, hvilket giver 120 ml methylenchloridkoncentrat.

Dette koncentrat fortyndes med 200 ml hexan og afkøles natten over ved 4eC. Det fremkomne bundfald fjernes ved filtrering 30 og kasseres. Filtratet fortyndes med 300 ml hexan. Det fremkomne bundfald (A) opsamles ved filtrering og opbevares.

Dette filtrat inddampes til tørhed, og den olieagtige remanens opløses derpå i 200 ml methylenchlorid og fortyndes med 1700 ml hexan. Det fremkomne bundfald (B) opsamles ved 35 filtrering og opbevares. Dette filtrat koncentreres til en olieagtig remanens, som derpå atter opløses i 50 ml methyl-

DK 165119B

40 enchlorid, der tilsættes 950 ml methanol, og denne opløsning opbevares ved 4“C i 3 dage. Det fremkomne bundfald fjernes ved filtrering og kasseres. Filtratet inddampes til tørhed, og remanensen (C) kombineres med (A) og (B) og underkastes 5 chromatografi på følgende måde: Kolonnen på 5,0 x 109 cm opslæmningspakkes med "Woelm TSCM-silicagel i ethylacetat/-methylenchlorid = 1:9. Kolonnen fremkaldes med samme opløsningsmiddelblanding ved en hastighed på 25 ml/min. De første 2 liter afløbsvæske kasseres, derpå opsamles 16 fraktioner 10 på 400 ml.

Fraktionerne 2 og 3 kombineres og inddampes, hvilket giver 3,9 g olieagtigt materiale (D).

Fraktionerne 4-7 kombineres og inddampes, hvilket giver 9,5 g olieagtigt materiale, som opløses i hexan og 15 chromatograferes på en 2,5 x 110 cm kolonne, der er opslæmningspakket med 300 g "Woelm,,-silicagel i ethylacetat/hexan = 1:4. Kolonnen fremkaldes med samme opløsningsmiddelsystem med en hastighed på 4 ml/min., idet der opsamles fraktioner med 7 minutters mellemrum.

20 Fraktionerne 45-54 kombineres og inddampes, hvilket giver 0,3 g materiale (E).

Fraktionerne 63-135 kombineres, inddampes til tørhed, opløses derpå igen i tert.butanol og lyophiliseres, hvilket giver 4,6 g næsten hvidt faststof (F).

25 LL-F28249K og u

Materiale (D) og (E) kombineres og chromatograferes på en 2,5 x 110 cm kolonne pakket med 300 g "Woelm,,-sili-cagel, idet der fremkaldes med ethylacetat/hexan = 1:9. Strømningshastigheden holdes på 4 ml/min., og der opsamles 30 fraktioner med 7 minutters mellemrum.

Fraktionerne 67-115 kombineres og inddampes til tørhed, hvilket giver 920 mg remanens (G).

Denne remanens (G) chromatograferes ved præparativ HPLC ved hjælp af en omvendt-fase-kolonne ("Whatman® C8", 35 2,2 x 50 cm) og fremkaldes med 85% vol/vol methanol i vand.

Strømningshastigheden er ca. 10 ml/min., og der opsamles

DK 165119B

41 fraktioner med 2,5 minutters mellemrum.

Fraktionerne 33-40 kombineres, inddampes for at fjerne methanolet, ekstraheres derpå med methylenchlorid. Remanensen, der fås efter inddampning, opløses i tert.butanol og 5 lyophiliseres derpå, hvilket giver 60 mg LL-F28249*.

Fraktionerne 52-58 oparbejdes på samme måde, hvilket giver en lille smule LL-F28249/i.

LL-F28249X

1 g af materiale (F) chromatograferes ved omvendt-10 -fase-HPLC som beskrevet ovenfor med undtagelse af, at der anvendes 80% vol/vol methanol i vand som elueringsmiddel.

Fraktionerne 61-75 kombineres og oparbejdes som ovenfor, hvilket giver 100 mg LL-F28249X.

LL-F28249U

15 396 g materiale i alt væsentligt det samme som mate riale (D) ovenfor opløses i 500 ml methanol og afkøles derpå ved 4*C i flere timer. Det fremkomne bundfald fjernes ved filtrering, vaskes med koldt methanol og kasseres. Filtratet og vaskevæske kombineres og inddampes. Residualolien opløses 20 i hexan og fyldes på en 5 x 50 cm tørt pakket silicagelko-lonne ("Mallinckrodt® Silicar cc-7"). Kolonnen elueres med ethylacetat/hexan = 1,5:8,5 med en hastighed på ca. 50 ml/-min.

Der opsamles fire fraktioner:

25 Fraktion Volumen fliterV

1 1 2 4 3 1 4 2 30 Fraktion 3 inddampes, hvilket giver 5,0 g remanens, som renses ved præparativ omvendt-fase HPLC ("Waters® Cjg", 5 x 60 cm). Kolonnen fremkaldes først med 16 liter 80% methanol i vand, vol/vol. Den første liter afløbsvæske kasseres, og derpå opsamles fraktioner på 400 ml.

35 Fraktionerne 44-47 kombineres og oparbejdes som be skrevet ovenfor og giver 390 mg LL-F28249u som et bleggult

DK 165119B

42 faststof.

Eksempel 7 LL-F28249, NRRL 15773's fermenteringsvæskes antinematodiske 5 virkning

Denne in-vitro-prøve er tænkt benyttet til den frit-levende nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) for at påvise fermenteringsvæskers anti-nematodiske virkning mod mikroorganismer fra jorden. Prøvemetoden består i, at der 10 pipetteres 50 μΐ af hver væske i et af 96 huller på en mi-krodyrkningsplade, hvorpå der tilsættes 10 μΐ af en 3-4 dage gammel kultur af C. elegans (i alle udviklingsstadier) suspenderet i C. briggsae-vedligeholdelsesmedium. Fermenteringsvæskernes virkninger iagttages og noteres 48 timer 15 efter den indledende blanding af væske og nematoder.

Fermenteringsvæske fra LL-F28249, NRRL 15773, dræber alle voksne individer og reducerer udpræget overlevelsen og mobiliteten hos forskellige larvestadier ved både den indledende prøve og ved en gentaget prøve.

20

Eksempel 8

Anthelmintisk aktivitet in vivo hos LL-F28249.

NRRL 15773

Dette in-vivo-system er udtænkt til påvisning af 25 potentiel anthelmintisk aktivitet hos alle fermenteringsprodukter, der viser sig at have anti-nematodisk virkning mod C. elegans. Prøver af LL-F28249, NRRL 15773, blandes i foder i koncentrationer fra 0,0031% til 2,0% (31 ppm til 20.000 ppm). Denne medicintilsatte kost, der indeholder de 30 varierende koncentrationer af LL-F28249, NRRL 15773, gives til Gerbillus-mus inficeret med 400 3.-stadiums-larver af Trichostrongylus colubriformis. Det medicintilsatte foder gives ad libitum, begyndende, når infektionen er 7 dage gammel, i 1/2 til 4 dage, hvorefter Gerbillus-musene ob-35 duceres. Tarmene udtages og anbringes i vand i en inkubator ved 45*C i 2 timer, således at parasitterne kan udvandre

DK 165119B

43 fra vævet. Hver behandlings effektivitet bestemmes ved at opgøre antallet af T. colubriformis, der er tilbage, sammenlignet med en ubehandlet kontrol. Resultaterne af disse eksperimenter, der er anført i tabel XIII nedenfor, viser 5 den anthelmintiske aktivitet hos LL-F28249, når det indgives i foder, indgives som en enkelt oral portion og ved subcutan injektion.

10 15

DK 165119B

44 in in

CM CM

O O O O

Ό - «· * -

0 O ID O O

S 1-1 p‘ 3

P

r—i 3 in m lo X lo o o o o o o o o o o o 1 ^ S «»·» ^ »i ^ m cm o o η in co o σι o in ino i" S m cm co cn H n > r-> to 3

in 3 P

H g H

I Si 3j tn η tn

Pi 3 Η H

pi h t n c £ η Ό o o ho Οσο η o h o o o o h o •HttS " - *· *· r£j - - »«·*·* H “ ** r r - λ m co orr oo o o o oo -P o o oo cn P ' cm oo σι h in o o r- i4 m o o

0 P H 3 H H Øi—I

CM O 0 P ·η oo Ό O 3

CM in O H

fe O Ή P

I Λ H 3 3] P 0 3 tn 3 o o mo^ioo mo -P o o cm m H 10 ' ^ «· 3 v r ;3 * v »· * |j ιί g r—i o co ooøoo oo I o o o om ΓΊ p ρ H in σι o o o o Si o o o

H 14-, o -P CM i—I 3 Η H i—I 3 Η H

x p 3 0 tn

P H H

ΓΓ; 0 P U Ό Ό ® Ρ Λ H 0 0

Λ in 3 *0 S S

<0 O H 0 t^-POeoo oo oo oo oo oo tø *·*·«.*» *» *» * *k

føoo oo oo ooi OO HO

ø tn ø o o cm o ooho oo o

> 3 s m Η H CM Η H CM Η H

Η H

4-1 J>- —- -—· -—- si tr G1 x? tr tr

3 3 ~ .M.M MM

0 g g \ \ \ \

HP Qj« a# GidPGidP tPdPtndP

P ft ft g ε g g

· VH · ·*·—' » w I 'w* · s«# I

0 O P P P P PP

P J3 · Λ! · Si tn M in M COM to M

H O O 0 O 0 H 0 H 0 H 0 H 0

>H 3 P 3 P in P (Q P W P W P

HP OPOP OPOP OPOP

P &H « W « H QH QH Q W QW

iC -—V N

μ n jj M -G) <1) 0)

to P P P

H 0 0 0 P to 10 to

3 Η Η H

HH Η H

g σ ,14 H ,14 Η ,£! Η Η -ί 01 3 to Μ ιο Μ 0 CM ft) ίΐι fBft røfti ,3 °o S o so go +J CM H >i H >i H>1

3 I 0 H 0 H 0 H

_ < — a Sir-a ?- cd—a

DK 165119B

45

Eksempel 9

Anthelmintisk aktivitet hos LL~F28249tt mod parasitiske nematoder hos får

Dette forsøg er udtænkt til bedømmelse af aktivi-5 teten hos LL-F28249a mod de økonomisk betydningsfulde parasitter hos får. Fårene inokuleres ved forsøget med smitsomme larver af Haemonchus contortus, Ostertagia circum-cincta og Trichostrongylus colubriformis for at opbygge infektioner, som LL-F28249a kan afprøves imod. 21 dage efter 10 inokulering bestemmes infektionsniveauer ved standardtællemetoder til netværkstælling af nematoder for at bestemme antallet af æg af hver art pr. g fæces. Fårene fordeles tilfældigt under tre behandlingsgentagelser og kontrolgrupper baseret på tællinger af nematodeæg. 22 dage efter infektion 15 behandles fårene med LL-F28249a med de doser og indgiftsveje, der er vist i tabel XIV nedenfor. 78 dage efter behandling aflives fårene, og ormene indsamles ved hjælp af standardmetoder til anthelmintisk bedømmelse. Hver behandlings effektivitet mod hver art bestemmes ved at sammenligne antallet 20 af orme ved de respektive doser med antallet af orm, der findes hos de tre ubehandlede kontroldyr. Resultaterne af disse bedømmelser, der er anført i tabel XIV nedenfor, viser, hvor effektivt LL-F28249a er som anthelmintisk middel.

DK 165119B

46

Tabel XIV

LL—F282490;1 s anthelmintiske effektivitet mod Haemonchus.

Ostertaqia οσ Trichostronavlus hos får

Effektivitet (%) mod 5 Dosis Indgifts- - mg/kg vej Hæemonchus Ostertagia T. colubriform.

1.0 oral 100,0 100,0 99,9 0,2 oral 100,0 100,0 99,9 10 0,1 oral 100,0 95,4 99,9 1.0 IM 100,0 100,0 100,0 0,2 IM 100,0' 100,0 100,0

Gennemsnitligt antal fundne orme fomtr.^ 0,0 - 2683,0 881,0 16.200,0 3.5 - IM = intramuskulær

Eksempel 10

Effektivitet af antibiotikum LL-F28249oi mod insekt-20 parasitten Melophaaus ovinus ffåretæael hos får

Dette forsøg gennemføres løbende på de samme får, der anvendes til bestemmelse af anthelmintisk aktivitet som anført i eksempel 9. Fårene iagttages før behandling med hensyn til naturlige angreb af M. ovinus. Halvdelen af 25 hvert får inspiceres for tegn på anti-ektoparasitisk aktivitet ved obduktion 7 dage efter behandling.

Hvert fårs venstre side klippes langsomt med elektrisk sakt og inspiceres for levende og døde fåretæger. Angrebsgraden anslås tilnærmelsesvis ved det antal pupper, 30 der findes i ulden under inspektion, og bedømmes fra 0 til +++, dvs fra ingen pupper til mange pupper. Antallet af tæger noteres for hvert får uden kendskab til behandlingsniveauer for at opnå en uvildig bedømmelse. Indledningsvis noteres tæger som levende eller døde, men efterhånden som 35 man opnår erfaring, kan nogle tæger noteres som døde på grund af abnormt langsom adfærd.

Selv om der forekommer store variationer i det antal

DK 165119 B

47 tæger, der findes på fårene, viser de data, der er anført i tabel XV nedenfor, at LL-F28249a er effektivt mod M. ovinus, og at forbindelsen har systemisk ektoparasiticid aktivitet.

Hos behandlede dyr reduceres antallet af levende tæger ef-5 fektivt, og antallet af døde tæger forøges hos de med in-tramuskulær injektion behandlede får.

Tabel XV

Effektivitet*3) af F28249a mod Molophagus ovinus 10 hos får

Gen.snl. antal tægera)

Dosis Indgifts- --- mg/kg vej Levende Døde % 15 1,0 Intramusk. 1,67 1,67 78,22 0,2 Intramusk. 1,00 4,33 86,96 1,0 Oral 7,67 0,0 0,0 0,2 Oral 2,67 3,0 65,0 20 0,1 Oral 22,0 1,67 0,0

Kontrol - 7,67 0,67 a) Tre får pr. dosis 25 b) Effektivitet % =

Gensn.antal hos kontr. - gensn.antal hos beh.

100 x -

Gensn.antal hos kontr.

30 Eksempel 11

Insekticid aktivitet hos forbindelserne ifølge opfindelsen

Den insekticide aktivitet hos forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse mod en række forskellige insek-35 ter ved forskellige koncentrationer af aktivt stof i ace-tone/vand-opløsninger bestemmes ved hjælp af følgende insekticide prøveeksempler. Resultaterne af disse prøver findes i tabel XVI.

DK 165119B

48 (A) Heliothis virescens, æg af tobaksknoporm.

Et ungt bomuldsblad, ca. 7-8 cm langt, dyppes og bevæges 1 en prøvesuspension i 3 sekunder. Æg samles på osteklæde, som skæres i kvadrater på 10-20 mm indeholdende 5 ca. 50-100 æg (6-30 timer gamle). En kvadrat osteklæde med æg dyppes også i prøvesuspensionen og anbringes på det behandlede blad. Derefter anbringes kombinationen i et stinkskab for at tørre. Kombinationen anbringes i en "Dixie®"-skål nr. 2168-ST (240 ml, 6 cm høj, topdiameter 10 9,5 cm, bunddiameter 8 cm) indeholdende 5 cm fugtig dental væge. Et klart plastlåg lægges på skålen, og behandlingerne pågår i 3 dage, før der foretages optælling af døde eksemplarer.

(B) Aphis fabae. blandede stadier, bedelus.

15 Potter indeholdende en enkelt nasturtiumplante (Tro- paeolum sp.), ca. 5 cm høj, inficeres med ca. 100 bladlus en dag før prøven. I et stinkskab sprøjtes hver plante med prøvesuspensionen med en "nr. 154 DeVilluss"-forstøver, medens en drejeskive med 4 omdr./min. foretager 2 omdrej-20 ninger. Potterne henstilles på siden på hvide, emaljerede bakker og opbevares i 2 dage. Herefter foretages et skøn over antallet af døde bladlus.

(C) Empoasca abrupta. voksen kartoffelcikade.

Et sieva-limabønneblad, ca. 5 cm langt, dyppes og 25 bevæges i prøvesuspensionen i 3 sekunder og anbringes derpå i et stinkskab for at tørre. Bladet anbringes i en 100 x 10 mm Petriskål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bunden af skålen. Der tilføres 10 voksne cikader til hver skål, og behandlingerne foregår i 3 dage, hvorefter der foretages 30 tælling af døde cikader.

(D) Trichoplusia ni. tredje stadiumslarver af kålmåler.

Blade af en Sieva-limabønneplante, udfoldet til 7-8 cm's længde, dyppes og bevæges i en prøvesuspension i 3 35 sekunder og anbringes derpå i et stinkskab for at tørre.

Et blad udskæres derpå og anbringes i en 100 x 10 mm Petri-

DK 165119 B

49 skål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bunden, og der anbringes 10 3.stadiumslarver derpå. Skålen opbevares i 3 dage, før der foretages observationer med hensyn til dødelighed og reduceret fødeindtagelse.

5 (E) Spodoptera eridanis. 3.stadiumslarver af hær orm.

Bladene fra en Sieva-limabønneplante, udfoldet til 7-8 cm1 s længde, dyppes og bevæges i prøvesuspensionen i 3 sekunder og anbringes i et stinkskab for at tørre. Derpå 10 udskæres et blad og anbringes i en 100 x 10 mm Petriskål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bunden, og der tilføres 10 larver i 3. stadium. Skålen opbevares i 5 dage, før der foretages observationer med hensyn til dødelighed, reduceret fødeindtagelse eller eventuel forstyrrelse af normalt ham-15 skifte.

(F) Heliothis virescens. larver i 3. stadium af tobaksknoporm.

Bomuldskimblade dyppes i prøvesuspensionen og anbringes i et stinkskab for at tørre. Kimbladet skæres i 4 20 dele, og hver del anbringes i et 30 ml plastmedicinbæger indeholdende et stykke på 5-7 mm fugtig dentalvæge. Der tilsættes en larve i 3. stadium til hvert bæger, og der lægges et paplåg over bægeret. Behandlinger opretholdes i 3 dage, før der foretages optælling af døde eksemplarer og 25 skøn af reduceret fødeindtagelse.

(G) Musca domestica. stueflue.

Den ønskede koncentration af prøveforbindelsen tilsættes til standard CSMA-lucerneklid-larvemedium. Stueflueæg, 0-4 timer gamle, tilsættes til det behandlede medium. Det 30 behandlede medium opbevares, og der foretages observationer med hensyn til ægklækning, larvevækst og fremkomst af voksne eksemplarer.

_ (H) Tribolium confusum. melbiller.

Melbiller fås fra laboratoriekolonier opdrættet på 35 en blanding af hel hvede og hvidt mel. Til denne prøve behandles hvidt mel med en acetoneopløsning af prøvematerialet,

DK 165119B

50 idet der anvendes l ml opløsning pr. 5 g mel i en 30 ml krukke med bred åbning. Acetonen afdampes i et stinkskab natten over. Indholdet omrøres med en spatel for at udrøre klumper, der er dannet af prøveopløsningen. Krukken anbringes 5 derpå på en "Vortes-Genie"-vibrationsblandemaskine, således at prøvematerialet blandes omhyggeligt i foderet. 10 Voksne melbiller anbringes i hver krukke, og der lægges løst låg på krukken. Efter 5 dage til æglægning fjernes insekterne, og eventuel dødelighed noteres. 2 og 4 uger efter den ind-10 ledende smitning foretages observationer vedrørende antal og spor frembragt af udviklende larver gennem det behandlede mel. Sådanne iagttagelser viser forsinket vækst, dræbte æg eller larver eller eventuel anden forstyrrelse i det normale vækstmønster. Efter ca. 9 uger ved 27°C kommer de voksne 15 eksemplarer frem, og de sidste observationer foretages ved at lade indholdet af hver krukke passere gennem en 0,3 mm sigte. Disse observationer omfatter antallét af voksne, pupper og larver samt undersøgelse af affald, som ikke passerer gennem sigten, for at bestemme, om der findes døde æg 20 eller nyklækkede.

(I) Tetranvchus urticae (P-resistent stamme), toplettet spindemide.

Sieva-limabønneplanter med primære blade udfoldet til 7-8 cm udvælges og skæres tilbage til en plante pr.

25 potte. Et lille stykke af et blad taget fra hovedkolonien af mider afskæres og anbringes på hvert blad på prøveplanterne. Dette gøres ca. 2 timer før behandling, for at miderne får tid til at flytte over på prøveplanten og lægge æg. Størrelsen af det afskårne stykke varieres, således at 30 der fås ca. 100 mider pr. blad. På behandlingstidspunktet fjernes bladstykket, der blev brugt til at overføre miderne, og kasseres. De med mider smittede planter dyppes og bevæges i prøvetilberedningen i 3 sekunder og anbringes i et stinkskab for at tørre. Planterne opbevares i 2 dage, før der 35 foretages et skøn over voksne, dræbte mider ved hjælp af det første blad. Det andet blad bliver på planten i endnu

DK 165119 B

51 5 dage, før er foretages observationer af dræbte æg og/eller nyligt udviklede nymfer.

(J) Spodontera eridania. hærorm i 3. stadium, systemisk prøve med nedskåret stilk.

5 Forbindelsen tilberedes som en emulsion indeholdende 0,1 g prøvemateriale, 0,1 g polyethoxyleret vegetabilsk olie i 0,4 g vand, 10 ml acetone og 90 ml vand. Dette fortyndes ti gange med vand, hvilket giver den 100 ppm-emul-sion, der skal anvendes til prøven. Sieva-limabønneplanter 10 med netop udfoldede primærblade anvendes til denne prøve.

Disse blade skæres af mindst 2,5 cm over jordniveau for at undgå forurening med jordbakterier, der kan få stilken til at rådne under prøven. De afskårne stilke anbringes i prøveemulsionen. Efter 3 dages optagelse afskæres bladet og 15 anbringes i en 100 x 10 mm Petriskål indeholdende fugtigt filtrerpapir i bunden og 10 larver i 3. stadium. Der foretages optælling af døde eksemplarer og skøn af reduceret fødeindtagelse efter 3 dages forløb.

(K) Thrips palmi. thrips.

20 Svært angrebne blade af bomuldsfrøplanter sprøjtes under markbetingelser med de ønskede koncentrationer. Antallet af thrips tælles før og efter sprøjtning. Bekæmpelsen i procent er baseret på disse tællinger.

(L) Tetranvchus urticae (P-resistent stamme), toplet- 25 tet spindemide.

Forbindelsen oparbejdes som en emulsion indeholdende 0,1 g prøvemateriale, 0,1 g polyethyleret vegetabilsk olie i 0,4 g vand, 10 ml acetone og 90 ml vand. Dette fortyndes 10 gange med vand, hvilket giver en 100 ppm emulsion til 30 prøven. Sieva-limabønneplanter med lige udfoldede primærblade anvendes til prøven. De af skøres mindst 2,5 cm over jordbundsniveau for at undgå forurening med jordbakterier, som kan få stilken til at rådne under prøven. De afskårne stilke anbringes i prøveemulsionerne. Hvert blad inficeres med ca.

35 100 voksne mider og opbevares i 3 dage, hvorefter dødelig heden optælles.

DK 165119 B

52 t

-P

• a) o

-P T3 I I O I

s é * in n . .

^ ^ S I I S I

Hl w

M

O) o o o o

T3 I O O O O

•rj ri H rH

τ) S

0) £ ω C4 ·Η •Η ·Η κ Η (Τι

Η Μ ιΗ σι 00 | II

I es ι μ (JP * Q) ο Ο

2 ® > ο ο ι II

•Η 3 2 Μ Η Η -Ρ w 8 .

•Η · rH >4-10) •μ c < 4J Ο tT φ Ο Γ- ^ ϋ 0 g Ο ι σ . .

• &! 3 8 ^ g α •3 Μ 3 w ϋ ΕΗ Η Γ1 ·Ή >+>.,„ ^ -rj · * ε & 4 η ο οο Η w I 5 Λ 1 Μ ©g ø 73 øø ιη φ P-ι Ό ·Η Id Ο Ο Ο 3 U 1 ' ° S3 μ 3J * 1

8 . . S

to Γ—I J-| _ ΟΟ ΟΟ Μ

• ϋ g 2 £ ' 3 3 3 I

“ . . * * ω >· Η μ Ο Ο Ο ΟΟ 0) • σι οι ·η ο ο ο ιη ιη

«3* pL| > I—I r—I I—I ι—I

(Ν ω οο cn - γη · * (0 ι Ό · Ο Ο Ο Ο -Μ

Pt| Q Ό ο I ΙΟ ^ Ο.

Τ’ Α μ Η Ο gi C0 0) ^ ιη · *μ " Λ * ι ϋ Ο ο ο ·Η σ> ·η ·Η ο ο ι ιι -μ *3* μ G ι r-i ΰ γη !Η ro οο ^ 7 0)

Pli υ g ο ο ο οο 'ΰ — μ S, o o ο ο ο μ οΞοπη ο η 0 ^ Η rH 10 ·Η a a a >- >- ^ I σι σι σι σι ο ro S *3* ^ "3* 'S* *3· ø ø γη γη γη η ΓΗ ό Λ 0 00 00 00 0000 ·& μ Η, ΓΗ ΓΗ ΓΗ ΓΗ ΓΗ pq S'SifLÅfø til Ή

DK 165119B

53

Eksempel 12

Sammenligning af aktiviteten af LL-F28249-forbindelser og milbemvcinforbindelser (A) Tetranvchus urticae (P-resistent stamme), toplet-5 tet spindemide, voksne.

Sammenligningsforbindelserne milbemycin A3 og B2 fremstilles som beskrevet i US patentskrift nr. 3.950.360, eksempel 1. Milbemycin D er et kommercielt produkt (fra Sankyo Company, Ltd., Tokyo, JP). Dets fremstilling er be-10 skrevet i US patentskrift nr. 4.346.171.

Forsøgsopløsninger fremstilles ved opløsning af de aktive forbindelser i acetone:vand (2:1).

Forsøgsplanterne er Sieva-limabønneplanter, som behandles som beskrevet i eksempel 11, forsøg (I), indtil de 15 er tørret i stinkskab. Derefter henstår planterne i 3 dage, hvorefter der foretages tællinger af dødeligheden. Resultaterne er vist i nedenstående tabel XVII, hvor der er anvendt følgende bedømmelsesskala: 0 = ingen virkning 20 1 = dødelighed på 10-25% 2 = 11 " 26-35% 3 = " " 36-45% 4 = " " 46-55% 5 = '· " 56-65% 25 6 = « " 66-75% 7 » » » 76-85% 8 « " " 86-99% 9 = 100% udryddelse.

54

DK 165119B

Tabel XVII

Aktivitet af LL-F28249o: οσ β samt milbemvcin A3. Bo oa D imod toplettede spindemider Forbindelse Koncentration (ppm) 5 1 0,1 0,01 LL-F28249a 93 0 LL-F28249/3 6 5

Milbemycin A3 50 10 " B2 0 0 " D 9 0

Af tabel XVII vil det ses, at LL-F28249-forbindel-15 ser i en dosis på l ppm er lige så gode eller til dels bedre end milbemycinforbindelserne, hvilket er endnu mere udtalt ved en dosis på 0,1 ppm, hvor LL-F28249 har en udtalt virkning, medens milbemycin er virkningsløst.

(B) Trichostronavlus colubriformis 20 5 Uger gamle Gerbillus-hanmus inficeres på dag 0 i dette forsøg med 400-600 smitsomme larver af T. colubriformis stammende fra får. På dag 7 vejes musene, og behandling påbegyndes. Forsøgsopløsninger indgives via mavesonde på dag 7. På dag 11 aflives musene, og de tilbageværende orm 25 tælles. Ud fra antallet af talte orm hos de behandlede dyr sammenlignet med antallet hos de ubehandlede kontroldyr beregnes den procentvise effektivitet af forbindelserne ved hjælp af formlen i fodnote b) til tabel XV. Til denne vurdering anvendes tre dyr til hver behandling.

30 Den aktive forbindelse opløses i polyethylenglycol: di me thylsulf oxid (PEG:DMSO) (1:2, vo/vo) i en mængde, som er tilstrækkelig til, at dyrene får tilført fra 0,0156 til 0,1250 mg/kg legemsvægt af forbindelsen.

Resultaterne er vist i nedenstående tabel XVIII.

35

DK 165119 B

55

Tabel XVIII

Aktivitet af LL-F28249a samt milbemvcin A3.

Bg oa D imod T. colubriformis hos mus % Effektivitet (dødelighed) 5 ved en dosis (mg/kg) på

Forbindelse 0,125 0,0625 0,0313 0,0156 LL-F28249a 98 88 68 34

Milbemycin A3 80 10 " B2 18 0 0 - " D 82 74 29

Af tabel XVIII vil det ses, at LL-F28249<* er mere 15 aktivt end milbemycin, og denne tendens er jo mere udtalt, jo lavere dosis er.

(C) Psorontes cuniculi. øremider, kaniner.

Dagen før forsøget, eller om morgenen på forsøgsdagen, opløses forsøgsforbindelserne i acetone og fortyndes 20 til de ønskede koncentrationer. Koncentrationen beregnes således, at 400 μΐ indeholder den mængde, som skal anbringes på hvert filtrerpapir. 400 μΐ af opløsningen afpipetteres på en topskive (diameter 3,7 cm) og en bundskive (diameter 3,5 cm), begge af filtrerpapir, og derefter anbringes ski-25 verne på en keramikplade til tørring. OBS: Dette skal gennemføres i et stinkskab. Filtrerpapiret har en glat og en ru side, og forsøgsopløsningen påføres på den ru side, som anbringes opad under tørringen. Når de to skiver er tørre, anbringes de i en Petriskål med de ru sider vendende indad, 30 adskilt af et lille stykke stift papir foldet til teltforra.

Hvis skiverne fremstilles dagen før forsøget, holdes de ved stuetemperatur natten over. Der anvendes en standardmængde på 0,01, 0,1 og 1,0 μΐ/cm2 ved hvert forsøg.

~ Skurv (indeholdende mider) indsamles fra ørerne på 35 inficerede kaniner om morgenen på forsøgsdagen. Dette materiale anbringes i en stor Petriskål under et belyst forstørrelsesapparat. Mider kravler ud af skurven og indsamles let

DK 165119 B

56 på spidsen af en dissektionsnål eller på den ene gren af en fin pincet. Topfiltrerpapiret i hver skive fjernes, og 12 mider anbringes på bundskiven, og toppapiret lægges på plads igen. Før Petriskålens låg lægges på plads, smøres skivens 5 kant med vaseline for at fange alle flygtede mider.

Til forsøgsvurderingerne er der almindeligvis 4 forsøg, som tælles for hver dosis, to efter 4 timer og to efter 24 timer.

Efter at miderne er sat til skålene, anbringes skålene 10 fra hvert forsøg i en bakke, som derefter stilles i plastpose sammen med nogle våde håndklæder, og de holdes ved stuetemperatur.

Efter 4 eller 24 timers forløb undersøges skålene under et dissektionsmikroskop på følgende måde: 15 1. Skålen åbnes forsigtigt, topfiltrerpapiret fjernes og bevares.

2. På bundfiltrerpapiret tegnes med en blød blyant en lille cirkel med en diameter på ca. 1/2 cm.

3. Arealet i og omkring cirklen fugtes svagt med en en- 20 gangspipette.

4. Alle mider fra skålen anbringes inde i cirklen. Der ses omhyggeligt efter - på låget, topfiltrerpapiret og under bundpapiret - om der er mider.

5. Antallet af mider i cirklen tælles og noteres.

25 6. Toplåget lægges på, og skålen sættes til side.

7. Efter et minimum på 15 minutter tælles de områder, som er tilbage i cirklen. Dette er de døde mider.

8. Antallet af levende mider beregnes og noteres.

9. Den procentvise effektivitet beregnes efter formlen: 30 Antal døde mider % effektivitet = 100 x - .

Totalt antal mider

Data fra det ovenfor beskrevne forsøg er samlet i nedenstående tabel XIX.

35

DK 165119 B

57

Tabel XIX

Aktivitet af LL-F28249ct oa nogle milbemvcin- forbindelser imod P. cuniculi % Effektivitet (dødelighed) 5 ved en dosis (mg/cm2) på

Forbindelse 4 1 0,1 0,01 LL-F282490! - 100 93 23

Milbemycin A3 56 10 " B2 9 - " D 100 96 14 24

Af tabel XIX vil det ses, at LL-F28249a når 100% 15 effektivitet ved en væsentlig lavere dosis end den bedste milbemycinforbindelse (D), og at effektiviteten af LL-F28249a er væsentlig selv ved en dosis på 0,1 mg/cm2, hvor aktiviteten af milbemycin D er klart utilfredsstillende.

20 25 30 35

Claims (15)

1. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249a, kendetegnet ved (a) en molekylvægt på 612 (FAB-MS), 5 (b) en molekyl formel 035115203, (c) en specifik optisk rotation, [a]D = +133±3e (c = 0,3, acetone), (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 1, 10 (e) et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 2, (f) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 3, (g) et karakteristisk carbon-13-kernemagnetisk reso- 15 nansspektrum som vist i tegningens fig. 4 med signifikante spidser ved 173,4; 142,8; 139,4; 137,7; 137,3; 137,2; 130,6; 123,3; 120,3; 118,0; 99,7; 80,2; 79,3; 76,7; 69,3; 68,5; 68,4; 67,8; 67,7; 48,4; 45,7; 41,1; 40,7; 36,1; 36,0; 35,9; 20 34,7; 26,8; 22,8; 22,2; 19,9; 15,5; 13,9; 11,0, og (h) et karakteristisk elektronanslagsspektrum som vist i tegningens fig. 5 med målte m/z-værdier og foreslåede grundstofsammensætninger som vist 25 nedenfor opnået ved massemålinger med høj opløs ningsevne 612,3705 C36H5208 354,2181 C23H30O3 594,3543 C36H50O7 314,1877 C20H26O3 576,3472 C36H48°6 278,1144 C15H1805 30 484,3211 C30H44O5 265,1786 C16H2503 482,2648 ^29^38^6 248,1405 ^15^20^3 466,3097 C30H42O4 247,1705 C16H2302 448,2987 C30H40O3 237,1838 C15H2502 442,2375 C26H3406 219,1740 C15H230 35 425,2327 C26H33°5 151,0753 C9Hi;l02. DK 165119B

2. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F282490, kendetegnet ved (a) en molekylvægt på 584 (FAB-MS), (b) en molekylformel ¢34114303, 5 (c) en specifik optisk rotation, [a]D = +125* (C = 0,3, acetone), (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 6, (e) et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum 10 som vist i tegningens fig. 7, (f) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 8, (g) et karakteristisk carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 33 med 15 signifikante spidser ved 173,3; 142,6; 139,5; 137,7; 137,3; 133,9; 123,8; 123,4; 120,3; 120,2; 118,0; 99,7? 80,2; 79,4; 76,7; 69,2; 68,6; 68,3; 67,8; 67,7; 48,4; 45,7; 41,0; 40,8; 36,1; 35,9; 34,7; 22,3; 19,8; 15,5; 13,8; 13,1; 10,8, og 20 (h) et karakteristisk elektronanslagsspektrum som vist i tegningens fig. 9 med målte m/z-værdier og foreslåede grundstofsammensætninger som vist nedenfor opnået ved massemålinger med høj opløsningsevne 25 584,3388 C34H4808 314,1858 C20H2603 566,3306 C34H46O7 278,1168 C15H1805 456,2864 C28H40O5 237,1491 . C14H2103 442,2391 C26H3406 219,1380 C14H1902 438,2780 C28H3804 209,1534 C13H2102 30 425,2331 C26H3305 191,1418 C13H190 354,2187 C23H30°3 151,0750 C9Hi;l02. _

3. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249-r, kendetegnet ved 35 (a) en molekylvægt på 598 (FAB-MS), (b) en molekylformel C35H5ø08, 2 6 DK 165119 B (c) en specifik optisk rotation, [a]D = +150±4e (C = 0,3, acetone), (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 10, 5 (e) et karakteristisk infrarødt absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 11, (f) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 12, (g) et karakteristisk carbon-13-kernemagnetisk reso- 10 nans'spektrum som vist i tegningens fig. 13 med signifikante spidser ved 173,6? 142,4; 139,9? 137,3? 136,0? 134,0? 123,8? 123,6? 120,4? 119,6? 118,5? 99,8; 80,5? 77,8? 77,0? 76,8; 69,3? 68,6; 68,3? 67,9? 57,7? 48,5? 45,8? 41,2? 40,8? 36,2? 15 36,1? 36,0? 34,8? 22,3? 19,9? 15,5? 13,8? 13,1? 10,8, og (h) et karakteristisk elektronanslagsspektrum som vist i tegningens fig. 14 med målte jm/z-værdier og foreslåede grundstofsammensætninger som vist 20 nedenfor opnået ved massemålinger med høj opløs ningsevne 598,3543 C35H50O8 354,2199 C23H30O3 580,3422 C35H48O7 314,1875 C20H26°3 562,3292 C35H4606 292,1307 C16H2005 25 496,2824 C30H40°6 288,2075 C19H2802 484,2440 C28H3607 248,1397 C15H20O3 478,2687 C30H38O5 237,1490 C14H2103 456,2576 C27H3606 219,1382 . C14H1902 438,2772 C28H3804 209,1544 C13H2102 30 425,2341 C26H3305 191,1435 C^HigO 420,2651 c28H36°3- 151,0759 C9H1;L02.

4. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F282496, k e n_d e t e g n e t ved 35 (a) en molekylvægt på 616 (EI-MS), (b) en molekylformel C35H5209, (c) et HPLC-retentionsvolumen på 14,0 ml, (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspek-trum som vist i tegningens fig. 15, (e) et karakteristisk protonkerneraagnetisk resonans- 5 spektrum som vist i tegningens fig. 16, og (f) et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 17.

5. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249e, 10 kendetegnet ved (a) en molekylvægt på 598 (EI-MS), (b) en molekylformel 035115003, (c) et HPLC-retentionsvolumen på 14,8 ml, (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum 15 som vist i tegningens fig. 18, (e) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 19, og (f) et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 20. 20

6. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249f, kendetegnet ved (a) en molekylvægt på 598 (EI-MS), (b) en molekylformel C35H50O3, 25 (c) et HPLC-retentionsvolumen på 16,0 ml, (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 21, (e) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 22, og 30 (f) et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 23.

7. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249tj, k e n~d e t e g n e t ved 35 (a) en molekylvægt på 612 (EI-MS), (b) en molekylformel ¢3^5303, DK 165119B (c) et HPLC-retentionsvolumen på 23,5 ml, (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 24, (e) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonans- 5 spektrum som vist i tegningens fig. 25, og (f) et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 26.

. 8. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F282495, 10 kendetegnet ved (a) en molekylvægt på 626 (EI-MS), (b) en molekylformel C37H54O3, (c) et HPLC-retentionsvolumen på 24,5 ml, (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum 15 som vist i tegningens fig. 27, (e) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 28, og (f) et karakteristisk elektronanslagsmassespektrum . som vist i tegningens fig. 29. 20

9. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249i, kendetegnet ved (a) en molekylvægt på 626 (EI-MS), (b) en molekylformel C37H54O8, 25 (c) et HPLC-retentionsvolumen på 26,0 ml, (d) et karakteristisk ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 30, (e) et karakteristisk protonkernemagnetisk resonansspektrum som vist i tegningens fig. 31, og 30 (f) et- karakteristisk elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 32.

10. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249ic, ken-detegnet ved 35 (a) en molekylvægt på 584 (EI-MS), (b) en molekylformel C35H52O7, 26 DK 165119B (c) en specifik optisk rotation, [o]D = +189* (C = 0,165, acetone), (d) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 34, = 241 nItt (E 20.400), 5 (e) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i teg ningens fig. 35 (KBr-skive), (f) et elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 36, (g) et protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDC13) 10 som vist i tegningens fig. 37, og (h) et carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i tegningens fig. 38 og opregnet i tabel IX i beskrivelsen. !5

11. Antibiotisk forbindelse betegnet ^-Ρ28249μ, kendetegnet ved (a) en molekylvægt på 612 (EI-MS), (b) en molekylformel C37H55O7, (c) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i 20. tegningens fig. 44, UV^J°H = 241 nm (E 16.800), (d) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 45 (KBr-skive), (e) et elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 46, og 25 (f) et protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i tegningens fig. 47.

12. Antibiotisk forbindelse betegnet LL-F28249i>, kendetegnet ved 30 (a) en molekylvægt på 592 (EI-MS), (b) en molekylformel ¢35114507, 26 (c) en specifik optisk rotation, [a]D = +131* (C = 0,325, acetone), - (d) et ultraviolet absorptionsspektrum som vist i 35 tegningens fig. 48, = 256 nm (E 20.500), 358 nm (E 8.830), DK 165119B (e) et infrarødt absorptionsspektrum som vist i tegningens fig. 49 (KBr-skive), (f) et elektronanslagsmassespektrum som vist i tegningens fig. 50, 5 (g) et protonkernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i tegningens fig. 51, og (h) et carbon-13-kernemagnetisk resonansspektrum (CDCI3) som vist i tegningens fig. 52 og opregnet i tabel XI i beskrivelsen. 10

13. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne LL-F28249a, LL-F282490, LL-F28249t, LL-F282495, LL-F28249e, LL-F28249C, LL-F28249r?, LL-F282495, LL-F28249t, LL-F28249ic, LL-F28249M og LL-F28249u, 15 kendetegnet ved, at organismen Streptomyces cya-neogriseus noncyanogenus, NRRL 15773, eller en mutant deraf med væsentligt samme egenskaber fermenteres aerobt i et flydende medium indeholdende assimilerbare kilder for carbon, nitrogen og uorganiske anioner og kationer, indtil der er 20 produceret en betydelig mængde LL-F28249 a, β, r, δ, e, f, η, θ, t, k, μ og i> i mediet, hvorefter forbindelserne udvindes deraf.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendete g- 25 net ved, at fermenteringskulturen holdes ved steril be- luftning og omrøring ved en temperatur på 24-32“C i et tidsrum på 80-200 timer, hvorefter mæsken høstes, og forbindelserne ekstraheres.

15. Pharmaceutisk og pharmakologisk acceptable salte af de antibiotiske forbindelser ifølge krav 1-12.