DD268830A3 - Verfahren zur reinigung von insulin - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Insulin an schwach sauren Kationenaustauschern hydrophober Matrix, wobei die Fraktionierung des Insulins durch stufenweise oder kontinuierliche Veraenderung der Loesungsmittelkonzentration im sauren p H-Bereich erreicht wird. Als Ionenaustauscher werden handelsuebliche Wofatite auf Acrylatbasis mit Divinylbenzen, seinen Derivaten oder anderen Vernetzern verwendet. Das im Eluat befindliche, von seinen hochmolekularen Verunreinigungen befreite Insulin wird ohne weitere Isolierung kristallisiert. Das Verfahren zeichnet sich durch eine hoehere Trennkapazitaet und eine hoehere Ausbeute aus.

Description

Verfahren zur Reinigung von Insulin Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Feinreinigung von Insulin unter Einsatz von Ionenaustauschern mit hydrophober Matrix.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Ein technisch in großem Maßstab angewendetes Verfahren zur Gewinnung von Insulin aus tierischem Au.sgangsmaterial (Rind, Schwein) ist die Extraktion von Pankreas mit lösungsmittelhaltigen Gemischen. Die Extrakte lassen sich durch Zusatz von Salzen und pH-Umstellungen sowie Abkühlen auf niedrige·, Temperaturen von einem großen Teil der vorhandenen Ballast-Substanzen befreien. Nach dem schonenden Abtrennen der zur Extraktion benutzten Lösungsmittel erhält man wäßrige insulinhaltige Lösungen, aus denen das Insulin in unreiner Form zum Beispiel durch Aussalzen in fester Form abgetrennt werden kann.

Durch fraktionierte Fällung mit Kochsalz oder Ammoniumsulfat und/oder durch Fällung des Insulins in der Nähe seines isoelektrischen Punktes erhält man Niederschläge, aus denen sich Insulin in relativ reiner Form durch Kristallisation gewinnen läßt.

Analysiert man das so gewonnene Produkt mit empfindlichen Methoden wie der Disk-Elektrophorese oder der HPLC₁ so zeigt sich, daß neben einer odtjr zwei Hauptkomponenten eine Reihe von Nebenkomponenten vorhanden ist.

Es konnte gezeigt werden, daß solche· Komponenten, die biochemische Synthesevorstufen des Insulins sind, in den

nach oben beschriebenen Verfahren gewonnenem Insulin stets in beträchtlicher Menge vorhanden sind. Umfangreiche biologische, pharmakologische und medizinische Untersuchungen haben ergeben, daß solche Nabenkomponenten mit einer beträchtlich höheren Molmasse als das Insulin störende Nebenwirkungen der aus solchen Insulinen hergestellten pharmazeutischen Spezialitäten verursachen. Für die Herstellung besonders hochwertiger Insulinspezialitäten wurden Methoden zur Abtrennung solcher Verunreinigungen entwickelt.

In GB 1 235 045 wird ein Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulin an Anionenaustauschern in Gegenwart wassermischbarer organischer Lösungsmittel bei einem pH-Bereich von 6 bis 10 vorgeschlagen. Nachteilig bei diesem Verfahren ist der relativ hohe Bedarf von Austauschern (mindestens'30/1 Austauscher/Insulin) und die geringen Insulinausbeuten (maximal 60%).

Als Alternative wird in DD 119 216 und DD 119 217 entsprechend DE 2 505 306/307 die Reinigung von Ammonium- oder Alkali insulin durch Gelfiltration vorgeschlagen. Neben dem hohen Aufwand an Gel (1000 ml/4,5 g Insulin), der mechanischen und chemischen Instabilität des Gelbettes, besonders im pH-Bereich über 7,0, ist der relativ hohe Gehalt an Proinsulin ein Nachteil des Verfahrens. Weiterhin ist störend, daß nur gering konzentrierte Insulinlösungen nach der Chromatographie erhalten werden können.

..-ι. 2 629 568 wird die Reinigung von Peptiden, besonders I oulin, durch Ionenaustauschchromatographie in Gegenv/art nicii tionischer Detergentien vorgeschlagen. Nachteilig sind hier neben dem Einsatz relativ teurer und schwer zugänglicher Hilfstoffe die geringe Konzentration des Insulins in den nach Chromatographie erhaltenen Fraktionen (z.B. 0,35 %) sowie die geringen Insulinausbeuten.

DE 27 57 377 bevorzugt die Einbeziehung des Reinigungsvei—

850

fahrens an Kationen- und Anionenaustauschern zur Erzielung reiner Insuline schon in den Stufen des Pankreasextraktes. Unter Einsatz eines Anionenaustauschers erfolgt die Adsorption mit 0,1 M TRIS/HCl in 65 %igem Ethanol bei pH 8,2, die Elution mit 1 M Essigsäure. Nachteilig ist hierbei unter anderem der sehr hohe Bedarf an Ionenaustauschern. Trotz dieses Aufwandes ist eine abschließende Feinreinigung mittels Gelchromatographie an Sephadex G-50 notwendig.

Das in DE 19 40 130 vorgeschlagene Verfahren zur Reinigung von Insulin besteht wahlweise aus einer Kationenaustausch- oder einer Anionenaustauschchromatographie mit voi— oder nachgeschalteter Gelfiltration (G-50 sf.). Beim Einsatz eines schwach sauren Kationenauatauschers erfolgt die Elution mit 0,13 M Natriumphosphat unter Zusatz von 7 M Harnstoff bei pH 6,0.

Beim Einsatz eines stark basischen Anionenaustauschers erfolgt die Elution mit Θ,1 M TRIS/HCl/in 60 %igem Ethancl oder Methanol bei pH 6,0 bis 8,5. Zur Verbesserung der Löslichkeit des Insulins sowie zur Desaggregation der Substanz in diesem pH-Bereich werden entweder Lösungsmittel oder Harnstoff im Elutionsmittel eingesetzt. Dar Harnstoffeinsatz erfordert einen sich an den Ionenaustauschprozeß anschließenden Entsalzungsschritt, der sowohl die Ausbeute als auch die Effektivität des Verfahrens herabsetzt. Dia Trennkapazität des Verfahrens ist gering, die Produktausbeute mit 40 bis 60 % nur mäßig.

Ein ähnliches Reinigungsverfahren wird in DE 19 66 573 vorgeschlagen. Unter Verwendung eines Anionenaustauschers DEAE-Sephadex und von 60 % Methanol oder Ethanol zur Verbesserung der Löslichkeit von Insulin irr: bevorzugten ArbeitspH-Bereich von 6,5 bis 8,5 wird ein reines Endprodukt gewonnen. Nachteilig sind jedoch auch hier die geringe Produktausbeute von 40 bis 55 % und die geringe Trägerbe-

ladung.

In US 3 221 008 (entspr. GB 881 855) wird eine Insulinchromatographie an einem SuIfokationenaustauscher (Dowex 50-X-l) in Gegenwart von 70 7. Ethanol und 3,5 7. Natriumchlorid im Elutionsmittel vorgeschlagen. Die Trennkapazität des Trägers ist mit 2,5 rng/ml außerordentlich niedrig. Die Reinheit des chromatographischen Produktes wird nicht charakterisiert.

Verteilungs- und adsorptionschromato^raphisehe Trennverfahren (Houben-Weyl, Bd. 15/2, S. 496-505) werden z. B. zur Reinigung von Ile^-Angiotensin II an Cellulose mit Butanol/ Essigsäure/Wasser als Elutionsmittel, zur Reinigung von Oxytocin an Sephadex G--25 mit Butanol/Ethanol/Benzen/Essigsäure/Wasser und zur Reinigung von Staphyiokokkennuclease an Kieselgel mit Methanoi/Essigsäure/Dimethylformamid beschrieben.

Die Trennkapazität der Verfahren liegt ebenfalls sehr r>i<=>drig: zwischen 0,7 und 15 mg/ml.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren aufzuzeigen, das die Reinigung von Insulin ermöglicht, ohne daß hohe Verluste an Insulin eintreten oder teure oder mechanisch und/oder chemisch instabile Systeme angewendet werden. Außerdem werden eine hohe Trennkapazität, eine hohe Ausbeute und hohe Reinheit angestrebt, sowie die Vermeidung einer beim üblichen Einsatz von Puffersubstanzen und Salzen im Elutionsmittel notwendigen Entsalzung. Schließlich sollen die Ziele der Erfindung mit leicht zugänglichen Hilfsstoffen erreicht werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren, das mit mechanisch und chemisch weitgehend stabilen Ionenaustauschern bei einer hohen Beladbarkeit eine einfache und effektive Reinigungsmögl ichkei-¹: für Insulin bei hohen Ausbeuten ermöglicht, aufzuzeigen. Außerdem soll die erfindungsgemäße Lösung eine direkte Kristallisation aus den bei der Reinigung erhaltenen Insulinlösungen ermöglichen. Weiterhin soll es möglich sein, die eingesetzten Rohstoffe mit geringem Aufwand zurückzugewinnen .

Erfirdur.£5gt:iiiäfc> wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß das Insulin und seine Verunreinigungen auf die im folgenden beschriebene Weise an einem schwach sauren Ionenaustauscher mit hydrophooer Matrix im sauren pH-Bereich fraktioniert wi rd.

Geeignete Ionenaustauscher sind solche Copolymere, die aus Acrylsäurederivaten mit Divinylbenzen und Funktionalisierung gewonnen werden (z. B. handelübliche Wofatite® des VEB Chemiekombinat Bitterfeld).

Geeignete organische Lösungsmittel sind flüssige aliphatische Alkohole wie z. B. Methanol, Ethanol, n-Propanol, Propan-2-ol, flüssige niedrigsiedende aliphatische Ketone wie z. B. Aceton, Halbacetale wie z. B. Methylal und wenigstens teilweise mit Wasser mischbare Es^J:er, wie z. B. Essigsäuremethylester sowie Mischungen daraus.

Geeignete Säuren zur Einstellung des pH-Wertes sind organische Säuren wie z. B. Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Weinsäure, Zitronensäure, anorganische Säuren wie z. B. Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure.

Die Abtrennung der Verunreinigungen des Insulins kann sowohl im "batch"-Verfahren als ajch im Säulenverfahren erfolgen.

zbssio

Dabei findet das "batch"-Verfahren zweckmäßig zur Vorreinigung, das Säulenverfahren zu einer Feinreinigung Anwendung.

Während die bekannten Verfahren zur Reinigung von Insulin auf einer Veränderung der Ionenstärke oder/und des pH-Wertes beruhen, werden bei der vorgeschlagenen Lösung die diesen Methoden anhaftenden Nachteile wie z. B. eine Verunreinigung der Eluate mit Salzen und eine Umladung des Ionenaustauschers dadurch vermieden, daß die Fraktionierung durch stufenweise oder kontinuierliche Veränderung der LösungsmittelkonzenIration bei der Elution erreicht wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im allgemeinen so durchgeführt, daß aus geeigneten Lösungen Insulin hinreichender Reinheit, wie zum Beispiel verunreinigtes Kristal 1 insulin der Struktur der menschlichen oder tierischen Insuline oder technologische Vorstufen wie Aussalzungsniederschlage oder isoelektrische Fällungen an den Ionenaustauscher in einem Durchflußreaktor gebunden werden. Anschließend erfolgt als eigentlicher Reinigungsschritt die Elution mit sauren Wasser-Lösungsmittel-Gemischen bei konstanten pH-Werten von 1,7 bis 3,0 bei Temperaturen von etwa 10 bis 50 ⁰C bei steigender Lösungsmittelkonzentration. Dabei läßt sich Insulin frei von hochmolekularen Verunreinigungen eluieren. Durch Variation der Beladung des Austauschers und der Durchflußgeschwindigkeit läßt sich weiter eine Fraktionierung des Insulins in eine in der Disk-Elektrophorese praktisch einheitliche Insulinkomponente sowie in Fraktionen, die an sauren Insulinkomponenten wie den desamidierten Formen und Fraktionen, die an basischen Insulinkomponenten wie den Arginin-Derivaten oder Insulinestern angereichert sind, erreichen.

Die vorteilhafte Wirkung des offenbarten Verfahrens ergibt sich aus den Daten der nachstehend angeführten Vergleichstabelle.

Die Vorteile bestehen in einer mindestens !^fachen Trenn-

kapazität bei höheren Ausbeuten und vergleichbarer Produktreinheit gegenüber den bekannten Verfahren des Standes der Technik. Außerdem vermeidet das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung von Salzen und/oder Pufferlösungen im EIutionsmittel und damit die im Anschluß an den Ionenaustausch notwendigen Entsalzungsprozesse.

VERGLEICHSTABELLE

Verfahren

Trennkap, d. Verfahrens (mg/ml Träger) Ausbeute

Reinheit d. Produkts

Ioti Bn aus tausch ver fahren DE 27 57 377 keine Angabe

DE 19 40 130 Gelfiltr. Kat.-Aust.

Anion.-Aust. DE 19 66 573

0,5 4.3

10

10

a. 80%	95-99% der Ver
	unrei nigungen
	abgetrennt
80 %
66 %	Monokomponent-
	Insulin (MKI)
	(PAAGE)
40-60 %	MKI
40-55 %	MKI
88 %	keine Angabe

Verteilungs- u. adsorptionschromatogr. Verfahren

Reinigung v. 1 keine Ang. keine Angaben

Angiotensin

Reinigung v. 0,7 keine Ang. keine Angaben

Oxytocin Reinigung v.

Nuclease 15 keine Ang. keine Angaben

Erfiη dungsgemäßes Verfahren Reinigung v.

Insulin 80-85 %

> 94 '/. (PAAGE)

ZW 810

Ausführungsbeispi. ele

Beispiel 1

Auf eine Säule von 600 mm Höhe und 100 mm Durchmesser, die mit 4, 7 1 Wofatit CA 20 der Korngröße 50 bis 90 μπι gefüllt ist, warden 470 g Schwoineinsulin in 10 1 1 N Essigsäure pH 2,4 mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 l/h aufgetragen. Nach Waschen des Ionenaustauschers mit 10 1 Essigsäure pH 2,4 erfolgt die Elütion des Insulins mit 1 N Essigsäure/ 42,5 % Ethanol pH 2,4 durch stufenweise Veränderung der Lösungsm.i ttelkonzentration Lei einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 l/'i (Insulinkonzentration im Eluat 5 mg/ml). Die Aufarbeitung des Insulineluats erfolgt durch Destillation, isoelektr.ische Fällung und Kristallisation. Ausbeute: 395 g (entspr. 84 %) Reinheit: 96 % (Polyacrylamidgelelektrophorese PAAGE pH 8,4)

Beispiel 2

Auf eine Säule von 300 mm Höhe und 80 mm Durchmesser mit einem Volumen von 1,5 1, in der sich 900 ml Wofatit CA 20 befinden, werden 147 g Schweineinsulin, gelöst in 3,0 1 1 N Essigsäure pH 2,4, mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 l/h aufgetragen. Anschließend rd die Säule mit 3 1 1 N Essigsäure pH 2,4 nachgewaschen und danach Insulin mit einem Lösungsmittelgradienten von 0 bis 60 % Propan-2-ol, 1 N an Essigsäure pH 2,4 eluiert (Insulinkonzentration im Eluat 6 mg/ml)

Das isolierte Insulin ist frei von Proinsulin (PAAGE, pH 8,4, Coomassie-Blau).

Ausbeute: 125 g (entspr. 85 %)

Reinheit: 95 % (PAAGE, pH 8,4)

26*830

Beispiel 3

Auf eine Säule von 300 mm Höhe und 80 mm Durchmesser, die 1,47 1 Wofatit CA 20 enthält, werden 147 g eines Gemisches aus 40 % Rinderinsulin und 60 % Schweineinsulin in 3,0 1 0.02 N Salzsäure pH 1,7 mit einer Fließgeschwindigkeit von \ l/h aufgegeben. Nach Waschen der Säule mit 3,0 1 0,02 N Salzsäure pH 1,7 erfolgt die Elution des Insulins mit einem linearen Gradienten 0,02 N HCl pH 1,7/0,02 N HCl 30 % Aceton pH 1,7 und einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 l/h. Das insulinhaltige Eluat <c = 8 mg/ml) wird mit Wasser 1 : 1 und unter Zusatz von Zitronensäure und Zinkchlorid direkt kristal1isiert.

Ausbeute: 120 g (entspr. 82 */.) Reinheit: 94 % (PAAGE₁ pH 8,4)

Claims (2)

us no Pa-cent anspruch

1. v/erfahrun zur Reinigung von Insulin an schwach sauren Kationenaustauschern in Gegenwart von wassermischbaren organischen Lösungsmitteln, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionierung deis Insulins mit einem Säure-Lösungsnittel-Wassi-ir-Gemisch bei einem konstanten pH-Wert innerhalb des Bereiches von 1,7 bis 3,ζ und bei konstanter lonenstärke ausschließlich durch Veränderung der Lösungsmittiidkonzentration erfolgt, wobei als Lösungsmittel aliphatische Alkohole, aliphatische Ketone, HaIbacetsle sowie Ester aus aliphatischen Carbonsäuren und al iphati£ch«-n Alkoholen oder Mischungen hiervon verwendet werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösungsmittelkonzentration zw.'^-hen 3 und 70 % beträgt.