DE3508356C2

DE3508356C2 -

Info

Publication number: DE3508356C2
Application number: DE3508356A
Authority: DE
Inventors: Haruo Matsudo Chiba Jp Ogura; Kimio Furuhata; Toshiaki Osawa; Satoshi Tokio/Tokyo Jp Toyoshima; Yoshiyasu Musashino Tokio/Tokyo Jp Shitori; Masayoshi Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Ito; Shoji Iruma Saitama Jp Yoshimura
Original assignee: Mect Corp
Current assignee: Mect Corp
Priority date: 1984-03-09
Filing date: 1985-03-08
Publication date: 1988-11-17
Also published as: GB2158433A; FR2560881B1; HK27689A; JPS60190791A; JPS637556B2; GB2158433B; GB8506244D0; FR2560881A1; US4691012A; CA1257257A; DE3508356A1

Description

Gegenstand der Erfindung sind neue N-Acetylneuraminsäure- Derivate, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung. Die neuen N-Acetylneuraminsäure-Derivate der Erfindung sind wertvolle Arzneistoffe, die die Metastasierung von Krebszellen inhibieren.

N-Acetylneuraminsäure, die auch als "Sialinsäure" bezeichnet wird, ist an die endständigen Einheiten von zusammengesetzten Glukokonjugaten, wie Glycolipiden und Glycoproteinen gebunden, die sich auf den Zelloberflächen befinden. Sie übt wichtige Wirkungen auf die Differenzierung, Reifung, Funktionen und intrazellulären Wirkungen organischer Zellen aus. Es wurde bereits eine Vielzahl von N-Acetylneuraminsäure-Derivaten hergestellt und auf ihre Wirkung untersucht. Einschlägige Veröffentlichungen hierüber sind z. B.

- R. Kuhn, P. Lutz und D. L. MacDonald, Chem Ber., Bd. 99 (1966), S. 611-617 "Synthese anomerer Sialinsäure-methylketoside"
- P. Meindl und H. Tuppy, Mh. Chem., Bd. 100 (1969), S. 1295-1306 "Über 2-Deoxy-2,3-dehydro-sialinsäuren, I. Mitt.: Synthese und Eigenschaften von 2-Deoxy-2,3- dehydro-N-acylneuraminsäuren und deren Methylestern"
- R. Brossmer, H. Friebolin, G. Keilich, B. Löser und M. Supp, Hoppe-Seyler′s Z. physiol. Chem., Bd. 359 (1978) S. 1064, "Synthesis of Disaccharides Containing N-Acetyl-D- neuraminic Acid"
- M. N. Sharma und R. Eby, Carbohydr. Res., Bd. 127 (1984), S. 201-210, "Synthesis and Conformational Studies of 2-β- Chloro, 2-α-Fluoro, and 2-β-Fluoro-Derivatives of 2-Deoxy-N-acetylneuraminic acid"
- L. Holmquist and R. Brossmer, Hoppe-Seyler′s Z. Physiol, Chem., Bd. 353 (1972), S. 1346-1350, "Synthesis and Properties of the 2-Aminoethyl-a- and the 2-Pyridyl-α-and β-Ketosides of N-Acetyl- D-neuraminic Acid"
- L. Holmquist and R. Brossmer, FEBS Letters, Bd. 22 (1972), S. 46-48, "ON THE SPECIFICITY OF NEURAMINIDASE" The carboxymethyl α-ketoside of N-acetyl-D- neuraminic acid, a Vibrio cholerae neuraminidase substrate having two anionic sites
- T. Ogawa and M. Sugimoto, Carbohydr. Res., Bd. 128 (1984), C1-C4, "Synthesis of α-and β-(2→9)-linked disialylglycerolipids"
- H. Paulsen und H. Tietz Carbohydr. Res., Bd. 125 (1984), S. 47-64, "Synthese eines Trisaccharides aus N-acetylneuraminsäure und N-acetyllactosamin"

N-Acetylneuraminsäure-Derivate mit einem über eine α-Bindung an die N-Acetylneuraminsäure gebundenen Nucleosid- oder Glucoserest besitzen hervorragende physiologische Wirkungen; vgl. US-A 44 47 600 bzw. DE 32 19 209 A1.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue N-Acetylneura minsäure-Derivate mit physiologischer Wirksamkeit herzustellen. Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst, daß N-Acetylneuraminsäure-Derivate, bei denen ein Pyrimidin- oder Purin-Nucleosidrest über eine β-Bindung an die N-Acetylneuraminsäure gebunden ist, hervorragende pharmazeutische Wirksamkeit im Hinblick auf die Inhibierung der Metastasenbildung von Krebszellen besitzen.

Gegenstand der Erfindung sind somit N-Acetylneuraminsäure- Derivate der allgemeinen Formel I

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der N-Acetylneuraminsäure-Derivate der vorstehenden allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III,

R²-H (III)

in der R² einen Pyrimidin- oder Purin-Nucleosidrest darstellt, in Gegenwart eines Katalysators umsetzt, das erhaltene Reaktionsprodukt gegebenenfalls hydrolysiert und anschließend mit Hilfe eines zweifachen Chromatographieverfahrens aus dem Reaktionsgemisch gewinnt.

Schließlich ist auch die Verwendung eines N-Acetylneuramin säure-Derivates zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere zur Inhibierung der Metastasenbildung, Gegenstand der Erfindung.

Der Begriff "Nucleosidrest" bezeichnet eine über eine Glykosidbindung an eine Purin- oder Pyrimidinbase gebundene Ribose. Die Ribose und die entsprechenden Basen im vorstehend definierten "Nucleosidrest" können Substituenten tragen oder einen ankondensierten Ring aufweisen. Beispiele für derartige Nucleosidreste sind Reste der folgenden Formeln:

Bevorzugte Beispiele für Pyrimidin- und Purin-Nucleosidreste sind Reste mit folgenden Formeln:

Eine Anzahl verschiedener Beispiele für die Reste der vorstehend angegebenen Formeln sind in den nachstehenden Beispielen erläutert.

Die Verbindungen der Erfindung können beispielsweise nach dem in folgender Reaktionsgleichung dargestellten Verfahren hergestellt, und danach durch doppelte Chromatographieverfahren, die im einzelnen nachstehend beschrieben werden, gewonnen und gereinigt werden. In der folgenden Reaktionsgleichung ist die durch die Formel III wiedergegebene Verbindung bekannt und kann im Verfahren der Erfindung als Zwischenprodukt zur Herstellung verschiedener Verbindungen verwendet werden.

Gemäß vorstehendem Reaktionsschema werden die Verbindungen der Formeln II und III miteinander unter Reaktionsbedingungen umgesetzt, wie sie bei der Koenigs-Knorr-Reaktion angewendet werden. Beispielsweise läßt man die Reaktionsteilnehmer miteinander in Gegenwart eines Katalysators bei Atmosphärendruck und bei einer Temperatur von etwa 20 bis 25°C etwa 36 bis 48 Stunden miteinander reagieren.

Zur Erhöhung der Ausbeute an β-Derivat ist die Verwendung der Verbindung II in einem Verhältnis von mindestens etwa 1,2 Mol pro Mol Verbindung III bevorzugt. Zum gleichen Zweck ist auch die absatzweise Zugabe von frischer Verbindung II und Katalysator, beispielsweise nach etwa 12 bis 24 Stunden nach Beginn der Umsetzung günstig. Dabei sollen jedoch die Mengen der Ausgangsverbindungen und des Katalysators in einem vernünftigen Bereich bleiben, wenn das nachstehend erläuterte absatzweise Beschickungsverfahren angewendet wird.

Von den üblicherweise bei der Koenigs-Knorr-Reaktion verwendeten Katalysatoren eignen sich im Verfahren der Erfindung Quecksilber(II)-bromid, Quecksilber(II)-cyanat oder Silberperchlorat. Im Hinblick auf Ausbeute und Selektivität sind Quecksilber(II)-bromid und -(II)-cyanat am meisten bevorzugt. Der Katalysator wird in einer Menge von etwa 1 bis 4 Äquivalenten zur Verbindung (II) verwendet.

Geeignete Lösungsmittel sind Acetonitril, Nitromethan, Aceton und Methylenchlorid, wobei Aceton und Acetonitril bevorzugt sind.

Das bei der Umsetzung erhaltene Reaktionsprodukt wird durch ein doppeltes Chromatographieverfahren gewonnen und gereinigt. Der Begriff "doppeltes Chromatographieverfahren" bezeichnet ein Verfahren, bei dem die Reinigung durch eine Kombination von mindestens zwei Absorptionschromatographie- und/oder Verteilungschromatographiestufen erfolgt, die unter verschiedenen Bedingungen durchgeführt werden. Bei der Herstellung der N-Acetylneuraminsäure-Derivate, die den Nucleosidrest über eine α-Bindung gebunden enthalten, gemäß US-A 44 47 600 konnten keine N-Acetylneuraminsäure-Derivate mit β-gebundenem Nucleosidrest erhalten werden. Dagegen werden im Verfahren der Erfindung N-Acetylneuraminsäure-Derivate mit β-gebundenem Nucleosidrest zusätzlich zu den α-Derivaten gewonnen und im gereinigten Zustand erhalten, wenn eines der doppelten Chromatographieverfahren angewendet wird.

Beispiele für geeignete Kombinationen verschiedener chromatographischer Verfahren, die erfindungsgemäß zur Anwendung kommen können, umfassen:
Adsorptionschromatographie/Adsorptionschromatographie,
Adsorptionschromatographie/Verteilungschromatographie,
Verteilungschromatographie/Adsorptionschromatographie, Verteilungschromatographie/Verteilungschromatographie

Im Hinblick auf die Verbesserung der Abtrennung ist die Kombination von Verteilungschromatographie und Adsorptionschromatographie am stärksten bevorzugt.

Als Füllstoffe für die Säule zur Adsorptionschromatographie eignen sich z. B. Kieselgel und Aluminiumoxid, wobei Kieselgel bevorzugt ist. Zur Entwicklung der Säule können beispielsweise Chloroform, Methanol, Essigsäureäthylester, Äthanol, Benzol, Aceton oder Toluol verwendet werden. Auch als Füllstoffe für eine Säule zur Verteilungschromatographie eignen sich z. B. Kieselgel und Aluminiumoxid, wobei wiederum Kieselgel bevorzugt ist. Zur Verteilungschromatographie können ähnliche Entwickler wie für die Adsorptionschromatographie verwendet werden.

Einzelheiten zu den Verfahrensbedingungen der doppelten Chromatographie ergeben sich aus den nachstehenden Beispie len.

Die Verbindungen der Erfindung besitzen hervorragende pharmazeutische Wirksamkeit bei der Inhibierung der Metastasenbildung von Krebszellen. Diese Wirksamkeit wurde durch den im nachstehenden Bezugsbeispiel wiedergegebenen Test aufge zeigt.

Beispiel 1 Herstellung von 2′,3′-Isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-3,6,7,8,-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D-glycero- β-D-galacto-octapyranosyl)-uridin

50 ml Acetonitril werden mit 1 g 2′,3′-Isopropylidenuridin, 300 mg Hg(II)-cyanat, 600 mg Hg(II)-bromid und 1 g Molekularsieb (4A) versetzt. Die erhaltene Suspension wird bei Raumtemperatur 30 Minuten gerührt.

1,5 g 2-Chlor-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-β-D-N-acetylneuraminsäuremethylester (nachstehend als Verbindung II bezeichnet) werden mit der vorstehend genannten Suspension 16 Stunden unter Rühren umgesetzt. Dann werden weitere 510 mg Verbindung II, 150 mg Hg(II)-cyanat und 300 mg Hg(II)- bromid zugegeben und das Gemisch weitere 24 Stunden gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Lösungsmittel zur Trockene abdestilliert.

Der erhaltene pulverförmige Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und von unlöslichen Bestandteilen befreit. Die dabei erhaltene Lösung wird zur Entfernung ätherlöslicher Stoffe mit Äther behandelt. Anschließend wird die wäßrige Lösung mit Kaliumchlorid gesättigt und mit Essigsäureäthylester extrahiert. Der Essigsäureäthylesterextrakt wird über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, wobei 2,3 g Rohprodukt erhalten werden.

Das feste Rohprodukt wird an einer unter Verwendung von Essigsäureäthylester mit Aluminiumoxid gepackten Säule (Merk, Aluminoxid 90, 0,06 bis 0,21 mm) der Säulenchromatographie unterzogen und mit Essigsäureäthylester, einem Gemisch von Essigsäureäthylester und Äthanol (5 : 1), einem Gemisch von Essigsäureäthylester und Äthanol (3 : 1) und dann mit Äthanol in dieser Reihenfolge eluiert. Dabei wird ein Gemisch der Titelverbindung (nachstehend als "β-Isomer" bezeichnet) und von 2′,3′-Isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-3,6,7,8,-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D-glycero- α-D-galacto-octapyranosyl)-uridin (nachstehend als "α-Isomer" bezeichnet) erhalten.

1,9 g des Gemisches werden erneut durch 100 g Aluminiumoxid säulenchromatographisch gereinigt, wobei ein Gemisch von Essigsäureäthylester und Äthanol (6 : 1) zur Eluierung verwendet wird. Dabei werden 120 mg des β-Isomers (Ausbeute: 4,5%) und 300 mg des α-Isomers (Ausbeute: 11,2%) in Form von farblosen Pulvern gewonnen. Die restliche Menge wird als Gemisch der α- und β-Isomeren eluiert.

Bei der Gewinnung durch Säulenchromatographie wird in einer anderen Ausführungsform die vorstehend genannte Aluminiumoxidsäule durch eine mit Kieselgel 40-63 µm gefüllte Säule ersetzt. Dabei werden 830 mg β-Isomer (Ausbeute: 31,1%) und 210 mg α-Isomer (Ausbeute: 7,9%) gewonnen. In dieser Ausführungsform wird Chloroform/Methanol (60 : 1) mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml/min zur Eluierung verwendet.

Physikalische Eigenschaften des β-Isomer:
[α] + 3.4° (C = 1, in Methanol)
Analyse: C₃₂H₄₃O₁₈N₃; Molekulargewicht= 757.70

Ber.:C, 50.73, H, 5.72, N, 5.55 Gef.:C, 50.42, H, 5.80, N, 5.36

Massenspektrogramm m/Z 757 (M⁺), 742 (M⁺ -15), 714 (M⁺ -43), 698 (M⁺ -59)
IR µ 1735, 1680 und 1535 cm^-1
′H-NMR (CDCl₃) δ H (TMS)
1.37 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.88 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 2.46 (dd, 1H, J=4.8 and 12.9 Hz), 3.82 (s, 3H), 5.72 (d, 1H, J=2.1 Hz), 5.83 (d, 1H, J=8.4 Hz), 7.35 (d, 1H, J=8.4 Hz), 9.83 (breit s, 1H)

Beispiel 2 Herstellung von 2′,3′-Isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-1-carboxyl-D-glycero-β-D-galacto-octapyranosyl)- uridin

185 mg des in Beispiel 1 erhaltenen β-Isomers werden mit 10 ml 1 mol/l Natronlauge versetzt. Die erhaltene Lösung wird bei Raumtemperatur 2 Stunden gerührt. Dann wird die Lösung mit 20 ml Wasser versetzt und im Eis gekühlt. Der pH-Wert der Lösung wird mit einem Kationenaustauscher auf 3,0 eingestellt. Dann wird die Lösung filtriert und gefriergetrocknet. Das dabei erhaltene Pulver wird in 20 ml Methanol gelöst, mit Aktivkohle behandelt, filtriert, auf ein Volumen von 5 ml eingeengt und mit Essigsäureäthylester versetzt, wobei ein farbloses Pulver erhalten wird, das über Phosphorpentoxid getrocknet wird. Es wird die Titelverbindung in einer Ausbeute von 82% erhalten.

Physikalische Eigenschaften:

[α] -12° (C = 1, in Methanol
Analyse: C₂₃H₃₃O₁₄N₃;

Ber.:C, 48.00, H, 5.78, N,7.30 Gef.:C, 47.91, H, 5.84, N,7.25

UV λ nm (log ε ); 260 (3.96)
IR ν 1660, 1530 cm^-1
′H-NMR (D₂O) δ H (DSS): 1.40 (s, 3H), 1.58 (s, 3H), 1.70 (dd, 1H, J=12.8 und 11.5 Hz), 2.03 (s, 3H), 2,43 (dd, 1H, J=12.8 und 3.8 Hz), 5.82 (breit s, 1H), 5.85 (d, 1H, J=8.1 Hz), 7.72 (d, 1H, J=8.1 Hz)

Beispiel 3 Herstellung von 5-Fluor-2′,3′-isopropyliden-5-O-(4-N-acetyl- 2,4-dideoxy-3,6,7,8,-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D- glycero-b-D-galacto-octapyranosyl)-uridin

In 50 ml Acetonitril werden 500 mg 5-Fluor-2′,3′-isopropylidenuridin, 300 mg Hg(II)-cyanat, 600 mg Hg(II)- bromid und 1 g Molekularsieb (4A) suspendiert. Die Suspension wird mit 1,2 g Verbindung II (die in Beispiel 1 verwendete Verbindung) 16 Stunden unter Rühren umgesetzt. Dann werden weitere 510 mg Verbindung II, 150 mg Hg(II)-cyanat und 300 mg Hg(II)-bromid zugegeben und weitere 24 Stunden gerührt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch filtriert, und das Filtrat unter vermindertem Druck bei 40°C zur Entfernung des Lösungsmittels eingedampft. Es wird ein öliger Rückstand erhalten, der mit 100 ml Wasser versetzt wird. Unlösliche Bestandteile werden entfernt. Hierauf wird die Lösung zur Entfernung von ätherlöslichen Stoffen mit Äther behandelt. Die wäßrige Lösung wird mit Kaliumchlorid gesättigt und mit Essigsäureäthylester extrahiert. Der erhaltene Essig säureäthylesterextrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel abdestilliert. Es verbleiben 1,5 g öliges Produkt.

Das erhaltene Öl wird säulenchromatographisch an einer Kieselgelsäule gereinigt (200 g, Kieselgel 60, 0,06 bis 0,21 mm). Zur Eluierung wird Chloroform/Methanol (30 : 1) verwendet. Es wird ein Gemisch der Titelverbindung und eines Isomeren davon erhalten. Die erhaltene Fraktion wird eingedampft und getrocknet. Ausbeute: 580 mg Rohprodukt.

Das Rohprodukt wird erneut an Kieselgel 40-63 µm säulenchromatographisch gereinigt. Chloroform/Methanol (60 : 1) wird als Laufmittel mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min durch die Säule geführt. Die Titelverbindung wird mit Hilfe eines Detektors zur Aufnahme der Fraktion mit UV (290 nm) isoliert und anschließend gereinigt. Ausbeute: 300 mg (23%) der Titelverbindung. Gleichzeitig werden 210 mg (Ausbeute: 16%) des isomeren 5-Fluor-2′,3′-isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4-dideoxy- 3,6,7,8,-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D-Glycero-α-D-galac to-octapyranosyl)-uridin erhalten. Die Ausbeute an reinem Isomer beträgt 85 mg (11%).

Physikalische Eigenschaften der Titelverbindung:
[α] + 11.0° (C = 1, in Methanol)
Analyse: C₃₂H₄₂O₁₈N₃F;

Ber.:C, 49.55, H, 5.42, N, 5.45 Gef.:C, 49.34, H, 5.65, N, 5.22

Massenspektrogramm m/Z 775 (M⁺), 760 (M⁺ -15), 732 (M⁺ -43), 716 (M⁺ -59)
IR ν 1735, 1680 und 1535 cm^-1
′1H-NMR (CDCl₃) δ H (TMS)
1.37 (s, 3H), 1.56 (s, 3H), 1.87 (s, 3H), 1.99 (s, 6H), 2.02 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.50 (dd, 1H, J=14 und 3.5 Hz), 3.77 (s, 3H), 5.54 (breit s, 1 H), 7.44 (dd, 1H, J=8 Hz)

Beispiel 4 Herstellung von 5-Fluor-2′,3′-isopropyliden-5′-O-(4-N- acetyl-2,4-dideoxy-1-carboxyl-D-glycero-β-D-galacto- octapyranosyl)-uridin

Unter Verwendung der in Beispiel 3 hergestellten Verbindung wird bei Anwendung des Verfahrens von Beispiel 2 die Titelverbindung in einer Ausbeute von 80% erhalten.

Physikalische Eigenschaften:
[α] -9.2° (C = 1, in Methanol
Analyse: C₂₃H₃₂O₁₄N₃F;

Ber.:C, 48.08, H, 5.61, N, 7.31 Gef.:C, 48.05, H, 5.48, N, 7.42

IR ν 3400, 1688, 1580 cm^-1
′H-NMR (D₂O) δ H (DSS): 1.40 (s, 3H), 1.58 (s, 3H), 1.74 (t, 1H, J=14 Hz), 2.04 (s, 3H), 2,48 (dd, 1H, J=14 und 3.5 Hz), 5.86 (breit s, 1H), 7.95 (d, 1H, J=8 Hz)

Beispiel 5 Herstellung von 2′,3′-Isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4-dide oxy-1-methoxycarbonyl-D-glycero-β-D-galacto-octapyranosyl)- uridin

500 mg (0,66 mmol) 2′,3′-Isopropyliden-5′-O-(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-3,6,7,8-tetra-O-acetyl-1-methoxycarbonyl-D-Glycero- β-D-galacto-octapyranosyl)-uridin, gelöst in 10 ml Methanol, werden mit 10 ml einer 100 mg (4,35 mmol) metallisches Natrium enthaltenden Methanollösung versetzt, wobei das Gemisch in einem Eisbad 20 Minuten gerührt wird. Die erhaltene Lösung wird mit 1 g Dowex 50-X8 (H⁺) neutralisiert, anschließend filtriert, eingedampft und durch Trocknen verfestigt. Die verfestigte Masse wird in einer kleinen Menge Wasser gelöst, gefriergetrocknet und dann im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 350 mg (90%) farbloser amorpher Feststoff. 200 mg des amorphen Feststoffes werden an Kieselgel chromatographiert und unter Verwendung von Chloroform/Methanol (10 : 1) fraktioniert. Ausbeute: 150 mg (75%) der Titelverbindung in amorpher Form.

Physikalische Eigenschaften:
Zersetzungspunkt: 165°C
[α] -3.4° (C = 1, in Methanol
Analyse: C₂₄H₃₅O₁₄N₃ · 3H₂O;

Ber.:C, 44.79, H, 6.42, N, 6.53 Gef.:C, 45.23, H, 5.51, N, 6.38

IR ν 1730 cm^-1 (COO Me)′1H-NMR MHz (D₂O), TSP): 1.413 (s, 3H), 1.605 (s, 3H), 2.061 (s, 3H), 3.807 (s, 3H)

Beispiel 6 Herstellung von 5′-O-(4-N-Acetyl-2,4-dideoxy-1-methoxycarbo nyl-D-glycero-b-D-galacto-octapyranosyl)-uridin

2 ml einer 90% Trifluoressigsäurelösung von 150 mg (0,273 mmol) der in Beispiel 5 erhaltenen Verbindung werden 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach vollständiger Umsetzung wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand mit einer kleinen Menge Wasser versetzt. Die Lösung wird dann gefriergetrocknet und im Vakuum getrocknet. Es werden 150 mg farblose amorphe Masse erhalten, die an Kieselgel säulenchromatographiert und mit Chloroform/Methanol (20 : 1) fraktioniert werden. Ausbeute: 120 mg (80%) der Titelverbindung als farblose amorphe Masse.

Physikalische Eigenschaften:
Zersetzungspunkt: 158°C
[α] -4.1° (C = 1, in Methanol
Analyse: C₂₁H₃₁N₃O₁₄ · 2 H₂O;

Ber.:C, 43.08, H, 6.07, N, 7.18 Gef.:C, 42.72, H, 5.26, N, 7.03

′H-NMR MHz (D₂O), TSP): 1.83 (1H, 3-Hax), 2.06 (3H, -NHAc) 2.49 (1H, 3-Heq), 3.86 (3H, COOMe)

Beispiel 7 Herstellung von 5′-O-(4-N-Acetyl-2,4-dideoxy-3,6,7,8-tetra-O- acetyl-1-methoxycarbonyl-D-glycero-β-D-galacto-octapyranosyl)- uridin

1,5 ml einer 90% wäßrigen Trifluoressigsäurelösung von 50 mg (0,07 mmol) der in Beispiel 1 erhaltenen Verbindung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach vollständiger Umsetzung wird das Lösungsmittel abdestilliert, der Rückstand mit einer kleinen Menge Wasser versetzt und die erhaltene Lösung gefriergetrocknet und dann im Vakkuum getrocknet, wobei 50 mg der Titelverbindung als farblose amorphe Masse erhalten werden.

Physikalische Eigenschaften:
Zersetzungspunkt: 133°C
IR ν 1735, 1680 cm^-1
′H-NMR (D₂O) δ H (DSS) 2.62 (1H, 3Heq), 3.85 (3H, COOMe)

Bezugsbeispiel

Das Bezugsbeispiel zeigt die Wirkung der Verbindungen der Erfindung bei der Inhibierung der Metastasenbildung von Krebs zellen.

Testverfahren:
Im Test werden als Krebszellen "high metastasis factor species NL-17" und "low metastasis factor species NL-44" verwendet, die beide vom Clon Anenocarcinoma 26 von der Balb/c Maus stammen. Einzelheiten hierzu finden sich bei Takashi Tsuruo u. Mitarb., Cancer. Res., Bd. 43 (1983), S. 5437.

Die Krebszellen werden in einem Kohlendioxid-Inkubator 24 Stunden in Gegenwart von 0,1 mmol der in Beispiel 3 erhaltenen Verbindung inkubiert (nachstehend als Verbindung I bezeichnet). Mäuse der gleichen Familie werden durch ihre Schwanzvene mit 5×10⁴ Krebszellen infiziert. Gleichzeitig wird den Mäusen 0,25 mg oder 0,5 mg der Verbindung I verabreicht. Danach wird zweimal pro Woche 0,25 mg bzw. 0,5 mg der Verbindung I intravenös gegeben. 22 Tage nach der Überimpfung der Krebszellen werden die Mäuse getötet und ihre Lungen entkernt. Die entkernten Lungen werden gewogen und die Anzahl der entstandenen Tuberosa bestimmt.

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle zusammengefaßt. Aus der Tabelle ist zu sehen, daß der Faktor der Metastasenbildung in der Lunge für beide Zellarten NL-17 und NL-44 durch die Vorbehandlung und die Gabe der Verbindung I der Erfindung erheblich inhibiert wird. Die Inhibierung hängt dabei auch von der Dosierung der Verbindung ab.

Tabelle

Wirkung der Verbindung I gegen die Metastasierung von NL-17 und NL-44

Beispiel 8 Herstellung von 2′,3′-Di-O-acetyl-5′-O(4-N-acetyl-2,4- dideoxy-1-methoxycarbonyl-3,6,7,8-tetra-O-acetyl- D-glycero-β-D-galacto-1-octopyranosyl)-inosin (3β )

Ähnlich den vorhergehenden Beispielen wurde Methyl-2-chlor-5- acetamido-2,5-dideoxy-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-D-glycero-β-D- galacto-2-nonulopyranosonat (1) mit 2′,3′-Di-O-acetylinosin (2) unter den Bedingungen der Koenigs-Knorr-Reaktion umgesetzt und dabei die folgenden Ergebnisse erhalten:

Tabelle

Sialosylierung von 2′,3′-Di-O-acetylinosin mit 1

Zusätzlich wurden die folgenden Nebenprodukte erhalten.

Die Ausbeute an acetyliertem Sialosylinosin (3α+3β ) betrug etwa 30%.

Bei einer nachfolgenden Verseifung erhielt man die weiter unten näher angegebene Verbindung 6β mit einer Ausbeute von etwa 98%.

Die physikalischen Eigenschaften der erhaltenen Produkte sind in den folgenden Tabellen zusammengefaßt:

Claims

1. N-Acetylneuraminsäure-Derivate der allgemeinen Formel I in der die Reste R¹ unabhängig voneinander Wasserstoffatome oder Acetylgruppen bedeuten, R² einen Pyrimidin- oder Purinrest darstellt und R³ eine Carboxyl- oder Methoxycarbonylgruppe ist.

2. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ eine Acetylgruppe bedeutet, R² eine 2′,3′-Isopropylidenuridingruppe darstellt und R³ eine Methoxycarbonylgruppe bedeutet.

3. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet, R² die 2′,3′-Isopropylidenuridingruppe darstellt und R³ die Methoxycarbonylgruppe ist.

4. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet, R² die Uridingruppe darstellt und R³ eine Carboxylgruppe bedeutet.

5. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet, R² die 5-Fluor-2′,3′-isopropylidenuridingruppe darstellt und R³ eine Methoxycarbonylgruppe bedeutet.

6. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ eine Acetylgruppe bedeutet, R² die 5-Fluor-2′,3′-isopropylidenuridingruppe darstellt und R³ eine Methoxycarbonylgruppe bedeutet.

7. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet, R² die 5-Fluoruridingruppe darstellt und R³ eine Methoxycarbonylgruppe bedeutet.

8. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet, R² die 5-Fluoruridingruppe darstellt und R³ eine Carboxylgruppe bedeutet.

9. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ ein Wasserstoffatom bedeutet, R² die Uridingruppe darstellt und R³ eine Methoxycarbonylgruppe bedeutet.

10. N-Acetylneuraminsäure-Derivat nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, in der R¹ eine Acetylgruppe bedeutet, R² die Uridingruppe darstellt und R³ eine Methoxycarbonylgruppe bedeutet.

11. Verfahren zur Herstellung der N-Acetylneuraminsäure-Derivate nach Anspruch 1 der allgemeinen Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II mit einer Verbindung der allgemeinen Formel III,R²-H (III)in der R² einen Pyrimidin- oder Purin-Nucleosidrest darstellt, in Gegenwart eines Katalysators umsetzt, das erhaltene Reaktionsprodukt gegebenenfalls hydrolysiert und anschließend mit Hilfe eines zweifachen Chromatographieverfahrens aus dem Reaktionsgemisch gewinnt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als zweifaches Chromatographieverfahren
Adsorptionschromatographie/Adsorptionschromatographie,
Adsorptionschromatographie/Verteilungschromatographie,
Verteilungschromatographie/Adsorptionschromatographie oder
Verteilungschromatographie/Verteilungschromatographie
durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Verbindung der allgemeinen Formel III eine Verbindung der allgemeinen Formel einsetzt, in der R ein Wasserstoff- oder Fluoratom bedeutet und Me Methylgruppe ist.

14. Verwendung von 5-Fluor-2′,3′-isopropyliden-5-O-(4-N- acetyl-2,4-dideoxy-3,6,7,8-tetra-O-acetyl-1- Methoxycarbonyl-D-glycero-β-D-galacto- octapyranosyl)-uridin zur Behandlung von Krebserkrankungen, insbesondere zur Inhibierung der Metastasebildung.