DE3507407A1

DE3507407A1 - Durchfluss-zytometriegeraet

Info

Publication number: DE3507407A1
Application number: DE19853507407
Authority: DE
Inventors: Vernon L. Los Altos Calif. Chupp
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1984-03-05
Filing date: 1985-03-02
Publication date: 1985-09-12
Also published as: US4545677A; JPS60195436A; JPH0258585B2; DE3507407C2

Description

VON KREISLER SCHÜN VON KREISLER

Becton Dickinson and Cos Mack Centre Drive Paramus, New Jersey 076 U.S.A.

EISHOLIi FUES ING WERNER

PATENTANWÄLTE

Dr.-Ing. von Kreisler 11973 Dr.-Ing. K. W. Eishold t 1981

Dr.-Ing. K. Schönwald

Dr. J. F. Fues

Dipl.-Chem. Alek von Kreisler

Dipl.-Chem. Carola Keller

Dipl.-Ing. G. Selting

Dr. H.-K. Werner

Durchfluß-Zytometriegerat DEICHMANNHAUS AM HAUPT3AHKMOF

D-5000 KÖLN 1

Sg-Da/Fe

1. März 1985

Die Erfindung betrifft ein Durchfluß-Zytomet-ie _:rer. "it nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Durchfluß-Zytometriegeräte τ Zellen oder anderen Partikel mung, um eine oder mehrere C suchenden Zelle zu bestLame:: Zellen enthaltende Flüssigfluß-Zytometriegerät in £·.?.■ Flüssigkeitsströmung so :?e. wesentlichen eine nach ' : passiert. Änderungen der e: mit der Bestimmung des Is gebracht, wenn eine jede Sei Auf ähnliche Weise stre-ie Zellen, wenn ein ein fell-i-ride bereich gerichtet ist, -·Λ λ ;, Meßbereich durchströ.:<vj»r:« i-=i eine Funktion der "iller-^:..a Lichtdurchlässigkexc, eier:· ; i

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BADORIGINAL

■felefon:(0221) 13104L·Telex: ^:.:i\:^- ■palent Köln

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ist die von markierten Zellen emittierte Fluoreszenz, die beim Hindurchtreten der Zellen durch den Lichtstrahl aufgrund der Anregungsenergie des einfallenden Lichtstrahls angeregt worden ist, zur Identifikation der speziell markierten Zellen meßbar. Mit dem Durchfluß-Zytometriegerät kann nicht nur eine Zellenanalyse, sondern auch das Sortieren der Zellen durchgeführt werden. Laser werden als Lichtquelle für den einfallenden Lichtstrahl in Durchfluß-Zytometriegeräten verwendet, aber auch Lichtquellen für inkohärentes Licht, wie beispielsweise Quecksilber-Bogenlampen.

Bei der Strömungs-Zytometrie mit Laseranregung wird im einzelnen ein scharf fokussierter Laserstrahl üblicherweise in Koinzidenz mit den Zellen o.dgl. gebracht, die in Verbindung mit dem Lichtstrahl analysiert werden sollen. Auf diese Weise erlaubt der Lichtstrahl die Ausführung der Analyse aufgrund des von den Zellen gestreuten Lichtes oder der von ihnen emittierten Fluoreszenz. Wenn die Zellen auf einem normalerweise vertikalen Weg in ihrer Flüssigkeitsstrombahn von der Düsenspitze bis zum Zellenkollektor bewegt werden, kreuzen sie den fokussierten Laserstrahl, der normalerweise entlang einem im wesentlichen horizontalen Weg verläuft. Das optische System, häufig ein Mehrkanalsystem, zur Messung der Fluoreszenz oder des Streulichts hat üblicherweise eine Betrachtungsachse, die gegenseitig senkrecht auf beide Achsen, sowohl auf der Achse der Flüssigkeitsströmung und als auch auf der Achse des Laserstrahls steht. Jedesmal wenn ein Laserstrahl auf eine Zelle trifft, wird ein optischer Impuls erzeugt, dessen Intensität und Wellenlangenprofil die Zelle charakterisiert. Optische Impulse werden letztlich in Digitalwerte konvertiert und von einem Computer

entsprechend vorgewählter Bedienungsfunktionen verarbeitet. Die Ausgangsdaten v/erden üblicherweise der Bedienungsperson in Verbindung mit dieser digitalen Information präsentiert. Da es wünschenswert ist, daß die Impulse eine Intensitätsinformation über die Zelle geben und nicht vom Laserstrahl, ist es weiterhin erwünscht, daß die vertikale Dimension des fokussierten Laserbrennflecks derart reduziert ist, daß er kleiner ist als die typischen zu untersuchenden Zellen.

Darüber hinaus erfaßt das elektrische Meßsystem zum Analysieren der Impulse manchmal nur die Höhe der Impulse anstelle der Fläche. In diesem Fall erzeugt die Reduzierung der vertikalen Brennpunkteinschnürung des Laserstrahls zu einer Einschnürung, die sich dem Zellendurchmesser nähert, eine Vergrößerung des erhaltenen Signals im direkten Verhältnis hierzu. Andererseits führt die Reduzierung der horizontalen Brennpunkteinschnürung des Laserstrahls auf eine geringere Einschnürung als der Zellendurchmesser üblicherweise zu fehlerhaften Ergebnissen durch Vergrößerung der Unsicherheit hinsichtlich der präzisen horizontalen Position der Flüssigkeitsströmung. In diesem Fall ergibt sich eine geringere Auflösung, die in diesem Technologiebereich als vergrößerter Variationskoeffizient bezeichnet wird. Entsprechend weist ein verbessertes Beleuchtungssystem wunschgemäß einen Fokussierbereich auf, bei dem die vertikale Strahleinschnürung wesentlich kleiner als die horizontale Strahleinschnürung ist. Eine derartige asymmetrische Strahlgestaltung ist nicht unüblich in der Laserdurchfluß-Zytometrie.

Beispielsweise ist es bekannt, daß Einzelbetriebsart-

Laser mit kontinuierlichem Laserlicht, wie sie in Durchfluß-Zytometriegeräten verwendet werden, ein Strahlintensitätsprofil Gaußscher Art aufweisen und daß die folgende Gleichung die Strahleinschnürung wiedergibt, wenn mit einer Linse fokussiert wird:

X 4 λ f

¥ w

2Q wobei Λ die Laserwellenlänge ist; f die Linsenbrennweite;

w die Breite des unfokussierten Laserstrahls und 6 die durch die Fraktion begrenzte minimale

Brennpunkteinschnürung.

(w und 6 werden üblicherweise auf die l/«£²

Intensitätspunkte dimensioniert)

Aus der obigen Gleichung ist offensichtlich, daß, um die Strahleinschnürung zu reduzieren, entweder die Linsenbrennweite (f) verkleinert werden muß oder die unfokussierte Laserstrahlbreite (w) vergrößert oder erweitert werden muß. Ebenfalls sind beide Möglichkeiten nur so lange erfolgreich wie die Winkel so klein sind, daß geometrische Abberationen nicht einen Faktor darstellen.

Bekannterweise ist es üblich, zur Erzeugung einer Ausdehnung des fokussierten Strahls, die in der vertikalen Ebene kleiner ist als in der horizontalen, Zylinderlinsen zu verwenden, üblicherweise kann eine elliptische Strahlform erzeugt werden, in der die vertikale Strahlbreite größer ist als die horizontale Strahlbreite. Das Fokussieren erfolgt dann mit einer sphärischen Linse mit einer bestimmten Brennweite.

Alternativ ist bekannt, einen einfallenden Zirkularstrahl zu verwenden, der auf die Zelle über asymmetrische, üblicherweise zylindrische Fokussieroptiken fokussiert ist. Für diese Art der Fokussieroptiken gilt die gleiche Gaußsche Beziehung. Jegliche Anzahl von Variationen dieser Techniken kann verwendet werden, um einen asymmetrischen Brennpunktfleck auf den in der Flüssigkeitsströmung fließenden Zellen zu erzeugen.

Alle bekannten Systeme haben einen chromatischen Fehler, wenn mehr als ein Laser gleichzeitig als Anregungslichtquelle verwendet wird und wenn eine der zuvor beschriebenen zylindrischen Linsen zum Fokussieren verwendet wird. Jede der zylindrischen Linsen fokussiert die Laser mit unterschiedlichen Wellenlängen in unterschiedlich von der Linse auftretenden Entfernungen. Auf diese Weise würden die Zellen, wo der Flüssigkeitsstrom mit den Zellen den ersten Laser in einer scharf fokussierten Zone kreuzt, wenige μεεσ später den zweiten Laserstrahl in einer größeren im wesentlichen unfokussierten Zone mit einer entsprechenden Verschlechterung der Arbeitsweise kreuzen. Wenn zylindrische Linsen verwendet werden, erfordert die Korrektur dieses Fehlers zwei oder drei komplizierte Linsenelemente, die sorgfältig unter Verwendung verschiedener Gläser mit geeignet verändernden Dispersionen entworfen sind, üblicherweise können solche Kombinationen die chromatischen Abberationen nur über einen Teil des erforderlichen Wellenlängenbereichs

ausreichend korrigieren. Darüber

hinaus müssen die Achsen der individuellen zylindrischen Elemente sorgfältig überprüft werden. Selbst wenn die zylindrischen Linsen sorgfältig zusammengestellt sind, können sie optische Abberationen erzeugen,

die innerhalb der Diffraktionsgrenze am Zellenraum gehalten werden müssen, um eine Strahlform, mit optimaler Wirkungsweise zu erzeugen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Durchfluß-Zytometriegerät der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem der Lichtstrahl derart geformt ist, daß ein Fokussierbereich erzeugt werden kann, dessen vertikale Strahleinschnürung wesentlich kleiner als die horizontale Strahleinschnürung ist.

Zur Lösung dieser Aufgabe ist erfindungsgemäß vorgesehen,

daß mindestens ein lichtbrechende Eigenschaften aufweisendes Prisma in dem Lichtstrahl angeordnet ist, das den Lichtstrahl in mindestens einer Richtung erweitert hat, wenn der Lichtstrahl aus dem Prisma austritt,
daß das Prisma derart orientiert ist, daß der erweiterte Lichtstrahl auf einer im wesentlichen quer zur Richtung der Strömungsbahn verlaufenden Achse auf die Zellen gerichtet ist, und daß die Fokussxerexnrichtung den erweiterten Lichtstrahl in einem Strömungsbahnbereich so fokussiert, daß die vertikale Strahleinschnürung geringer ist als die horizontale.

Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung sind zwei lichtbrechende Prismen vorgesehen, die in dem von einem Laser erzeugten Strahlengang angeordnet sind. Die Prismen sind derart angeordnet, daß zwischen ihnen ein Luftspalt besteht. Jedes Prisma weist einen der-

artigen spitzen Winkel auf, daß der Einfallwinkel des Laserstrahls im wesentlich in der Nähe des Brewster-Winkels liegt. Jedes Prisma hat vorzugsweise eine Austrittsfläche, die so orientiert ist, daß sie im wesentlichen senkrecht zum Strahlengang des Laserstrahls ist. Jedes Prisma hat lichtbrechende Eigenschaften zum Erweitern des einfallenden Lichtstrahls in einer im wesentlichen parallel zur Richtung der Zellflußbahn verlaufenden Richtung. Eine Fokussierlinse fokussiert den Lichtstrahl auf die Flüssigkeitsbahn, so daß der Brennpunktbereich eine vertikale Strahleinschnürung aufweist, die kleiner ist als die horizontale Strahleinschnürung.

Entsprechend den Prinzipien der vorliegenden Erfindung wird die Lichtstrahlfokussierung ohne Verwendung der derzeit bekannten und verwendeten zylindrischen Fokussierlinsen erreicht. Bei Verwendung einer prismatischen Refraktionsanordnung werden chromatische Abberationen entweder eliminiert oder wesentlich reduziert, da die Wellenfront, die bei Eintritt in eine prismatische Fläche plan verläuft, beim Austritt aus einer solchen prismatischen Fläche plan bleibt. In der vorliegenden Erfindung ist das einzige optische EIement, das achromatisch sein muß, eine sphärische Probenfokussierlinse, die leichter herzustellen ist als eine zylindrische Linse. Ein zusätzlicher Vorteil des primatischen Strahlerweiterers aus der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß in manchen Fällen der Einfallswinkel und das Prismenmaterial ausgewählt v/erden kann, um den Brewster-Winkel näher zu kommen, um dadurch einen sehr hohen Transmissionswirkungsgrad des polarisierten Laserstrahls ohne eine Mehrschicht-Antireflektionsbeschichtung zu benötigen, sicherzu-

stellen. Eine andere signifikant vorteilhafte Eigenschaft besteht darin, daß die erfindungsgemäße prismatische Strahlerweitereranordnung leicht für die Anwendung mit vielfachen Lichtquellen, wie beispielsweise mit unterschiedlichen Wellenlängen arbeitenden Lasern in der Simultananalyse der in dem Durchfluß-Zytometriegerät fließenden Zellen anpaßbar ist. Ein besserer Arbeitswirkungsgrad der Systemoptiken wird ebenfalls erreicht.
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Im folgenden wird unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ein Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert.

Es zeigen:
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Fig. 1 eine schematische Darstellung der optischen Elemente und der Strahlengänge bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel in einem Durchfluß-Zytometriegerät zur Bestimmung der Eigenschaften von Zellen o.dgl.,

Fig. 2 eine schematische Darstellung der optischen Elemente in dem Gerät gemäß Fig. 1, wobei die Expansion des Laserstrahls in vertikaler Richtung eingezeichnet ist,

Fig. 3 eine vergrößerte Stirnflächenansicht des fokussierten Laserstrahls, durch den die Zellen in der Flüssigkeitsströmung fließen, wobei gezeigt ist, daß die vertikale Strahleinschnürung wesentlich kleiner ist als die horizontale Strahleinschnürung und

Fig. 4 eine schematische Darstellung der optischen Elemente in dem Durchfluß-Zytometriegerät gemäß Fig. 1, in der die Achsen von zwei

gleichzeitigen Laserstrahlen eingezeichnet sind, die auf die in der Flüssigkeitsströmung fließenden Zellen fokussiert sind.

In Fig. 1 sind im einzelnen die optischen Elemente und die Zellendurchflußelemente einer Strömungs-Zytometrievorrichtung 10 dargestellt. Die optischen bzw. Durchflußelemente gemäß Fig. 1 stellen die Hauptkomponenten einer Strömungs-Zytometrievorrichtung für den Transport von Partikeln, wie beispielsweise Zellen o.dgl., nacheinander in einer Flüssigkeitsströmung dar, um derartige Partikel hinsichtlich ihrer spezifischen Eigenschaften zu untersuchen. Beispielsweise können die Elemente der in Fig. 1 gezeigten Vorrichtung in einem FACS-Fluoreszenz-aktivierten Zellensortierer eingebaut sein, der von FACS, Systems Division of Becton, Dickinson and Company, Sunnyvale, California, hergestellt wird. Der FACS-Zellensortierer analysiert und separiert Zellenpopulationen auf der Basis von Streulicht und Fluoreszenz in einem großen Anwendungsbereich für wissenschaftliche Laboratorien. Zusätzlich zu den optischen Elementen und den Durchflußelementen, die im folgenden detailliert beschrieben werden und die in einem Gerät wie dem FACS-Zellensortierer eingebaut sein können, sind andere Einzelheiten eines Zellensortiergerätes, die in Verbindung mit dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel von Bedeutung sind, in der US-PS 3 826 364 beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist in vielen unterschiedlichen Arten von Durchfluß-Zytometriegeräten vorteilhaft anwendbar, sei es, daß das Streulicht, das Partikelvolumen, die Fluoreszenz oder andere optische Parameter zur Identifikation oder Quantifizierung der Zellen o.dgl. in einer Flüssigkeitsprobe

gemessen werden. Die optischen Elemente stellen speziell die Verbesserung in den Durchfluß-Zytometriegeräten, wie in dem zuvorerwähnten Patent beschrieben, dar.
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Wie in Fig. 1 dargestellt, stellen zwei Laser 12 und 14 die Lichtenergie für das vorliegende Durchfluß-Zytometriegerclt zur Verfügung. Bei diesem Ausführungsbeispiel weist das Durchfluß-Zytometriegerät 10 zwei Lichtquellen auf, so daß es möglich ist, eine Vielzahl verschiedener Zellentypen mit unterschiedlicher Fluoreszenz, unterschiedlichem Streulicht, unterschiedlichem Volumen oder anderen meßbaren Eigenschaften zu messen und zu quantifizieren. Es sei jedoch verstanden, daß die Verwendung von zwei Lasern in dem in Fig. 1 dargestellten Ausführungsbeispiel lediglich eine bevorzugte Ausführungsform darstellt und daß es nur ein Beispiel für die Anwendung von mehr als einer Lichtenergiequelle und Analyseelementen in der beschriebenen Erfindung dient.

Die Laser 12 und 14 sind ausgewählt, um Primäremissionen kohärenten Lichtes und spezifischer Wellenlängen zu erzeugen, die voneinander im Spektralbereich getrennt sind. Ein solcher geeigneter Laser 12 ist ein Argon-Ionen-Laser mit einer Primäremission bei 488 nm. Der Laser 14 arbeitet vorzugsweise mit einer unterschiedlichen, vom Laser 12 abweichenden Wellenlänge. Ein solcher Laser 14 kann ein Rhodamin-6-G-Farbstofflaser sein, der eine Primäremission bei 600 nm aufweist. Auch andere Laser können verwendet werden. Darüber hinaus, und obwohl die vorliegende Erfindung am nützlichsten beim Fokussieren von Laserstrahlen ist,

können Nicht-Laser-Lichtquellen, wie beispielsweise Quecksilber- oder Xenon-Bogenlampen anstelle einer Laserbestrahlung verwendet werden. Wenn jedoch ein Betrieb mit getrennten Wellenlängen bei dem Durchfluß-Zytometriegerät erwünscht ist, fällt die Wahl der Lichtbestrahlung auf Laser.

Laserstrahlen 16 und 18 treten aus den Lasern 12 bzw. 14 aus. Diese austretenden Laserstrahlen sind zu diesem Zeitpunkt in bezug auf die in der Flüssigkeitsströmung 20 fließenden Zellen unfokussiert. In dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ist der Laser 12 im wesentlichen horizontal ausgerichtet in bezug auf die Flüssigkeitsströmung 20 angeordnet, so daß der unfokussierte Laserstrahl 16 direkt in Richtung der Flüssigkeitsströmung gerichtet ist. Andererseits ist der unfokussierte Laserstrahl 18 über zwei Umlenkprismen 21 und 22 umgelenkt, um so in Richtung des Laserstrahls 16 zu verlaufen. Wenn auch die Laserstrahlen 16 und 18 in Richtung auf die fließenden Zellen auf einer im wesentlichen quer zur Richtung des Strömungsdurchgangs der Zellen verlaufenden Achse strahlen, ist der Strahl 18 vertikal nach unten in bezug auf den Strahl 16 verschoben, wenn er aus dem Umlenkprisma 22 austritt. Beide unfokussierte Laserstrahlen 16 und 18 sind konvergierend auf einen prismatischen Strahlerweiterer 24 gerichtet, der in dem vorliegenden Ausführungsbeispiel aus zwei Prismen 25 und 26 besteht. Beim Austritt aus dem prismatischen Strahlerweiterer 24 sind die jeweiligen Strahlen in vertikaler Richtung erweitert. Die erweiterten Laserstrahlen sind in Fig. 1 mit dem Bezugszeichen 28 bzw. 29 gekennzeichnet. Die erweiterten Laserstrahlen verlaufen durch eine Fokussierlinse 30,

die die Laserstrahlen in zwei Bereichen 31 und 32 der Flüssigkeitsströmung 20 fokussiert. Die Fokussierbereiche 31 und 32 sind im wesentlichen mit vertikalem Abstand voneinander angeordnet.
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Eine Düse 34, die in dem Durchfluß-Zytometriegerät eingebaut ist, vereinfacht den Fluß der Zellen innerhalb der Flüssigkeitsströmung 20. Die Verwendung einer derartigen Düse ist bekannt und beispielsweise in der ÜS-PS 3 826 364 beschrieben. Da jede Zelle die Bereiche 31 und 32 passiert, kann das davon gestreute Licht von einem geeigneten Fotodetektor 36 gemessen werden. Auf ähnliche Weise kann die Fluoreszenz, falls sie von den durch die Laserbestrahlung aktivierten Zellen emittiert wird, von Fluoreszenzdetektoren 38 und 39 gemessen werden. Wenn das Durchfluß-Zytometriegerät Zellen mit bestimmten Charakteristiken sortierend sammeln soll, können aufladende Platten 40 verwendet werden, um die Zellen in verschiedenen Behältern 42a,b und c zu sammeln.

In Fig. 2 ist eine detailliertere Darstellung des prismatischen Strahlerweiterers 24 in Richtung seiner optischen Achse dargestellt. Zum Zwecke der Klarheit ist lediglich der Durchgang des Laserstrahls 16 in Fig. 2 eingezeichnet, so daß der Effekt der Strahlerweiterung klarer verdeutlicht werden kann. Beide Prismen 25 und 26 sind im wesentlichen dreieckig gestaltete lichtbrechende Prismen mit einem rechten Winkel, die in dem Laserstrahlengang angeordnet sind. Diese Prismen sind mit engem Abstand voneinander, aber mit einem dazwischenliegenden Luftspalt 50 angeordnet, dessen Zweck im folgenden klarer erläutert wird. Jedes Prisma ist darüber hinaus derart ausgesucht, daß sein

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Eintrittwinkel im wesentlichen der Polarisationswinkel (Brewster-Winkel) ist. Der spitzen Winkel dieses Prismas ist mit den Bezugszeichen 52 bzw. 54 gekennzeichnet. Wie in der Optik allgemein bekannt, stellt der Brewster-Winkel den Eintrittwinkel dar, bei dem der Reflektionsbetrag für polarisiertes zur Einfallebene paralleles Licht minimiert ist. Auf diese Weise entstehen bei einem solchen Eintrittwinkel geringe oder keine Reflektionsverluste. Darüber hinaus ist der Brewster-Winkel eine Funktion des Prismenmaterials. Wie in Fig. 2 zu sehen ist, ist das Prisma 25 so orientiert, daß die Oberfläche 55 zwischen dem spitzen Winkel 52 und dem rechten Winkel 56 die Eintrittsfläche für den unfokussierten Laserstrahl 16 ist. Der Laserstrahl 16 verläuft in Richtung auf die Oberfläche 55 auf einer Achse 60, die im wesentlichen quer zur Richtung der Flüssigkeitsströmung 20 verläuft. Wenn das Licht von einem dünnen zu einem dichten Medium übergeht, wie beispielsweise von Luft in ein Prisma, wird der Lichtstrahl bei einem großen Einfallwinkel als Ergebnis der lichtbrechenden Eigenschaft des Prismas abgelenkt. Desweiteren ergibt sich, nachdem der Laserstrahl 16, wie durch das Bezugszeichen 16a gekennzeichnet, abgelenkt worden ist, eine Erweiterung der Strahlweite. Der erweiterte Strahl 16a fällt dann auf die Fläche 58, die eine interne reflektierende Fläche ist. Entsprechend unterliegt der erweiterte Strahl 16a einer internen Reflektion, mit 16b gekennzeichnet. Der Laserstrahl 16b ist ebenfalls erweitert in bezug auf den einfallenden Strahl 16. Dieser erweiterte Strahl 16b tritt aus dem Prisma 25 über die Austrittsfläche 59, wie in Fig. 2 gezeigt, aus. Der erweiterte Strahl 16b durchläuft die Austrittsfläche in einer im wesent-

lichen senkrecht zur ihr verlaufenden Richtung. Vorzugsweise kann die Austrittsfläche 59 mit einer Schicht aus Antireflexmaterial beschichtet sein, um den Transmissionswirkungsgrad durch diese zu verbessern. Sobald der erweiterte Strahl 16b aus dem Prisma 25 heraustritt, tritt er in den Luftspalt 50 ein.

Von dem Luftspalt 50 aus tritt der erweiterte Strahl 16b noch einmal von einem dünnen in ein dichtes Medium ein, wenn er auf die Fläche 62 des zweiten Prismas 26 fällt. Der Lichtstrahl 16b wird dann innerhalb des Prismas 26 derart in eine Richtung umgelenkt, daß er an der Fläche 64 im wesentlichen in Normalrichtung austritt. Wie bei dem Prisma 25 bewirkt das Umlenken des Strahl 16b im Prisma 26 eine zusätzliche Erweiterung in vertikaler Richtung, so daß sich beim Austritt aus dem Prisma 26 ein erheblich erweiterter Strahl 28 ergibt. Es sei darauf hingewiesen, daß die Prismen 25 und 26 mit ihren spitzen Winkeln komplementär zueinander angeordnet sind, so daß der sich ergebende erweiterte Strahl 28 auf einer im wesentlichen parallel und in Ausrichtung mit der Originalachse 60 des einfallenden Strahles 16 Achse 65 verläuft. Aufgrund der Orientierung der Prismen 25 und 26 wird der Laserstrahl 16 nur in einer Richtung, d.h. in vertikaler Richtung, verbreitert, das ist bei diesem Ausführungsbeispiel im wesentlichen parallel zur Richtung der Flüssigkeitsströmung 20. Auf diese Weise bleibt der verbreiterte Lichtstahl 28, während er in vertikaler Richtung expandiert, im wesentlichen konstant in bezug auf die ursprüngliche Strahlbreite in der horizontalen Ebene.

Der erweiterte Strahl 28 tritt durch die Fokussierlinse

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30, so daß der Strahl in dem Bereich 31 fokussiert werden kann, durch den die Flüssigkeitsströmung 20 verläuft. Der Fokussierbereich 31 ist in einer Phantomdarstellung in Fig. 3 gezeigt. Es ist erkennbar, daß die vertikale Strahlbreite, mit S bezeichnet, wesentlich kleiner ist als die horizontale Strahlweite, mit <f, bezeichnet. Das ist darauf zurückzuführen, daß nur die vertikale Komponente des einfallenden Laserstrahl von den Prismen verbreitert worden ist. Entsprechend der zuvor erwähnten Gaußsehen Beziehung ergibt die Aufweitung oder Vergrößerung der Breite des unfokussierten Laserstrahls eine Verminderung oder Abnahme der minimalen Fokussiereinschnürung in der Ebene, in der die umfokussierte Laserbreite vergrößert wurde.

Die elliptische Gestalt des fokussierten Laserstrahls im Bereich 31 ist derart, daß <f typischerweise kleiner ist als der Durchmesser der zu analysierenden Zellen, während <f, gleich oder geringfügig größer ist als der Durchmesser der zu untersuchenden Zellen. Als Ergebnis dieser elliptischen Anordnung des fokussierten Laserstrahls wird die optische Signalintensität oder Impulshöhe vergrößert, um dadurch die Elektronik dieses Gerätes effektiver zu machen.

in Fig. 4 sind die Achsen beider Laserstrahlen dargestellt, wie die jeweiligen Lichtstrahlen durch die Prismen verlaufen. In Fig. 4 ist die Strahlerweiterung nicht dargestellt, so daß die Divergenzcharakteristik der zwei Laserstrahlen deutlicher gesehen werden kann.

Selbstverständlich ist jeder Laserstrahl in der vertikalen Richtung in ähnlicher Weise, wie in Verbindung mit Fig. 2 erläutert, verbreitert, wenn er durch das Prisma verläuft.

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Wie zuvor beschrieben, ist die Achse 60 des Laserstrahls 16 im wesentlichen quer zur Richtung der Flüssigkeitsströmung 20. Darüber hinaus ist die Achse 65 des erweiterten Strahls 28 im wesentlichen parallel zur Achse 60 und mit dieser ausgerichtet als Ergebnis der Orientierung der Prismen 25 und 26. Die Achse des unfokussierten Laserstrahls 18 wird durch die Achsenlinie 70 wiedergegeben. Wie zuvor in Verbindung mit Fig. 1 erwähnt, ist der unfokussierte Laserstrahl 18 in bezug auf den unfokussierten Laserstrahl 16 vertikal verschoben. Entsprechend ist, wie in Fig. 4 gezeigt, die Achse 70, die für den Laserstrahl 18 repräsentativ ist, vertikal in bezug auf die Achse 60, die den Laserstrahl 16 repräsentiert, verschoben. Beide Achsen konvergieren, wenn sie auf die Oberfläche 55 des ersten Prismas 25 auftreffen. Nach der Strahlerweiterung repräsentiert die Achse 65 die Erweiterung des Laserstrahls 16, während die Achse 75 die Achse des Laserstrahls 18 repräsentiert. Die Achse 65 verbleibt im wesentlichen horizontal in bezug auf die Flüssigkeitsströmung 20 und schneidet die Flüssigkeitsströmung im Fokussierbereich 31. Andererseits divergiert die Achse 75 nach dem Durchstrahlen des zweiten Prismas 26 und der Fokussierlinse 30 unter einem relativ kleinen Winkel in bezug auf die Achse 65. Dieser Winkel ist von dem vertikalen Abstand, der zwischen den Fokussierbereichen 31 und 32 der jeweiligen fokussierten Laserstrahlen gewünscht ist, abhängig. Bei dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ist der Bereich 32 des zweiten fokussierten Laserstrahls typischerweise 0,25 mm vertikal von dem Bereich 31 des ersten fokussierten Laserstrahls verschoben. Auf diese Weise wird die Achse 75 bei Austritt aus dem prismatischen Strahlerweiterer und

- Jr? -

der Fokussierlinse auf einem vertikal nach unten verlaufenden Weg unter relativ kleinem Winkel gehalten. Um den Abstand zwischen den jeweiligen Fokussierbereichen zu erhalten, kann die Linse 30 aus einer sphärischen achromatischen Linse bestehen, die das Fokussieren des zweiten Laserstrahls an einem von dem ersten fokussierten Laserstrahl unterschiedlichen Punkt erleichtert.

Es sei bemerkt, daß in Verbindung mit dem bevorzugten Ausführungsbeispiel zwei Prismen beschrieben worden sind, die vorliegende Erfindung aber nicht auf die Verwendung von zv/ei Prismen beschränkt ist. So kann ein Prisma oder mehr als zwei Prismen in Abhängigkeit von der strukturellen Gestaltung der optischen Elemente des Durchfluß-Zytometriegerätes verwendet werden.

Während die Prismen aus verschiedenen lichtbrechenden Materialien hergestellt v/erden können, ist geschmolzenes Quarz (Silizium-Dioxyd) das Material der Wahl. Prismen einer Gestalt, die keinen rechten Winkel aufweist, sind im Erfindungsgedanken der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.

Auf diese Weise wird ein verbessertes Durchfluß-Zytometriegerät vorgeschlagen, das insbesondere in Verbindung mit Laserstrahlbeleuchtung vorteilhaft ist und das den fokussierten Laserstrahl zur Verbesserung der optischen Effizienz gestaltet. Der Erfindung hat die Eigenschaft, frei von chromatischen Aberrationen zu sein, und sie vermeidet die Notwendigkeit komplizierter zylindrischer Optiken, wobei sie für einen hohen optischen Transmissions-Wirkungsgrad keine speziellen Beschichtungen benötigt.

Claims

35D7407 ANSPRÜCHE

1. Durchfluß-Zytometriegerät zur Bestimmung der Eigenschäften von Zellen o.dgl., die in einem Flüssigkeitsstrom fließen,

- mit einer Strömungseinrichtung zum vereinzelten Befördern der Zellen in einer Flüssigkeitsströmungsbahn,

- einer Lichtquelle mit einem einfallenden Lichtstrahl,

- einer Fokussierexnrichtung, die den Lichtstrahl in einem Bereich der Strömungsbahn fokussiert,

- einer Meßeinrichtung, die das mit jeder fließenden Zelle in Verbindung stehende Licht

mißt, wenn die Zelle den fokussierten Lichtstrahl kreuzt, und

- mit einer Auswerteeinrichtung für das gemessene Licht, um die Eigenschaften der Zellen zu bestimmen,

dadurch gekennzeichnet,

- daß mindestens ein lichtbrechende Eigenschaften aufweisendes (25,26) Prisma in dem Lichtstrahl (16,18) angeordnet ist, das den Lichtstrahl (16,18) in mindestens einer Richtung erweitert

hat, wenn der Lichtstrahl (16b,28) aus dem Prisma (25,26) austritt,

- daß das Prisma (25,26) derart orientiert ist, daß der erweiterte Lichtstrahl (28,29) auf einer im wesentlichen quer zur Richtung der

Strömungsbahn (20) verlaufenden Achse (65) auf die Zellen gerichtet ist, und

- daß die Fokussierexnrichtung (30) den er-

'JL-

weiterten Lichtstahl (28,29) in einem Strömungsbahnbereich (31) so fokussiert, daß die vertikale Strahleinschnürung (<f ) geringer ist als die horizontale (/, ) .

2. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle kohärentes Licht erzeugen.

3. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtquelle für das kohärente Licht ein Laser (12,14) ist.

4. Durchfluß-Zytometriegerät nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Prisma (25,26) eine erste lichtbrechende Eintrittsfläche (55) aufweist, die in bezug auf den Lichtstrahl (16,18) unter einem Winkel verläuft.

5. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß Eintrittsfläche (55) den Lichtstrahl (16,18) in einer im wesentlichen parallel zur Richtung der Strömungsbahn (20) verlaufenden Richtung verbreitert.

6. Durchfluß-Zytometriegerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Prisma (25,26) eine innere reflektierende Fläche (58) , um den erweiterten Lichtstrahl (16a) zu reflektieren, und eine Austrittsfläche (59) aufweist, aus der der reflektierte erweiterte Lichtstrahl (16b) aus dem Prisma (25) heraustritt.

7. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Austrittsfläche (59) der-

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art orientiert ist, daß sie im wesentlichen senkrecht zum erweiterten Lichtstrahl (16b) verläuft.

8. Durchfluß-Zytometriegerät nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zwei lichtbrechende Prismen (25,26) im Lichtstrahl (16,18) angeordnet sind, zwischen deren sich ein Luftspalt (50) erstreckt und die unter einem Winkel verlaufende Eintrittsflächen (55,62) aufweisen, so daß der erweiterte Lichtstrahl (28) , wenn er aus dem zweiten Prisma (26) austritt, im wesentlichen parallel zu dem einfallenden Lichtstrahl (16) verläuft.

9. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Prismen (25,26) rechtwinklig und dreieckig gestaltet sind.

10. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die spitzen Winkel der Prismen (25,26) so gewählt sind, daß der Eintrittwinkel an jedem Prisma im wesentlichen dem Brewster-Winkel (Polarisationswinkel) entspricht.

11. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das erste Prisma (25) im Strahlengang des Lichtstrahls (16) so angeordnet ist, daß die Fläche zwischen dem spitzen Winkel und dem rechten Winkel die Eintrittsfläche (55) für den Lichtstrahl (16,18) ist."

12. Durchfluß-Zytometriegerät nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Prismen (25,26) aus Silizium-Dioxyd bestehen.

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13. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein zweiter einfallender Lichtstrahl (70) auf das Prisma (25) gerichtet ist, so daß dieser in mindestens der einen gleichen Richtung erweitert ist wie der erste erweiterte Lichtstrahl, wenn der zweite Lichtstrahl aus dem Prisma austritt, wobei der zweite erweiterte Lichtstrahl aus dem Prisma unter einem divergierenden Winkel («£) in bezug auf den ersten erweiterten Lichtstrahl austritt.

14. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zur Fokussierung des zweiten erweiterten Lichtstrahls auf die Zellen in der Strömungsbahn (20) auf eine im wesentlichen mit vertikalem Abstand von dem Kreuzungsbereich (31) zwischen der Strömungsbahn (20) und dem ersten fokussierten Lichtstrahl (65) vorgesehen sind.

15. Durchfluß-Zytometriegerät nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussiermittel für den ersten und den zweiten Lichtstrahl eine sphärische achromatische Linse (30) aufweisen, die zwischen dem Prisma (26) und der Ströraungsbahn (20) angeordnet ist.

16. Durchfluß-Zytometriegerät nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lichtmeßeinrichtung (36) das von den den fokussierten Lichtstrahl kreuzenden Zellen gestreute Licht messen.

17. Durchfluß-Zytometriegerät nach einem der Ansprüche

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bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lichtmeßeinrichtung, die von den den Lichtstrahl kreuzenden Zellen emittierte Fluoreszenz messen.

18. Durchfluß-Zytometriegerät zur Bestimmung der Eigenschaften von Zellen o.dgl., die in einem Flüssigkeitsstrom fließen,

- mit einer Strömungseinrichtung zum vereinzelten Befördern der Zellen in einer Fltissigkeitsströmungsbahn,

- einer Lichtquelle mit einem einfallenden Lichtstrahl,

- einer Fokussiereinrichtung, die den Lichtstrahl in einem Bereich der Strömungsbahn fokussiert,

- einer Meßeinrichtung, die das mit jeder fließenden Zelle in Verbindung stehende Licht mißt, wenn die Zelle den fokussierten Lichtstrahl kreuzt, und

- mit einer Auswerteeinrichtung für das gemessene Licht, um die Eigenschaften der Zellen zu bestimmen, _t

dadurch gekennzeichnet,

- daß lichtbrechende Eigenschaften aufweisende prismatische Mittel (25,26) in dem Strahlengang des Lichtstrahls (16,18) angeordnet sind, die den Lichtstrahl (16,18) in mindestens einer Richtung erweitern und den erweiterten Lichtstrahl (28) auf die Zellen in der Strömungsbahn (20) richten und

- daß die Fokussiereinrichtung (30) den erweiterten Lichtstahl (28,29) in einem Strömungsbahnbereich (31) so fokussiert, daß die vertikale Strahleinschnürung (S₁) geringer ist als die horizontale (<O ·

19. Durchfluß-Zytometriegerät zur Bestimmung der Eigenschaften von Zellen o.dgl., die in einem Flüssigkeitsstrom fließen,

- einer Lichtquelle mit einem einfallenden Lichtstrahl,

dadurch gekennzeichnet,

- daß zv/ei Laser (12,14) zwei unfokussierte Lichtstrahlen (16,18) mit unterschiedlichen Wellenlängen erzeugen,

- daß zwei rechtwinklig gestalteten Prismen

(25,26) in dem Strahlengang beider Laserstrahlen (16,18) angeordnet sind, die zwischen sich einen Luftspalt (50) haben und deren spitze Winkel so gewählt sind, daß der Eintrittwinkel an jedem Prisma (25,26)im wesentlichen dem Brewster-Winkel entspricht und die Austrittsfläche (64) von einem der Prismen (26) im wesentlichen normal zu der Bahn (60) von einem der Strahlen

(16) ist,

- daß die Prismen (25,26) lichtbrechende Eigenschaften aufweisen, um die einfallenden Laser-

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strahlen (16,18) in eine im wesentlichen parallel zur Richtung der Zellenflußbahn (20) verlaufenden Richtung zu erweitern, daß die Prismen (25,26) so orientiert sind, daß einer der erweiterten Lichtstrahlen (28) aus diesen Prismen in einer im wesentlichen parallel zur Bahn (60) des einfallenden Laserstrahls (16) verlaufenden Bahn (65) austritt, daß die erweiterten Laserstrahlen (65,75) die Prismen unter einem divergierenden Winkel (·£) in bezug auf die vertikale Achse verlassen und auf die Zellen auf einer im wesentlichen quer zur Richtung der Strömungsbahn (20) verlaufenden Achse gerichtet sind,

daß eine Fokussierlinse (30) den ersten erweiterten Laserstrahl (65) in einem ersten Bereich (31) in der Strömungsbahn (20) und den zweiten erweiterten Laserstrahl (75) in einem zweiten Bereich (32) in der Strömungsbahn (20), der einen wesentlichen vertikalen Abstand von dem ersten Bereich aufweist (31) aufweist, fokussiert, wobei jeder Fokussxerberexch eine geringere vertikale Strahleinschnürung (i ) aufweist als die horizontale Strahleinschnürung