DE3444495A1

DE3444495A1 - Herstellung eines multi-kopien-hefe-vektors

Info

Publication number: DE3444495A1
Application number: DE19843444495
Authority: DE
Inventors: Ewa Dr. Wien Chlebowicz-Sledziewska; Andrzej Dr. Sledziewski
Original assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim International GmbH
Priority date: 1984-12-04
Filing date: 1984-12-04
Publication date: 1986-06-05
Also published as: JPS61181385A; EP0184163A2; ES549526A0; DK559585D0; HUT39775A; GR852891B; FI854781A0; ES556975A0; NO854864L; EP0184163A3; DK559585A; ES556976A0; ZA859240B; HU196454B; SU1364241A3; ES8802075A1; PT81594A; ES8801705A1; FI854781A; AU5070685A

Description

12/017 U/A

NACM-T-i

Boehringer Ingelheim International GmbH

Herstellung eines Multi-Kopien-Hefe-Vektors

3 4 4 4 Λ 9 5

* B tf «»*«

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung rekombinanter MuIti-Kopien-Hefe-Vektoren, ein Verfahren zur Vervielfältigung dieser Vektoren, Verwendung der Vektoren sowie die Vektoren selbst.

Bei der gentechnologischen Herstellung von Proteinen in geeigneten Wirtsorganismen wird die heterologe DNA, die für die gewünschten Proteine codiert, üblicherweise in die doppelsträngige DNA eines geeigneten KLonierungsvektors eingefügt, der dann in einem geeigneten Wirtsorganismus eingeführt wird. Das Replikationssystem des Wirtsorganismus reproduziert dann zusammen mit den DNA Abschnitten des originären Wirts die eingefügten DNA Fragmente. Vorausgesetzt, das Plasmid enthält ein geeignetes Leseraster und Promotoren, dann wird nicht nur die DNA repliziert, sondern auch das von ihr codierte Protein exprimiert. Die Proteinausbeute hängt natürlich ab von der Effizienz des Replikationssystems des Wirtsorganismus, nicht zuletzt aber auch von der zur Verfugung stehenden Menge an exprimierbarem DNA Material.

Viele Plasmide existieren nur einmal pro Zelle: einige wenige in mehr als einer Kot)ie üro Zelle. Das Plasmid ColE1 existiert beispielsweise in 10 bis 20 Kopien pro E.coli Chromosom. Von C0IEI abgeleitete Pla3mide lassen sich durch die Zugabe von Proteininhibitoren vervielfältigen, dadurch bedingt ist natürlich eine Vervielfältigung des Proteins nicht zu erreichen. Auch durch Temperatursteigerung können manche Plasmide, sogenannte "runaway Plasmide", zu einer Vervielfachung angeregt werden.

Nun hängt jedoch die Proteinausbeute nicht nur von der Anzahl der Kopienzahl der Plasmide ab, sondern auch von der Stabilität der Plasmide selbst. Bei den für Hefe geeigneten Vektoren sind Plasmide bekannt, die in hoher Kopienzahl vermehrbar, jedoch instabil sind; andere sind äußerst stabil, jedoch nur in geringer Koüienzahl pro Zelle vorhanden.

-■ 3

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand darin, ein für Hefe geeignetes Vektorsystem bereitzustellen, das sich in befriedigender Kopienzahl stabil erhalten und verwenden läßt.

Viele Plasmide mit heterologer OTA können nur unter selektionierenden Bedingungen fir die gentechnologische Herstellung von Proteinen verwendet werden, da sonst die nichttransformierten Organismen Überwuchern "würden. Diese selektionierenden Bedingungen können oftmals nur durch die Verwendung von Antibiotika eingestellt werden. Nicht nur, daß sich durch diese Mittel die Herstellung verteuert, auch die Entsorgung der Antibiotika-enthaltenden Fermentationsbrühen bereitet Probleme (Resistenzgefahr!).

Eine weitere Aufgabe bestand also darin, einen rekombinanten Multi-KoT>ien-Hefe-Vektor bereitzustellen, der sich unter nichtselektiven Bedingungen stabil kultivieren läßt.

Gelöst wurden diese Aufgaben durch die Verwendung von Hefe-Wirt s-Systemen und Elementen von Hefe-Express ions— Plasmiden wie Promotoren, Centromere und originäre Replikationselemente, die durch gentechnologische Methoden in geeigneter, im folgenden beschriebener Weise verknüpft wurden.

Die in der anhängenden Bibliographie zitierten Literaturstellen beleuchten den Stand der Technik und * beschreiben weitere Details. Wo erforderlich, werden sie durch die Angabe ihrer Ziffern zitiert.

Es gibt verschiedene Arten von Vektoren, die für die Expression heterologer Gene in Hefe verwendet werden können (1) . Eine Klasse an Hefe-Vektoren setzt sich zusammen aus sogenannten Hefe-integrierenden-Plasraiden (YIp) , die üblicherweise aus bakteriellen Plasmiden wie beispielsweise pBR 322 und Fragmenten von Hefe-chromosomaler DNA und einem Selektionierungsgen zusammengesetzt sind· Diese Vektoren

transformieren Hefe mit sehr geringer Ausbeute (1 "bis 10 transformiere Zellen pro 1 ¹Jg Plasmid DM) . Der transformierte Phenotyp wird durch Integration.des YIn Plasmides in das Hefe Chromosom erhalten (2,3)·

Bekannt ist, daß einige Fagmente aus Hefe- oder anderer eukaryotischer DNA Ylp-Plasmiden die Eigenschaft verleihen, sich extrachromosomal zu replizieren (4-8). Vektoren, die das ARS-Eletnent (autonomously replicating sequence) enthalten, wurden YRp (yeast replicating plasmids) oder einfach ARS-Plasmide genannt. Untersuchungen zur mitotischen Stabilität der YRp Plasmide haben gezeigt, daß selbst unter selektiven Wachstumsbedingungen nur ganz wenige Zellen (5-25$) das Plasmid enthalten (4,5,7,9)· Die Kopienzahl dieser Plasmide bewegte sich jedoch in der Größenordnung von 20-50 Kopien pro Zelle (7,10).

Bekannt ist auch, daß die Anwesenheit von sogenannten Centromer-Sequenzen auf einem Hefe-Vektor oftmals dessen Stabilität verbessert. Nicht verbessert wird jedoch durch die Centromer-?unktion die Anzahl der Plasmid-Kopien pro Zelle.

Die mitotische Stabilität der YRp-Plasmide kann nun Verbessert werden, indem Fragmente der Hefe-DNA zugegeben werden, von denen angenommen wird, daß sie die funktionellen Elemente eines Centromers (-CEN) darstellen (11,12). Diese Plasmide, YCp genannt (yeast centromere plasmid) sind in ca. 80fo der unter selektiven Bedingungen gewachsenen Zellen in 1 bis 2 Kopien cro Zelle vorhanden(11,12).

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae beinhaltet ein endogenes DNA-Plasmid, das "2 μ-Circle" genannt wurde; es ist mitotisch stabil und in 20 bis 50 Kopien pro Zelle vorhanden (13). Das 2 ·α-Circle trägt sein eigenes Amplif ikationssystem, das es dem Plasmid ermöglicht sich mehr als einmal pro Zellcyclus zu replizieren (14,15)· Viele verschiedene Hefe-Vektoren wurden auf Basis des 2 -i hergestellt; die meisten sind bis zu 60-80$ auf nichtselektivem Medium mit einer Kopienzahl von 20-50 pro

.ι 8 * ti ι"· ■

-ι - tr- ~ί

Zelle mitotisch stabil(14-16). Sie haben also zum Teil die Stabilität des 2 u verloren.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daS die Hefe-Centromer-Funktion (CEJI) durch die Transkription über einen regulierbaren Hefe-Promotor gesteuert werden kann.

Es konnte gezeigt werden, daß die Hefe-Centromere DNA YRp-Plasmide dann nicht mehr mitotisch stabilisiert, wenn sie von einem starken Promotor transkribiert wird (17)· In der vorliegenden Erfindung wurde eine CEN Sequenz, vorzugsweise eine CEN3 Sequenz vor einen regulierbaren Hefe Promotor, vorzugsweise dem Alkoholdehydrogenase II Promotor, plaziert; man erhielt die YCRp Plasmid Familie (yeast centromere regulated).

Die Expression des Hefe-Alkoholdehydrogenase-II Gens (ADH2) wird in Gegenwart· von Glucose' desaktiviert und in Gegenwart von nicht fermentierbaren Kohlenstoffquellen wie beispielsweise Ethanol reaktiviert (18). Es konnte gezeigt werden, daß die 5' flankierenden Sequenzen des ADH2 Gens, wenn sie in geeigneter Weise mit einem anderen Gen verknüpft sind diesem Gen Glucose-Desaktivierung verleihen können (19)· Durch Verknüpfung der CSN3-Sequenz vor die den ADH2 Promotor enthaltenden 5' flankierenden Regulationssequenzen (abgekürzt ADH2-Promotor) sollte die Kontrolle der Expression der ADH2-CEN3 Fusion durch einfachen Wechsel der Kohlenstoffquelle im Medium möglich werden. Wird die mit einem ADH2-CEN3 Fusionsplasmid (YCRp) transformierte Hefe in Gegenwart von Glucose kultiviert, wird der ADH2 Promotor desaktiviert (ADH2-AUS), und CEN3 stabilisiert das YCRp Plasmid mitotisch (CEN3-AS)· Bei Umstellung der Kohlenstoffquelle auf Ethanol wird der ADH2 Promotor reaktiviert (ADH2-AN) und blockiert durch die Expression durch die CEN3 Region hindurch (CEN3-AUS). Ergebnis: die YCRp Plasmide sind nicht mehr stabil. In diesem Stadium sollten die YCRp Plasmide in Hefezellen bis zu der gewünschten Kopienzahl amplifiziert werden können. Nach der Amplifikation

können diese YCRp Plasmide durch einfache Umstellung des Mediums von Ethanol auf Glucose durch die nun wieder funktionale CEN3 Sequenz stabilisiert werden.

Die Erfindung beschränkt sich nicht nur auf die CEN3 Sequenz als stabilisierendes und auf das ADH2 Gen als regulierbares Element; ebenso sind auch andere stabilisierende Elemente wie beispielsweise die GEN6 und CEN11 möglich, wenn sie in geeigneter Weise mit streng regulierbaren Hefe Promotoren fusioniert sind. Je nach Promotor kann dann die Regulierung durch eine Anzahl denkbarer Paktoren erreicht werden. Beispielhaft seien genannt: Wahl der Kohlenstoffquelle, Hitzeschock, Sauerstoff, Harn, Phosphate usw.

Die Zeichnungen sollen die Erfindung näher erläutern.

Figur 1 zeigt scheraatisch die Restriktions- und die genetische Karte der pBC3T1 und ADH2 BS Plasmide. Außerdem wird die Herstellung des YCRp2 Plasmids gezeigt.

Figur 2 zeigt schematisch die Restriktions- und die genetische Karte des JDB2O7 Plasraids. Außerdem wird die Herstellung der YCRp3 und YCRp4 Plasmide gezeigt.

Figur 3 zeigt einen Assay zur Ermittlung der Kopienzahl von YCRp Plasmiden.

Tabelle 1 führt die Stabilitäts- und Kopienzahldaten des YCRp2 Plasmides im Hefe Stamm SHU 32 auf.

Tabelle 2 führt die Stabilitäts- und Kopienzahldaten des YCR?3 Plasmides im Hefe Stamm SHU 32 auf.

Alle verwendeten DNA Restriktions- und Metabolismus-Enzyme stammen von den New England Biolabs und von den Bethesda Research Laboratories. Die Enzyme wurden unter Bedingungen und in Puffern verwendet, die von den Vertreibern angegeben wurden. ATP und die Deoxynukleotid-Triphosphate stammten von SIGMA; die DNA-linker von den New England Biolabs.

Die Reinigung kovalent geschlossener cirkulärer Plasmid DNA aus E.coli und die Transformation von B.coli wurde nach bereits beschriebenen Verfahren durchgeführt (20,21).

"E.coli-miniscreens" wurden wie beschrieben verwendet (22). Auch die Transformation der Hefe wurde im Prinzip nach bereits bekannten Verfahren durchgeführt (2), jedoch mit folgenden Modifikationen:

200 ml Zellen mit einem Gehalt von 2x10 Zellen/ml wurden durch Waschen mit 25 ml H₃O durch Zentrifugation gereinigt. Diese Zellen wurden mit 10 ml 1 M Sorbitol, 25 mM EDTA (ph 8) und 50 mM Dithiothreithol Lösung für 10 Min- bei 30⁰C behandelt und anschließend mit 10 ml 1 M Sorbitol gewaschen. Die pelletierten Zellen wurden danach vorsichtig in 10 ml SCE (1 M Sorbitol, 0,1 M Natriumeitrat ph 5,3 und 0,01 M EDTA) resuspendiert und bei 30°C mit 1 mg Zymolyase 5000 (Kirin Brauerei) behandelt. 80$iges Spheroplasting erfolgte durch die Zugabe von 100 al der Suspension zu 0,9 ml einer 10bigen SDS Lösung; gemessen wurde bei Abs_fl00 unter Verwendung einer Zello'sung vor der Zugabe des Enzyms als 0 Prozent Abgleich (die Lyse in der 10xigen SDS führte zu einem Abfall der )

Danach wurden die Zellen 3x mit 10 ml 1 M Sorbitol, einmal mit 1 M Sorbitol, 10 mM CaCl₃ und 10 mM Tris-HCl (ph 7,4) gewaschen und dann in 1 ml derselben Lösung resuspendiert. bis 15 ug der gereinigten plasmidischen'DNA wurden dann zugegeben und vorsichtig mit 100 ·ι1 der resufspendierten Zellen für 15 Min. vermischt. 1 ml einer Lösung, die 20^ (v/v) Polyethylenglykol 4000 (Merck), 10 mM CaCl₃ und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) enthielt, wurde unter vorsichtigem Vermischen innerhalb von 15 Min- zugegeben. Die Zellen wurden dann ab zentrifugiert und in 200 >il SOS ((1 M Sorbitol, 33,5$ (v/v IEPD Brühe und 6,5 mM CaCl₃)) für 20 Min. bei 30⁰C inkubiert. 100 al dieser Suspension wurde danach auf eine Petrischale aufgebracht, die 20 ml "Bottom-Agar" (182 g Sorbitol, 20 g Glucose, 0,7 g YNB und 30 g Difco Agar pro 1 1 H₂O) enthielt und mit 10 ml 50°C "Top-Agar" (gleiche Zusammensetzung wie der "Bottom-Agar", jedoch zusätzlich versehen wurde mit 1 ml Adenin (1,2 mg/ml), 1 ml Uracil (2,4 mg/ml) und 1 ral eines "-trp drop-out mix" pro 50 ml

"Bottom-Agar" ("-trp drop-out mix enthält folgende Aminosäuren pro 100 ml HpO: 0,2 g arg, 0,1 g his, 0,6 g ile, 0,6 g leu. 0,4 g lys, 0,1 g met, 0,6 g phe und 0,5 g thr) . Diese Trp⁺ Selektion ergab 10^ Hefe Transformanten pro ag Plasmid DNA.

Die Stabilität der Plasmide in Hefe wurde überprüft, indem man Zellen nach selektivem oder nichtselektivem Wachstum in Wasser verdünnte und auf YPD Platten plattierte (nichtselektiv). Nach 30 h Wachstum bei 28"C wurden diese Platten auf YNB-^AA Platten (TRP⁺ oder LEU⁺ Selektion) replika plattiert. Die prozentuale Plasmidstabilität wurde durch Division der Anzahl an Kolonien, die selektiv gewachsen waren durch die Anzahl an Kolonien, die nichtselektiv gewachsen waren, multipiziert mit 100 ermittelt.

Die Bestimmung der Kopienzahl der Plasmide wurde durch Southern Analyse ermittelt (23) · Die gesamte DNA der SHU 32 (YCRp) Transformanten die in selektivem Medium gewachsen waren, wurden mit der EcoRI Restriktionsendonuklease verdaut und durch Agarose Gel Elektrophorese fraktioniert. Nach Übertragung auf Nitrocellulose-Filter wurde die DNA mit durch Nick-Translation radioaktiv markierter YIp5 Plasmid DNA hybridisiert (YIp5 ist pBR322, das das Hefe URA3 Gen enthält' (3))· Nach Exponierung auf Röntgenfilm wurden wenigstens zwei Banden beobachtet: eine zeigte die einzelne URA3 chromosomale Kopie, die andere ist(sind) das(die) YCRp Plasmid Fragment(e). Als weitere Kontrolle diente eine DNA Probe eines mit dem YCp Plasmid transformierten SHU 32; dadurch wurde ein direkter Vergleich der Kopienzahl von YCp und YCRp Centromeren Plasmiden möglich. Bei einigen Versuchen wurden Serien-Verdünnungen der vollständigen Hefe DNA auf dem Gel entwickelt, so daß ein direkter Vergleich zwischen der Intensität der YCRp Banden und der der Kontrollplasmidbande, von dem bekannt ist, daß es nur in 1-2 Kopien pro Zelle vorhanden ist, möglich wurde.

Für die Transformation von Bakterien wurde jeweils der E.coli

Stamm RR1 verwendet (P", pro"", leu", thi~, lacy, rpsh, hsdR, hadM)(2i). Die Hefe Saccharomyces cerevisiae Stamm SHTJ 32 (leu2, trp1, ura3; freundlicherweise durch Dr.A.Hartig, Universität Wien zur Verfugung gestellt) wurde für die Hefe Transformationen verwendet. Daneben können natürlich auch andere Hefestämme verwendet werden.

Das verwendete LB Medium war wie bei Miller beschrieben (27) , jedoch unter Zugabe von 30 ug/ml Ampicillin (SERVA) nachdem das Medium autoklaviert und abgekühlt worden war. Die Hefen wurden auf folgenden Medien kultiviert: YP (1$ Hefe Extrakt, 2# Pepton und eine -Kohlenstoffquelle entweder 5$ Glucose oder 3£ Ethanol), YNB+CAA (0,67$ Hefe-Stickstoff-Base w/o Aminosäuren (Difco) , 0, 5$ Difco Casaminosäuren (CAA) und eine Kohlenstoffquelle entweder 5$ Glucose oder 3$ Ethanol). Zur TRP⁺ Selektionierung wurde das YNB+CAA Medium ergänzt mit "-trp drop-out" Lösung (1 ml einer 50x Lösung pro jeweils 50 ml Medium); zur LEU Selektion wurde eine "-leu drop-out" Lösung in der gleichen Weise zugegeben. Das Hefe Medium wurde durch Zugabe von 2, 5$ Difco Agar verfestigt.

Figur 1 zeigt zwei Plasmide: pBC3T1 und ADH2Bs. Hinweise zur Herstellung dieser Plasmide sind veröffentlicht (19,28). Das Plasmid pBC3T1 enthält einen Teil des pBR322 (19) mit dem Arapicillin-Resistenz-Gen (Ap ) und dem ColE1 Replikationsursprung (ORI) für die Selektionierung und stabiles Wachstum in E.coli. Außerdem enthält es das TRP1 Gen auf einem EcoRl/EcoRI 1,45 kb Fragment, das von dem Hefe-Chromosom III stammt (30) . Dieses Gen erlaubt die Selektionierung auf trp1~ Hefe Stämme und kann daher genutzt werden, um Hefe-KLone zu isolieren, die dieses Plasmid enthalten. Auf demselben DNA Fragment befindet sich das ARS1 Fragment (autonomously replicating sequence). Das ARS1 Element erlaubt der DNA sich in Hefe autonom zu replizieren und sich als Plasmid zu behaupten (30). Das pBC3T1 Plasmid enthält zudem noch die CEN3 Sequenz auf einem 2,0 kb Hindlll/BamHI Fragment, das von dem Hefe-Chromosom III stammt (31)· Plasmide, die die CEN3 Sequenz enthalten sind

te *J 2 Xt -s

mitotisch stabil und in 1 bis 2 Kopien pro Zelle vorhanden.

Das Plasmid ADH2BS ist pBR322 mit einem in die BamHI Schnittstelle klonierten 2,0 kb BamHI/Sau3A Fragment der Hefe-chromosomalen DNA, das das ADH2 Gen enthält (23). Hierbei wird durch die Verknüpfung zwischen den BamHI und Sau3A "sticky" Enden die BamHI Restriktionsstelle regeneriert, so daß das ADH2 Gen durch Schnitt mit BamHI aus dem ADH2S Plasmid herausgeschnitten werden kann.

Aus der publizierten DNA Sequenz fiir das ADH2 Gen und den 5' flankierenden Regionen kennt man eine günstige EcoRV Restriktionsstelle in Position +67 (wobei +1 ein A des ATG Codons ist) . Diese EcoRV Schnittstelle zusammen mit der BanHI Schnittstelle an Position -1027 "upstream" wurden verwendet, um den ADH2 Promotor mit all seinen 5' flankierenden Regulationssequenzen zu isolieren.

Typischerweise wurden 5 ^g der ADH2BS Plasmid DNA vollständig mit EcoRV verdaut (Figur 1 ), durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt, "blunt-end" mit 2 ug phosphoryliertem Bglll-Linker (5' CAG-ATCTG 3) (Biolabs) verknüpft und mit BamHI und BgIII erneut geschnitten; nach praparativer Agarose Gel Elektrophorese wurde ein 1300 bp Fragment isoliert. Dieses Fragment enthält den vollständigen ADH2 Promotor mit allen Regulationssequenzen und ein kleines Stück der ADH2 codierenden Region (codierend für die ersten 22 Aminosäuren) .

5 ;.ig der pBC3T1 Plasmid DNA wurden vollständig mit BamHI Endonuclease verdaut, durch Phenolextraktion und Ethanolfällung gereinigt, und mit Kälber-intestinaler Phosphatase (CIP) nach bekannten Verfahren dephosphoryliert (33) · Nach erneuter Phenolextraktion und Ethanolfällung wurden 100 ng BamHI geschnittener und dephosphorylierter pBC3T1 Plasmid DNA mit 200 ng des 1,3 kb Fragmentes BamHI/BgIII des ADH2 Promotors verbunden, beispielsweise mit T,DNA Ligase. Kompetente RR1 Zellen wurden daraufhin mit

r _ Λ. y - -£■

"' "' 3UU95

1/5 dieser Mischung transformiert.'Ampicillin resistente Kolonien wurden durch Koloniehybridisierung überprüft, indem ein 1,3 kb, durch Fick-Translation radioaktiv markiertes BamHI/Bglll ADH2 Promotor Fragment als Probe verwendet wurde. Aus 12 sich positiv zeigenden Kolonien wurde die Plasmid DKA gewonnen und mit verschiedenen Restriktionsendonucleasen verdaut, um die KLone zu identifizieren, die eine ADH2 Insertion in einer Orientierung aufweist, die eine Transcription von dem ADH2 Proraotor durch die CEN3 Sequenz ermöglicht. Dieser KLon wurde isoliert und das Plasmid wurde YCRp2 genannt. Die Restriktionskarte dieses Plasmids ist in Figur 1 gezeigt.

Zur Ermittlung der Kopienzahl und der Stabilität des Plasmides in Hefe wurde der Hefestamm SHU 32 (trp1~,

Ieu2~, ura3~) mit der YCRp2 Plasmid DUA transformiert.

Die TRP Transformanten wurden isoliert und auf Stabilität und Kopienzahl· überprüft. Die Daten sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Die YCRp2 Plasmid Stabilität wurde nachgewiesen, nachdem die Transformanten auf verschiedenen Kohlenstoffquellen gewachsen waren. Wurde YCRp2 Transformanten nur auf Glucose-Medium kultiviert, bewegte sich die Stabilität der Plasmide im Bereich anderer YCp Plasmide (ca.80$); die Kopienzahl war gering (1-2 Kopien pro Zelle; vgl. Beispiele 1 und 3 in Tabelle 1; Spalte 1 und 2 in Figur 3)· Dies war zu erwarten da Glucose den ADH2 Promotor desaktiviert (ADH2-A.US) und die CSN3 Sequenz normal arbeiten läßt (CEN3-AH).

Wurden jedoch die YCRp2 Transformanten auf Ethanol-haltigen Medium kultiviert, sank die Stabilität des Plasmides extrem ab (auf ca. 36$); die Anzahl an Kopien stieg jedoch auf bis zu 5-10 Kopien pro Zelle. YCp Plasmide waren unter den gleichen Bedingungen nach wie vor sehr stabil und präsent in geringer Kopienzahl (vgl. Beispiele 2 und 4 in Tabelle 1)· Dies zeigt wie die Transkription de3 nun wieder reaktivierten ADH2 Promotors (ADH2-AN) die CEN3 Sequenz blockiert (C3N3-\US); als Resultat verhält sich das YCRp2 Plasmid nun

wie ein YRp Plasraid: sehr instabil, jedoch mit hoher Kopienzahl!

Überraschenderweise wurde die Stabilität des YCRp2 Plasmides sogar höher als vorher, wenn das Medium wieder auf Glucose umgestellt wurde. Die Stabilität auf diesem Medium lag bei ca. 95$ und die Kopienzahl blieb mit 5-10 Kopien pro Zelle konstant (vgl. Beispiel 5 in Tabelle 1; Spalte 3 in Figur 3)· Glucose desaktiviert also wieder den ADH2 Promotor (ADH2-AUS) und reaktiviert die CEN3 Punktion (CEN3-AN). Hefe selbst konnte jedoch während des Kultivierens auf Ethanol nicht mehr Kopien des YCRp2 Plasmides akkumulieren. Selbst nach 50 ' Generationen auf YNB+CAA - Ethanol Medium Überstieg die Kopienzahl nie mehr als 8-12 Kopien pro Zelle (vgl. Beispiel 6 in Tabelle 1; Spalte 4 in Figur 3).

Herstellung der YCRp3 Und YCR p4 Plasmide

Die Herstellung der YCRp3 und 4 Plasmide ist schematisch in Figur 2 dargestellt. Hinweise zu dem KLonierungsvektor pJDB2O7 wurden bereits publiziert (16). pJDB207 enthält ein bakterielles pAT153 Plasmid (34) mit den Ampicillin- (Ap^R) und Tetracyclinresistenzgenen (Tet ) und dem ColE1 Replikationsursprung (ORI) zur Selektion und stabilem Wachstum in S.coli. Das Plasmid enthält außerdem ein 2,7 ¹^b EcoRI/EcoRI Fragment der 2 α DNA. Auf diesem Fragment ist sowohl die 2 1.1 originäre Replikationsstelle lokalisiert (13), was den Vektor in die Lage versetzt, sich extrachromosonial in Hefe zu replizieren und sich zu manifestieren, als auch der RE?3 Locus der 2 α DNA. Dieser Locus ist ein wichtiges Element des 2 u Amplifikationssystems und muß eis vorliegen, um das Plasraid zur Amplifikation zu befähigen. Weitere notwendige Elemente wie REP1 und RSP2 werden beigesteuert durch "Wildtypen" Kopien der 2 μ DNA in trans Orientierung (14,15)· Der Selektionsmarker LEÜ2, von dem Hefechromosora III stammend (3), wurde nach einigen Modifikationen in die Pst I Schnittstelle des besagten 2 u DNA Fragmentes kloniert.

«if- f ." B * ·»

S ,. i .< G- *■ i-

« * » ti e λ >ί< r.t«l »6

Dieses LEU-2-d Gen ermöglicht die Selektionierung auf Ieu2~ Hefemutanten und ergänzt die Ieu2~ Mutation nur dann, wenn sie in einem "MuIti-Kopien-Vektor" vorliegt (16).

Zur Herstellung der YCRp3 und 4 Plasniide wurden 5 ug der YCRp2 DNA mit BgIII und BamHI Restriktionsendonuclease verdaut. Nach präparativer Agarosegel-Slektrophorese wurde ein 4,2 kb Fragment Bglll/BamHI isoliert. Dieses Fragment enthielt das Hefe TRP1 Gen und die ADH2-CEN3 Fusion. 5 ug der pJDB2O7 plasmidischen DKA wurden vollständig mit BamHI verdaut und durch Phenolextraktion und Ethanol-Fällung gereinigt und mit Kalber-intestinaler Phosphatase wie beschrieben dephosphoryliert (33)· 100 ng dieser so erhaltenen pJDB207 Plasmid DNA wurden anschließend mit 200 ns, des 4, 2 kb BgIII/BamHI YCRp2-Fragntentes ligiert. E.coli RR1 Zellen wurden mit 1/5 dieser Mischung transformiert und Ap Kolonien isoliert. Sämtliche Kolonien wurden durch Kolonie-Hybridisierung unter Verwendung eines Nick-translatierten 4,2 kb Fragmentes des YCRp2 als Probe überprüft. Von den sich positiv zeigenden Kolonien wurde die Plasmid DNA isoliert und eine Restriktionskarte dieser Plasmide erstellt. Da das Bg III/Bam HI Fragment sich in zwei verschiedenen Orientierungen in die BamHI Schnittstelle des pJDB207 klonieren läßt, entstehen zwei Plasmide: YCRp3 und YCRp4 (Figur 2).

Kopienzahl und Stabilität des YGRp3 Plasmides

Es konnte festgestellt werden, daß die Orientierung des klonierten ADH2-CEN3 Fusion keinen Einflu3 auf die Stabilität oder die Kopienzahl des YCRp Plasmides in Hefe hat. Sämtliche Ergebnisse wurden mit dem YCRp3 Plasmid erhalten, doch verhält sich das YCRp4 Plasmid ähnlich.

Es sollte angemerkt werden, daß das YCRp3 plasmid nunmehr zwei Hefe Markierungsgene enthält: LEÜ2-d und TRP1. Das TRP1 Gen komplementiert eine trp1~ Mutation in Hefe selbst dann, wenn es nur in einer Kopie pro Zelle enthalten ist, das LEU-d

Gen komplementiert eine Ieu2~ Mutation nur dann, wenn es sich auf einem "MuIt i-Kopien-Pias mid" (50-100 Kopien pro Zelle) befindet. Dieses System ermöglicht die Überprüfung der Kopienzahl durch einfaches Plattieren auf selektivem Medium. Alle LEU⁺ Zellen müssen wenigstens 50 Plasmidkopien pro Zellen enthalten, während TRP Zellen wenigstens eine Kopie des Plasmides enthalten. Außerdem ist zu erwihnen, daß der SHU 32 Stamm cir⁺ ist, d.h. es trägt "Wild-Typ" 2 η DNA, was den YCRp¹J Vektor mit zwei weiteren Komponenten des 2 ·ι Amplifikationssystem versorgt: REP1 und REP2. Das voll aktive 2 Ii Amplif ikationssystem erfordert 4 loci: REP1 und REP2 in trans und REP3 und ORI in eis.

Der Hefestamm SHU 32 (cir⁺, trp1", Ieu2~, ura3~) wurde mit YCRp3 Plasmid DNA transformiert, TRP⁺ Transformanten wurden isoliert und auf leu~ und ura" überprüft. Alle Transformanten, die getestet wurden, waren leu" und ura" und zeigten, daß das YCRp3 Plasmid-in geringer Kopienzahl vorliegt. Dies Ergebnis war nicht überraschend, da nur Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet wurde; CEN3 sollte also voll funktionsfähig sein. Bemerkenswert ist, daß· die CEN3 Punktion das 2 α Amplifikationssystem überwindet und die Kopienzahl der Plasmide bei 1-2 pro Zelle stabilisiert (Beispiel 2 in Tabelle 2; Spalte 8 in Figur 3)· Die Stabilität des YCRp3 im Hefestamm SHU 32 bei Wachstum auf Glucose ist ebenfalls charakteristisch fur ein YCp Plasmid (ca.80$) .

Wurde jedoch der mit YCRp3 transformierte SHU 32 auf selektivem -leu Ethanol Medium kultiviert, sank die Stabilität der Plasmide, wie durch die Anzahl der leu⁺ Kolonien gemessen wurde, auf ca. 65^· Es wird angenommen, daß die CEN3 Sequenz in Anwesenheit von Ethanol durch den reaktivierten ADH2 Promotor transkribiert wird, wodurch als Ergebnis die CEF5 Funktion blockiert wird. Mit der Selektion auf LEU und nichtfunktionelle Centromere übernimmt das 2 u Amplifikationssystem die Kontrolle und amplifiziert YCRp3 zu hoher Kopienzahl. SHU 32 Transformanten wurden LEtJ⁺ und die

■Μ ''" " 3'UU 9 5

Stabilität der YCRp3 Plasmide unter diesen Bedingungen ist charakteristisch für ein 2 μ chimäres Plasmid (vgl. Bespiele 1 und 4 in Tabelle 2). Diese Erwartung fand Bestätigung, nachdem die SHU 32 Transformanten anschließend an das Wachstum auf Ethanol auf Glucose kultiviert wurden, und die Kopienzahl der Plasmide bestimmt wurde. Aus den in Figur 3, Spalten 9-11 aufgeführten Daten wird klar, daß die Kopienzahl des YCRp3 annähernd 100 pro Zelle erreichte. Darüberhiηaus war das Plasmid sehr stabil (zu mehr als 90$!), wie sich durch die Anzahl der leu⁺ Kolonien nachweisen ließ.

Die Herstellung von Plasmiden mit Centromer regulierten Funktionen, wie für die YCRp Plasmide gezeigt werden konnte, ist von grossem Nutzen fir die Vervielfachung sowohl von heterologer DJJA als auch far die Expression heterologer Proteine in Hefe.

Wird beispielsweise in einen erfindungsgemässen MuIt i- Kopie η-Hefe- Vektor in geeigneter V/eise eine heterologe DNA eingefügt, so laßt sie sich mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahren - Wechsel der den regulierbaren Promotor beeinflussenden Faktoren, z.B. im Falle des ADH2 Promotors Wechsel der Kohlenstoffquelle - mit dem Vektor bis zur gewünschten Konzentration vervielfachen.

Von noch grb'sserem Eutzen sind die erfindungsgemäßen Vektoren, wenn heterologe DNA mit einem geeigneten Expressionssystem fir die Expression heterologer Proteine in korrekter Orientierung in die Vektoren eingebaut wird.

Die Effizienz eines Fermentationsprozesses hängt entscheidend von der Art des exprimierten Proteins ab. Wird beispielsweise ein Protein exprimiert, das fir den Wirtsorganismus ab einer bestimmten Konzentration toxisch ist, so kann der gesamte Fermentationsprozess ineffektiv werden, wenn die Froteinmenge nicht direkt oder indirekt gesteuert werden kann.

Durch die erfindungsgemäßen Vektoren ist man in der lage, die

Kopienzahl der Expressionsplasmide nur durch den Wechsel der den regulierbaren Promotor beeinflussenden iaktoren, z.B. durch Wechsel der Kohlenstoffquelle auf einen niedrigen, einen mittleren oder einen hohen Wert einzustellen und auf dem jeweiligen Niveau zu stabilisieren. Durch ,diese Vektoren wird es sogar möglich, ein für das Wirtssystem toxisches Produkt zu erhalten, indem man die Kopienzahl der Expressionsvektoren bei einem Fermentationsansatz mehrere Generationen niedrig und die einzelnen Plasmide stabil hält. Ist dann genügend Zellmaterial gebildet, wird der Promotor "umgeschaltet", beispielsweise durch Wechsel der Kohlenstoffquelle, und die Anzahl der Kopien an Expressionsplasmiden drastisch erhöht. Gleichzeitig damit wird das gewünschte Protein in vielfacher Konzentration produziert; die Toxizität des Proteins ist zu diesem Zeitpunkt unwichtig.

« e s * * f¹ *

1. Gunge, N. (1983) Ann. Rev. Microbiol. 3_7, 2532-2576

2. Hinnen, A. H. et al. (1978) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7_5* 1929-1933.

3. Struhl, K. et al. (1979) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7_6, 1035-1039

4. Stinchcomb, D.T. et al. (1979) Nature £82, 39-43

5. Hsiao, CL. and Carbon, J. (1979) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76, 3829-3833

6. Chan, C.S.M. and Tye, B.K. (1980) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77, 6329-6333

7. Hyman, B.D. et al. (1982) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79./ 1578-1582

8. Zakian, V. A* (1981) Proc.Natl.AcadSci.USA 7J3, 3128-2132

9. Fitzgerald-Hayes, M. et al. (1982) Cell 29_, 235-24 4

10. Zakian, V. A. and Kupfer,

11. Clarke, L. and Carbon, J. (1980) Nature 282/ 504-509

12. Stinchcomb, D.T. et al. (1982) J. Mol.Biol. JJ58, 157-179

13. Broach, J. R. (1981) in the Molecular Biology of Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, J. Strathern, E. Jones and J.R. Broach, eds. (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory), pp 445-470

14. Jayaram, M. et al. (1983) Cell 3±, 95-104

15. Kikuchi, Y. (1983) Cell 2i# 487-493

16. Beggs, J. (1978) Nature 275, 104-109

17. Panzeri, L. Et al. (1983) in the Abstracts of papers presented at The Meeting the Molecular Biology of Yeast, Cold Spring Harbor Laboratory, ρ. 69.

18. Young, T. et al. (1982) in the Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, A. Hollaender, R.D. DeMoss, S. Kaplan, J. Konisky, D. Savage and R,S. Wolfe, eds. (Plenum Publishing

T- J. *

β U

Corporation) pp. 335-361

19. Beier, D.R. and Young, T. (1982) Nature 300, ,724-728

20. Clarke, L. and Carbon, J. (1976) Cell 9_, 91-99

21. Peacock, S.L. et al. (1981) Bioch. Biophys. Acta 655, 243-250

22. Birnboim, H.C. and DoIy, J. (1979) Nucleic Acids Res. ]_, 1513-1523

23. Southern, E. (1975) J.Mol.Biol. £8_, 503-517

24. Sledziev/ski, A. and Young, T. (1982) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79, 253-256

25. Montgomery, D.L. et al. (1978) Cell JU, 673-680 .

26. Wallace, R.B. et al. (1981) Nucl.Acids Res. 9_, 879-894

27. Miller, J.H. (1972) in Experiments in Molecular Genetics,

pp. 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York

28. Williamson, V.M. et al. (1981) Cell 2_3, 605-614

29. Bolivar, F. et al. (1977) Gene 2, 95-113

30. Tschumper, G. and Carbon, J. (1980) Gene 29_/ 157-166

31. Chinault, A.C. and Carbon, J. (1979) Gene _5, 111-126

32. Rüssel, D.W. et al. (1983) J.Biol.Chem.258, 2674-2682

33. Chaconas, G. and van de Sande, J.H. (1980) Methods Enzymol. 65, 75-79

34. Twigg, A. and Sherratt, D. (1980) Nature 283, 216-218

Tabelle 1

Stamm

Plasmid

Kohlenstoffquelle im Medium

% Plasmid Stabilität^a' Kopienzahl^b*

1	SHU 32	pBC3Tl	Glucose
"2	SHU 32	pBC3Tl	Ethanol
3	SHU 32	YCRp2	Glucose
4	SHU 32	YCRp2	Ethanol
5	SHU 32	YCRp2	Ethanol
6	SHU 32	YCRp2	Ethanol

Glucose Glucose

80 % 76 % 78 % 36 % 95 % 95 %

1 -	2
Ί —	2
1 -	2
5 -	10
5 -	10
8 -	12

a) % Plasmid Stabilität wurde wie beschrieben nach 25 Generationen auf nichtselektivem Wachstum ermittelt.

b) Kopienzahl wurde nach 12 Generationen auf selektivem Medium bestimmt.

c) der Stamm war 12 Generationen auf Ethanol-selektivem Medium kultiviert worden, danach für 12 Generationen auf Glucose-selektivem Medium überführt worden und ein Inokulum dieser Kultur wurde zur Bestimmung der Stabilität und der Kopienzahl entnommen.

d) der Stamm wurde wie unter c) kultiviert, jedoch für 50 Generationen auf Ethanol.

	<	TP tu
CO		I
		X
4>s		Q
	I	PI.
4>-	'^r	a
CO
CTi

Tabelle	2	Stamm	Plasmid	Kohlenstoffquelle	% Plasmid Stabilität^a)	TRP⁺	Kopienzahl
				im Medium	LEU+	72 — nicht wachsend 85 % 65 % 85 % 98 % 99 %
Exp.	SHU 32 SHU 32 SHU 32 SHU 32	PJDB2O7 YCRp 3 YCRp 3 YCRp 3	Glucose Glucose Ethanol Ethanol->G1 ucose		100 1-2 n.b.^c) 1OO

1 2 3 4

b) Kopienzahl wurde nach 12 Generationen auf selektivem Medium bestimmt.

c) nicht bestimmt.

cn

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, stabilen Multi-KoOien-Hefe-Vektors, dadurch gekennzeichnet, daß in einen Vektor, der eine stabilisierende Punktion aufweist, ein regulierbarer Promotor so eingefügt wird, daß die stabilisierende Punktion durch diesen gesteuert werden kann.

2. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Punktion ein Hefe Centromer ist.

3· Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Punktion das Hefe Centromer 3 ist.

4. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der regulierbare Promotor der Alkoholdehydrogenase-II Promotor ist.

5· Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, stabilen MuIti-KoiDien-Hefe-Vektors, dadurch gekennzeichnet, daß in einen Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche ein Amplifikationssystem eingefügt wird.

6. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationssystem das des 2 L-Oircle -Plasmides ist.

7· Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach Anspruch oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationssystem aus dem Plasmid pJDB207 stammt.

8. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, da!3 das Hefe Centromer 3 aus den Plasmid oBC3T1 stammt.

3A44495

ff ο * s- a a β c c *

9. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der regulierbare Promotor ADH2 aus dem Plasmid pADH2BS stammt.

10. Verfahren zur Herstellung eines rekorabinanten, stabilen Multi-KoOien-Hefe-Vektors, dadurch gekennzeichnet, daß

a) das Plasmid pBC3T1 mit BamHI geschnitten, die erhaltene lineare DNA gereinigt und dephosphoryliert wird,

b) das Plasraid ADH2BS mit EcoRV geschnitten, die erhaltene lineareDNA gereinigt und mit einem phosphoryliertem Bglll-Linker verknüpft wird, das so erhaltene Fragment mit BamHT und BgITI geschnitten und danach gereinigt wird und

c) die Fragmente aus den Verfahrensschritten a) und b) mit einer DNA Ligase verknüpft werden.

11. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten, stabilen MuIti-Konien-Hefe-Vektors, dadurch gekennzeichnet, daß

a) das Plasmid YCRt>2 mit BgIII und BamHI geschnitten, und das 4,2 kb Fragment gereinigt wird,

b) das Plasmid pJDB207 mit BamHI geschnitten, die erhaltene lineare DNA gereinigt und dephosphoryliert wird und

12. Rekombinanter . stabiler MuI ti-Kopien-Hefe-Vektor , dadurch gekennzeichnet, daß er eine stabilisierende Funktion und einen regulierbaren Promotor enthält, durch den die stabilisierende Funktion gesteuert werden kann·

13· Rekombinanter, stabiler Hefe Vektor nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Funktion ein Hefe Centromer ist.

14- Rekombinanter, stabiler Hefe Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die stabilisierende Punktion das Hefe Centromer 3 ist.

15. Rekombinanter, stabiler Hefe Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, da3 der regulierbare Promotor der Alkoholdehydrogenase-II Promotor ist ·

16. Rekombinanter, stabiler Multi-Kopien-Hefe Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß in einen Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche ein Amplifikationssystem eingefügt wird ·

17. Rekombinanter, stabiler Hefe Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das AmiDlif ikationssystem das des 2 L-C ircle- Plasmides ist.

13. Rekombinanter, stabiler Hefe Vektor nach Anspruch 16 ode^ 17. dadurch gekennzeichnet, daß das Anmlifikat ions sys ten aus dem Plasmid pJDB2O7 stammt.

19. Rekombinanter, stabiler Hefe Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Hefe Centromer 3 aus dem Plasmid p3C3T1 stammt.

2 0. Rekombinanter, stabiler Hefe Vektor nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der regulierbare Promotor ADH2 aus dem Plasmid pADH2BS stammt.

21. Rekombinanter, stabiler Multi_rKoDien-Hefe Vektor YCRp2.

2 2. Rekombinanter, stabiler HuIt i-Kopien-Hefe Vektor YCRp?.

I NAOMIS

•SREICMT

23- Rekombinanter, stabiler Multi-Kopien-Hefe Vektor YCRp4·

24. Verwendung eines Hefe Vektors nach einem der Ansprüche bis 23 zur Vervielfachung einer heterologen DNA, codierend für ein gewünschtes heterologes Protein, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine heterologe DNA, codierend für ein gewünschtes Protein, in geeigneter "v/eise in einen Vektor nach einem der Ansprüche 12 bis 23 eingefügt wird,

b) der Vektor in einen geeigneten Hefe-Wirtsorganismus, der "wild-tvüe" Kopien des 2 ü-Circle-Plasmiäes enthält transformiert wird,

c) der Wirt zunächst auf einem Medium kultiviert wird, das den regulierbaren Promotor desaktiviert,

d) danach der Wirt auf einem Medium kultiviert wird, das den regulierbaren Promotor reaktiviert,

e) anschließend der Wirt erneut auf das den regulierbaren Promotor desaktivierende Medium überführt und kultiviert wird,

f) die Vektoren aus den Zellen in üblicher Weise isoliert und gereinigt werden und

g) die heterologe DNA in üblicher Weise aus den Vektoren isoliert und gereinigt wird.

25- Verwendung eines Hefe Vektors nach einem der Ansprüche bis 23t dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt e) im Anspruch 26 entfällt.

26. Verwendung eines Hefe Vektors nach Anspruch I5, dadurch gekennzeichnet, daß das den regulierbaren Promotor desaktivierende Medium im Anspruch 24- Glucose, und das ihn

■ir

3U4495

aktivierende Medium Ethanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.

27. Verwendung eines Hefe Vektors nach einem der Ansprüche bis 23 zur Expression eines heterologen Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine heterologe DNA, codierend für das gewünschte Protein, mit einem Expressionssystem in korrekter Orientierung in einen Vektor nach einem der Ansprüche 12 bis 23 eingefügt wird,

b) der Vektor in einen geeigneten Hefe-Wirtsorganismus, der "wild-type" Kopien des 2 ;.i-Circle-Plasmides enthält transformiert wird,

e) anschließend der Wirt erneut auf das den regulierbaren Promotor desaktivierende Medium überführt und kultiviert wird und,

f) das gewünschte Protein in üblicher Weise isoliert und gereinigt wird.

28. Verwendung eines Hefe Vektors nach Anspruch 15. dadurch gekennzeichnet, daß das den regulierbaren Proraotor desaktivierende Medium im Anspruch 27 Glucose und das ihn aktivierende Medium Ethanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.

29· Verfahren zur Vervielfachung der Vektoren nach einem der Ansprüche 12 bis 23> dadurch gekennzeichnet, daß

344U95

I Γ'ac -:rsF;^!"i'"'-ϊτ|

a) der Vektor in einen geeigneten Hefe-Wirtsorganismus, der "wild-type" Kopien des 2 >·· -Circle-Plasmides enthält transformiert wird,

b) der Wirt zunächst auf einem Medium kultiviert wird, das den regulierbaren Promotor desaktiviert,

c) danach der Wirt auf einem Medium kultiviert wird, das den regulierbaren Promotor reaktiviert und

d) anschließend der Wirt erneut auf das den regulierbaren Promotor desaktivierende Medium überfuhrt und kultiviert wird.

30. Verfahren zur Vervielfachung des Vektors nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das den regulierbaren Proraotor desaktivierende Medium im Anspruch 29 Glucose, und das ihn aktivierende Medium Ethanol als einzige Kohlenstoffquelle enthält.