DE3687734T2 - Stellenspezifische rekombination von dns in hefe. - Google Patents
Stellenspezifische rekombination von dns in hefe.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung stellen-spezifischer Rekombination von DNA in Hefe.
- Hefen sind vielversprechende Wirte in kommerziellen Anwendungen der Gentechnologie. Ein Verfahren zur Erzeugung stellenspezifischer Rekombination von DNA in Hefe würde das kommerzielle Potential von Hefen als Wirtsorganismen für gentechnologische Produkte erweitern.
- Abremski et al., Cell, 32: 1301-1311 (1983) offenbaren ein Stellenspezifisches Rekombinations-System des Bakteriophagen Pl. Das System besteht aus einer Rekombinations-Stelle, loxP genannt und einer Recombinase, Cre genannt. Die Autoren zeigen, daß Rekombination zwischen loxP-Stellen auf Überhelix-, Ring mit Einzelstrangbruch oder linearer DNA in Gegenwart von Cre abläuft.
- Brent et al., Nature, 312: 612-615 (1984) offenbaren, daß ein Bakterien-Repressor-Protein oder ein Hefe-Transscriptions-Terminator die Stromaufwärts- Aktivierung eines Hefegens blockieren kann. Offenbarte Experimente sollen genetischen Beweis dafür geben können, daß ein Bakterien- Repressor-Protein, das in dem Hefecytoplasma gebildet wurde, in den Hefekern eintreten, seinen Operator erkennen und Gentranscription von einem Hefepromotor unterdrücken kann.
- Barnes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1354-1358 (1985) offenbaren, daß das Bakterien-Restrictions-Enzym Eco RI in der Lage ist, in den Kern von Saccharomyces cerevisiae einzutreten und innerhalb des Kerns zu arbeiten, wenn das procaryotische Protein in vivo synthetisiert ist.
- Backman et al., Bio/Technology (Dezember 1984) offenbaren ein stellen-spezifisches Rekombinations-System des Bakteriophagen lambda. Das System katalysiert Rekombination zwischen zwei verschiedenen Stellen in der DNA, die mit attP und attB bezeichnet sind, um zwei andere, verschiedene Stellen zu erhalten, die mit attR und attL oder vice versa bezeichnet sind. Rekombination tritt nur in Gegenwart bestimmter E. coli Proteine und dem Int Protein des Bakteriophagen lambda auf und kann verwendet werden, um Gen-Expression von E. coli zu regulieren. Langeveld et al., Mol. Gen. Genet., 199: 396-400 (1985) offenbaren die Expression eines E. coli phr Gens in Saccharomyces cerevisiae Hefen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung stellen-spezifischer DNA-Rekombination in Hefen zur Verfügung. Das Verfahren umschließt das Einführen folgender Sequenzen in die DNA:
- a) eine erste DNA-Sequenz, umfassend eine Regulator-Nucleotid-Sequenz und ein cre-Gen,
- b) eine zweite DNA-Sequenz, umfassend eine erste lox- Stelle, und
- c) eine dritte DNA-Sequenz, umfassend eine zweite lox-Stelle.
- Die Regulator-Nucleotid-Sequenz ist aktiviert, wobei sie Expression des cre-Gens bewirkt und die stellen-spezifische Rekombination erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die zweiten und dritten DNA-Sequenzen in die DNA in Hefe inseriert, die mit einem prä-selektierten DNA-Segment verbunden ist.
- Es folgt eine kurze Beschreibung der Zeichnungen und eine allgemeine Beschreibung der Erfindung.
- Fig. 1 stellt die Konstruktion der Plasmide pBS39 und pBS49 dar, die den GAL1 Promotor und das cre-Gen enthalten.
- Fig. 2 stellt die Konstruktion der Plasmide pBS42 und pBS43 dar, die ein funktionelles LEU2-Gen, das von lox-Stellen in der gleichen Orientierung flankiert ist, enthalten. Die lox- Stellen sind durch Pfeile gekennzeichnet.
- Fig. 3 stellt die Modifikation des Chromosoms 7 des Hefestamms DBY931 nach homologer Rekombination mit pBS42 (Feld A) oder pBS43 (Feld B) dar. Die lox-Stellen sind durch Pfeile gekennzeichnet. Das Centromer ist durch einen Punkt gekennzeichnet.
- Fig. 4 zeigt die Deletion des LEU2-Gens vom Hefestamm BSY38 nach Aktivierung des GAL1 Pormotors, wie in Beispiel 1 beschrieben.
- Fig. 5 zeigt, daß die Deletion des LEU2-Gens an den lox-Stellen auftritt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die lox-Stellen sind durch Pfeile gekennzeichnet; Eco RI-Stellen sind durch einen Aufwärtspfeil gekennzeichnet. Der Abstand zwischen den Eco RI-Stellen ist in Kilobasen (kb) angegeben.
- Fig. 6 stellt die Modifikation des Chromosoms 13 des Hefestamms DBY931 nach homologer Rekombination mit pBS44 (Feld A) oder pBS47 (Feld B) dar, wie in Beispiel 3 beschrieben.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung stellen-spezifischer Rekombination von DNA in Hefen zur Verfügung. DNA-Sequenzen, die ein cre-Gen und erste und zweite lox-Stellen umfassen, werden in die DNA eingeführt, und die Expression des cre-Gens erzeugt die Rekombination an den lox-Stellen. Der Ort und die Orientierung der lox- Stellen bestimmen die Natur der Rekombination.
- Der Ausdruck "stellen-spezifische Rekombination", wie er hier verwendet wird, soll folgende drei Vorgänge einschließen:
- 1. Deletion eines prä-selektierten DNA-Segments, das von lox-Stellen flankiert ist,
- 2. Inversion der Nucleotid-Sequenz eines prä-selektierten DNA-Segments, das von lox-Stellen flankiert ist und
- 3. reziproker Austausch von DNA-Segmenten, die sich neben auf verschiedenen DNA-Molekülen lokalisierten lox- Stellen befinden.
- "DNA-Segment" betrifft ein lineares Fragment einer einzel- oder doppelstrangigen Desoxyribonucleinsäure (DNA), die aus einer beliebigen Quelle gewonnen werden kann. Der Ausdruck "DNA in Hefe" schließt die gesamte in Hefezellen vorhandene DNA ein. Ein "Gen", wie hier verwendet, soll ein DNA-Segment bedeuten, das normalerweise in Fachkreisen als Gen angesehen wird. Der Ausdruck "Regulator-Molekül" betrifft ein Ribonucleinsäure-Polymer (RNA) oder ein Polypeptid, das zur Steigerung oder Hemmung der Expression eines Gens befähigt ist.
- "Regulator-Nucleotid-Sequenz" ein hier verwendeter Ausdruck, betrifft eine Nucleotid-Sequenz am Ort 5' an einem Gen, dessen Transcription von der Regulator-Nucleotid- Sequenz in Verbindung mit dem Gen-Expressions-Apparat der Zelle gesteuert wird. Der Ausdruck "Nucleotid-Sequenz" betrifft ein DNA- oder RNA-Polymer, das einzel- oder doppelstrangig sein kann, das wahlweise synthetische, nicht natürliche oder veränderte Nucleotide, die zur Inkorporation in DNA- oder RNA-Polymere befähigt sind, enthält. Eine "Regulator-Nucleotid-Sequenz" ein hier verwendeter Ausdruck, kann eine Promotor-Region einschließen, wie dieser Ausdruck herkömmlich von Fachleuten verwendet wird. Eine Promotor- Region kann eine Kopplungs-Region, die von einer RNA-Polymerase erkannt wird, eine oder mehr Regionen, die die Wirksamkeit des Transcriptionsbeginns als Antwort auf physiologische Bedingungen steuern und eine Transcriptionsbeginn- Sequenz einschließen. "Gen-Produkt" betrifft ein Polypeptid, das aus Transcription, Translation und, wahlweise, aus post-translationeller Weiterverarbeitung eines selektierten DNA-Segments resultiert.
- In dem vorliegenden Verfahren wird eine erste DNA-Sequenz, die eine Regulator-Nucleotid-Sequenz und ein cre-Gen umfaßt, in DNA in Hefe eingeführt. Geeignete Regulator-Nucleotid- Sequenzen schließen GAL1, GAL10, ADH1, CYC1 und TRP5 Promotoren ein. GAL1 und GAL10 Promotoren sind auf dem Plasmid pBM150 vorhanden, das von Johnston und Davis, Molec. Gell. Biol., 4: 1440 (1984) beschrieben ist. Der ADH1 Promotor, auch ADC1 genannt, ist auf dem Plasmid pAAH5 vorhanden, das von Ammer, Methods Enzymol., 101:192 (1983) beschrieben ist. Der CYC1 Promotor ist von Stiles et al., Gell, 25: 277 (1981) beschrieben. Der TRP5 Promotor ist von Zalkin und Yanofsky, J. Biol. Chem., 257: 1491 (1982) beschrieben. Die Regulator-Nucleotid-Sequenz ist vorzugsweise ein GAL1 Promotor.
- Das Gen-Produkt des cre-Gens ist eine Rekombinase, die hier "Cre" genannt wird, die stellen-spezifische Rekombination der DNA in Hefe an lox-Stellen bewirkt. Der Ausdruck "cre- Gen", wie hier verwendet, bedeutet eine Nucleotid-Sequenz, die für ein Gen-Produkt codiert, das stellen-spezifische Rekombination von DNA in Hefe an lox-Stellen bewirkt. Ein cre-Gen kann aus dem Bakteriophagen P1 mit in Fachkreisen bekannten Verfahren isoliert werden. Ein Verfahren zur Isolierung eines cre-Gens aus dem Bakteriophagen P1 ist von Abremski et al., Cell, 32: 1301-1311 (1983) offenbart. E. coli DH1 und Hefestamm pBSY90, die mit dem Plasmid pBS39 transformiert wurden, das ein aus dem Bakteriophagen P1 isoliertes cre-Gen trägt und eine GAL1 Regulator-Nucleotid- Sequenz sind in der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und tragen die Zugangs-Nrn. ATCC 53255 beziehungsweise ATCC 20772. Das cre-Gen kann aus dem Plasmid pBS39 mit den Restriktions-Enzymen Xho I und Sal I isoliert werden.
- Zweite und dritte DNA-Sequenzen, die eine erste lox-Stelle, beziehungsweise eine zweite lox-Stelle umfassen, werden auch in die DNA eingeführt. Der Ausdruck "lox-Stelle", wie hier verwendet, bedeutet eine Nucleotid-Sequenz, bei der das Gen-Produkt des cre-Gens eine stellen-spezifische Rekombination katalysieren kann. Die loxP-Stelle ist eine 34-Basenpaare-Nucleotid-Sequenz, die aus dem Bakteriophagen P1 mit in Fachkreisen bekannten Verfahren isoliert werden kann. Ein Verfahren zur Isolierung einer loxP-Stelle aus dem Bakteriophagen P1 ist von Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 3398 (1982) offenbart. Die loxP-Stelle besteht aus zwei invertierten Sequenzwiederholungen mit 13 Basenpaaren, die durch eine Abstands-Region bestehend aus 8 Basenpaaren getrennt sind. Die Nucleotid-Sequenzen der Insertionswiederholungen und die Abstands-Region sind wie folgt:
- ATAACTTCGTATA ATGTATGC TATACGAAGTTAT
- E. coli DH5 Δlac und Hefestamm BSY23, die mit dem Plasmid pBS44, das zwei loxP-Stellen, verbunden mit einem LEU2-Gen trägt, transformiert sind, sind im ATCC hinterlegt und tragen die Zugangs-Nrn. ATCC 53254 beziehungsweise ATCC 20773. Die lox-Stellen können aus dem Plasmid pBS44 mit den Restiktions-Enzymen Eco RI und SalI oder Xho I und Bam I isoliert werden. Zusätzlich kann ein prä-selektiertes DNA- Segment in pBS44 entweder durch die Restriktions-Enzym- Stellen Sal I oder Bam I mit dem Fachmann bekannten Techniken inseriert werden. Andere geeignete lox-Stellen schließen LoxB-, LoxL- und LoxR-Stellen ein, die Nucleotid- Sequenzen, isoliert aus E. coli, sind. Diese Sequenzen sind von Hoess et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 79: 3398 (1982) offenbart und beschrieben. Vorzugsweise ist die lox-Stelle eine LoxP-Stelle. Lox-Stellen können auch durch eine Vielfalt synthetischer Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, erzeugt werden. Synthetische Techniken zur Erzeugung von lox-Stellen sind von Ito et al., Nuc. Acid Res., 10: 1755 (1982) und Ogilvie et al. , Science, 214: 270 (1981) offenbart.
- Verfahren zum Einführen von DNA-Sequenzen in DNA in Hefe an prä-selektierten Regionen sind in Fachkreisen bekannt. Vorzugsweise werden die DNA-Sequenzen durch ein Plasmid eingeführt, das Hefe transformieren kann, während es eine DNA-Sequenz trägt. In einer Ausführungsform werden die ersten, zweiten und dritten DNA-Sequenzen in einen Hefestamm eingeführt. Im anderen Fall werden die DNA-Sequenzen in zwei verschiede Hefestämme von entgegengesetzten Kreuzungstypen, die anschließend gepaart werden, um einen einzelnen Stamm mit allen drei DNA-Sequenzen zu bilden, eingeführt. Vorzugsweise enthält das Plasmid entweder
- (1) eine Nucleotid-Sequenz von DNA, die zu einer innewohnenden Hefe-Sequenz homolog ist, um die Integration in die Hefe-DNA durch das Rekombinations-System der Hefe zu erlauben oder
- (2) eine Nucleotid-Sequenz der DNA, die autonome Replikation in der Hefe erlaubt.
- Eine Nucleotid-Sequenz, die autonome Replikation in Hefe erlaubt, ist eine ARS-Sequenz, die von Stinchcomb et al., Nature, 282: 39 (1979) beschrieben ist. Eine Teil-Liste von Plasmiden, die Hefe transformieren können, umfaßt YIP5, YRP17 und YEP24. Diese Plasmide sind von Botstein und Davis, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Metabolism and Gene Expression (Verl. Strathern et al.), (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982), auf Seite 607 offenbart und beschrieben. Das am meisten bevorzugte Plasmid zum Einführen einer DNA-Sequenz, die eine Regula- Nucleotid-Sequenz und ein cre-Gen umfaßt, ist pBS39 oder pBS49, und das Plasmid zum Einführen einer DNA-Sequenz, die eine lox-Stelle umfaßt, ist pBS44, pBS47, pBS42, pBS43 oder deren Abkömmlinge, die ein prä-selektiertes DNA-Segment tragen, das anders als das oder zusätzlich zu dem LEU2-Gen zwischen der ersten und zweiten lox-Stelle lokalisiert ist. E. coli DH1 und DH5 Alac, die mit den Plasmiden pBS39 beziehungsweise pBS44 transformiert sind, sind beim ATCC hinterlegt und tragen die Zugangs-Nrn. 53255 beziehungsweise 53254. Die Hefestämme BSY90 und BSY23, die mit den Plasmiden pBS39 beziehungsweise pBS44 transformiert sind, sind auch beim ATCC hinterlegt und tragen die Zugangs-Nrn. ATCC 20772 beziehungsweise ATCC 20773. Diese Hefestämme sind entgegengesetzte Kreuzungstypen und können zur Bildung eines einzelnen Stamms mit dem Plasmid pBS39 und einem pBS44-modifizierten Chromosom gepaart werden. Es sollte jedoch der Zugang zu einer Hinterlegung nicht als eine Lizenz verstanden werden, den Erfindungsgegenstand durch Verletzung staatlich geschützter Patentrechte zu praktizieren.
- Die lox-Stelle ist eine asymmetrische Nucleotid-Sequenz. Daher können zwei lox-Stellen auf demselben DNA-Molekül in Bezug auf einander die gleiche oder entgegengesetzte Orientierung haben. Rekombinationen zwischen lox-Stellen in der gleichen Orientierung resultieren in einer Deletion des DNA-Segments, das sich zwischen den beiden lox-Stellen befindet. Das deletierte DNA-Segment bildet ein kreisförmiges DNA-Molekül. Sowohl die ursprüngliche DNA, als auch das kreisförmige Molekül enthalten eine einzelne lox-Stelle. Rekombination zwischen lox-Stellen in entgegengesetzten Orientierungen auf demselben DNA-Molekül resultieren in einer Inversion der Nucleotid-Sequenz des DNA-Segments, das sich zwischen den beiden lox-Stellen befindet. Zusätzlich kann ein reziproker Austausch der DNA-Segmente, die den auf zwei verschiedenen DNA-Molekülen lokalisierten lox-Stellen benachbart sind, stattfinden. All diese Rekombinationsereignisse werden durch das Gen-Produkt des cre-Gens katalysiert.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, werden die zweiten und dritten DNA-Sequenzen in die DNA in Hefe durch ein prä-selektiertes DNA-Segment eingeführt. Das Segment kann ein Gen oder irgendeine andere Desoxyribonucleotid-Sequenz homologen, heterologen oder synthetischen Ursprungs sein. Vorzugsweise ist das prä-selektierte DNA-Segment ein Gen für ein Strukturprotein, ein Enzym oder ein Regulator-Molekül. Wenn die erste und zweite lox-Stelle die gleiche Orientierung haben, bewirkt die Aktivierung der Regulator-Nucleotid-Sequenz eine Deletion des prä-selektierten DNA-Segments. Wenn die erste und zweite lox-Stelle entgegengesetzte Orientierung haben, bewirkt die Aktivierung der Regulator-Nucleotid-Sequenz eine Inversion der Nucleotid-Sequenz des präselektierten DNA-Segments.
- In Hefe zur Erzeugung eines Fremdproteins hineingebrachte Gene werden oft unter die Kontrolle eines hoch aktiven Promotors gestellt. Die Aktivität des Promotors kann in einer Überproduktion des Proteins resultieren, die das Wachstum der genetisch veränderten Hefe stört. Diese Überproduktion des Proteins kann das Wachsenlassen der genetisch veränderten Hefe in einer für ökonomische Proteinherstellung ausreichenden Menge schwierig gestalten. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, wobei genetisch veränderte Hefe zu einer gewünschten Dichte wachsen gelassen werden kann, bevor das veränderte Gen exprimiert wird. Das veränderte Gen wird, wie gewünscht, durch das Aktivieren einer Regulator-Nucleotid-Sequenz exprimiert, die für die Steuerung der Expression des cre-Gens verantwortlich ist. Die Verfahren zur Steuerung der Expression eines veränderten Gens, gemäß der vorliegenden Erfindung, schließen folgendes ein:
- (1) Ein DNA-Segment, das von lox-Stellen gleicher Orientierung flankiert ist, wird in DNA in Hefe zwischen einem Promotor und einem veränderten Gen eingeführt, um den Promotor unfähig zu machen, das Gen zu exprimieren. Eine zweite DNA-Sequenz, die eine Regulator-Nucleotid-Sequenz und ein cre-Gen umfaßt, wird auch in die DNA eingeführt. Nachdem die genetisch veränderten Hefen zu einer gewünschten Dichte gewachsen sind, wird die Regulator- Nucleotid-Sequenz aktiviert, wobei sie die Expression des cre-Gens bewirkt und die Deletion des DNA-Segments erzeugt. Dann kann das veränderte Gen exprimiert werden.
- (2) Ein Gen für ein Regulator-Molekül, das von lox-Stellen gleicher Orientierung flankiert ist, wird in die DNA in Hefe eingeführt. Das Regulator-Molekül hemmt die Expression eines veränderten Gens. Eine zweite DNA- Sequenz, die eine Regulator-Nucleotid-Sequenz und ein cre-Gen umfaßt, wird ebenfalls in die DNA eingeführt. Nachdem die genetisch veränderten Hefen zu einer gewünschten Dichte gewachsen sind, wird die Regulator- Nucleotid-Sequenz aktiviert, wobei sie die Expression des cre-Gens bewirkt und die Deletion des Gens für das Regulator-Molekül erzeugt. Dann kann das veränderte Gen exprimiert werden.
- (3) Ein verändertes Gen, dem ein Promotor fehlt und das von zwei lox-Stellen mit entgegengesetzter Orientierung flankiert ist, wird in DNA in Hefe eingeführt, so daß das 3' Ende des Gens zur Trancriptionsbeginn-Stelle einer Regulator-Nucleotid-Sequenz benachbart liegt. Eine zweite DNA-Sequenz, die eine Regulator-Nucleotid-Sequenz und ein cre-Gen umfaßt, wird auch in die DNA eingeführt. Da das veränderte Gen in der gegensinnigen Richtung transcribiert würde, würde kein verändertes Protein gebildet werden. Nachdem die genetisch veränderten Hefen zu einer gewünschten Dichte gewachsen sind, wird die Regulator-Nucleotid-Sequenz aktiviert, wobei sie die Expression des cre-Gens bewirkt und die Inversion des gewünschten Gens erzeugt. Dann konnte das veränderte Gen in die geeignete Richtung transcribiert und exprimiert werden.
- Wenn nicht anders spezifiziert ist, sind die in diesem Abschnitt verwendeten Anteile und Prozente auf das Gewicht bezogen und Grade in Celsius angegeben.
- Die E. coli Stämme DH1 und DH5 ΔlacU169 oder ein Abkömmling davon, dienten als E. coli Wirte für alle in allen Experimenten verwendeten Plasmide. Der Stamm DH5 ΔlacU169 wurde von Dr. Michael Berman, Litton Bionetics erhalten und ist ein Abkömmling von DH5, eine Variante von DH1, die von Hanahan, J. Mol. Biol., 166: 557 (1983) offenbart und beschrieben ist. Für Bakterienwachstum verwendete Medien sind in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) beschrieben.
- Die leu2 ura3 Hefestämme DBY745 (Kreuzungstyp alpha) und DBY931 (Kreuzungstyp a) wurden in allen Experimenten verwendet. Diese Stämme sind in Falco, Rose und Botstein, Genetlcs, 105: 843 (1983) offenbart und beschrieben. Ein reiches Wachstumsmedium (YEPD), das Pepton aus Hefeextrakt und Dextrose (Glucose) enthält, wurde für nicht-selektives Hefewachstum verwendet. Ein minimales Wachstumsmedium (SD), das Dextrose und geeignete Zusätze enthält, wurde für selektives Wachstum und das Durchmustern auf Ernährungs-Marker verwendet. Diese Medien werden durch Sherman et al., Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1974) beschrieben. In Experimenten, die Wachstum auf Galactose umfassen, waren 2% Galactose durch Glucose ersetzt. Um das Selektionsmittel Sulfometuronmethyl (Molekulargewicht 364) zu einem festen Medium hinzuzufügen, wurde es zu 2 mg/ml in Aceton gelöst und zu dem Medium hinzugegeben, um eine Endkonzentration von 30 ug/ml unmittelbar vor dem Eingießen in die Kulturschalen zu erhalten.
- Plasmid-DNA wurde aus E.coli gemäß einem Schnellverfahren nach (1) hergestellt, das im wesentlichen dem von Quigley und Holmes, Anal. Biochem. 114: 193 (1981), beschriebenen gleicht oder (2) einem Cäsiumchlorid-Dichte-Gradienten Verfahren, das im wesentlichem dem von Davis et al., Advanced Bacterial Genetlcs: A Manual for Genetic Engineering (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (1980)) offenbarten gleicht. Hefe-DNA wurde mit einem von Davis et al., Methods in Enzymology, 65: Teil I (Academic Press, New York, 1980) beschriebenen entsprechenden Verfahren hergestellt.
- Selektierte Wirtsstämme von Hefen wurden nach einem dem von Hinnen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978) ähnlichen Verfahren hergestellt, abgesehen von den folgenden Abwandlungen. Empfängerzellen wurden mit Glusulase (α, β- Glucuronidase/Sulfatase-Präparation) 2 Stunden bei 30º in 1M Sorbit mit 1% beta-Mercaptoethanol und 0,1M Natriumcitrat, pH 5,8 inkubiert, um Sphäroplaste zu bilden. E. coli Stämme wurden gemäß (1) nach einem dem von Mandel und Higa, J. Mol. Biol. 53: 159 (1970) entsprechenden Verfahren oder (2) nach einem dem von Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557 (1983) entsprechenden Verfahren transformiert, wenn hohe Wirksamkeit gefordert war.
- Alle anderen Verfahren, DNA zu manipulieren, sind bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982) beschrieben.
- DNA wurde von Agarosegelen auf Nitrocellulosemembranen übertragen und mit spezifisch markierten DNA-Fragmenten sondiert, gemäß einem von Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975) beschriebenen entsprechenden Verfahren, auf das hier mit "Southern Analyse" Bezug genommen wird. Die DNA-Segmente wurden sequenziert unter Verwendung eines Didesoxynucleotidverfahrens, das dem von Sanger et al., J. Mol. Biol. 143: 161 (1980) entspricht.
- Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele beschrieben, worin alle Anteile und Prozente auf das Gewicht bezogen und Grade in Celsius angegeben sind.
- Stellen-spezifische Deletion eines LEU2-Gens, das in DNA der Hefe Saccharomyces cerevisiae vorhanden ist, wurde gemäß folgendem Verfahren bewirkt. Hefestämme, die für Leucin auf Grund einer leu2 Genmutation auxotroph waren, wurden mit den folgenden Plasmiden transformiert, - (1) pBS49, das ein cre- Gen unter Regulator-Steuerung eines GAL1 Promotors trägt, (2) pBS42 oder pBS43, das ein funktionelles LEU2-Gen trägt, das von loxP-Stellen in gleicher Orientierung flankiert ist. Der transformierte Hefestamm enthielt ein funktionelles LEU2-Gen und konnte in Abwesenheit von Leucin wachsen. Aktivierung des GAL1-Promotors mit Galactose bewirkte die Expression des cre-Gens und Deletion des LEU2-Gens. Der resultierende Hefestamm war beim Wachsen von Leucin abhängig.
- In Fig. 1 ist ein Fließbild zur Verdeutlichung der zur Konstruktion der Plasmide pBS39 und pBS49 verwendeten Verfahren dargestellt. Plasmid pBS7, von dem ein Teil in Fig. 1 gezeigt ist, ist ein Abkömmling des Plasmids pRH103, das die 46 Deletion enthält. Plasmid pBS7 unterscheidet sich von pRH103 darin, daß die erste DNA-Sequenz -ATG- die auf den cre-codierenden Strang des pBS7 trifft, der an der Xho I Stelle beginnt, die eines intakten cre-Gens ist. Plasmid pBS7 hat auch einen Promotor, der die Expression des cre- Gens in E. coli steuert. Plasmid pBS7 wurde mit Xho I aufgeschlossen und ein Bg1 ZI-Xho I Adapter (DNA-Sequenz: TCGAGTAGATCTAC) wurde an das aufgeschlossene Plasmid gebunden. Die resultierende Konstruktion wurde anschließend mit Bg1 II und Sal I aufgeschlossen. Der Aufschluß erzeugte ein cre-enthaltendes Fragment, das gereinigt und anschließend an Plasmid pBM150 gebunden wurde, was von Johnston und Davis, Mol. Cell. Biol. 4: 1440 (1984) beschrieben ist. Das resultierende Plasmid, pBS39 genannt, war ein autonom replizierendes Centromer, das einen Hefevektor mit einem cre-Gen unter der Steuerung von einem GAL1-Promotor hat.
- Das Plasmid pBS49, das das vom GAL1-Promotor gesteuerte cre-Gen enthält, war von dem Plasmid pBS39, gemäß dem in Fig. 1 dargestellten Verfahren, abgeleitet. Das Xho I-Sal I Fragment des pBS7, das das cre-Gen enthält, wurde in die Xho I Stelle, die im Maus-Metallothionein-Gen MT-1 vorhanden ist, inseriert, was bei Pavlakis und Hamer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 397 (1983) beschrieben ist. Das resultierende Plasmid, pBS31 genannt, enthielt ein cre-Gen stromaufwärts vom Maus MT-1-Gen und, insbesondere, eine 3'-Region des MT-1-Gens, die ein Polyadenylierungs-Signal enthielt. Die Eco RI Stelle am 3' Ende des MT-1-Gens wurde zu einer Sal I Stelle umgewandelt, und das resultierende Sal I-Bam HI Fragment wurde in pBS39 inseriert, das von Sal I und Bam HI aufgeschlossen war, um pBS49 zu bilden.
- Plasmid pBS49 teilt mit pBS39 die Fähigkeit, in E. coli und Hefen autonom zu replizieren. Beide Plasmide haben ein durch einen GAL1-Promotor gesteuertes cre-Gen. Zusätzlich enthält pBS49 ein Säuger-Polyadenylierungs-Signal, das von dem MT-1-Gen erzeugt ist, das in 3' zu dem cre-Gen lokalisiert ist. Das Polyadenylierungs-Signal kann Expression des cre- Gens in anderen eucaryotischen Zellen erleichtern. Jedoch sind von MT-1 abgeleitete DNA-Sequenzen unnötig für die cre- Gen-Expression vom Plasmid pBS49 in Hefe, wie unten gezeigt wird.
- In Fig. 2 ist ein Fließbild zur Verdeutlichung der zur Konstruktion der Plasmide pBS42 und pBS43 verwendeten Verfahren dargestellt. Ein LEU2-Gen, das durch loxP-Stellen mit gleicher Orientierung flankiert ist, wurde aus dem Plasmid pRH499 gemäß dem folgenden Verfahren erhalten. Die Hind III Stelle wurde vom Plasmid pRH499 entfernt, um das Plasmid pBS30 zu bilden. Das 6,1 Kilobasen (kb) Hind III Fragment des pJM53 ist zu einer Region homolog, die zwischen TRP5, das ein Gen mit einem bekannten Ort auf dem Chromosom 7 hat und für die Tryptophan-Biosynthese erforderlich ist, und dem Leu1-Gen, das auch einen bekannten Ort auf dem Chromosom 7 hat, befindlich ist. Dieses Fragment war selbst-ligasiert und wurde durch Xho I aufgeschlossen, um ein Kopf-Schwanz verbundenes Fragment zu bilden. Das Fragment wurde anschließend in die Xho I Stelle des pBS30 in beiden Orientierungen inseriert, um pBS42 und pBS43 zu erzeugen. Das auf pJM53 vorhandene DNA-Segment vom Chromosom 7 wurde eingeschlossen, um das resultierende Plasmid auf eine homologe Region auf einem Hefechromosom durch das endogene Rekombinations-System der Hefe hinzulenken.
- Die Plasmide pBS42 und pBS43 wurden mit Hind III gestreckt und in den Hefestamm DBY931 transformiert, der eine leu2- Mutation enthält. Hefezellen, die Leucin zum Wachsen nicht brauchen, wurden selektiert. Fig. 3 zeigt, daß Integration dieser Plasmide in das Chromosom 7 in einem leu2-Gen resultiert, das von loxP-Stellen flankiert ist. Die Orientierung der lox-Stellen in bezug auf das Centromer, hängt davon ab, ob pBS42 oder pBS43 das transformierende Plasmid war. Die Integration von pBS42 erzeugt den Hefestamm BSY4, der ein Substrat-Chromosom mit loxP-Stellen hat, die von dem Centromer des Chromosoms 7, wie in Fig. 3A gezeigt ist, wegzeigen. Die Integration von pBS43 erzeugt den Hefestamm BSY16 mit loxP-Stellen, die in Richtung des Centromers des Chromosoms 7 zeigen, wie in Fig. 3B gezeigt ist.
- Das cre-Gen wurde dann in die mit den Plasmiden pBS42 und pBS43 tranformierten Hefestämme eingeführt, gemäß dem folgenden Verfahren. Der Hefestamm DBY745, der die Mutanten- Gene ura3 und leu2 enthält, wurde mit dem Plasmid pBS49 transformiert, das ein funktionelles URA3-Gen enthält. Transformierte Hefen, die Uracil nicht für das Wachsen brauchen, wurden selektiert und Hefestamm BSY3 genannt. Der Hefestamm BSY4 der das loxP-Substrat auf seinem Chromosom 7 enthält, wurde anschließend mit dem Hefestamm BSY3 gekreuzt, der das Plasmid pBS49 enthält, das das durch GAL1-Promotor gesteuerte cre-Gen hat. Diese Kreuzung erzeugte einen diploiden Hefestamm, BSY38 genannt. Als Kontrolle wurde der isogene diploide Hefestamm BSY63 konstruiert, der sich vom Hefestamm BSY38 nur darin unterscheidet, daß ihm das Plasmid pBS49 fehlt. Ähnlich wurde Hefestamm BSY16 mit dem Hefestamm BSY3 gekreuzt, um einen diploiden Hefestamm zu erzeugen, BSY45 genannt, der sowohl ein cre-Gen als auch ein modifiziertes Chromosom 7 enthielt. Der Hefestamm BSY16 wurde auch mit dem Hefestamm DBY745 gekreuzt, um den isogenen Kontrollstamm BSY70 zu erzeugen, dem das Plasmid pBS49 und daher das cre-Gen fehlte.
- St. John und Davis, Cell 16: 443 (1979), offenbaren, daß der GAL1-Promotor in Zellen, die auf Glucose wachsen, inaktiv ist, aber zu einer 1000-fach größeren Aktivität in Gegenwart von Galactose induziert wird. Die in Tabelle I gezeigten Stämme waren auf Platten wachsen gelassen, die entweder Glucose oder Galactose enthielten. Die resultierenden Kolonien wurden in Selektionsmedien vermehrt, um nachzuweisen, ob sie Leucin für das Wachsen (Leu&supmin;-Phänotyp) brauchten, oder nicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Tabelle I Deletion von LEU2-Genen Hefestamm Plasmid mit lox-Stellen Plasmid mit cre-Gen Kohlenstoff-Quelle Leucin erfordernde Kolonien Gesamt-Kolonien glu = Glucose gal = Galactose
- Mit Plasmid pBS49 transformierte Hefestämme, die das cre-Gen tragen, erforderten Leucin (Leu&supmin;), wenn sie auf Galactose wachsen gelassen, aber nicht, wenn sie auf Glucose wachsen gelassen wurden. Hefestämme, denen Plasmid pBS49 fehlt, zeigten einen völlig stabilen nicht-Leucin erfordernden (Leu&spplus;) Phänotyp. Die Ergebnisse weisen darauf hin, daß das Gen-Produkt des cre-Gens (1) unter der Steuerung des GAL1-Promotors exprimiert werden kann, (2) in der Lage ist, in den Hefekern nach Translation in das Hefecytoplasma einzutreten und (3) die Rekombination zwischen zwei in die Hefe-DNA inserierte lox-Stellen bewirkt. Außerdem tritt die Rekombination an lox-Stellen mit beiden Orientierungen in Bezug auf das Centromer auf. Die Orientierung wirkt sich nicht auf die Zugänglichkeit der lox-Stellen durch das Gen-Produkt des cre-Gens aus.
- Es wurde gezeigt, daß das Ergebnis der Rekombination wirksam ist. Eine log-Phase-Kultur des Hefestamms BSY38 wurde mit Glucose als Kohlenstoffquelle wachsen gelassen und dann in ein Wachstumsmedium mit Galactose überführt. Aus dem galactosehaltigen Medium wurden Aliquots der Hefe in den in Fig. 4 dargestellten Zeitabständen entnommen, und auf einem nicht-selektiven Medium, das Leucin und Glucose enthält, plattiert. Die resultierenden Kolonien wurden durch Replica-Plattieren auf einem Selektionsmedium ohne Leucin untersucht. Die resultierenden Platten wurden nach einem Tag durchgemustert und die Ergebnisse in Fig. 4 dargestellt. Das Vorhandensein von für das Wachsen Leucin erfordernder Hefen wurde 8 Stunden nach Induktion mit Galactose nachgewiesen. Nach 24 Stunden hatten 98% der Ausgangskultur das LEU2-Gen deletiert, wie in diesem Versuch gezeigt wurde.
- Das Erscheinen von Organismen zeigte, daß das Gen-Produkt des cre-Gens Rekombination an den lox-Stellen auf Chromosom 7 erzeugte. Acht unabhängige, Leucin erfordernde Isolate des Hefestamms BSY38 wurden durch Plattieren von BSY38 auf Leucin und Galactose enthaltendes Agarmedium erhalten. Die gesamte DNA jedes dieser Leucin erfordernden Isolate wurde mit Eco RI aufgeschlossen, und die Struktur der Region, bei der pBS42 in das Chromosom 7 integriert wurde, wurde mit dem Verfahren von Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975) unter Verwendung des Plasmids pBS78 als Sonde, nachgewiesen. Das Plasmid pBS78 stammt von pBS42 ab durch cre vermittelte Rekombination an den lox-Stellen in einem E. coli-Stamm. Das Plasmid pBS78 enthält Sequenzen, die zum Amp®-Gen von pBR322 und zum Segment von Chromosom 7, dessen DNA sich von pJM53 ableitet, homolog sind, aber dem Homologie zum LEU2-Gen der Hefe fehlt. Die durch pBS78 nachgewiesene Homologie wird in Fig. 5 durch den schwarzen Balken angezeigt. Fig. 5 zeigt die Analyse sieben dieser Leucin erfordernden Abkömmlinge. Es werden die haploiden Eltern DBY931 (Reihe 1) gezeigt, die haploiden BSY4 mit dem LEU2 enthaltenden Substrat-Chromosom 7 (Reihe 2), die diploiden BSY63, denen das cre-Plasmid pBS49 (Reihe 3) fehlt, die diploiden BSY38 mit dem Plasmid pBS49 (Reihe 4) und sieben unabhängige, galactose-induzierte, Leucin erfordernde Abkömmlinge von BSY38 (Reihen 5-11). Auch die Marker-Plasmide pBS78 und pBS42 sind dargestellt. Die Analyse zeigt, daß alle Leucin erfordernden Abkömmlinge das 3,4 kb Fragment der durch die Sonde nachgewiesenen DNA verloren haben. Statt dessen werden in Fig. 5 Leucin erfordernde Abkömmlinge gezeigt, die ein 1,8 kb Fragment der DNA haben, wie durch Deletion des LEU2-Gens vorhergesagt war. Die Abkömmlinge zeigen alle genau die gleiche Struktur, die anzeigt, daß Deletion nur auf dem modifizierten Chromosom 7 und nur an den lox-Stellen stattgefunden hat. Um weiterhin zu zeigen, daß die spezifische Deletion stattgefunden hatte, wurde integrierte Plasmid-DNA von jeweils drei der Leucin erfordernden Isolate durch Abspalten der genomischen DNA mit Hind III wiederhergestellt. Die DNA jedes Isolats wurde re-ligasiert und verwendet, um E. coli zu transformieren. Die der lox-Stelle benachbarte Region wurde für zwei der Plasmide sequenziert. Die Sequenzen wurden als identisch zu denen befunden, die durch Rekombination an den lox-Stellen vorhergesagt waren. Das dritte Plasmid stellte sich mit den anderen beiden durch Restriktions-Kartographieren als identisch heraus, jedoch wurde keine Sequenzierung durchgeführt.
- Das folgende Experiment zeigt, daß das Ergebnis der Rekombination an lox-Stellen in Hefe nach Glaactose-Aktivierung von einem funktionellen cre-Gen abhängt. Das Plasmid pBS77, das ein Abkömmling des Plasmids pBS49 ist, der ein nicht-funktionelles cre-Gen enthält, wurde gemäß dem folgenden Verfahren konstruiert. Das Plasmid pBS49 wurde mit Bam HI verdaut - das innerhalb des cre-Gens schneidet - und die resultierenden versetzten Enden wurden unter Verwendung des Klenow- Fragments der DNA-Polymerase I geglättet. Die resultierende DNA wurde re-ligasiert, um das Plasmid pBS77 zu bilden, das mit pBS49 identisch ist, abgesehen davon, daß es ein Mutanten-cre-Gen enthält, das in E. coli inaktiv ist. Diploide Hefestämme BSY91 und BSY93 wurden gemäß dem folgenden Verfahren konstruiert. Der Hefestamm DBY745 wurde mit pBS77 transformiert, und Hefezellen mit der Fähigkeit, in Abwesenheit von Uracil zu wachsen, wurden selektiert. Der resultierende Hefestamm BSY92 wurde mit BSY4 zur Erzeugung von BSY93 gekreuzt. In ähnlicher Weise wurde der Hefestamm DBY745 auch mit dem Plasmid pBS39 transformiert - mit pBS49 identisch, abgesehen von seinem Fehlen der Maus MT-1 DNA- Sequenzen - um einen Hefestamm, BSY90 genannt, zu gewinnen. Der Hefestamm BSY90 wurde mit BSY4 gekreuzt, um einen diploiden Hefestamm zu erzeugen, BSY91 genannt.
- Die Hefestämme, die in Tabelle II dargestellt sind, wurden auf Galactose und Leucin enthaltendem Agarmedium wachsen gelassen. Einzelne Kolonien wurden auf ein Glucose und Leucin enthaltendes Agarmedium übertragen und dann auf ihre Fähigkeit hin, in Abwesenheit von Leucin zu wachsen, durch Replica-Plattieren auf geeignete Platten, untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle II dargestellt. Tabelle II Deletion des LEU2-Gens Hefestamm Plasmid mit lox-Stellen Plasmid mit cre-Gen Leucin erfordernde Kolonien Gesamt-Kolonien
- Tabelle II zeigt, daß das Vorhandensein von Galactose keinen Einfluß auf die Deletion des LEU2-Gens in mit pBS77, das das Mutanten-cre-Gen enthält, transformierter Hefe hat. Tabelle II zeigt auch, daß pBS39, dem der Anteil des Maus- Metallothionnein-Gens, das in p8S49 vorhanden ist, fehlt, das cre-Gen exprimieren und die Rekombination an lox-Stellen in der Hefe-DNA beeinflussen kann. Daher ist für die Expression oder Funktion des cre-Gens in Hefe, die mit dem Plasmid pBS39 transformiert wurde, kein Anteil des MT-1-Gens erforderlich.
- Dieses Beispiel macht deutlich, daß cre-vermittelte Rekombination an lox-Stellen auf einem anderen Hefe-Chromosom als dem Chromosom 7 stattfinden kann. Plasmide zum Inserieren einer DNA-Sequenz, die das LEU2-Gen umfaßt, das am ILV2-Ort auf dem Chromosom 13 von den lox-Stellen flankiert ist, wurden gemäß dem folgenden Verfahren konstruiert. Ein Allel von ILV2, das für Sulfometuronmethyl-Resistenz codiert, ist auf dem Plasmid pCP2-4-10 vorhanden, das von Falco und Dumas, Genetics 109: 21 (1985) offenbart und beschrieben ist. Das Plasmid pCP2-4-10 ist in der American Type Culture Collection hinterlegt und trägt die Hinterlegungs-Zugangs- Nr. 39606. Die Cla I und Hind III Stellen, die das ILV2-Gen auf dem pCP2-4-10 flankieren, wurden in Xho I Stellen umgewandelt. Das aus dem Aufschluß durch Xho I resultierende Fragment wurde in die Xho I Stelle des pBS30 inseriert, um die Plasmide pBS44 und pBS47, die sich nur in der Orientierung des inserierten Xho I Fragments, das das ILV2-Gen enthält, unterscheiden, zu bilden. Diese beiden Plasmide wurden in das Chromosom 13 durch Transformation des Hefestamms DBY931 und Selektieren der nicht-Leucin erfordernden Transformanten, gemäß einem in Beispiel 1 beschriebenem entsprechenden Verfahren, integriert. Die Integration des Plasmids pBS44 in den ILV2-Ort auf Chromosom 13 ergab den Hefestamm BSY23. Die Integration des Plasmids pBS47 in den ILV2-Ort auf Chromosom 13, resultierte in dem Hefestamm BSY27. Nicht-Leucin erfordernde Transformanten, die durch Transformation von Hefezellen mit pBS44 erhalten wurden - wie z. B. der Hefestamm BSY23 - unterscheiden sich von denen, die durch Transformation mit pBS47 entstanden sind - wie z. B. der Hefestamm BSY27 - darin, daß das inserierte LEU12- Gen flankierende lox-Stellen, aufeinander bezogen, in entgegengesetzter Orientierung hat, wie in Fig. 6 dargestellt ist. Die Strukturen dieser Chromosomen wurden durch Southern Analyse verifiziert. Diploide Hefestämme, die eines dieser Chromosomen enthalten, und pBS49, das ein durch einen GAL1- Promotor gesteuertes cre-Gen zur Verfügung stellte, wurden 1) durch Kreuzung von BSY23 mit BSY3 zur Erzeugung des Hefestamms BSY31 und auch mit dem Hefestamm DBY745 zur Erzeugung des Cre&supmin; Kontrollhefestamms BSY56 und 2) durch Kreuzen von BSY27 mit BSY3 zur Erzeugung des Hefestamms BSY35 und auch mit DBY745 zur Erzeugung des isogenischen Cre&supmin; Kontrollhefestamms BSY59, konstruiert.
- Die in Tabelle III dargestellten Hefestämme waren auf Agarmedium mit Galactose und Leucin wachsen gelassen worden. Einzelne Kolonien wurden auf Agarmedium, das Glucose und Leucin enthält, überführt, und dann auf ihre Fähigkeit, in Abwesenheit von Leucin zu wachsen, mit dem Replica- Plattieren auf geeignete Platten getestet. Die Ergebnisse werden in Tabelle III dargestellt. Tabelle III Deletion des LEU2-Gens Hefestamm Plasmid mit lox-Stellen Plasmid mit cre-Gen Leucin erfordernde Kolonien Gesamt-Kolonien
- Tabelle III zeigt, daß transformierte Stämme, die ein cre- Gen enthalten, das LEU2-Gen deletieren, wenn sie auf galactosehaltigem Medium wachsen gelassen werden. Daher ist das Gen-Produkt des cre-Gens in der Lage, lox-Stellen in jeder Orientierung bezüglich der Normalsequenz des Chromosoms 13 zu rekombinieren, um chromosomale Deletionen sowohl auf dem Chromosom 13, als auch auf dem Chromosom 7 zu erzeugen.
- Stellen-spezifische Inversion des in Hefe-DNA vorhandenen LEU2-Gens wird gemäß dem folgenden Verfahren bewirkt. Ein erstes Plasmid, das ein cre-Gen unter der Steuerung des GAL1-Promotors enthält, wird gemäß einem Verfahren, das dem zum Konstruktion von pBS39 und pBS49 verwendeten entsprechend ist, konstruiert, wie in Fig. 1 gezeigt wird. Ein zweites Plasmid, das einen selektierbaren Marker, wie z. B. Sulfometuronmethyl-Resistenz und ein von loxP-Stellen flankiertes LEU2-Gen besitzt, wird gemäß einem Verfahren, das dem zur Konstruktion von pBS44 und pBS47 verwendeten entsprechend ist, konstruiert, außer daß das LEU2-Gen in das Plasmid inseriert ist, ohne einen Promotor (2) mit flankierenden loxP-Stellen in, aufeinander bezogen, entgegengesetzter Orientierung und (3) mit einem 3' Ende des LEU2- Gens, das einer Nucleotid-Regulator-Sequenz benachbart ist, in der Weise, daß das Gen in einer gegensinnigen Richtung transcribiert wird.
- Ein für Leucin auxotropher Hefestamm wird mit beiden Plasmiden, gemäß einem Verfahren, das dem in Beispiel 1 und Beispiel 3 beschriebenen ähnlich ist, transformiert. Die resultierenden Hefen werden in einem glucose- und leucinhaltigen Medium wachsen gelassen. Die Hefen erfordern Leucin zum Wachsen, da das LEU2-Gen bezüglich seines Promotors invertiert ist. Der GAL1-Promotor wird durch die Gegenwart von Galactose wie in Beispiel 1 beschrieben, aktiviert, wodurch die Expression des cre-Gens bewirkt und die Inversion des LEU2-Gens erzeugt wird. Die resultierenden Hefen können in Abwesenheit von Leucin wachsen.
Claims (18)
1. Hefestamm, der mit den folgenden DNA-Sequenzen
transformiert ist:
i) einer ersten DNA-Sequenz, umfassend eine
Regulatornucleotidsequenz und ein cre-Gen,
ii) einer zweiten DNA-Sequenz, umfassend eine erste
lox-Stelle und
iii) einer dritten DNA-Sequenz, umfassend eine zweite
lox-Stelle.
2. Hefestamm nach Anspruch 1, worin die zweite und die
dritte DNA-Sequenz durch ein prä-selektiertes
DNA-Segment verbunden sind.
3. Hefestamm nach Anspruch 2, worin das prä-selektierte
DNA-Segment ein Gen für ein Strukturprotein, ein Enzym
oder ein Regulatormolekül ist.
4. Hefestamm nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin die erste und die zweite lox-Stelle loxP- Stellen
sind.
5. Hefestamm nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin das cre-Gen aus dem Bakteriophagen P1 isoliert
ist.
6. Hefestamm nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche,
worin die Regulatornucleotidsequenz ein GAL1-Promotor
ist.
7. Plasmid, das eine Regulatornucleotidsequenz und ein cre-
Gen hat, wobei das Plasmid befähigt ist, Hefe zu
transformieren und das cre-Protein zu exprimieren.
8. Plasmid pBS39, verfügbar aus der ATCC Hinterlegung
20772.
9. Plasmid, das zwei lox-Stellen hat, die durch ein
prä-selektiertes DNA-Segment verbunden sind, wobei das
Plasmid befähigt ist, Hefe zu transformieren und darin
stabil zu replizieren.
10. Plasmid pBS44, verfügbar aus der ATCC Hinterlegung
20773.
11. Mikroorganismus, der mit einem Plasmid nach irgendeinem
der Ansprüche 7 bis 10 transformiert ist.
12. Hefestamm, der mit einem Plasmid nach Anspruch 7 oder 8
transformiert ist.
13. Hefestamm, hinterlegt als ATCC 20772 und Mutanten
desselben, die ein Plasmid nach Anspruch 7 oder 8
umfassen.
14. Hefestamm, der mit einem Plasmid nach Anspruch 9 oder 10
transformiert ist.
15. Hefestamm, hinterlegt als ATCC 20773 und Mutanten
desselben, die ein Plasmid nach Anspruch 9 oder 10
umfassen.
16. Verwendung von Hefestämmen nach Anspruch 12 oder 13 und
Anspruch 14 oder 15 in einem Verfahren zur Erzeugung
eines diploiden Hefestammes, wie er in irgendeinem der
Ansprüche 1 bis 6 definiert ist.
17. Verfahren zur Erzeugung stellenspezifischer
Rekombination von DNA in Hefe, das die Aktivierung der
Regulatornucleotidsequenz eines Hefestammes nach irgendeinem
der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt, wodurch die Expression des
cre-Gens bewirkt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, worin die
stellenspezifische Rekombination der Hefe-DNA die Expression
eines konstruierten Gens ergibt.
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