DE3433339A1

DE3433339A1 - Zellmembran-proteine, diese enthaltende arzneimittel und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3433339A1
Application number: DE19843433339
Authority: DE
Inventors: Irun Robert Cohen; Meir Shinitzky
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1983-09-11
Filing date: 1984-09-11
Publication date: 1985-03-28
Anticipated expiration: 2004-09-12
Also published as: JPH0641421B2; FR2553100B1; GB2146338A; DE3433339C2; ATE83151T1; IL69686A; GB8422869D0; CA1235660A; GB2146338B; IT1210493B; US4634590A; FR2553100A1; US4996194A; IT8422580A0; IL69686A0; JPS60155126A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf neue Präparate und Arzneimittel für Behandlung und Prophylaxe von Autoimmun-Krankheiten, die . immunogenes Material aus Membranen bestimmter Autoimmun-Lymphozyten-Zellinien oder Druck-aktivierte Zellen enthalten.
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Die Grundlage der Prophylaxe von Autoimmun-Krankheiten ist die Impfung mit Membranprotein-enthaltenden Präparaten aus Autoimmun-T-Zellinien, die bestimmte T-Zell-Rezeptoren enthalten oder die Verwendung von Druck-aktivierten Zellen. Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines solchen aktiven Zellmembran-Materials und zur Zellaktivierung bereit sowie Arzneimittel, die diese als Wirkstoff enthalten.

Die Ursache für Autoimmun-Krankheiten sind endogene Lymphozyten, die normale Bestandteile des Organismus angreifen. Die Erfinder hatten besonders Autoimmun-T-Zellinien als Langzeit-Zellinien gezüchtet, die eine Reihe experimenteller Autoimmun-Krankheiten hervorrufen (vgl. Referenzen 1 bis 9) . Durch die so erhaltenen verhältnismäßig reinen Autoimmun-Zellkulturen wurde die Erforschung der Pathogenese erleichtert, der Trägerstatus der Autoimmunität aufgedeckt und es wurden Mittel zur Impfung gegen die Autoimmunität und zur Behandlung derselben bereitgestellt (vgl. Referenzen 5 bis 9).

*® Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Präparate zur Verwendung bei Prophylaxe und Behandlung von Autoimmun-Krankheiten. Als aktiven Wirkstoff enthalten die genannten Präparate bestimmte Membrankomponenten spezifischer Autoimmun-T-Lymphozyten oder Druck-aktivierte Zellen. Weiterhin bezieht

or

sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Gewinnung dieser 2'iembrankomponenten aus den genannten Lyitphozyten, auf die Druck-Aktivie-

rung solcher Lymphozyten und auf die Herstellung von Impfstoffen und Arzneimitteln, die diese Membrankomponenten oder Lymphozyten enthalten¹.

Ein gemeinsames Merkmal der Autoimmun-Krankheiten ist, daß sie durch einen Angriff des Immun-Systems auf Organismus-eigene Gewebe verursacht werden» Grundsätzlich treten bei allen Autoimmun-Krankheiten Autoimmun-Lymphozyten auf, die spezifisch bestimmte Ziel-Antigene des Organismus erkennen. Zu den Autoimmun-Krankheiten gehören rheumatische Arthritis, Multiple Sklerose, einige Formen von Diabetes mellitus sowie Thyroiditis. Bislang gab es keine spezifische Art der Therapie gegen diese Krankheiten.

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. Es ist möglich geworden, T-Lymphozyten als Langzeit-Zellinien zu züchten, die in Labortieren Autoimmun-Krankheiten verursachen. Zu diesen Krankheiten gehören Encephalomyelitis, Arthritis sowie Thyroiditis.

Es hat sich herausgestellt, daß solche Zellen als Wirkstoffe bei der Impfung gegen die genannten spezifischen Autoimmun-Krankheiten verwendet werden können: Dazu wurden diese Lymphozyten so attenuiert, daß sie keine Autoimmun-Krankheit verursachen können und injiziert. Es wurde gefunden, daß solche Impfungen die Tiere immun oder weniger sensitiv (die Krankheit war weniger ernst) gegenüber diesen Krankheiten machen. Außerdem wurde gezeigt, daß kranke Tiere durch die Verabreichung der genannten Zellen wirkungsvoll behandelt werden können.

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Erfindungsgemäß werden Arzneimittel bereitgestellt, die als Wirkstoff Membran-Material spezifischer, bestimmte T-ZeIlrezeptoren tragenderAutoimmun-T-Zellinien enthalten. Außerdem wird durch die Erfindung ein neues Verfahren zur Produktion und Isolierung der genannten Membran-Komponenten bereitgestellt, bei dem die T-Lymphozyten einem hohen hydrostatischen Druck

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Γ - 2 - Π

ausgesetzt wurden und dieser Druck allmählich entlastet wurde, wodurch wirkungsvoll das Ausscheiden von biologisch hochaktiven Membran-Komponenten verursacht wurde. Eine andere Möglichkeit ist die Druck-Aktivierung dieser Zellen. Dabei werden sie einem hydrostatischen Druck unterworfen, der allmählich entlastet wird.

Typische Bedingungen für das Ausscheiden von aktivem Membranmaterial sind Drucke von etwa 500 - 1500 bar, die allmählich innerhalb von 5 Minuten aufgebaut werden, auf ihrem höchsten Niveau etwa 10 bis 45 Minuten gehalten werden.und allmählich innerhalb von 5 bis 15 Minuten wieder entlastet werden.

Die Druckaktivierung von Zellen wird dadurch erreicht, daß diese Zellen einem während 5 Minuten aufgebauten Druck von 500 bis 1000 bar ausgesetzt werden, dieser'Druck etwa 5 Minuten aufrechterhalten wird und danach während etwa 5 Minuten 20

wieder entlastet wird.

Es findet so gut wie kein Ausscheiden von Membran-Komponenten statt, aber die Zellen werden aktiviert. Dies erfolgt wahrscheinlich durch eine laterale Verschiebung von Membran-Bestandteilen. Sowohl die ausgeschiedenen Komponenten als auch die Druck-aktivierten Zellen können als Wirkstoff für die erfindungsgemäßen Impfstoffe verwendet werden. Bei der Druck-Aktivierung behalten die Zellen ihre vollständige Lebens-

fähigkeit. 7 8

Die so erhaltenen Substanzen enthalten etwa 10 bis 10 aktivierte Zellen oder Material aus .einer gleichen Anzahl von Zellen. Zur Impfung von Menschen werden Mengen der Größenordnung von etwa 0,01 mg bis 3 mg dieser Substanzen ver-

„_ wendet (ausgeschiedenes Protein oder aktivierte Zellen). Die Impfung wird in einem Abstand von etwa 2 Wochen zweimal durchgeführt.

Derartige Immunisierungen sind bei der Prophylaxe und der Behandlung gewisser Autoimmun-Krankheiten v/irksam.

Die Lymphozyten werden in einem geeigneten Puffer suspendiert, in einen Gasphase-freien Druckbehälter eingebracht, in dem mit einer Preßvorrichtung ("French Press") wie vorstehend beschrieben ein Druck erzeugt wird.

10

Die entstandene Zellsuspension wird bei etwa 1500 üpm zentrifugiert. Der erhaltene überstand wird zur Sedimentation der Membran-Fragmente 1 Stunde bei etwa 100 000 g ultrazentrifuge giert.

Es wurden spezielle in vitro-Autoimmun-T-Zellinien entwickelt ■ (vgl. Referenzen 1 bis 9). In Tabelle I sind drei experimentelle Autoimmunkrankheiten zusammengefaßt, die mit diesen T-Lymphozyten-Zellinien in Verbindung stehen.

25 30 35

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ω
cn

co ο

to αϊ

ro ο

Tabelle I

Beispiele von Autoimmun-Krankheiten, die mit Membran-Proteinen aus Autoimmun-Zellinien behandelt

werden können

Krankheit

aktiv induzierte Krankheit

Durch Zellinien gebildete Krankheit

Art Zielorgan

Eigen- Immuni- Latenz Verlauf antigen sierung (Tage)

Antigen Zeil- Empfänger Latenz Verlauf zur Zeil- inokulum (Tage)

linien-Selektion

EAE*

EAT

Ratte

Maus

Ratte

Weiße Substanz des ZNS	BP	BP/CFA	12	Akut
Schild drüse	Tg	Tg/CPA	30	Chro nisch
Gelenke	·?	CFA	14	Sub akut

10⁴-10⁵ Intakt

3-6

10⁷

Akut

4 Tg 10-10 Intakt 1-3 Chronisch

Bestrahlt 5-10 Subakut

*) In den Tabellen verwendete Abkürzungen: '*

AA, Adjuvant-Arthritis; BP; Basisches Myelin-Protein; CFA, vollständiges Freund's Adjuvants; ZNS, Zentrales Nervensystem; EAE, Experimentelle Autoimmun-Encephalitis; EAT, Experimentelle Autoimmun-Thyroiditis;

IFA, unvollständiges Freund's Adjuvant; Tb, Mycobacterium tuberculosis, Tg, Thyroglobulin CJ

Die experimentelle Autoimmun-Encephalomyelitis (EAE) kann in genetisch susceptiblen Rattenstämmen durch Immunisierung die-

Ratten

serlmit basischem Myelin-Protein (BP) (vgl. Referenz 10) aktiv induziert werden. Gewöhnlich manifestiert sich EAE als akute Krankheit mit den Symptomen der Paralyse und der zellulären Infiltration in der weißen Substanz des Zentralen Nerven-Systems. Unbehandelte Ratten erholen sich gewöhnlich innerhalb von 2 oder 3 Tagen spontan von akuter EAE und sind dann resistent gegenüber weiteren Versuchen der Induktion aktiver EAE (vgl. Referenz 2). Chronische oder rückfällige EAE kann ebenso unter bestimmten Bedingungen induziert werden und gleicht dann in vielen Merkmalen der menschlichen Multiplen Sklerose.

Experimentelle Autoimitiun-Thyroiditis (EAT) kann in genetisch suszeptiblen H-2-Mäusen durch Immunisierung dieser Mäuse gegen Maus-Thyroglobulin (Tg) in einem Adjuvant induziert werden (vgl. Referenz 11). EAT wirkt sich als chronische Entzündung der Schilddrüse aus. EAT-resistente Mäusestämme können hohe

anti—
Titer von»Tg-auto-Ant!körpern bilden. Anscheinend ist EAT ein Modell für die beim Menschen nicht ungewöhnliche Autoimmun-Thyroiditis (Hashimoto's Thyroiditis).

Die Adjuvant-Arthritis (AA) unterscheidet sich von EAE und EAT dadurch, daß sie in Ratten nicht durch Immunisierung derselben gegen ein definiertes Eigen-Antigen sondern gegen Mycobacterium tuberculosis (Tb) in vollständigem Freund¹s Adjuvant induziert wird (CFA; vgl. Referenz 12). Etwa 2 Wochen nach der Inokulation entwickeln genetisch suszeptible Ratten eine subakute Polyarthritis mit Merkmalen, die sehr an die menschliche rheumatische Arthritis erinnern. Es wurde vermutet, daß Typ II-Kollagen das Ziel-Eigen-antigen bei AA ist, denn Arthritis kann durch die Immunisierung gegen dieses Antigen induziert werden (vgl. Referenz 13). Neuere Ergebnisse jedoch weisen darauf hin, daß AA und Typ II-Kollagen-Arthritis verschiedene Krankheiten sein können (vgl. Referenzen 14 und 15).

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Tabelle I veranschaulicht außerdem, daß ähnliche Autoimmun-Krankheiten durch die Inokulation von Antigen-spezifischen Zelllinien induziert werden können. Einzelheiten über Wachstum und Erhaltung der Zellinien und die Verursachung der Krankheit sind veröffentlicht worden (vgl. Referenzen 1 bis. 5). Das Wissentliche der Methode ist die Behandlung von Tieren mit einem bestimmten Antigen und die Auswahl der spezifisch reagierenden Zellen aus einer Kultur mit dem selektierenden Antigen zusammen mit syngenetischen,bestrahlten Hilfszellen. Die Antigen-präsentierenderi Hilfszellen müssen zumindest in einem Teil des Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (MHC) syngenetisch sein, um die proliferative Antwort der Zellinien-Zellen auszulösen (vgl. Referenzen 3 und 4). Die ausgewählten Zellinien-Zellen werden dann in eine Kultur mit konditioniertem Medium, das kein Antigen und keine Hilfszellen enthält, überführt. Stabile Zelllinien, die Autoimmun-Krankheiten übertragen können-, sind' alle positiv für die üblichen T-Zell-Marker (Thy 1 bei Mäusen oder W3/13) und für die Marker der Helfer-Zellen der verspäteten Form der Hypersensitivität (Lyt-1 oder W3/25)und enthalten einige oder keine . für den Lyt-2-oder OX8-Marker der cytotoxischen oder Suppressor-T-Zellen positive Zellen. Keine Zellinien-Zellen sind positiv für Ig-Marker. Zur Übertragung der Krankheit muß die T-Lymphozyten-Zellinie durch Inkubation mit spezifischem Antigen von T-Zell-Mitogenen aktiviert werden, bevor die Inokulation in die Empfänger-Tiere erfolgt. Eine einzi-

4 5
ge Inokulation von etwa 10 bis 10 anti-BP- oder anti-Tg-Zellen kann in verhältnismäßig kurzer Zeit zu den klinischen und pathologischen Anzeichen deutlicher EAE oder EAT führen.

7 Um AA hervorzurufen, werden höhere Zellinien-Zellzahlen (10 )

^ου und verhältnismäßig starke Bestrahlung der Empfänger-Tiere (750 R)benötigt. Wenn die Krankheit auftreten soll, müssen die Empfänger in einem Teil des MHC syngenetisch mit den Zelllinien-Zellen sein. Die charakteristischen Autoimmun-Verletzungen gehen einher mit einer immunologisch spezifischen Akkumu-

lation von Zellinien-Zellen im Zielorgan. Es gibt keine

Hinweise für die Mitwirkung von Auto-Antikörpern

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bei der Krankheit, die von den T-Lymphozyten-Zellinien-Zellen hervorgerufen wird.

Außerdem wurden erfolgreich Encephalomyelitis-oder Arthritis-Zellen cloniert; die anti-BP-Clone waren etwas weniger virulent als ihre elterlichen Zellinien während ein anti-Tb-Zellclon isoliert wurde, der viel virulenter war als die elterliche Zellinie.

Die Verwendung von Zellinien-Zellen als spezifischem Impfstoff zur Induktion der Resistenz gegen Autoimmun-Krankheiten ist in Tabelle II zusammengefaßt.

Tabelle IT

'^ Impfung gegen Autoimmun-Krankheiten mit spezifischen Autoimmun-

Zellinien-Zellen

Krank- Impfstoff Resistenz gegen die Krankheit

Zellinie Behandlung aktiv- übertragene Resistenzgrad j induziert Linie

EAE anti-BP Bestrahlung ja nein 60 - 70 %

EAT anti-Tg Bestrahlung ja ja vollständig,

Auto-Antikörper entstehen

AA anti-Tb keine ja ? vollständig

Ratten oder Mäusen wurden intravenös aktivierte Zellinien-Zellen inokuliert (anti-BP, 5 χ 10 ; anti-Tg, 5 χ 10 ; anti-Tb, 2 χ 10 ), einige davon waren durch Bestrahlung behandelt worden (1500 R). Kontrollieren wurden Zellinien-Zellen gegen nicht-interessierende Antigene inokuliert. bis 4 Wochen später wurden die Tiere einem Immunitätstest unterzogen, bei dem versucht wurde, aktive Autoimmun-Krankheiten zu induzieren.

AA

Anti-BP-Zellinien-Zellen konnten infolge von Bestrahlung oder Behandlung mit Mitomycin C nicht mehr EAE hervorrufen. Eine einzige intravenäse Inokulation von auf diese Weise attenuierten Zellinien-Zellen führte jedoch bei etwa 65 % der Ratten, die aktiv durch Immunisierung mit BP/CFA induziert wurden, zur Resistenz. Bei ersten Versuchen waren die Ratten noch suszeptibel für durch passiven Transfer von anti-BP-Zellinien-Zellen hervorgerufene EAE. Daher wurde vermutet, daß der Resistenzmechanismus weniger wirksam gegenüber vorgeformten Wirkungen oder Zellen ist,-■*als. gegenüber differenzierenden Zellen (vgl. Referenz 7). Kürzlich wurde jedoch beobachtet, daß sowohl durch positiven Transfer von Zellinien-Zellen verursachte EAE als auch aktive EAE mit Hilfe von Druck-behandelten Zellen verhindert werden kann. Dagegen verhindert eine einzige intravenöse Inokulation attenuierter anti-Tg-Zelllinien-Zellen nicht nur vollständig - aktive EAT, die durch Tg/CFA induziert wurde, sondern sie schützt auch vor durch Inokulation aktiver;anti-Tg-Zellinien-Zellen vermittelter EAT. Damit ist die Resistenz gegenüber Autoimmun-Krankheiten im allgemeinen nicht auf die frühen Stadien der Differenzierung beschränkt, sondern kann auch die Effektor-Phase der Krankheit

umfassen. j

Es wurde gefunden, daß Autoimmun-Zellinien-Zellen Wirkstoffe für Prophylaxe und■Behandlung experimenteller Autoimmunität sind. Dieser Befund ist hilfreich für den Umgang mit klinischen Autoimmun-Krankheiten, also für Krankheiten, für die es keine spezifische Form der Therapie gibt. Obwohl die klinische Anstrengung eher im Bereich der Behandlung als der Prophylaxe

liegen muß, ist dieser Unterschied in der Praxis möglicherweise nicht entscheidend. Ernsthafte Autoimmun-Krankheiten sind häufig progressiv oder mit Rückfall verbunden und schon die Prophylaxe der Ausbildung neuer Wellen von Autoimmun-

Lymphozyten kann eine wirkungsvolle Therapie sein. 35

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Figur 1 veranschaulicht die Linderung von AA durch eine einzige Inokulation von Zellinien-Zellen. In diesem Experiment wurden Gruppen von Ratten, die an aktiv induzierter AA erkrankt waren, mit spezifischen anti-Tb-Zellinien-Zellen oder mit Kontroll-Zellinien-Zellen behandelt. Die mit spezifischen Zellinien-Zellen behandelten Ratten zeigten eine weniger ernste Krankheit und eine beschleunigte Remission.

Eine andere Überlegung ist die Identifizierung und Nutzbarmachung von Eigen-Antigenen, gegen die die Autoimmun-Lymphozyten-Zellinien selektiert werden sollen. Häufig sind die Eigen-Antigene unbekannt ader nur sehr begrenzt zugänglich. Dennoch läßt das AA-Modell vermuten, daß es möglich ist, durch Verwendung von Gemischen nur wenig definierter Antigene, die sogar aus fremden Quellen erhalten sein können, entsprechende Zellinien zu schaffen. Warum oder wie sich spezifische virulente Autoimmun-Lymphozyten unter solchen'Bedingungen entwickeln können ist rätselhaft.

Es kann vorteilhaft sein, die Therapie mit subzellulärem Material aus Zellinien-Zellen oder mit Zellen verstärkter Antigenizität auszuführen und es wurde gefunden, daß Membranproteine wirkungsvoll verwendet werden können. Membranproteine von Zellinien-Zellen wurden mit einer neuen Methode hergestellt, die früher zur Isolierung von Blutgruppen-Antigenen menschlicher Erythrocyten verwendet wurde. Die Methode beruht auf der Hypothese, daß die Gleichgewichts-Position von Membranproteinen nach Verfestigung des Membran-Lipid-Bilayers zum wässrigen Bereich verschoben wird und, daß bei hoher Lipid-Zähflüssigkeit Proteine ausgeschieden werden. Im allgemeinen hat jedes in der Membran integrierte Protein eine definierte Lipid-Zähflüssigkeits-Schwelle, bei der es aus der

Membran ausgeschieden wird. 35

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Die wirksamste Methode der Hyper-Verfestigung von Membranen ist die Anwendung von hydrostatischen Drücken (500 bis 1500 bar) _t die durch Vorbehandlung mit Cholesterol unterstützt werden kann. Im allgemeinen überleben Zellen eine solche Behandlung und das ausgeschiedene Material kann durch Zentrifugatiön größenabhängig fraktioniert werden. Das nach einstündiger Zentrifugatiön bei 100 000 g im Überstand verbleibende Material kann als isoliertes Protein oder als kleine Aggregate davon betrachtet werden. Das Präzipitat dieser Zentrifugatiön besteht aus Membran-Fragmenten und großen Protein-Aggregaten. Im allgemeinen behalten lösliche Membran-Proteine, im Gegensatz zu in an sich bekannter Weise durch die Verwendung von Detergentien isolierten Membran-Proteinen, ihre Aktivität.

Die Fähigkeit zur Immunisierung gegen Autoimmun-Krankheiten wurde für die folgenden Fraktionen gefunden:

I. Druck-aktivierte Zellen (vermutlich durch laterale Umlagerungen und vertikale Verschiebungen der spezifischen

Antigen-Rezeptoren),

II. ausgeschiedene lösliche Proteine,

III. Membranfragmente.

Tabelle III zeigt, daß Membranfraktionen, die durch die Druckmethode isoliert wurden, immunologisch spezifisch die Reaktion von Autoimmun-Zellinien-Zellen mit dem entsprechenden Antigen inhibierten.

r M ...

-w- 343333S

₁ Tabelle III

Membranfraktionen inhibieren die proliferative Antwort auf spezifische Zellinien-Zellen

Zellulärer Ursprung Proliferative Antwort auf spezifider Membran-Fraktion _^ sches Antigen

% Hemmung der Zellinie

A2 ZIa

A2 39 0

10 ZIa 0. 50

Membranfraktionen aus A2- (Arthritis) und Z1a- (Encephalolyelitis) Zellinien-Zellen wurden durch die Druckmethode (1000 bar) gewonnen und 50 μg:/ml wurden für die proliferativen Antworten auf spezifische Antigene der intakten ZeIllinien-Zellen verwendet. Die Inhibition in Prozent wurde durch Vergleich der Reaktion in Gegenwart der Membranfraktionen aus den spezifischen Zellinien-Zellen mit der Reaktion in Gegenwart anderer Zellinien-Zelleii-Membran-Fraktionen berechnet.

Die mit Druck-aktivierten. Zellen ausgeführten Experimente ergaben praktisch identische Resultate.

Beispielsweise inhibierte die aus der anti-BP-Zellinie Z1a gewonnene Membran-Fraktion die Reaktion von intakten ZIa-ZeIllinien-Zellen auf BP; sie inhibierte nicht die Reaktion von Arthritis-hervorrufenden A2-Zellinien-Zellen auf deren Antigen. Im Gegensatz dazu inhibierte die Membranfraktion aus Arthritis-hervorrufenden A2-Zellen die Antwort auf intakte A2-Zellinien-Zellen aber nicht/Z1a-Zellinien-Zellen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß die Membranfraktionen biologisch aktive Rezeptoren für Eigen-Antigene enthalten.

\ Abbildung 2 zeigt die Ergebnisse eines Experimentes, bei dem Ratten 2 Dosen von jeweils 0,5 ng Membran-Fraktion aus Zia-Zellinien in wöchentlichen Abständen verabreicht wurde und bei dem 2 Wochen später aktive EAE in den Ratten induziert wurde. Aus der Abbildung kann entnommen werden, daß die Ratten, die mit der Membran-Fraktion behandelt wurden, im Vergleich zu den Kontroll-Ratten nur an einer sehr milden Paralyse litten. Der Verlauf der Krankheit konnte also merklich durch die Verwendung spezifischer Membran-Fraktionen gelindert werden. Tabelle IV zeigt die Resultate der Impfung von Ratten mit Druck-aktivierten anti-BP-Zellinien-Zellen.

Tabelle IV

Impfung gegen EAE mit Druck-aktivierten anti-BP-15 Zellinien-Zellen

Behandlung von Ratten Durch aktive Immunisierung mit mit Druck-aktivierten BP/CFA induzierte EAE Zellinien-Zellen ·

Vorkommen klinische Schwere der Krankheit

Kontrolle 4/4 leicht bis ernst

anti-BP 0/4 keine

Lewis-Ratten wurden intraperitoneal anti-BP- oder Kontroll-Zellinien-Zellen (5x10 pro Woche, viermal) verabreicht, die durch hydrostatischen Druck aktiviert worden waren (1150 bar, 15 Minuten). Eine Woche später wurden die Tiere einem Immunitäts-Test mit BP/CFA unterworfen, bei dem aktive EAE induziert werden sollte.

Aus Tabelle IV geht hervor, daß die Ratten, die mit den Kontroll-Zellinien-Zellen behandelt wurden suszeptibel für EAE waren, wogegen Ratten, die mit Druck-aktivierten, spezifischen anti-BP-Zellinien-Zellen behandelt waren, vollständig resistent gegenüber EAE waren. Außerdem waren sie resistent gegenüber durch intakte anti-BP-Zellinien-Zellen vermittelte EAE. ■ · ■

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41*-

Beispiele von Autoimmun-Krankheiten, die mit Membran-Proteinen aus Äutoimmun-Zellinien behandelt werden können:

Menschliche Autoimmun -Kr ankhe i t s-Zellinien Zur T-Selektion verwendetes Antigen

Multiple Sklerose

a) Basisches Myelin-Protein

b) Rohextrakt aus dem Zentralen Nervensystem

Thyroiditis

a) Thyroglobulin

b) Rohextrakt aus der Schilddrüse

Diabetes (Typ I)

a) Extrakt aus Insel-Zellen

Ankylotische Spondylitis (spezifische Formen)

a) Verschiedene Klebsiella-Bakterien

b) Rohextrakt aus Gelenken

Rheumatische Arthritis

a) Rohextrakt aus Gelenken

Die Figuren erläutern die Erfindung.

Figur 1: Behandlung der Anfangsstadien von Arthritis durch

Zellinien-Zellen-5 Lewis-

In 20/Ratten wurde durch Inokulation von CFA die aktive Adjuvants-Arthritis induziert. 5 Tage nach dem Ausbruch der klinischen Arthritis (Pfeil, Tag 16) wurde eine Gruppe von 10 Ratten durch eine einzige intravenöse Inokulation aktivierter anti-Tb-Zellinien-Zellen behandelt (geschlossene Kreise). Eine zweite Gruppe von 10 Ratten wurde mit Zellen einer Kontroll-Zellinie behandelt (offene Kreise). Die mittlere Häufigkeit des Auftretens von Arthritis wurde wie in Referenz 5 beschrieben bestimmt.

Figur 2: Linderung von EAE durch Verabreichung einer

Membran-Fraktion

Im Abstand von 1 Woche wurden Ratten Membran-Fraktionen aus Zia-Zellinien-Zellen verabreicht (0,5 μg, erhalten durch die Druck-Methode). 2 Wochen später wurden die Tiere einem Iirmunitätstest mit einer encephalogenen EAE-Dosis unterworfen. Die klinische Trefferquote bei den Testratten wird durch die offenen Kreise angegeben, die bei den Kontrollratten durch geschlossene Kreise. Klinische Trefferquote: 1 = mild;

₂₅ 2 = mäßig; 3 = ernst.

Beispiel 30 Herstellung eines Impfstoffs

Es wurden Zellen einer T-Lymphozyten-Zellinie gegen das basische Myelin-Protein verwendet (Z1a-Zellinie). In Ratten induzieren diese Zellen die experimentelle Autoimmun-Encephalitis

(EAE). In eine sterile Druckkammer wurden 6x10. Zellen, suspendiert in 2,5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2 (PBS)), eingebracht. Zum Ausschluß von Gasblasen wurde der Deckel direkt auf die Oberfläche der Lösung aufge-

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("French Press")

bracht. Mit einer Presse/wurde innerhalb von 15 Minuten allmählich ein Druck von 1000 Atmosphären aufgebaut und etwa 45 Minuten lang aufrechterhalten. Der Druck wurde dann langsam wieder während 15 Minuten auf Atmosphärendruck reduziert. Dann wurden die Zellen in ein Teströhrchen überführt, bei 1500 Upm abzentrifugiert und das Präzipitat wurde abgetrennt. Die Zellüberlebensrate wurde mit Trypan-blau-Färbung getestet und betrug mehr als 90 %. Danach wurde der überstand 1 Stunde bei 100 000 g ultrazentrifugiert. Der überstand (ungefähr 600 \ig Protein in 2 ml PBS) wurde gesammelt und bei den in vitro und in vivo-Funktions-Experimenten wie nachstehend beschrieben, verwendet.

Im in-vitro-Experiment wurden Zellen der Zellinie Zia durch ^⁵ Zugabe ihres spezifischen Antigens (0,2 μg/ml, basisches Myelin-Protein) zur Proliferation angeregt.

Die Zellproliferations-Rate wurde durch Zählungen der Zerfälle eingebauten, radioaktiven Thymidins pro Minute ge*- messen. Durch Zugabe von 30 |ig/itil der ausgeschiedenen Proteine (siehe oben) wurde die Zell-Proliferation um 50 bis 60 % reduziert. Wenn 30 μg/ml von anderen T-Zellinien-Zellen ausgeschiedene Proteine (auch von Arthritis) verwendet wurden, wurde kein Effekt auf die Zell-Proliferation beobachtet. Typische Ergebnisse eines solchen Experimentes sind in Tabelle III gezeigt und weisen darauf hin, daß das Material, das während der Druck-Aktivierung aus der Zelloberfläche ausgeschieden wurde, einen spezifischen Rezeptor für das induzierende Antigen enthält. Dieses Material kann zur Immunisierung gegen den Rezeptor verwendet werden. Dies führt zur partiellen oder vollständigen Eliminierung der Autoimmun-Krankheit. Ein solches Experiment wird nachstehend beschrieben.

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Ratten wurden zunächst im Abstand von 1 Woche zweimal durch Inokulation von 0,5 ug löslichen Proteinen, die nach der Druckbehandlung aus den Z1a-Zellinien-Zellen ausgeschieden . wurden, immunisiert. 2 Wochen später wurden die Ratten einem Immunitätstest mit BP-Antigen in Adjuvants unterworfen. Nach 14 Tagen trat bei allen Ratten der Kontrollgruppe schwere EAE auf, während, die vorbehandelten Ratten nur eine leichte EAE zeigten. Typische Profile für den Immunitätstest mit einer encephalitogenen BP-Dosis werden in Figur 2 gezeigt. Wiederum hatte die Vorbehandlung mit Proteinen,

die unter Druck aus einer nicht verwandten Zellinie (Arthritis) ausgeschieden wurden, keine Auswirkung auf die Entstehung von EAE.

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Claims

YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT COMPANY LTD. Rehovot, Israel Zellmembran-Proteine, diese enthaltende Arzneimittel und Verfahren zu ihrer Herstellung Patentansprüche

1. Arzneimittel für Prophylaxe und Behandlung einer

Autoimmun-Krankheit, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Membran-Proteinen, die aus der Zellmembran von Autoimmun-T-Lymphozyten ausgeschieden wurden, oder einen Gehalt an Druck-aktivierten Autoiitimun-T-Lymphozyten als Wirkstoff, sowie an üblichen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen. .

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran-Proteine die Fraktion sind, die man als Überstand erhält, wenn man eine Suspension mit T-Lymphozyten, aus denen Membran-Proteine ausgeschieden wurden, ultrazentrifugiert.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran-Proteine bzw. die Druck-aktivierten Autoimmun-T-Lymphozyten aus Autoimmun-T-Lymphozyten erhalten wurden, die spezifisch sind für Multiple Sklerose, Thyroiditis, Diabetes (Typ I), Ankylotische Spondylitis oder Rheumatische Arthritis.

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4. Aus der Zellmembran von Autoimmun-T-Lymphozyten ausgeschiedene Membran-Proteine zur Verwendung bei Prophylaxe

5 und Behandlung von Autoimmun-Krankheiten.

5. Druck-aktivierte Autoimmun-T-Lymphozyten zur Verwendung bei Prophylaxe und Behandlung von Autoimmun-Krankheiten.

6. Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Zellmembran-Protein-Präparaten nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine aus einem erkrankten Patienten erhaltene spezifische T-Lymphozyten-Zeliinie in einem geeigneten Puffer einem hohen hydrostatischen Druck aussetzt, diesen allmählich wieder entlastet, die Zellfragmente abzentrifugiert, den Überstand ultrazentrifugiert und den dabei erhaltenen Überstand entnimmt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Lymphozyten aus einem an einer Autoimmun-

Krankheit erkrankten Patienten stammen*

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Druck von 500 bis 1500 bar in einer geeigneten Vorrichtung erzeugt wird und, daß der Druck allmählich entlastet wird.

9. Verfahren zur Herstellung der Druck-aktivierten Lymphozyten gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß

man die Lymphozyten einem allmählich ansteigenden hydrostatischen Druck von 500 bis 1000 bar aussetzt, den Druck für eine bestimmte Zeitspanne aufrechterhält und allmählich wieder entlastet, wobei diese Bedingungen zur Zellaktivierung ausreichen', aber nicht zur Ausschaltung von Membran-Proteinen führen.
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