DE3420947C2

DE3420947C2 -

Info

Publication number: DE3420947C2
Application number: DE3420947A
Authority: DE
Inventors: Otto Dr. Wolfbeis; Edmund Dr. Graz At Urbano
Original assignee: Avl AG
Current assignee: Avl AG
Priority date: 1983-06-08
Filing date: 1984-06-05
Publication date: 1987-08-20
Also published as: US4580059A; ATA209883A; DE3420947A1; JPS608748A; AT390840B; JPH0643967B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung der Konzentrationen oder von Konzentrationsverhältnissen von in einem Stoffgemisch enthaltenen Stoffen, mit Fluoreszenzindikatoren, deren Fluoreszenzintensität von den zu bestimmenden Stoffen gemindert oder gelöscht wird und deren ungelöschte Fluoreszenzintensität bekannt ist, wobei zur gleichzeitigen Bestimmung der Konzentrationen an dem die Stoffe enthaltenden Stoffgemisch eine der Anzahl der zu bestimmenden Stoffkonzentrationen entsprechende Anzahl von Messungen der Fluoreszenzintensität vorgenommen wird. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 5.

Es ist bekannt, daß die Fluoreszenzfähigkeit gewisser Farbstoffe durch Zusatz von Stoffen, von sogenannten Fluoreszenzlöschern, gemindert werden kann. Zwischen der Konzentration des sogenannten Löschers und der Verminderung der Fluoreszenzintensität besteht nach Stern und Volmer die folgende Beziehung:

Hier bedeuten:

F⁰die Fluoreszenzintensität eines Fluoreszenzindikators in Abwesenheit eines Löschers Fdie Fluoreszenzintensität eines Fluoreszenzindikators in Gegenwart eines Löschers kdie sogenannte Löschkonstante, welche für jedes Paar von Löscher und Fluoreszenzindikator spezifische ist [Q)die Konzentration des löschenden Stoffes bzw. des Löschers (englisch "Quencher")

Da F⁰ und k für die eingesetzten Fluoreszenzindikatoren bzw. die jeweiligen Indikatorsubstanzen Konstante sind, kann man durch Messung von F auf die Konzentration des Löschers schließen. Wenn F⁰ und k unbekannt sind, eliminiert man sie durch die Vornahme von Messungen und durch die Erstellung von Eichgeraden oder -kurven, wobei F gegen [Q] aufgetragen wird und F⁰ und k z. B. graphisch ermittelt werden.

Diese analytische Methode hat verschiedene Anwendungen gefunden:

Das eingangs genannte Verfahren ist aus der DE-OS 25 08 637 bekannt, wo eine Methode zur optischen Messung von Blutgasen beschrieben wird, welche auf dem Prinzip der Fluoreszenzlöschung beruht. Dabei werden zur gleichzeitigen Bestimmung von Konzentrationen eine der Zahl der zu bestimmenden Konzentrationen entsprechende Anzahl von Messungen vorgenommen. Die entsprechenden Meßsiganle werden einer elektronischen Auswerteeinheit zur Ermittlung der Konzentrationen der zu bestimmenden Stoffe zugeleitet.

In der US-PS 36 12 866 wird eine Methode zur Messung von Sauerstoffkonzentrationen in verschiedenen Substanzen, wie z. B. Blut, beschrieben. Die Methode beruht darauf, daß Sauerstoff als Löscher die Fluoreszenzintensität gewisser aromatischer Kohlenwasserstoffe, wie z. B. Pyren, gemäß Gleichung (1), zu vermindern vermag. In "Biochemistry" (Band 9, Seiten 464-473, 1970) ist ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe von Pyrenbuttersäure die lokale Konzentration an Sauerstoff über die Fluoreszenzlöschung zu verfolgen. In "Fresenius Zeitschrift für Analytische Chemie" (Band 314, Seiten 577-581, 1983) wird ein Verfahren beschrieben, mit Hilfe gewisser heterocyclischer Fluoreszenzindikatoren die Konzentration von Halogenidionen über die durch sie bewirkte Fluoreszenzlöschung mit großer Genauigkeit zu bestimmen. Weitere analytische Methoden zur Bestimmung von Stoffkonzentrationen mit Hilfe der Fluoreszenzlöschung sind beschrieben in der DD-PS 1 06 086 sowie in "The Analyst" (Band 107, Seiten 465-494, 1982).

Allen diesen Verfahren haftet der Nachteil an, daß die verwendeten Fluoreszenzindikatoren bzw. die Indiaktorsubstanzen für den zu untersuchenden Stoff spezifisch sein müssen, d. h. nur auf diesen einen Stoff ansprechen dürfen. In der Praxis findet man jedoch meist den Fall, daß Fluoreszenzindikatoren auf mehr als einen zu untersuchenden Stoff ansprechen bzw. von mehreren Stoffen löschbar sind.

Aufgabe der Erfindung ist die Erstellung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur fluorimetrischen Bestimmung einer oder mehrerer Stoffkonzentrationen mit Hilfe von Fluoreszenzindikatoren, welche nicht mehr notwendigerweise spezifisch für die zu untersuchenden Stoffe sein müssen, so daß insbesondere gleichzeitig verschiedene Stoffe mit beliebigen Fluoreszenzindikatoren untersuchbar sind. Insbesondere sollen Konzentrationsverhältnisse bestimmt werden oder interessierende Verhältnisse z. B. zweier bestimmter Konzentrationen ermittelt werden.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe bei dem eingangs genannten Verfahren dadurch gelöst, daß mindestens ein in bezug auf mindestens einen der zu betimmenden Stoffe nicht spezifischer, von mehr als einem der Stoffe löschbarer Fluoreszenzindikator eingesetzt wird, der in bezug auf die ihn jeweils in seinen Intensitäten löschenden Stoffe (Löscher) verschiedene Löschkonstanten aufweist und daß die bekannten, ungelöschten Fluoreszenzintensitäten der eingesetzten Fluoreszenzindikatoren, die gemessenen gelöschten oder geminderten Fluoreszenzintensitäten und die bekannten oder vorab ermittelten Löschkonstanten zur Bestimmung der Konzentrationen der einzelnen Stoffe und/oder des Verhältnisses der Stoffkonzentrationen herangezogen werden.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung erlaubt nun erstmals die gleichzeitige fluorimetrische Bestimmung mehrerer analytischer Größen bzw. Stoffkonzentrationen auch dann, wenn keine Indikatorspezifität mehr vorhanden ist, bzw. die Bestimmung von nur einer Konzentration trotz der Anwesenheit von störenden bzw. löschenden Stoffen.

Die Erfindung geht von der Erkenntnis aus, daß man, um den Einfluß mehrerer Löscher mathematisch berücksichtigen zu können, die Gleichung (1) erweitern muß, indem man dem Einfluß zusätzlicher Löscher d. h. weiterer zu untersuchender Stoffe durch Anfügung weiterer Glieder Rechnung trägt: Es resultiert somit eine Gleichung für den Fall zweier Löscher bzw. eine allgemeine Gleichung (3) für den Fall mehrerer Löscher bzw. zu untersuchender, nicht spezifischer Fluoreszenzindikatoren löschender Stoffe.

Da die Gleichung (2) zwei Unbekannte und die Gleichung (3) mehrere Unbekannte enthält (nämlich die verschiedenen Stoff- bzw. Löscherkonzentrationen [Q], braucht man zur Lösung zwei bzw. mehrere unabhängige Meßwerte, im allgemeinen Fall n Meßwerte. Man erhält sie dadurch, daß man die Fluoreszenzintensität F zweier verschiedener von den zu untersuchenden Stoffen gelöschten Fluoreszenzindikatoren mißt.

Bei Verwendung eines Indikators A erhält man ein Meßsignal

In Gleichung (4) bedeuten:
F die Fluoreszenzintensität des Indikators A in Abwesenheit von Löschern bzw. der zu untersuchenden Stoffe; F _A die Fluoreszenzintensität in Gegenwart von Löschern bzw. der zu untersuchenden Stoffe; ¹k _A die Löschkonstante des Indikators A durch den Löscher Q₁; ²k _A die Löschkonstante des Indikators A durch den Löscher Q₂ und [Q₁] und [Q₂] die Konzentration der beiden Löscher.

Bei Verwendung des Indikators B erhält man analog:

F ist die Fluoreszenzintensität des Indikators B in Abwesenheit von Löschern; F _B die Fluoreszenzintensität in Gegenwart von Löschern; ¹k _B die Löschkonstante des Indikators B durch Löscher Q₁; ²k _B die Löschkonstante des Indikators B durch Q₂, und [Q₁] und [Q₂] die Konzentration der beiden Löscher.

Setzt man nun zur Vereinfachung für

gleich α und für

gleich β und setzt das aus Gleichung (4) berechnete [Q₂] in Gleichung (5) ein, so resultiert folgender Ausdruck:

bzw. für

¹k _A, ²k _A, ¹k _B und ²k _B sind konstante Größen, die bekannt sind bzw. bereits ermittelt wurden. α und β sind variable Größen, die sich aus den Meßwerten der gelöschten Intensitäten F _A bzw. F _B ergeben. Damit lassen sich entsprechend den Gleichungen (6) und (7) die Konzentrationen der zu bestimmenden Stoffe bzw. Löscher Q₁ und Q₂ bestimmen.

Bei drei zu bestimmenden Stoffen bzw. Löschern braucht man drei Fluoreszenzindikatoren und muß drei Meßgrößen α, β und γ bestimmen, welche wie folgt definiert sind:

Daraus ergeben sich mit Gleichung (3) drei Gleichungen mit neun Löschkonstanten:

α = ¹k _A · [Q₁] + ²k _A · [Q₂] + ³k _A · [Q₃]
β = ¹k _B · [Q₁] + ²k _B · [Q₂] + ³k _B · [Q₃] (9)
γ = ¹k _C · [Q₁] + ²k _C · [Q₂] + ³k _C · [Q³]

Die Lösung des Gleichungssystems kann durch Erstellen einer Matrix,

und die Auswertung über eine Systemdeterminate mit Hilfe eines geeigneten Taschenrechners erfolgen.

Zur Bestimmung von n unbekannten Konzentrationen werden in gleicher Weise n unabhängige Gleichungen aufgestellt und es müssen n Meßwerte der gelöschten Fluoreszenzintensitäten F _n ermittelt werden.

Der Vorteil des Verfahrens liegt darin, daß es mit Hilfe von z. B. zwei nicht spezifischen Fluoreszenzindikatoren erstmals möglich ist, zwei unbekannte Stoffkonzentrationen fluorimetrisch zu ermitteln, wenn die beiden Stoffe jeweils beide Fluoreszenzindikatoren löschen.

Aber auch die Bestimmung von nur einer Konzentration eines Stoffes in Gegenwart eines nicht interessierenden Stoffes bzw. einer löschenden Störsubstanz ist möglich; dazu werden ebenfalls zwei Meßwerte benötigt; und zwar die gelöschten Fluoreszenzintensitäten der beiden Fluoreszenzindikatoren, wobei die Berechnung der Stoffkonzentrationen auf die beschriebene Weise erfolgt, nur eben mit der Ausnahme daß die gelöschte Intensität der Störsubstanz als Rechenhilfsgröße benötigt wird und allenfalls die tatsächliche Konzentration der Störsubstanz nicht berechnet wird. In diesem Fall wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Diskriminierung der gewünschten Stoffkonzentration gegenüber einem störenden Stoff dienen und ist dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Konzentration von mindestens einem Stoff in Gegenwart von mindestens einem weiteren nicht interessierenden oder störenden Stoff, welcher die Fluoreszenzintensitäten der vorliegenden Fluoreszenzindikatoren ebenfalls löscht, auch die Fluoreszenzintensitäten bezüglich des mindestens einen störenden Stoffes wie die Fluoreszenzintensitäten bezüglich des mindestens einen zu bestimmenden Stoffes bestimmt werden und diese Fluoreszenzintensitäten zur Ermittlung der Konzentration des mindestens einen zu bestimmenden Stoffes herangezogen werden.

Analog können Effekte von n Störsubstanzen bzw. nicht interessierenden Stoffen durch n ermittelte Meßwerte von gelöschten Fluoreszenzintensitäten der Störsubstanzen ausgeschaltet werden, die gemeinsam mit der gelöschten Fluoreszenzintensität des zu untersuchenden Stoffes in n+1 Gleichungen eingesetzt werden. Bedingt für die Lösung der Gleichungen ist der Umstand, daß für alle Indikator-Löscher-Kombinationen die Löschkonstanten k unterschiedlich sind. Unter der Anzahl der zu bestimmenden Konzentrationen wird somit die Anzahl der zur Lösung der Gleichungen erforderlich gelöschten Intensitäten der Stoffe und der Störsubstanzen verstanden.

Gleichungen (6) und (7) werden stark vereinfacht, wenn mindestens ein für einen Stoff spezifischer Indikator eingesetzt wird. Eine der Löschkonstanten wird dann gleich Null, und der Bruch besteht dann nur mehr aus drei Gliedern

Will man hingegen nur das Verhältnis von zwei Löschkonzentrationen ermittelt, so gilt dafür durch Kombination der Gleichungen (6) und (7) Gleichung (11):

Es ist möglich, daß ein Fluoreszenzindikator eingesetzt wird, der jedoch in verschiedener Indikatorumgebung, z. B. in verschiedenen Lösungen oder Bindungen, vorliegt, und dadurch in den verschiedenen Indikatorumgebungen für den jeweils zu bestimmenden Stoff bzw. Löscher unterschiedlicher Löschkonstanten besitzt. In verschiedener Umgebung vorliegende und dadurch für jeweils verschiedene Stoffe unterschiedliche Löschkonstanten aufweisende Fluoreszenzindikatoren sind für das erfindungsgemäße Verfahren als voneinander unabhängig einsetzbare, unterschiedliche Fluoreszenzindikatoren zu betrachten.

Je nach der Verfahrensdurchführung können Fluoreszenzindikatoren eingesetzt werden, die sich in derselben Phase oder demselben Stoffgemisch wie die zu bestimmenden Stoffe befinden. Zweckmäßig kann es nach der Erfindung auch sein, daß im Falle eines von den zu bestimmenden Stoffen räumlich getrennt vorliegenden Fluoreszenzindikators, oder wenn der Fluoreszenzindikator und die zu bestimmenden Stoffe nicht in derselben Phase vorliegen, ein die Diffusion ermöglichender Kontakt zwischen den zu bestimmenden Stoffen und der Indikatorphase hergestellt wird, oder daß die Fluoreszenzindikatoren gleichzeitig dem Stoffgemisch mit den zu bestimmenden Stoffen zugegeben und vorzugsweise mit diesem vermischt werden oder mehreren einzelnen Stoffgemischen zugesetzt oder auf mehrere Indikatormembranen aufgebracht werden.

Die Wahl, ob sich der Fluoreszenzindikator in derselben oder in einer anderen Phase befindet, richtet sich nach den gestellten Erfordernissen. Wenn sich der Indiaktor in derselben Phase befindet, so kann man sehr empfindlich messen, da die Löscher praktisch ungehindert zum Indikator vordringen können. Andererseits wird aber die Spezifität gering sein, da praktisch alle in der Lösung befindlichen Löscher wirksam werden. Befindet sich der Indikator in einer anderen Phase, so wird die Empfindlichkeit der Messung dadurch meist erniedrigt, da der Löscher erst in die zweite Phase eindiffundisieren muß und dort, zumindest in den Fällen der Praxis (z. B. in einem Polymer) eine geringere Löscheffizienz besitzt, was in einer geringeren Signaländerung und damit einer geringeren Empfindlichkeit bzw. Genauigkeit resultiert. Andererseits wird die Spezifität der Löschung deutlich verbessert, da nur mehr diejenigen Stoffe löschen können, welche in die zweite Phase einzudringen vermögen, also meist nur Gase oder kleine Moleküle.

Erfindungsgemäß wird die obengenannte Aufgabe bei einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 5 dadurch gelöst, daß mindestens einer der in den Sensorelementen angeordneten Fluoreszenzindikatoren ein in bezug auf mindestens einen der zu bestimmenden Stoffe nicht spezifisch ansprechender, von mehr als einem Stoff löschbasrer Fluoreszenzindikator ist, und daß die Löschkonstanten dieses Fluoreszenzindikators für die ihn löschenden Stoffe jeweils unterschiedlich sind. Diese Anordnung ermöglicht bei Einsatz von nicht spezifischen Fluoreszenzindikatoren eine Bestimmung der Konzentration von Stoffen bzw. der Verhältnisse der Konzentrationen, auch wenn sich unter diesen Stoffen nicht interessierende Störsubstanzen befinden.

Die Auswerteeinheit kann eine Divisionseinheit aufweisen, der die Meßwerte der ungelöschten Fluoreszenzintensität der einzelnen Fluoreszenzindikatoren eingegeben und die Meßwerte der einzelnen gemessenen Fluoreszenzintensitäten aus den Fluoreszenzindikatoren, gegebenenfalls nach Substraktion eines konstanten, einem Streulichtanteil entsprechenden Wertes, zugeführt werden, wobei dem errechneten Quotienten der Wert 1 abgezogen wird. In der Auswerteeinheit ist auch eine Recheneinheit zur Berechnung der Stoffkonzentrationen und/oder der Konzentrationsverhältnisse der Stoffe vorgesehen.

Erfindungsgemäß kann vorgesehen sein, daß mindestens in einem Teil der Sensorelemente derselben Fluoreszenzindiaktor in jeweils verschiedener Lösung oder Bindung vorliegt und in verschiedener Lösung oder Bindung gegenüber den ihn löschenden Stoffen unterschiedliche Löschkonstanten besitzt.

Je nach Bedarf ist es vorteilhaft, wenn die Fluoreszenzindikatoren auf mehrere einzelne Stoffgemische oder auf mehrere Sensorelemente verteilt sind und/oder zwischen dem Probenraum und den Fluoreszenzindikatoren Reaktionsräume vorgesehen sind, in welchen durch chemische Reaktion löschende Stoffe in nichtlöschende oder in denen nichtlöschende Stoffe in löschende umwandelbar sind, so daß auch nichtlöschende Stoffe indirekt untersucht und gemessen werden können.

Erfindungsgemäß ist es auch möglich, daß die Sensorelemente in der Spitze einer Meßsonde angeordnet sind, die in das die Stoffe enthaltende Stoffgemisch eintauchbar ist. Neben der Möglichkeit, daß der Probenraum gleichzeitig Reaktionsraum ist, kann auch hinter dem Probenraum noch ein eigener Reaktionsraum vorgesehen sein.

Zweckmäßig ist es zur Auswertung, wenn zur Ausschaltung von Lichtquellenintensitätsschwankungen eine Referenzlichtmeßzelle odr ein Referenzindikator im Strahlengang der Lichtquelle steht, welcher(r) mit der Auswerteeinheit in Verbindung steht.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung beispielsweise näher erläutert:

Fig. 1 bis 3 zeigen verschiedene Meßanordnungen und

Fig. 4 ein Diagramm zur Löschkonstantenermittlung.

Die Fig. 1 und 2 zeigen einfache Vorrichtungen, mit denen das Verfahren für den gängigen Fall von zwei diffusionsfähigen Stoffen in flüssigen oder gasförmigen Proben durchgeführt werden kann. An einem Probenraum 20 sind außen Sensorelemente 21 A und 21 B mit den Fluoreszenzindikatoren angebracht. Lichtquellen 22 A bzw. 22 B oder eine Lichtquelle 22 erzeugen mit den Fluoreszenzindikatoren Fluoreszenzen, deren Intensitäten mit Hilfe der Lichtdetektoren 23 A, 23 B gemessen werden. In Abwesenheit von Löschern bzw. der zu untersuchenden Stoffe wird die Fluoreszenzintensität F⁰ besonders hoch sein; die gemessenen Werte entsprechen dann den Größen Fk in Gleichung (2). Zur Messung wird dann das die zu bestimmenden Stoffe enthaltende Stoffgemisch in den Probenraum 20 eingeleitet bzw. durch diesen geleitet. Aus dem Probenraum 20 können nun Löschersubstanzen zu den Fluoreszenzindikatoren in den Sensorelementen 21 A, 21 B diffundieren (z. B. Sauerstoff, Schwerfeldioxid, Halothan usw.). Diese Löscherstoffe bewirken bei diesen Indikatoren eine reversible Verminderung der Fluoreszenzintensität auf F (Gleichung (2) bzw. (4) und (5)). Mißt man nun die Fluoreszenzintensität F _A, F _B beider Indiaktoren, so kann man in Kenntnis von Fk sowie der Löschkonstansten k die Konzentrationen der Löscher berechnen. Zur besseren Diskriminierung des Anregungslichtes 24 und des Fluoreszenzlichtes 25 können auch optische Lichtfilter 26, 27 z. B. Interferenzfilter in den Stahlengang eingebracht werden.

Die Probenräume 20 können als Einmal-Meßkammer oder auch als Durchflußmeßzellen ausgeführt sein. Ein Vorteil des vorliegenden Verfahrens und der zugehörigen Vorrichtung besteht auch darin, daß sowohl einzelne Proben wie auch kontinuierlich vorbeiströmende Proben vermessen werden können.

Als Lichtquellen können thermoelektrische, elektronische, Laser- oder LED-artige Anordnungen dienen, die kontinuierlich oder gepulst Licht liefern.

Die eingesetzten Sensorelemente bestehen üblicherweise aus Lösungen löschersensitiver Materialien bzw. Indikatorsubstanzen in dünnen Membranen aus polymeren Materialien, die gegebenenfalls mit Weichmacherzusätzen versehen sind. Alternativ können Fluoreszenzindikatormaterialien bzw. -substanzen auch in kovalenter Weise an Trägermaterial gebunden vorliegen.

Als Indiaktoren kommen alle Fluoreszenzindikatoren bzw. Indikatorsubstanzen gegebenenfalls in unterschiedlichen Umgebungen in Frage, welche durch Fremdsubstanzen eine Fluoreszenzlösung erleiden. Zweckmäßigerweise sollen diese Indiaktoren stark fluoreszieren und stabil sein. Als Beispiel seien folgende Indikator-Löscher-Kombinationen genannt:

Pyrenbuttersäure - Sauerstoff
Chlorophyll - Schwefeldioxid
Chininsulfat - Chloridion
Acridinsulfat - Bromidion
Indol - H₂O₂
Benzo(ghi)perylen - Halothan

Die Lichtdetektoren 23 A, 23 B dienen zur Messung der Fluoreszenzlichtintensität, die von der Löscherkonzentration abhängt. Als Lichtmeßeinrichtungen bzw. -detektoren können lichtelektrische Photozellen, Photoverstärker oder Photodioden eingesetzt werden. Das erhaltene Meßsignal wird üblicherweise noch in einer Verstärkereinheit 28 verstärkt, ehe es einer analogen oder digitalen Rechen- bzw. Auswerteeinheit 29 oder Anzeigevorrichtung 30 zugeführt wird. In der Recheneinheit 29 werden die Konzentrationen der zu bestimmenden Stoffe gemäß den angeführten Gleichungen ermittelt.

Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung zur kontinuierlichen Messung von drei Stoffen in optisch transparenten strömenden Medien, wie z. B. Gasen oder Flüssigkeiten. Die zu untersuchen den Stoffe strömen in Richtung der Pfeile 34 durch einen von einem U-förmigen Rohr gebildeten Probenraum 20 an drei Sensorelementen 21 A, 21 B, 21 C mit den Fluoreszenzindikatoren vorbei, die durch das Licht 31 einer Lichtquelle 22, gegebenenfalls durch ein Lichtfilter 26 zur Fluoreszenz erregt werden. Das von den Indikatoren ausgestrahlte Fluoreszenzlicht 32 wird, gegebenenfalls nach Passieren eines Lichtfilters 27, mit Hilfe von Lichtdetektoren 23 A, 23 B, 23 C gemessen. Die erhaltenen Signale werden in Verstärkern 28 verstärkt und mit einer Auswerteeinheit 29 gemäß Gleichungen (8), (9) und (10), ausgewertet. Sie können dann analog oder digital in der Anzeigevorrichtung 30 angezeigt oder ausgedruckt werden. Zur Bestimmung des Verhältnisses der Löscherkonzentrationen zieht man Gleichung (10) heran.

Es wird bemerkt, daß es in der Praxis oft zweckmäßig ist, vom anliegenden Meßsignal bzw. der gemessenen Fluoreszenzintensität F eine konstante Größe F _s abzuziehen, um auf das eigentliche Meßsignal zu kommen. Die Größe F _s berücksichtigt das störende Fluoreszenzlicht bzw. Falschlicht, welches durch Lichtstreuung in das Fluoreszenzdetektionssystem gelangt. Bei der Ermittlung des Falschlichtanteils F _s geht man so vor, daß man zuerst die Stern-Volmer- Gleichung so modifiziert, daß der Falschlichtanteil F _s berücksichtigt wird:

Stern-Volmer:
-1=k[Q]
F⁰=I⁰-F _s
F=I-F _s

I⁰, I: detektierte Lichtintensitäten (Fluoreszenzlicht + Falschlicht) es ergibt sich:

Nach einer Dreipunktseichung ergeben sich drei Eichwerte:

[Q]₀ = 0 → I₀
[Q]₁ → I₁
[Q]₂ → I₂

und es verbleiben zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten (k, F _s ):

Auf diese Weise können Falschlichtanteile F _s und Löschkonstanten für jeden Sensor (jeden Löscher) bei der Eichung ermittelt werden.

Im Bedarfsfall kann die Lichtzufuhr von der Lichtquelle zu den Fluoreszenzindikatoren in den Sensorelementen sowie die Lichtableitung von den Indikatoren zu den Lichtdetektoren mit Hilfe von Lichtleitern erfolgen. Es ist möglich, den Indikatormembranen sogenannte Ionencarrier zuzusetzen, um die Diffusion der Löscher durch die Membranen bzw. in die Fluoreszenzindikatoren zu erleichtern bzw. selektiver zu gestalten.

Es stehen mehrere Möglichkeiten zur Erfassung der Meßwerte bzw. Ermittlung der Konzentrationen zur Verfügung. Für den häufigen Fall, daß man zwei Meßwerte benötigt, kann man
(a) die Fluoreszenzintensitäten F _A und F _B von zwei Sensorelementen, die verschiedene Fluoreszenzindikatoren enthalten, in Gegenwart der Löscher bzw. zu bestimmenden Stoffe messen und dann die Konzentrationen der Löscher Q₁ und Q₂ nach Gleichungen (6) und (7) oder graphisch ermitteln;
(b) die Fluoreszenzintensitäten F _A und F von zwei Sensorelementen messen, die denselben Fluoreszenzindikator allerdings in jeweils verschiedener Indikatorumgebung, z. B. in verschiedenen Lösungsmitteln oder in verschiedenen Polymermembranen enthalten. Da sich die Löschkonstanten k einer Indikatorsubstanz mit der Art der Umgebung bzw. des Lösungsmittels ändern, kann man wiederum mit Gleichungen (6) und (7) bzw. graphisch die Konzentation von zwei Löschern ermitteln. Fk.

Für den Fall von mehr als zwei Stoffen bzw. von in mehr als zwei verschiedenen Umgebungen bzw. Lösungen vorliegenden Fluoreszenzindikatoren gilt natürlich entsprechendes.

Die Wechselwirkung zwischen Fluoreszenzindikator und dem Löscher kann in homogener Lösung erfolgen, indem Lösungen von dem zu untersuchenden Stoff und dem Fluoreszenzindikator zusammengegeben werden (z. B: Messungen in Küvetten, wie in den folgenden Beispielen 1 und 2 angegeben ist).

Die Wechselwirkung zwischen Fluoreszenzindikator und dem zu bestimmenden Stoff kann auch erfolgen, indem die Indikatoren sich nicht in derselben Phase wie der Stoff befinden, indem die Löschsubstanzen aus dem die Stoffe enthaltenden Stoffgemisch in den Fluoreszenzindikator diffundieren (z. B. bei der Bestimmung von Gaskonzentrationen mit membranförmigen Sensoren, wie z. B. in Fig. 1 bis 3).

Die Fluoreszenzindikatoren können, wenn sie spektral unterscheidbare Strahlung abgeben, in einer Lösung oder einer Membran vorliegen, sie können aber auch auf mehrere Lösungen oder Membranen verteilt sein.

Es ist dabei möglich, mehrere Membranen übereinander oder nebeneinander anzuordnen. Zur Verbesserung der Selektivität können die Indikatoren bzw. Indikatorelemente durch zusätzliche permeationsselektive Membranen abgedeckt sein.

Um Intensitätsschwankungen der Lichtquelle 22 zu eliminieren, kann vorgesehen werden, eine Referenzlichtmeßzelle 33 einzubauen (Fig. 3), die die Intensität der Lichtquelle 22 mißt und die mit den Verstärkern 28 verbunden ist, um Schwankungen der Lichtquelle 22 zu kompensieren bzw. nicht als Änderungen in der Fluoreszenzintensität erscheinen zu lassen. Als Beispiele seien genannt:

a) die gleichzeitige Messung von Sauerstoff und Schwefeldioxid in Industrieabgasen oder in Umweltmeßanlagen.
b) Die Messung von Sauerstoffkonzentrationen z. B. in Straßentunnels in Gegenwart störender Autoabgase, wie z. B. SO₂ oder NO_x.
c) Die gleichzeitige Messung der Löscher Sauerstoff und Halothan im Anästhesiegas während der Anästhesie.
d) Die kontinuierliche Messung von Chlorid und Sulfid in Abwässern.

Im folgenden werden Beispiele angegeben, denen auch die Genauigkeit des Meßverfahrens zu entnehmen ist:

1. Beispiel

Quantitative fluorimetrische Simulatanbestimmung zweier Löscher (Chlorid und Bromid) in homogener Lösung.

Prinzip

Die Fluoreszenzintensität der Indikatoren Chinin und Acridin wird durch Bromid und Chlorid unterschiedlich gelöscht.

5,123 mg 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol (MG: 202.56) und 4,602 mg Benzalacetophenondibromid (MG: 368.08) wurden zusammen eingewogen und in einer Sauerstoffatmosphäre verbrannt. Die Verbrennungsgase werden in 5 ml einer 1%figen Hyxdrazinsulfatlösung absorbiert.

Nach der Absorption der Reaktionsgase wurde der Inhalt des Kolbens in einen 20-ml-Meßkolben und dieser ohne Indikatorzugabe aufgefüllt. Man pipettierte nun je 8 ml dieser Stammlösung in zwei 10-ml- Meßkolben. In den einen kamen 1 ml einer 2,0 · 10^-5 molaren Chininsulfatlösung in 1 N Schwefelsäure (1. Indikator), in den anderen 1 ml einer 1,0 · 10^-5 molaren Acridinlösung in 1 N Schwefelsäure (2. Indikator). Danach wurden beiden Kolben mit Wasser auf 10 ml aufgefüllt. Nach der Bereitung zweier halogenidfreier Standardlösung wurden deren Standard- Fluoreszenzintensitäten (Fk auf 100 eingestellt. Der relative F _A-Wert der Probe (Chininsulfat als Indikator) betrug 76,1, der F _B-Wert der Probe (Acridin als Indiaktor) zufällig ebenfalls 76,1.

Die für die Auswertung der Meßergebnisse erforderlichen Löschkonstanten k wurden vorher bestimmt und sind in der Tabelle 1 aufgeführt:

Tabelle 1

Löschkonstanten k für die im folgenden Beispiel verwendeten Indiaktoren Chininsulfat und Acridin in Schwefelsäure

Auswertung:

Folgende Meßergebnisse wurden erhalten:

Fk = 100
F _A = F _B = 76,1
α = (F/F _A )-1 = 0,31506
β = (F/F _B )-1 = 0,31506

Setzt man diese Größen und die Stern-Volmer- Konstanten k in die Gleichungen (6) und (7) ein, so ergeben sich die molaren Konzentrationen der Löscher Chlorid und Bromid zu:

Cl⁻ = 1,0296 mM = 0,9126 mg/25 ml Gesamtprobenvolumen
Br⁻ = 1,0036 mM = 2,0048 mg/25 ml Gesamtprobenvolumen

Um den mg-Gehalt Halogenid zu erhalten, muß die molare Löscherkonzentration der Proben mit dem Molekulargewicht und dem Gesamtprobenvolumen in ml multipliziert und durch 1000 dividiert werden.

Dividiert man den in mg/Gesamtprobenvolumen erhaltenen Analysenwert durch die Einwaage (in mg) und multipliziert man das Ergebnis mit 100, so erhält man den Relativprozentgehalt der Halogenide. Für das angeführte Beispiel erhält man folgendes Ergebnis:

Einwaage:9,9725 mg Chlorid:gefunden 9,38%, berechnet 9,22% Bromid:gefunden 20,61%, berechnet 20,55%

2. Beispiel

Quantitative fluorimetrische Simultanbestimmung dreier Löscher (Chlorid, Bromid und Jodid) in homogener Lösung.

Prinzip

Die Fluoreszenz der Indikatoren Chinin, Acridin und Harman wird in schwefelsaurer Lösung durch die Stoffe Chlorid, Bromid und Jodid in unterschiedlicher Weise gelöscht.

Die fluorimetrische Simultanbestimmung von drei Löschern wurde anhand von drei Kaliumhalogenidlösungen überprüft. Dazu ermittelte man zuerst die Löschkonstanten und überprüfte deren additive Zusammensetzung zu einer Gesamtlöschkonstante. Tab. 2 gibt die Ergebnisse dieser Untersuchung wieder.

Tabelle 2

Ionenspezifische Löschkonstanten und Gesamtlöschkonstanten für in evorliegende Halogenide

Indikator: Chininsulfat in 0,1 N H₂SO₄

Wie aus Tab. 2 ersichtlich, ist eine additive Zusammensetzung der Gesamtlöschkonstanten aus den isoliert gemessenen ionenspezifischen Konstanten gegebebn. Damit konnte bewiesen werden, daß die Löschbeiträge der einzelnen Ionen bzw. Stoffe unabhängig von der Anwesenheit anderer Löscher erfolgen bzw. sind.

Zur Simultanbestimmung der drei Halogenide wurden in drei 10-ml-Meßkolben jedesmal je 1 ml einer 1,00 · 10^-2 molaren KCl-, KBr- und KJ-Lösung pipettiert. Von den Indikatoren Chininsulfat, Acridin und Harman wurden in 1 N Schwefelsäure Lösungen bereitet und in jeden Kolben 1 ml von einer der drei Indikatorlösungen gegeben. Nach dem Auffüllen der Meßkolben wurde die (relative) Fluoreszenzintensität F der Proben gegen die Fluoreszenzintensität F⁰ der entsprechenden Standardlösungen (1 ml Indikatorlösung/ 10 ml Wasser) gemessen. Ihre Standardfluoreszenzintensität F⁰ wurde dabei auf 100 eingestellt und nach jeder Messung überprüft. Die für die einzelnen Indikatoren bestimmten Löschkonstanten sind in Tab. 3 angeführt.

Tabelle 3

Löschkonstanten für die Simultanbestimmung von Chlorid, Bromid und Jodid in homogener wäßriger Lösung

Die drei Meßwerte der relativen Fluoreszenzintensitäten F _A, F _B, F _C waren:

F _A = 64,3, F _B = 58,4 F _C = 81,8

Fkk = 100 (Standardfluoreszenzintensitäten)
α = (F/F _A)-1 = 0,55521
β = (F/F _B)-1 = 0,71233
γ = (F/F _C)-1 = 0,22249

Die Berechnung nach den Gleichungen (8) bis (10) ergibt:

Systemdeterminante= 7759322,2 Determinante bzw. Ko-Determinante 1= 7762,839 Determinante bzw. Ko-Determinante 2= 7786,451 Determinante bzw. Ko-Determinante 3= 7776.161

Zur Berechnung der i-ten Unbekannten wurde die i-te Spalte der Systemdeterminante durch die linke Seite der Gleichung (10) ersetzt.

Daraus ergeben sich die Konzentrationen der Halogenidlösungen zu:

[Cl⁻]= 1000 mM [Br⁻]= 1003 mM [J⁻]= 1002 mM

Die ermittelten Konzentrationen stimmen mit den tatsächlichen einpipettierten (1000 mM) sehr gut überein.

3. Beispiel

Gleichzeitige kontinuierliche Bestimmung von Sauerstoff und Halothan in einem Anästhesiegas.

Prinzip

Die Fluoreszenz gewisser aromatischer Kohlenwasserstoffe wird durch Sauerstoff und Halothan (ein Anästhesiegas) gelöscht.

In einer Meßanordnung, wie sie in vereinfachter Form in der Fig. 2 schematisch dargestellt ist, wurde die Fluoreszenzlöschung durch ein Gas gemessen, welches 20% Sauerstoff und 4,4% Halothan enthielt . Die Fluoreszenzindikatoren in den Sensorelementen 21 A und 21 B enthielten Lösungen von Decacyclen bzw. Benzo(ghi) perylen oder heterocyclischen Verbindungen in quervernetzten Silikonen bzw. Polyvinylchlorid mit hohem Weichmacheranteil. In Vorversuchen wurden, wie Fig. 4 zeigt, die Löschkonstanten ¹k _A (Löschung des Fluoreszenzindikators in Sensorelementen A durch den ersten Löscher O₂), ²k _A (Löschung des Fluoreszenzindikators im Sensorelement 21 A durch den zweiten Löscher Halothan), ¹k _B (Löschung des Fluoreszenzindikators im Sensorelement 21 B durch O₂) und ²k _B (Löschung des Fluoreszenzindikators im Sensorelement 21 B durch Halothan) experimentell bestimmt, und zwar nach Gleichung (1). In Fig. 4 sind auf der Abszisse die O₂- bzw. Halothankonzentrationen [Q₁], [Q₂] und auf der Ordinate der um 1 verminderten Quotient der Standard- und relativen Fluoreszenzintensität aufgetragen. Die Anstiege der gezeichneten Geraden entsprechen den Löschkonstanten des ersten Indikators für O₂ bzw. Halothan.

Die Löschkonstanten des ersten und zweiten Indikators sind in Tab. 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

Löschkonstanten von Fluoreszenzindikatoren mit aromatischen Kohlenwasserstoff durch Sauerstoff und Halothan

Folgende Meßwerte wurden erhalten:

F/F _A = 1,073; daher ist α gleich 0,073.
F/F _B n= 1180; daher ist β gleich 0,180.

Setzt man α, β und die Löschkonstanten der Tab. 4 in die Gleichungen (6) und (7) ein, so resultieren für die Konzentrationen von O² [Q₁] und Halothan [Q₂] die Werte 0,1999 bzw. 0,043, entsprechend einem Prozentsatz von 19,99 und 4,3%. Dies steht in hervorragender Übereinstimmung mit dem tatsächlichen Sauerstoff- bzw. Halothangehalt.

Claims

1. Verfahren zur fluorimetrischen Bestimmung der Konzentrationen oder von Konzentrationsverhältnissen von in einem Stoffgemisch enthaltenen Stoffen, mit Fluoreszenindikatoren, deren Fluoreszenzintensität von den zu bestimmenden Stoffen gemindert oder gelöscht wird und deren ungelöschte Fluoreszenzintensität bekannt ist, wobei zur gleichzeitigen Bestimmung der Konzentrationen an dem die Stoffe enthaltenden Stoffgemisch eine der Anzahl der zu bestimmenden Stoffkonzentrationen entsprechende Anzahl von Messungen der Fluoreszenzintensität vorgenommen wird, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein in bezug auf mindestens einen der zu bestimmenden Stoffe nicht spezifischer, von mehr als einem der Stoffe löschbarer Fluoreszenzindikator eingesetzt wird, der in bezug auf die ihn jeweils in seinen Intensitäten löschenden Stoffe (Löscher) verschiedene Löschkonstanten aufweist und daß die bekannten, ungelöschten Fluoreszenzintensitäten der eingesetzten Fluoreszenzindikatoren, die gemessenen gelöschten oder geminderten Fluoreszenzintensitäten und die bekannten oder vorab ermittelten Löschkonstanten zur Bestimmung der Konzentrationen der einzelnen Stoffe und/oder des Verhältnisses der Stoffkonzentrationen herangezogen werden.,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung der Konzentration von mindestens einem Stoff in Gegenwart von mindestens einem weiteren nicht interessierenden oder störenden Stoff, welcher die Fluoreszenzintensitäten der vorliegenden Fluoreszenzindikatoren ebenfalls löscht, auch die Fluoreszenzintensitäten bezüglich des mindestens einen störenden Stoffes wie die Fluoreszenzintensitäten bezüglich des mindestens einen zu bestimmenden Stoffes bestimmt werden und diese Fluoreszenzintensitäten zur Ermittlung der Konzentration des mindestens einen zu bestimmenden Stoffes herangezogen werden.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Falle eines von den zu bestimmenden Stoffen räumlich getrennt vorliegenden Fluoreszenzindikators, oder wenn der Fluoreszenzindikator und die zu bestimmenden Stoffe nicht in derselben Phase vorliegen, ein die Diffusion ermöglichender Kontakt zwischen den zu bestimmenden Stoffen und der Indikatorphase hergestellt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzindikatoren gleichzeitig dem Stoffgemisch mit den zu bestimmenden Stoffen zugegeben und vorzugsweise mit diesem vermischt werden oder mehreren einzelnen Stoffgemischen zugesetzt oder auf mehrere Indikatormembranen aufgebracht werden.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, mit einem Probenraum, in welchem das die zu bestimmenden Stoffe enthaltende Stoffgemisch untergebracht ist, welches mit einer der Anzahl der gleichzeitig zu bestimmenden Konzentrationen der Stoffe entsprechenden Anzahl von Fluoreszenzindikatoren, die in Sensorelementen angeordnet sind, mindestens indirekt in Kontakt steht, wobei die Fluoreszenzintensität der von einer Lichtquelle in den Fluoreszenzindikatoren angeregten Fluoreszenzstrahlung durch die zu bestimmenden Stoffe verringer- bzw. löschbar ist, sowie mit einer elektronischen Auswerteeinheit zur Ermittlung der Konzentrationen der einzelnen zu bestimmenden Stoffe aufgrund der den verringerten oder gelöschten Fluoreszenzintensitäten entsprechenden Signale der einzelnen Fluoreszenzindikatoren, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der in den Sensorlementen (21 A, 21 B, 21 C, . . .) angeordneten Fluoreszenzindikatoren ein in bezug auf mindestens einen der zu bestimmenden Stoffe nicht spezifisch ansprechender, von mehr als einem Stoff löschbarer Fluoreszenzindikator ist, und daß die Löschkonstanten dieses Fluoreszenzindikators für die ihn löschenden Stoffe jeweils unterschiedlich sind.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens in einem Teil der Sensorelemente (21 A, 21 B, 21 C . . .) derselbe Fluoreszenzindikator in jeweils verschiedener Lösung oder Bindung vorliegt und in verschiedener Lösung oder Bindung gegenüber den ihn löschenden Stoffen unterschiedliche Löschkonstanten besitzt.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Fluoreszenzindikatoren auf mehrere einzelne Stoffgemische oder auf mehrere Sensorelemente verteilt sind.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Probenraum (20) und den Sensorelementen (21 A, 21 B, 21 C, . . .) Reaktionsräume vorgesehen sind, in welchen durch chemische Reaktion löschende Stoffe in nichtlöschende oder in denen nichtlöschende Stoffe in löschende umwandelbar sind.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorelemente in der Spitze einer Meßsonde angeordnet sind, die in das die Stoffe enthaltende Stoffgemisch eintauschbar ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Sensorelemente und/ oder die Reaktionsräume und/oder permeationsselektive Membranen für die Fluoreszenzindikatoren in Reihe nebeneinander oder schichtförmig übereinander angeordnet sind.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Steigerung der optischen Selektivität und zur Rauschunterdrückung Lichtfilter (26, 27) in dem Strahlengang zwischen der Lichtquelle (22) und dem Probenraum und/oder zwischen dem Probenraum (20) und den Sensorelementen (21 A, 21 B, 21 C, . . .) vorgesehen sind.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Ausschaltung von Lichtquellenintensitätsschwankungen eine Referenzlichtmeßzelle (33) oder ein Referenzindikator im Strahlengang der Lichtquelle (22) steht, welche(r) mit der Auswerteeinheit (29) in Verbindung steht.