DE3401250A1

DE3401250A1 - Verfahren zur bestimmung von wasserstoffperoxid

Info

Publication number: DE3401250A1
Application number: DE19843401250
Authority: DE
Inventors: Barbara Dr. 6220 Rüdesheim Schöbel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-01-16
Filing date: 1984-01-16
Publication date: 1985-07-18

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON WASSERSTOFFPEROXID
Gegenstand der Erfindung sind die in den Ansprüchen gekennzeichneten Verfahren und diagnostischen Reagenzien zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid bzw.
von unter Wasserstoffperoxidbildung reagierenden Substanzen sowie von Peroxidase und peroxidatisch wirkenden Stoffen. Es ist bekannt, daß Wasserstoffperoxid mit Hilfe oxidativer Kupplungsreaktionen, die zu gefärbten Produkten führen, und einer Peroxidase kolorimetrisch bestimmt werden kann. Beispiele hierfür sind: Phenol + 4-Aminophenazon Gochman et al.Clin.Chem. 18, 1972,S.943; 4-Axinophenazon + 3,5-Dichlor-2-hydroxibenzolsulfonsäure, Trinder, Analyst Vol. 97,1972,S.
142; 3-Methyl-N-ethyl-N- (ß-hydroxiethyl) -aminophenyl + 4-Aminophenazon, WAKO FINE CHEM. CA 90:P148115v, CA 91:P86918u. Diesen Reaktionen gemeinsam ist der mehr oder weniger ausgeprägte Nachteil, daß die vereinigten Lösungen der beiden Reaktionspartner bereits langsam eine spontane Farbbildung zeigen. Es müssen daher stets frische Mischungen angesetzt werden und/oder Reagenzienleerwerte stets mit gemessen werden. Bei der Überprüfung derartiger Kupplungsreaktionen konnte nun überraschenderweise festgestellt werden, daß die Verwendung von einfachen N-alkylierten Anilinen gegenüber den beschriebenen Reaktionen von Phenolen oder Ringalkylierten N-Alkyl-N-hydroxialkyl-anilinen mit einem 4-Aminophenazon zu keiner spontanen Farbbildung führt. Die vereinigten Reaktionspartner N-alkyliertes Anilin plus ein 4-Aminophenazon sind in Lösung sogar bei Zimmertemperatur mehrere Wochen haltbar, ohne daß die geringste spontane Farbentwicklung zu beobachten ist. Bei diagnostischen Tests kann daher eine Fertigreagenzlösung verwendet werden ohne daß zusätzliche Reagenzienleerwerte erforderlich sind. Ein weiterer Vorteil des aus den beiden Reaktionspartnern I und II gebildeten Chinoniminfarbstoffe ist neben der ausgezeichneten Stabilität das zum langwelligen Spektralbereich verschobene Absorptionsmaximum bei 560 nm. Die angeführten bekannten Reaktionen ergeben Farbstoffe mit Absortionsmaxima zwischen 505 und 545 nm. Damit sind Tests mit dem erfindungsgemäßen Farbstoff weniger störanfällig genüber Trübungen oder Bilirubin und Haemogibin in den Proben.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Reagenzien sind in den folgenden Beispielen näher erläutert: Beispiel 1 Harnsäurebestimmung Zu 2 ml einer Lösung von 0,5 mmol 4-Aminophenazon (4-Amino-1-phenyl-2,3,-dimethyl-pyrazolon-(5) )/l, 0,5 mmol N,N-Diethylanilin/l, 0,01% EDTA-Na2, 500 U Peroxidase/l und 1000 U Uricase/l in 0,1 mol Trispuffer/l pH 7,6 werden 0,04 ml der zu untersuchenden Probelösung gegeben. Bereits nach 3 Minuten hat sich eine stabile bläuliche Färbung gebildet. Diese ist der vorhandenen Harnsäuremenge proportional und wird im Photometer bei 560 nm oder Hg 546 oder Hg 578 Filter gemessen. Die Harnsäurekonzentration beträgt Extinktion bei 560 nm X 72,0 (mg/dl) oder Extinktion bei Hg 578 X 84,7 (mg/dl).
Beispiel 2 Cholesterinbestimmung Zu 2 ml einer Lösung von 0,3 mmol 4-Amino-1-phenyl-3-methyl-pyrazolon- (5)/l, 0,4 mmol N,N-Dibutylanilin/l, 0,02% ß-Thioglycol, 0,01% NaN3, 300 U Peroxidase, 800 U Cholesterinesteresterase und 800 U Cholesterinoxidase -jeweils pro Liter - in 0,1 mol Phosphatpuffer/l pH 7,2 werden 0,01 ml der Probe pipettiert. Nach 5 Minuten kann der Extinktionsendwert am Photometer bestimmt werden.
Die Auswertung erfolgt mit einer Standardlösung.

Claims

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON WASSERSTOFFPEROXID Patentansprüche 9 erfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid bzw. von unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagierenden sowie peroxidatisch wirksamen Substanzen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß Wasserstoffperoxid mit einem Reagenz bestehend aus einem N-Alkyl-anilin der allgemeinen Formel I (R1= H oder niedere Alkylgruppe, R2= niedere Alkylgruppe) und einem 4-Amino-1-phenyl-pyrazolon-(5) der allgemeinen Formel II Phenyl R zu° II R4 -NH2

(R3=H oder niedere Alkylgruppe, R4=H oder niedere Alkylgruppe) kolorimetrisch nachgewiesen wird.
2.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionspartner der allgemeinen Formel I und II als Salze organischer oder anorganischer Säuren eingesetzt werden.
3.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die beiden Reaktionspartner I und II vorzugsweise in Konzentrationen von 0,1-2 mmol/l verwendet werden.
4.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Stabilisatoren wie Chelatbildner (z.B. EDTA-Na2), Metallazide (z.B.NaN3) oder Thioglycole (z.B. ß-Thioglycol) zugesetzt werden.
5.Reagenz zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid bzw.

von unter Wasserstoffperoxidbildung reagierenden Stoffen, bestehend aus einer wässrigen Lösung von Peroxidase oder einer peroxidatisch wirkenden Substanz und einer Reagenzlösung, dadurch gekennzeichnet, daß als Reagenz eine Mischung einer Verbindung der allgemeinen Formel I mit einer Verbindung der allgemeinen Formel II verwendet wird.