DE3601686C2 - - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft eine chemische Zusammensetzung zum
Nachweis von auf Peroxid wirkenden Enzymen.
Die Enzymassays nutzen die Aktivität verschiedener
Enzyme auf Peroxide, die nach den folgenden allgemeinen
Reaktionsgleichungen ablaufen:
Enzym + ROOH → C + ROH (I)
C + AH₂ → Enzym + H₂O + A (II)
wobei C für die Enzymradikal-Sauerstoffkomponente und A
für einen chromogenen Stoff steht, der seine Farbe aufgrund
des Verlustes der Wasserstoffatome ändert.
Das Enzym kann ein beliebiges auf Peroxid wirkendes Enzym
sein, wie beispielsweise (aber nicht im einschränkenden
Sinne): Peroxidase, Katalase und
Myeloperoxidase. Im folgenden wird der Einfachheit halber
Peroxidase als ein repräsentatives Enzym verwandt.
Beispiele für chromogene Stoffe sind:
Chloronaphthol, Benzidin, Tetramethylbenzidin,
3-Amino-9-Äthylcarbazol, Dichloronaphthol,
Dibromonaphthol, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid,
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-(Dihydrochlorid-Dihydrat),
3-Methylbenzothiazol-2,
1-Hydrazon, Parahydroxyphenol-Essigsäure,
2,2′-Azino-Di-(3-Äthylbenzothiazolin-Sulfonsäure),
5-Aminosalizylsäure, Guajakol, o-Tolidin, Pyrogallol.
Beispiele für häufig angewandte Assays werden nachfolgend
kurz beschrieben.
In diesem Test wird einem auf Spuren eines bestimmten
Antigens zu untersuchenden Medium der entsprechende unlösliche
Antikörper, nämlich ein Peroxidase-Konjugierter
Antikörper, zugefügt. Nach Waschen wird ein H₂O₂-haltiges
Substrat und ein chromogener Stoff hinzugefügt. In Gegenwart
des getesteten Antigens wird der Peroxidase-Konjugierte
Antikörper an das Antigen gebunden. Die Zugabe
des Substrats bewirkt die Zersetzung des H₂O₂ durch die
Peroxidase unter Farbentwicklung.
Diese Methode setzt ein Antigen, ein Anti-Antigen und
ein Konjugat aus Peroxidase-konjugiertem Antikörper
Anti-Antikörper Anti-Antigen ein. Die Peroxidase wird
gebunden und es entwickelt sich wie oben Farbe bei Zugabe
des Substrates.
Diese Methode verwendet die Wechselbindung (reciprocal
bonding) der folgenden Mittel: Antigen, Anti-Antigen
(produziert in Kaninchen), Ziegen-Antikaninchen IgG und
Peroxidase-Antiperoxidase (Antiperoxidase produziert in
Kaninchen). Die Bindung der Peroxidase wird wieder erhalten,
welche zu einer Farbentwicklung bei Zugabe des
Substrates führt.
Zusätzlich zu den aufgeführten Assays werden andere
Extrazellulärtests durchgeführt, beispielsweise zum
Nachweis einer enzymatischen Aktivität in einem vorgegebenen
Medium. In diesen Fällen wird das Substrat
direkt dem enzymhaltigen Medium zugegeben und Enzymaktivität/-Konzentration
wird anhand der Intensität der
erzeugten Farbe abgelesen.
Obige und ähnliche Assays sind heutzutage für eine ganze
Palette klinischer Tests in Anwendung. Die Anwendung
dieser Methoden wird jedoch dadurch entscheidend erschwert,
daß frische Substratlösung kurz vor ihrer Anwendung
vorbereitet werden muß, da chromogene Stoffe
und Peroxide nicht über längere Zeitspannen nebeneinander
bestehen können, weil eine spontane Farbentwicklung aufgrund
der Zersetzung des Peroxides eintritt, wodurch ein
Sauerstoffradikal entsteht. Diese Zersetzung findet sehr
leicht unter Einfluß von Licht, Metallionen, Verunreinigungen
etc. statt. Ein derartig spontan reagiertes
Substrat kann für einen zuverlässigen Test nicht verwendet
werden und muß ersetzt werden.
Als Stand der Technik sei noch auf die US-Patente 42 78 439, 41 48 611
und 40 71 317 verwiesen.
Hieraus ist die Anwendung chromogener Verbindungen bekannt und daß
bestimmte Lösungsmittel wie Dimethylsulfen, Dimethylsulfoxid oder
N,N-Dimethylformamid die Stabilität und Sensitivität derartiger
Kompositionen verbessern.
Demzufolge ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
eine Zusammensetzung anzugeben,
in der Substrate verwendet werden, die bereit zur
Anwendung gelagert werden können, ohne dabei zu verderben,
und dadurch alle Tests, die diese Stoffe einsetzen, zu
vereinfachen und zu beschleunigen.
Gelöst wird diese Aufgabe mit den im Anspruch 1 angegebenen
Merkmalen.
Vorzugsweise Weiterbildungen ergeben sich aus den
Unteransprüchen.
Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, ein Verfahren
zur Durchführung von Enzymassays anzuwenden, das stabile
Lösungen aus chromogenen Stoffen und Peroxiden verwendet.
Es gelten dabei spezielle Anforderungen an die Zusammensetzung
und die übrigen Bedingungen, wenn diese Lösungen
erfindungsgemäß als Substrate in biologischen Tests
verwendet werden, je nachdem, ob die Tests intrazellulär
oder extrazellulär durchgeführt werden. Insbesondere
hat sich gezeigt, daß bei Ausführung intrazellulärer
Assays die Mengenverhältnisse zwischen dem organischen
Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung in einem bestimmten
Bereich liegen müssen, damit verwertbare Farbreaktionen
ablaufen. Der Bereich ist bei intrazellulären
Tests wesentlich enger als bei extrazellulären Tests.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im einzelnen
darin, das auf Enzymhaltigkeit zu testende Medium mit
einer Zusammensetzung in Berührung zu bringen, die
- a) eine chromogene Verbindung,
- b) ein Peroxid,
- c) ein wassermischbares, organisches Lösungsmittel,
- d) ein wäßriges Lösungsmittel oder eine Pufferlösung und
- e) eine Verbindung mit der allgemeinen Formel
wobei
jedes der R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander
Wasserstoff, Hydroxy, CF₃, Halogen, Nitro, SO₂OH, NHCH₂,
CH₂NH₂ oder ein unteres Alkyl sein können und X Stickstoff,
Sauerstoff, Kohlenstoff- oder Schwefel ist,
oder eine Verbindung mit der Formel: wobei R₅, R₅′, R₆ und R₆′ jeweils Wasserstoff, ein unteres Alkenyl, -NH₂, Phenyl wahlweise substituiert, -NO₂, Halogen, -OCH₃, Hydroxy, COOC₆H₅, COOH, CH₂COOH oder SO₂OH sein können,
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₇ und R₈ jeweils Hydroxy oder ein unteres Alkenyl sein können, R₉ Alkenyl ist und R₁₀ eine Azulengruppe ist, wahlweise substituiert mit einer oder mehreren geraden oder verzweigten Alkylgruppen C₁-C₁₀,
oder eine Verbindung mit der Formel: wobei Y und Z jeweils Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel sein können und R₁₁ Wasserstoff oder Hydroxyphenyl ist,
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy oder ein unteres Alkyl sein können,
oder ein Salz einer der Verbindungen (I), (II), (III), (IV) oder (V) enthält
und danach zu prüfen, ob eine Farbentwicklung stattfindet.
Das wassermischbare organische Lösungsmittel hat vorzugsweise
ein Gasphasen-Dipolmoment von größer oder gleich
1.60 D.
Einer bevorzugten Ausführungsform zufolge wird das Enzym
ausgewählt unter Peroxidase, Katalase
und Myeloperoxidase.
Das Verfahren kann sinnvoll in intrazellulären Assays,
d. h. wenn das Assay ein IPA oder PAP ist, durchgeführt
werden. Einer bevorzugten Ausführungsform gemäß kann es
auch in einem extrazellulären enzymatischen Aktivitätstest,
d. h. in einem EIA angewendet werden.
Wenn das Assay ein intrazelluläres Assay ist, liegt das
Verhältnis zwischen dem organischen Lösungsmittel und
der wäßrigen Lösung bevorzugt zwischen 45 : 55 und 25 : 75,
vorzugsweise bei 35 : 65 Volumenprozent.
Wenn das Assay ein extrazelluläres Assay ist, liegt das
Verhältnis zwischen dem organischen Lösungmittel und der
wäßrigen Lösung bevorzugt zwischen 80 : 20 und 20 : 80 Volumenprozent.
Es hat sich gezeigt, daß sowohl in intrazellulären
als auch in extrazellulären Assays Dimethylsulfoxid
besonders geeignet als organisches Lösungsmittel
ist.
Die chemische Zusammensetzung zur Durchführung des Verfahrens
ist dadurch gekennzeichnet, daß es
- a) eine chromogene Verbindung,
- b) ein Peroxid,
- c) ein wassermischbares organisches Lösungsmittel,
- d) ein wäßriges Lösungsmittel oder eine Pufferlösung, und
- e) eine Verbindung mit der allgemeinen Formel (I), (II), (III), (IV) oder (V) oder ein Salz dieser Verbindungen enthält.
Die Zusammensetzung kann in der wäßrigen Lösung außerdem
0 bis 5000 ppm chelatierende Mittel enthalten. Diese
sind vorzugsweise ausgewählt aus Pyrophosphat, Acetanilid,
Citrat oder 8-Hydroxichinolin, entweder für sich oder
als Gemisch zweier oder mehrerer solcher chelatierender
Mittel.
In einer bevorzugten Mischung enthält die Zusammensetzung:
0 bis 200 ppm Pyrophosphat
0 bis 200 ppm Acetanilid
0 bis 1000 ppm Citrat
0 bis 2000 ppm 8-Hydroxychinolin oder ein Semi-Sulfatsalz davon.
0 bis 200 ppm Pyrophosphat
0 bis 200 ppm Acetanilid
0 bis 1000 ppm Citrat
0 bis 2000 ppm 8-Hydroxychinolin oder ein Semi-Sulfatsalz davon.
Das wassermischbare organische Lösungsmittel hat vorzugsweise
ein Dipolmoment größer oder gleich 1.6 D. Es wird
vorzugsweise ausgewählt aus Methanol, Äthanol, Dioxan,
Dimethylsulfoxid, Sulfolan, Dimethylsulfon, Hexamethylphosphor-Triamid
oder Dimethylformamid.
Die Verbindung mit der Formel (I) wird vorzugsweise ausgewählt
aus 8-Hydroxichinolin, 4-Chloro-7-(Trifluoromethyl),
Chinolin, 5-Chloro-7-Jodo-8-Hydroxichinolin,
5-Chloro-8-Hydroxichinolin oder aus Kupfer- oder Semi-Sulfatsalz
des 8-Hydroxichinolins.
Die Verwendung mit der Formel (II) ist vorzugsweise
4-Anilinosulfonsäure und die Verbindung mit der Formel
(III) ist vorzugsweise Colecalciferol.
Der Puffer ist vorzugsweise ausgewählt aus Phosphatpuffer
(PB), Trispuffer (Hydroxymethyl-Aminomethan),
Boratpuffer und Glycinpuffer.
Die chromogene Verbindung wird vorzugsweise ausgewählt
aus: Chloronaphthol, Benzidin, Tetramethylbenzidin,
3-Amino-9-Äthylcarbazol, Dichloronaphthol, Dibromonaphthol,
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid,
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin(Dihydrochlorid-Dihydrat),
3-Methylbenzothiazol-2, 1-Hydrazon, Parahydroxiphenyl-Essigsäure,
2,2′-Azino-Di(3-Äthylbenzothiazolinsulfonsäure),
Aminoantipyrin/phenol, o-Dianizidin, o-Toluidin,
5-Aminosalizylsäure, Guajakol, Pyrogallol, o-Tolidin.
Vorzugsweise liegt das Mengenverhältnis zwischen dem
organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung in
einer Anwendungsform zwischen 45 : 55 und 25 : 75 Volumenprozent,
am besten bei 35 : 65 Volumenprozent.
Weiterhin liegt das Mengenverhältnis zwischen dem organischen
Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung in
einer anderen Anwendungsform vorzugsweise zwischen 80 : 20
und 20 : 80 Volumenprozent.
Der pH-Wert der genannten Zusammensetzungen sollte
zwischen 7 und 8, vorzugsweise bei 7,6 liegen.
Die Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden
nachfolgend anhand von Beispielen erläutert, die erläuternd,
aber nicht einschränkend aufzufassen sind.
Diese Beispiele illustrieren die intrazelläre/extrazelluläre
Wirkung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.
Verschiedene Zusammensetzungen wurden unter Verwendung
von Dimethylsulfoxid (DMSO) als das organische Lösungsmittel
sowie von Trispuffer hergestellt, und deren
volumetrischen Verhältnisse wurden variiert. Alle Zusammensetzungen
enthielten die folgenden Stoffe:
100 mg 8-Hydrochinolin-Semi-Sulfatsalz, 500 mg 4-Chloro-1-Naphthol, destilliertes Wasser, 80 mg Acetanilid, 80 mg Pyrophosphat und 800 mg Citrat. Die Gesamtmenge von Wasser und DMSO betrug 1 Liter.
100 mg 8-Hydrochinolin-Semi-Sulfatsalz, 500 mg 4-Chloro-1-Naphthol, destilliertes Wasser, 80 mg Acetanilid, 80 mg Pyrophosphat und 800 mg Citrat. Die Gesamtmenge von Wasser und DMSO betrug 1 Liter.
Die daraus resultierenden Zusammensetzungen wurden über
einen Monat hinweg gelagert und dann zu Vergleichstests
zum Nachweis von Peroxidase sowohl in zellulär gebundener
Form, als auch in freier Lösung (Meerrettich) herangezogen.
Die Ergebnisse dieser Tests sind, als relative Färbungen
angegeben, in Tabelle 1 aufgeführt.
Ein EIA-Test wurde für den Nachweis menschlichen chlorionischen
Gonadotropins durchgeführt unter Anwendung von
4-Aminoantipyrin/phenol als Chromogen und einer Zusammensetzung
ähnlich jener der vorangegangenen Beispiele mit
einem DMSO-Gehalt von 35%.
Auf die Anwendung des Substrates hin entwickelte sich
eine rosafarbene Färbung. Der Gehalt an gebundener
Peroxidase wurde mit Hilfe der Spektralphotometrie
bei 510 nm bestimmt.
Der Test aus Beispiel 16 wurde mit o-Dianizidin als
Chromogen und einem DMSO-Gehalt von 30% wiederholt.
Färbung trat ein und wurde bei 400 nm abgelesen.
Der Test aus Beispiel 16 wurde mit 5-Aminosalizylsäure
als Chromogen wiederholt. Die Konzentration wurde durch
Bestimmung der Absorptionsfähigkeit bei 540 nm ermittelt.
Es wurde ein IPA-Test zur Bestimmung von Chlamydia
Trachomatis mit einer ähnlichen Zusammensetzung wie in
den Beispielen 1-15 mit einem DMF-Gehalt von 35% durchgeführt.
Als Chromogen diente 4-Chloro-1-Naphthol. Bei
Zugabe des Substrates wurde ein unlöslicher ultramarineblauer
Komplex erhalten.
Ein PAP-Test wurde mit einem DMSO-Gehalt von 25% und
4-Chloro-1-Naphthol als Chromogen zur Bestimmung von Epstein
Bar durchgeführt. Bei Zugabe des Substrates wurde ein
unlöslicher ultramarineblauer Komplex erhalten.
Es wurde eine Lösung getestet, um den Gehalt von Peroxidase,
produziert von Meerrettich, zu bestimmen. Drei
unterschiedliche Tests unter Anwendung von Äthanol als
Lösungsmittel mit einem Gehalt von 65%, bezogen auf den
Puffer und 4-Chloro-1-Naphthol, o-Dianizidin und Guajakol
als die drei verschiedenen Chromogene wurden vorgenommen.
Alle drei Tests ergaben vergleichbare Ergebnisse.
Alle beschriebenen Beispiele wurden mit frischen und
mit wochenlang "tisch-gelagerten" (desk-stored) Substraten
durchgeführt. Es wurden dabei keine feststellbaren
Unterschiede in den Ergebnissen mit den frisch hergestellten
Zusammensetzungen einerseits und mit den Wochen
vorher hergestellten Zusammensetzungen andererseits ermittelt.
Claims (17)
1. Chemische Zusammensetzung zum Nachweis von auf Peroxid
wirkenden Enzymen, die
- a) eine chromogene Verbindung,
- b) ein Peroxid,
- 2c) ein wassermischbares organisches Lösungsmittel,
- d) ein wäßriges Lösungsmittel oder eine Pufferlösung und
- e) eine weitere Komponente enthält,
dadurch gekennzeichnet,
daß diese Komponente eine Verbindung der allgemeinen Formel
wobei
R₅, R₅′, R₆ und R₆′ jeweils Wasserstoff, ein unteres
Alkenyl, -NH₂, wahlweise substituiertes Phenyl,
-NO₂, Halogen, -OCH₃, Hydroxy, COOC₆H₅, COOH,
CH₂COOH oder SO₂OH sein können,
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₇ und R₈ jeweils Hydroxy oder ein unteres Alkenyl sein können, R₉ ein Alkenyl ist und R₁₀ eine Azulengruppe, wahlweise mit einer oder mehreren geraden oder verzweigten Alkylgruppen von C₁-C₁₀ substituiert ist,
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy oder ein unteres Alkyl sein können,
oder ein Salz einer der Verbindungen (I), (II) oder (III) ist.
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₇ und R₈ jeweils Hydroxy oder ein unteres Alkenyl sein können, R₉ ein Alkenyl ist und R₁₀ eine Azulengruppe, wahlweise mit einer oder mehreren geraden oder verzweigten Alkylgruppen von C₁-C₁₀ substituiert ist,
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy oder ein unteres Alkyl sein können,
oder ein Salz einer der Verbindungen (I), (II) oder (III) ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das wasserlösliche organische Lösungsmittel ein
Gasphasen-Dipolmoment von größer oder gleich 1.60 D
aufweist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die wäßrige Lösung 0 bis 5000 ppm
chelatierender Mittel enthält.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die chelatierenden Mittel ausgewählt sind aus Pyrophosphat,
Acetanilid, Citrat oder 8-Hydroxichinolin,
entweder für sich oder als Gemisch zweier oder mehrerer
solcher chelatinierender Mittel.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß es
0 bis 200 ppm Pyrophosphat,
0 bis 200 ppm Acetanilid,
0 bis 1000 ppm Citrat,
0 bis 2000 ppm 8-Hydroxichinolin oder ein Semi-Sulfatsalz davon enthält.
0 bis 200 ppm Pyrophosphat,
0 bis 200 ppm Acetanilid,
0 bis 1000 ppm Citrat,
0 bis 2000 ppm 8-Hydroxichinolin oder ein Semi-Sulfatsalz davon enthält.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel
ausgewählt ist aus Methanol, Äthanol, Dioxan,
Dimethyl-Sulfoxid, Sulfolan, Dimethylsulfon, Hexamethylphosphor-Triamid
oder Dimethylformamid.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit der
Formel (I) ausgewählt ist aus 8-Hydroxichinolin,
4-Chloro-7-(Trifluoromethyl), Chinolin,
5-Chloro-7-Jodo-8-Hydroxichinolin, Chlorohydroxichinolin,
5-Chloro-8-Hydroxichinolin oder aus Kupfer-
oder Semi-Sulfatsalz des 8-Hydroxichinolins.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit der
Formel (II) 4-Anilinosulfonsäure ist.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit der
Formel (III) Colecaliferol ist.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ausgewählt
ist aus Phosphatpuffer, Trispuffer (Hydroximethyl-Aminomethan),
Boratpuffer und Glycinpuffer.
11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung
ausgewählt ist aus:
Chloronaphthol, Benzidin, Tetramethylbenzidin,
3-Amino-9-Äthylcarbazol, Dichlornaphthol, Dibromonaphthol,
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid,
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin oder
(Dihydrochlorid-Dihydrat), 3-Methylbenzothiazol-2,
1-Hydrazon, Parahydroxyphenyl-Essigsäure, 2,2′-Azino-Di
(3-Äthylbenzothiazolinsulfonsäure), 4-Aminoantipyril/phenol,
o-Dianizidin, o-Toluidin, 5-Aminosalizylsäure,
Guajakol, o-Tolidin, Pyrogallol.
12. Zusammensetzung
nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß das Mengenverhältnis zwischen dem organischen
Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung zwischen 45 : 55
und 25 : 75 Volumenprozent liegt.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
daß das Mengenverhältnis zwischen dem organischen
Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung etwa bei
35 : 65 Volumenprozent liegt.
14. Zusammensetzung nach
Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mengenverhältnis
zwischen dem organischen Lösungsmittel
und der wäßrigen Lösung zwischen 80 : 20 und 20 : 80
Volumenprozent liegt.
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß ihr pH-Wert zwischen
7 und 8 liegt.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß der pH-Wert etwa 7,6 beträgt.
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