DE3390432T1

DE3390432T1 - Verfahren zur volumetrischen Differenzierung von Leukozyten

Info

Publication number: DE3390432T1
Application number: DE19833390432
Authority: DE
Inventors: James H. Fort Lauderdale Fla. Carter; Harold R. Pembrooke Pines Fla. Crews; Stephen L. Hialeah Fla. Ledis; Ted Miami Fla. Sena
Original assignee: Coulter Electronics Inc Hialeah Fla; Coulter Electronics Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1983-01-03
Filing date: 1983-12-15
Publication date: 1985-04-04
Also published as: JPS60500097A; ES8407590A1; EP0131020A1; AU570943B2; EP0131020B2; EP0131020B1; WO1984002777A1; AU2413484A; DE3390432C2; ES528523A0; US4485175A; EP0131020A4

Description

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Verfahren zur volumetrischen Differenzierung von Leukozyten

Die Erfindung bezieht sich auf eine Methodik und ein Reagenz-System zur Volumendifferenzierung von wenigstens zwei Leukozyten-Populationen, insbesondere auf die Klassifizierung und das Zählen von wenigstens drei Leukozyten-Populationen, nämlich (1) einer Lymphozyten-Population,

(2) einer Monozyten-Population und (3) einer Granulozyten-Population, welche Neutrophile, Eosinophile und Basophile umfaßt, und zwar unter Verwendung des automatischen Blutzählgerätes Coulter Counter Model S Plus (Coulter Counter ist ein eingetragenes Warenzeichen von Coulter Electronics Inc.).

Diese Daten sind für Reihenuntersuchungen geeignet, die die Aufmerksamkeit auf abnormale Leukozyten-Verhältnisse lenken. Abnormale Situationen, die durch diese Methode identifiziert werden, liefern Informationen von diagnostischer Bedeutung und rufen beim Techniker ein Bedürfnis nach weiteren Untersuchungen hervor.

Die Trennung von normalen menschlichen Leukozyten durch Volumenverteilung unter Verwendung des Prinzips des Zählens und der Größenbestimmung, die in den Coulter Counter Instrumenten angewendet wird, wird nun als klinische
Diagnose-Methode eingesetzt. Diese Methode basiert auf der grundlegenden Eigenschaft aller lebenden Zellen, eine gO bestimmte Größe und Form aufrechtzuerhalten. Jeder Zellentyp im zirkulierenden Blut hat sein eigenes charakteristisches Volumen, das von einem kleinen Volumen von drei
Kubikmikron, d.h. 3 Fl, für Blutplättchen bis 650 fL für
polymorphonukleare Zellen reicht. Die fortgeschrittenen gg Coulter Counter Instrumente sind so ausgelegt, daß sie von dieser Volumendifferenz zum Zählen und zur Bestimmung der Größenverteilung der Blutplättchen, Leukozyten und Erythrozyten Gebrauch machen, um pathologische Stadien

festzustellen und zu erfassen.

Erythrozyten und lymphoide Leukozyten überlappen sich jedoch nachteiligerweise hinsichtlich der Zellgröße, so daß es nicht praktisch ist, die einen in Gegenwart der anderen durch Größen-Diskriminierung allein zu zählen. Nach der herkömmlichen Praxis wird daher ein starkes auflösendes , oberflächenaktives Reagenz verwendet, das die
Erythrozyten stromatolysiert, sie zu sehr kleinen Teilchen zerkleinert oder zu einer Membranauflösung führt, wobei das Zytoplasma sowohl von den lymphoiden wie von den
myeloiden Leukozyten abgestreift wird, so daß lediglich der gegenüber einer Auflösung resistente Kern übrigbleibt, der gezählt wird. Da das ursprüngliche Zellvolumen erheblieh beeinträchtigt und auf ein Minimum reduziert wird, ist bei der üblichen Größenverteilüngs-Analyse lediglich eine einzige Leukozyten-Population sichtbar.

Das automatische Blutzell-Zählgerät Coulter Gounter Model S Plus ist ausgelegt, um die Probe des Gesamtblutes in einem isotonischen Verdünnungsmittel zu verdünnen, ein auflösendes Reagenz hinzugeben und kurz danach mit dem Zählen zu beginnen. Ein verdünnendes, auflösendes System muß daher eine Erythrozyten auflösende Kinetik besitzen, die ausreichend schnell ist, tun eine vollständige Stromatolysierung der roten Blutzellen (Erythrozyten) während der Auflöseperiode zu bewirken. Darüberhinaus muß die
Änderung des Leukozyten-Volumens minimal während der Stufe des Sammelns der Daten sein, wobei es im IdealfaÜ· einige Minuten stabil sein sollte. Das Reagenz-System muß gleichfalls die Integrität der Erythrozyten- und Blutplättchen-Zahl und die Größenverteilung, das Hämoglobin-Absorptions-Spektrum und die gesamte Leukozyten-Zählung unangetastet lassen. Durch Fingeranstechen gewonnenes Blut muß

mindestens zwei Stunden stabil sein, wenn es mit dem isotonischen Verdünnungsmittel vorverdünnt worden ist.

In der US-Patentschrift 3 874 852 ist eine Formulierung

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für eine Zusammensetzung enthalten, die ein quaternäres Ammoniumsalz-Detergenz und Kaliumcyanid enthält und als auflösendes und Chromagen bildendes Reagenz eingesetzt wird, um eine einzige Volumen-Leukozyten-Zählung und eine Hämoglobin-Bestimmung zu erhalten.

Nach der US-Patentschrift 4 286 963 enthält ein auflösendes Verdünnungsmittel zur schnellen Auflösung roter Blutzellen im Gesamtblut zur Durchführung einer differentiellen Bestimmung von lymphoiden/myeloiden Populationen von Leukozyten sowie zur Bestimmung von Hämoglobin durch
Chromagen-Bildung ein Gemisch aus einer wässrigen Salzlösung von wenigstens einem quaternären Ammoniumsalz, das oberflächenaktive Eigenschaften aufweist, sowie bestimmten Additiven, wie 2-Phenoxyethanol.

In der US-Patentschrift 4 346 018 wird ein isotonisches Vielzweck-Blutverdünnungsmittel und ein Verfahren zur Herstellung dieses Verdünnungsmittels mit. einem auflösenden Reagenz-System zur differentiellen Zweivolumen-BeStimmung von lymphoiden/myeloiden Populationen von Leukozyten beschrieben.

Um eine Analyse der drei Volumen-Populationen von Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten-Zellen im Blut zu erhalten, muß das Leukozyten-Volumen-Histogramm sauber getrennte Populationen mit wenig zellulären Bruchstücken zeigen, wobei die Minima bis nahe an die Grundlinie gehen können. Die Integration jeder Population gibt die relative Anzahl der Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten-Zellen an. Es ist gezeigt worden, daß die lymphoide Population
Lymphozyten und kleine atypische Lymphozyten enthält, während die myeloide Population zwei Untergruppen enthält, die Monozyten und die Granulozyten. Die Granulozyten umfassen Neutrophile, Eosinophile und Basophile.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, um eine Gesamtblutprobe einem Reagenz-System auszusetzen,.

um wenigstens eine volumetrische Differenzierung von Mpnozyten- und Granulozyten-Populationen zu erreichen. Durch die Erfindung wird tatsächlich ein Verfahren zur Klassifizierung und zum Zählen von drei Leukozyten-Populationen bereitgestellt, nämlich von Lymphozyten^, Monozyten- und Granulozyten-Populationen, insbesondere in automatischen Teilchen-Zählsystemen, wie dem automatischen Coulter
Counter Model S Plus, und zwar bei lediglich geringfügig modifizierter Programmierung und bei einer Leukozyten-Größe-Kanalbildungsfähigkeit.

Das Verfahren umfaßt eine Methode zur volumometrisehen Differenzierung von wenigstens Monozyten- und Granulozyten-Populationen, die mit einer Gesamtblutprobe erhalten werden, wobei das Verfahren durch folgende Stufen gekennzeichnet ist: Die Gesamtblutprobe und das auflösende
Reagenz werden zugeführt und die Gesamtblutprobe wird mit dem auflösenden Reagenz in einem vorgegebenen Gesamtvolumen vermischt, und zwar in einer Art und Weise, daß ein einen niedrigen Gradienten aufweisender auflösender Stoß entsteht, wodurch die volumetrische Modifizierung der einzelnen Blutzellen von wenigstens einer der Populationen der Monozyten und Granulozyten während einer beträchtlichen Zeitspanne erfolgt, so daß die voluitiometrische

Differenzierung dieser Populationen möglich ist.

Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagenz-System umfaßt ein Mehrzweck-isotonisches Blutverdünnungsmittel, das ein Gemisch aus organischen Pufferstoffen, Zellmembran stabilisierenden Stoffen und keimtötenden Stoffen enthält, wobei die Endvolumen^Konzentration und die gesamte Menge desselben dazu dienen, die Auflöse-Kinetik des auflösenden Reagenzes auf die Leukozyten zu verlangsamen und eine differentielle Volumenreduktion zu

gg erhalten, während die herkömmlichen Hämogramm-Parameter stabilisiert werden■.

Das auflösende Reagenz, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren am besten geeignet ist, ist ein Gemisch aus einer

wässrigen Lösung quaternärer Ammoniumsalze mit oberflächenaktiven Eigenschaften, und zwar mit einem Volumen-Konzentrationsbereich und in einer Gesamtmenge, die wirksam ist, um drei Leukozyten-Volumen-Histogramme zu ergeben. Das auflösende Reagenz ist hypotonisch und neigt deshalb dazu, der Schrumpfung der myeloiden Zellen zu begegnen, welche Schrumpfung bestens bekannt ist. Die Daten werden mit einer Coulter Counter Standard-Einrichtung in Verbindung mit einem Coulter Channelyzer und einem X-Y-Schreiber erhalten.

Hilfsrechen-Einrichtungen und Datenverarbeitungsgeräte sind für eine vollständige Automatisierung erwünscht, jedoch nicht notwendig, um die Messungen durchzuführen.

Bei einer bevorzugten kommerziellen Ausführungsform der Erfindung wird ein Alkalimetallcyanid als Chromagen bildendes Reagenz hinzugefügt. Andere Chromagen bildende
Reagenzien, wie Drabkin's Reagenz, welches Kaliumferricyanid, Kaliumcyanid und Natriumbicarbonat enthält, können gleichfalls verwendet werden.

überraschenderweise ist festgestellt worden, daß, wenn herkömmliche auflösende Reagenzien und Verfahren modifiziert werden, um weiße Blutzellen in der Blutprobe dem auflösenden Reagenz unter milderen Bedingungen auszusetzen, die weißen Blutzellen (Leukozyten) einer hohen Konzentration des auflösenden Reagenzes nicht zu jeder Zeit ausgesetzt sind, d.h. der auflösende Stoß oder Schock reduziert wird, wobei die Granulozyten mit einem größeren Volumen aufrechterhalten werden, wodurch eine dritte Population sichtbar und zählbar gemacht wird, nämlich die Monozyten, d.h. ein mittlerer Volumenbereich zwischen
Lymphozyten und Granulozyten wird in einem ausreichenden Ausmaß expandiert (von Granulozyten befreit), um eine Hervorhebung einer dritten Population, der Monozyten, zu ermöglichen. Aus diesem Grunde werden ,anstelle einer Trennung von lediglich zwei Populationen von weißen Zellen in

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Lymphoide und Myeloide, wie sie aus den ÜS-Patentschrifteh 4 286 963 und 4 346 018 hervorgehen und wie in Figur IA gezeigt ist, die Myeloid-Zellen in zwei Unterpapulatiorten getrennt, wodurch insgesamt drei Populationen vorliegen,

B nämlich Lymphozyten, Monozyten und Granuloz^teh gemäß Fjgur IB. Weiterhin wurde bei Durchführung dieses Verfahrens festgestellt, daß das Instrument in der Lage ist, mehrere Arten von abnormen Blutproben durch überprüfung der Positionen und der relativen Größe der Maxima und der Minima des Histogramms festzustellen, sowie durch das Auffinden eines abnorm hohen Prozentsatzes von Zellen im
Monozyten-Bereich, ferner durch abnorme Gesamtweißzählungen. Das heue Verfahren besitzt daher für den Arzt eine spezielle klinische Verwendbarkeit.

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Es ist hervorzuheben, daß bei Durchführung der Erfindung nicht sowohl eine Zählung wie eine Klassifizierung der weißen Blutzellen erforderlich ist. Sie kann eingesetzt werden, um das Zählen und/oder Klassifizieiren mit einem Gerät zu verbessern. Weiterhin können das isotöhischei Ver^ dünnungsmittel und das auflösende Reagenz vor oder nach der Zugabe zu den Blutzellen vermischt werden. Falls sie nachher vermischt werden, sollte die Blutprobe nicht der gesamten Stärke des auflösenden Reagenzes ausgesetzt

den, sondern mit dem Verdünnungsmittel &&tdünnt

wie es in der detaillierten Beschreibung der Erfindung beschrieben wird.

Beispiele der Erfindung werden nun anhand der beigefügten Zeichnung beispielsweise erläutert. Darin zeigen:

Figur IA bis ID Leukozyten-Verteilungs^Histogramme mit

gleichem Maßstab;

Figur IA und IB zum Vergleich Histogramme, die mit der

gleichen normalen Blutprobe erhalten wurden, und zwar bei Figur IA unter Verwendung der bekannten Zwei-Po^ulatiöKeii-Technologie und bei Figur IB unter Ver-

Wendung der vorliegenden Erfindung, um

ein Drei-Populationen-Histogramm zu erhalten; und

Figur IC.und ID Drei-Populationen-Histogramme, die mit

verschiedenen Blutproben mit der vorliegenden Erfindung erhalten worden sind.

Die Einführung automatischer Hochgeschwindigkeits-Geräte, wie sie in der US-Patentschrift 3 549 994 beschrieben
sind, geht auf ein Bedürfnis nach einem Erythrozyten
stromatolysierenden Hochgeschwindigkeits-Reagenz zurück, das eine klare stabile und reproduzierbare Lösung liefert. Bei einem Gerät dieses Typs wird Blut mit einem herkömmliehen Verdünnungsmittel vermischt, um eine erste Verdünnung zu erhalten, worauf mit einem auflösenden Reagenz vermischt wird, um eine zweite Verdünnung zu ergeben. Das Gemisch bleibt in der Auflösekammer während einer kurzen, aber ausreichend langen Zeitspanne, um die

Erythrozyten oder roten Blutzellen zu zerstören (stromatolysieren) und deren Hämoglobin freizusetzen. Das auflösende Reagenz verwandelt ferner das Hämoglobin in ein Chromagen, das sich zur Messung 4ignet. Die gebildete Suspension wird durch Abtastöffnungen in ein Leukozyten-Zählbad geleitet, wo die Leukozyten oder weißen Blutzellen elektronisch gezählt . und deren Größe bestimmt wird. Da das Verhältnis der Erythrozyten zu den Leukozyten in normalem Blut nahe bei 1000:1 liegt, müssen die Erythrozyten schnell in kleine Bruchstücke zerkleinert werden, um eine

gQ Beeinträchtigung mit der Leukozyten-Zählung zu verhindern. Gleichzeitig dürfen die Leukozyten nicht zerstört werden, obgleich ihre Größe in einem mehr oder weniger großen Ausmaß schrumpft. Wie vorstehend erörtert ist, wird vorteilhaft ein quaternäres Ammoniumsalz als stromato-

gt lysierendes Reagenz mit fast augenblicklicher Zerstörung der Erythrozyten auf ein Niveau, das eine Beeinträchtigung der Zählung und Größenbestimmung der Leukozyten verhindert, verwendet. Das quaternäre Ammoniumsalz ist in einer

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wässrigen Lösung in einer Konzentration in einem Bereich von insgesamt etwa 0,5 bis 10 % enthalten, vorzugsweise etwa 1 bis 5 .%.., bezogen auf das Gewicht der ;Lösu*ig> wobei es mit dem Blut vermischt wird, das vorher mit einem Verdünnungsmittel verdünnt worden ist, und zwar in einem Verhältnis von etwa 1:11 des Volumens des auflösenden Reagenzes zu dem Volumen der verdünnten Probe. E:s ist verständlich, daß eine unterschiedliche Stärke des auflösenden Reagenzes eingesetzt werden kann, wenn die ursprüngliehe Verdünnung der Blutprobe von der vorstehend beschriebenen abweicht,um die gleiche Endkonzentration des reaktiven auflösenden Reagenzes oder das gleiche Endverhältnis des auflösenden Reagenzes zu dem vorhandenen Gesamtblut zu erhalten. Wenn eine Zwei-Volumen-Trennung der Leukozyten gemäß dem Verfahren der US-Patentschrift 4 346 018 durchgeführt wird, ist festgestellt worden, daß die Lymphoid-Myeloid-Histogramme, die nach der Auflösung erhalten werden, aus einem Lymphozyten-Maximum von etwa 50 bis 100 fL und einem Myelozyfcen-Maximum bestehen, das iⁿ einem Volumenbereich von 100 bis 4013 fL Mqnozyten und ι Granulozyten (Eosinophile und Neutrophile) enthält. j

Es ist festgestellt und experimentell bestimmt worden, daß Lymphozyten und Monozyten empfindlicher als Granülozyteri gegenüber den normalerweise verwendeten auflösenden Reagenzien sind. Durch Modifizierung der Kinetik der auflösenden Methode , um die weißen Zellen in der Blutprobe dem auflösenden Reagenz unter milderen Bedingungen aussetzen zu können, wurden die Grariulozyten weniger "ge-

3Q schockt", d.h. sie wurden einem geringeren oder einem geringen Gradienten des auflösenden Schocks ausgesetzt, wodurch keine Reduzierung der Größe in einem Ausmaß auftrat, wie sie bei den bekannten Reagenzien-Systemen und Methoden hervorgerufen wird. Dies wird erreicht* indem die verdünnte Blutprobe mit dem auflösenden Reagenz weniger schnell behandelt wird und wenn das auflösende Reagenz in einer niedrigeren Konzentration verwendet wird, als dies routinemäßig der Fall ist. Es wird jedoch etwa die gleiche

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Menge auflösendes Reagenz benötigt, um eine vollständige Stromatolysierung der roten Blutzellen sicherzustellen. Durch Modifizierung der Kinetik des Verfahrens werden die Lymphozyten auf ein Volumen von 50 bis 100 fL und die

.5 Monozyten auf 100 bis 160 fL reduziert, wobei die Granulozyten einen Volumenbereich von 180 bis 450 fL zeigen. Die Granulozyten-Population überlappt folglich nicht mehr mit der Monozyten-Population, so daß diese Populationen getrennt bestimmt und gezählt werden können. Die erhaltenen Daten müssen während einer Zeitspanne erhalten werden, während der die drei unterschiedlichen Populationen vorliegen.

Dies ist das erste Mal, daß festgestellt wurde, wie die Kinetik dieses Vorganges so gesteuert werden kann, daß dieses wichtige Ergebnis erhalten wird. Bisher würde das Hauptgewicht auf eine im wesentlichen augenblickliche Zerstörung der roten Blutzellen auf ein Niveau gelegt, bei dem eine Beeinträchtigung der Leukozyten-Bestimmung verhindert ist. Im vorliegenden Fall wird jedoch das Hauptgewicht auf eine Beurteilung dfer differentiellen Volumen der einzelnen Klassen von weißen Zellen gelegt, welche im Gegensatz zu roten Blutzellen in vielerlei Hinsicht variieren , und zwar hinsichtlich der Morphologie, des Vorliegens unterschiedlicher nuklearer Formen, des Volumens sowie der Funktion für die Gesundheit und im Krankheitsfall.

Durch die Erfindung wird ein Verfahren zur differentiellen Bestimmung von Lymphozyten-, Monozyten- und Granulozyten-Populationen von Leukozyten bereitgestellt, insbesondere mit Hilfe automatischer Zählsysteme. Hämogrammwerte können gleichfalls bestimmt werden.

Vorzugsweise werden bei dem Verfahren in Kombination verwendet:

(A) ein isotonisch ausgeglichenes Mehrzweck-Verdünnungs-

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mittel, das beispielsweise eine wässrige Lösung von

1. einem organischen Puffermittel;

2. einem Zellmembran-stabilisierehderi Mittel;
und

3. einem keimtötenden Mittel;

umfaßt,

wobei das Verdünnungsmittel einen vorgegebenen pH und eine vorgegebene Gsmolalitat aufweist; und

(B) ein auflösendes Mittel, welches eine wässrige Lösung eines quaternären Ammoniumsalzes mit Öbe'rf lä'cheriä'ktiven. Eigenschaften ist.

Um ein geeignetes Chromagen für die Hämoglobin-Bestimmung zu bilden, kann ferner ein Alkalimetallcyanid bereitgestellt werden. Andere Chromagen bildende Reagenzien können gleichfalls verwendet werden.

Die quaternären Ammoniumsalze besitzen f olgende iOrrhel :■

X-

worin Ry ein langkettiges Alkylradikäl· mit 10 bis 18 Kohlenstoffatomen ist und R_-, R- und R.i, kurzkettige Älkylradikale mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind sowie" X ein

Salz ist, das ein Radikal· oder e'iri ÄTiiö'hV wie'" 6W~ ,■ ßr~/

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PO. und CH^SO. ist. Bei besonders geeigneten Kdmbitiätionen weist das langkettige Alkyl 12 bis 16 Kohlenstöffatome auf, während die kurzen Ketten" Methyl oder Ethyl sind und X Chlorid Oder Brömid ist.

Bei dem bevorzugten auflösenden Mittel köittmt eine Kombination von Dodecyltrimethylaiimbrtiumchlörid" mit TeträdeCyltrimethylammoniumbromid und Käliüiticyahid: zur' ^

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Andere quaternäre Ammoniumsalze, die zu wirksamen Ergebnissen führen, umfassen Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder Hexadecyldimethylethylaminoniumbromid in Kombination mit Dodecyltrimethylammoniumehlorid.

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Beispiel nach dem Stand der Technik.

Wenn die vorgeschlagenen Richtlinien befolgt werden, die der Öffentlichkeit über die Volumen- und Durchflußeinstellung eines Coulter Counter Model S Plus bekannt sind, um eine Zwei-Volumen (lymphoid/myeloid) Population von Leukozyten zu erhalten, werden folgende Zusätze in den angegebenen Konzentrationen angewendet:

Verdünnungsmittel- Bevorzugte Kon- Konzentrations-US-Patent 4 346 018 zentration bereich
(Spalte 3,Zeile 55)

1. Procain-hydrochlorid 0,11 g/L 0,5 bis 0,25 g/L 2. N-(2-Acetamido)-

iminodiessigsäure

(ADA) 1,40 g/L 1,0 bis 2,5 g/L

3. Dimethylolharnstoff 1,0 gg/L 0,5 bis 2,5 g/L

pH 7,0 + 0,1 Osmolalität 320 + 5 mOs/Kg

Auflösendes Mittel- Bevorzugte Kon- Konzentrations-US-Patent 4 346 018 zentration bereich
(Spalte 6, Zeile 20)

1. Dodecyltrimethylammoniumchlorid
50%ige Lösung 60 g/L 40 bis 70 g/L

2. Tetradecyltrimethyl-

ammoniumbromid 6 g/L 4 bis 7 g/L

3. Kaliumcyanid 300 mg/L 250 bis 500 mg/L

4. Wasser ausreichend für einen Liter.

Beispiel 1

Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels wie bei dem Beispiel η .ach dem Stand der Technik verwendet, jedoch eine andere Konzentration der Zusätze, wobei das Volumen des auflösenden Mittels verdoppelt wird, so daß ein Histogramm mit drei Populationen erhalten werden
kann. Zum Beispiel: .

Auflösendes Mittel- Bevorzugte Kon- Konzentrations-Drei-Populationen zentration bereich

1. Dodecyltrimethylammoniumchlorid-

50%ige Lösung 35 g/L 20 bis 55 g/L

2. Tetradecyltrimethyl-

ammoniumbromid 3,7 g/L 2 bis 6 g/L

3. Kaliumcyanid 150 mg/L 125 bis 250 mg/L

4. Wasser ausreichend für einen Tjiter

Beispiel 2

Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels nach dem Stand der Technik verwendet, jedoch mit folgender Formulierung der Zusätze für das auflösende Mittel und mit einer Verdoppelung des Volumens des auflösenden Mittels, wobei ein Histogramm mit drei Populationen erhalten wird:

Auflösendes Mittel- Bevorzugte Kon- Konzentration-Drei-Populationen zentration bereich

1. Dodecyltrimethylammoniumchlorid-

50%ige Lösung 35 g/L 20 bis 55 g/L

2. Dimethylethylhexa-

decylammoniumbromid 2,5 g/L 1 bis 6 g/L

3. Kaliumcyanid 150 mg/L 125 bis 250 mg/L

1 Beispiel 3

Es wird die gleiche Formulierung des Verdünnungsmittels des Beispiels nach dem Stand der Technik verwendet, jedoch mit folgender Formulierung der Zusätze für das auflösende Mittel und mit einer Verdoppelung des Volumens des auflösenden Mittels, wobei ein Histogramm mit drei Populationen erhalten wird:

10 Auflösendes Mittel-Drei -Populationen

Bevorzugte Konzentration

Konzentrationsbereich

1. Dodecyltrimethylammoniumchlorid-

15 50 %ige Lösung

2. Hexadecyltrimethylammoniumbromid

3. Kaliumcyanid

3 5 g/L

2,7 g/L
150 mg/L

20 bis 55 g/L

1 bis 6 g/L

125 bis 250 mg/L

Die Bereiche des pH und der Osmolalität des Verdünnungsmittels, wie sie für die Erfindung verwendet werden, können größer sein als in dem Beispiel nach dem Stand der Technik; beispielsweise: pH 7,0 + 0,4; Osmolalität
320 + 50 mOs/Kg.

Es ist darauf hinzuweisen, daß das Alkalimetallcyanid, beispielsweise in Form von Kaliumcyanid, einen wahlweise verwendeten Zusatz darstellt, um ein Chromagen zur Hämoglobin-Bestimmung zu bilden und nicht für die Bildung
eines drei Populationen differenzierenden Leukozyten-Histogramms erforderlich ist.

Wenn ein Handelsprodukt verwendet wird, das unter einem Warenzeichen verkauft wird, werden die vorstehenden Formulierungen erforderlichenfalls im Hinblick auf die Reinheit und die genaue Zusammensetzung des verkauften Handelsprodukts eingestellt, um die gleichen Ergebnisse mit dem Gerätesystem zu erhalten.

Es können andere Arten von automatischen und halbautomatischen Blutzellen-Analysiergeräten mit unterschiedlichen Volumina und Konzentrationen dar Verdünnungsmittel und des auflösenden Mittels, als vorstehend angegeben, eirigesetzt oder für den Einsatz hergerichtet werden. Auch können Unterschiede in der Durchflußgeschwindigkeit usw. eingebaut werden. Derartige Unterschiede können auch in
Coulter Couter-Instrumenten des Typs Models S Plus und anderer Modelle angewendet werden, wenn gleichzeitig die grundsätzliche erfindungsgemäße Lehre und deren Entdekkung der Reduzierung des auflösenden öder lytischen
Schocks in einer Weise zur Anwendung kommt/ daß die Granulozyten mit einem höheren Volumen erhalten bleiben gegenüber den Monozyten, wodurch die Zählung der Monozyten als dritter unterschiedlicher Population ermöglicht wird.

Wie aus den vorstehenden Beispielen ersichtlich ist; wird das neue Ergebnis der Bildung eines Histogramms mit drei Populationen anstelle des Histogramms mit zwei Pöpülationen erreicht, indem ein handelsübliches auflösendes Mittel , das unter dem Warenzeichen Lyse S Plus verkauft wird, etwa auf die Hälfte seiner Konzentration verdünnt und dann etwa das doppelte Volumen des auflösenden Mittels angewendet wird. Dabei versteht es sich* daß die Könzentrationen der aktiven Bestandteile der Formulierungen des auflösenden Mittels geändert werden können, Wenn das Volumen des verwendeten auflösenden Reagenzes entsprechend modifiziert wird, solange die Verhältnisse der auflösenden Bestandteile innerhalb bestimmter Grenzen aufrechterhalten werden. Zum Beispiel: Ein Teil TeträdecyltrimetKYia^tünö-niumbromid auf 9,5 + 4 Teile Dodecyltrimethylämmoniümchlorid-50%ige Lösung; oder ein Teil Dimethylethylhexädecylammoniumbromid auf 14 + 6 Teile Dodecyltrimethylammoniumchlorid-50%ige Lösung; oder ein Teil Hexadedyltrimethylammoniumbromid auf 13+6 Teile Dödecyltfimethylammoniumchlörid-50%ige Lösung; Auch sollte das Verhältnis' des Gesamtbluts zu den aktiven auflösenden Bestandteilen in einem bestimmten Bereich gehalten werden. Zum Beispiel:

0,132 +_ 0,060 rag Tetradecyltrimethylammoniumbromid und 1,25 -t- 0,60 rag Dodecyltrimethylammoniuinchlorid-SOIige Lösung wird pro uL Gesamtblut zugegeben. Das Verhältnis des Gesamtbluts zu den aktiven auflösenden Bestandteilen beträgt daher etwa 1 uL: 1,4 mg. Die vorstehend angegebenen Werte sind lediglich Beispiele, die auf geeigneten Formulierungen basieren, wobei zu erwarten ist, daß vernünftige Abweichungen davon zu geeigneten Ergebnissen führen, um das Ziel der Erfindung zu erreichen.

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Nach der bekannten Betriebsweise eines automatischen
Coulter Counter Model S Plus Teilchen-Zählsystems wird das Gemisch aus dem Gesamtblut und dem isotonischen Verdünnungsmittel einem Bad zur Zählung weißer Zellen zugeführt, wobei das auflösende Mittel ebenfalls dem Zählbad während eines Teils dieser Zufuhr zugegeben wird, und zwar für etwa eine halbe Sekunde. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Zeit der Zufuhr des auflösenden Mittels erhöht, so daß das auflösende Mittel zu dem Zählbad während etwa 1 1/2 Sekunden während der Zeit zugegeben wird, in der das verdünnte Blut dem Zählbad zugeführt wird. Um beste Ergebnisse zu erhalten, werden die Leitung zur Zufuhr des auflösenden Mittels und die Leitung zur Zufuhr des verdünnten Blutes miteinander während eines signifikanten Teils ihrer Länge verbunden, so daß eine Vermischung vor dem Eintritt in das Zählbad erreicht wird. Diese langsamere Zufuhr des auflösenden Mittels und dessen längere Einwirkung auf das Blut , jedoch bei niedrigerer Konzentration, führt zu einer verbesserten Herabsetzung des lytischen Schocks, d.h. einem niedrigen oder niedrigeren Gradienten der lytischen Wirkung, wodurch erfindungsgemäß drei Volumina von Leukozyten erhalten werden. Stattdessen können das auflösende Mittel und das Verdünnungsmittel vorher kombiniert werden, um ein auflösendes oder lytisches Verdünnungsmittel zu erhalten, das zur Verdünnung und zur Auflösung der gesamten Blutprobe in einer Weise verwendet wird, mit der die lytische Wirkung mit dem gewünschten

niedrigen Gradienten erzielt wird.

Das Reagenzsystem und das Verfahren der Erfindung sind so ausgelegt, daß eine Dreiphasen-Größenverteilung der ■5 Leukozyten erhalten wird, so daß der Impulshöhenanalysator des Coulter Counter Modell S Plus-Systems Lymphozyten, mononukleare Zellen (Monozyten) und Granulozyten identifizieren und zählen kann.

Nach diesen Methoden werden die Schritt der Zufuhr und der Vermischung in einer solchen Weise durchgeführt, daß die Blutzellen-Volumenmodifizierung bewirkt, daß die
Granulozyten-Population eine Volumenverteilüng mit einem größeren Volumen als das der Monozyten-Population annimmt.

Beim Schritt der Vermischung des Blutes und des Verdünnungsmittels mit dem auflösenden Reagenz wird eine erheblich geringere Konzentration des auflösenden Reagenzes verwendet, so daß die Leukozyten einem lytischen Schock mit einem niedrigen Gradienten ausgesetzt werden. Beim Vermischen wird das auflösende Reagenz außerdem mit einer erheblich geringeren Geschwindigkeit und/oder während
einer erheblich längeren Zeitspanne zugeführt, was gleichfalls bewirkt, daß die Leukpzyten einem lytischjen Schock 5 mit geringem Gradienten ausgesetzt sind·

Wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem langsameren Zusatz des auflösenden Reagenzes und des längerer Einwirkung auf das Blut , jedoch bei einer niedrigeren Konzentration, vorgegangen wird, ist unerwarteterweise festgestellt worden, daß wenigstens die Monozyten^ und Granulozyten-Populationen differentiell klassifiziert werden können, indem eine Gesamtblutprobe mit dem auflösenden Reagenz auf ein bestimmtes Gesamtvolumen verdünnt

wird. Die Entverdünnung des Gesamtblutes mit den aktiven lytischen Bestandteilen kann erreicht werden, indem lediglich das auflösende oder lytische Reagenz verdünnt wird, anstelle eines ursprünglichen Zusatzes des Verdünnungsmit-

tels zu dem Gesamtblut, bevor es mit dem auflösenden Reagenz gemäß den bekannten Verfahren vermischt wird.

Wenn nach dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgegangen
wird, werden bestimmte abnormale Blutproben mit einem Mangel an Granulozyten erkennbar. Diese zeigen Lymphozyten mit dem üblichen Volumenbereich von 50 bis 100 fL, Monozyten mit einem Volumenbereich von lediglich 100 bis 160 fL und im wesentlichen keine Zellen im Bereich zwischen 180 fL und 450 fL. Proben, die lediglich Lymphozyten und Monozyten enthalten, wurden aus normalem Blut mit bekannten physikalischen Methoden der Dichtetrennung erhalten, wobei diese Proben zeigten, daß Monozyten nach der Auflösung in etwa dem gleichen Einheitsvolumenbereich erscheinen.

■

Die beschriebenen Modifikationen der Erfindung sind nicht auf Coulter Counter Modell S Plus Instrumente beschränkt, vielmehr gelten ähnliche Überlegungen allgemein für andere automatische Instrumente sowie für die manuelle Behändlung von verdünntem Blut mit einem auflösenden Reagenz, um den lytischen Schock zu reduzieren oder zu beseitigen und die beobachtete Verbesserung der Volumenhistogramme zu erreichen.

Figur IB zeigt ein Verteilhistogramm einer Probe normalen Blutes, das erfindungsgemäß erhalten wurde, indem ein Coulter Counter Modell S Plus Gerät und ein kalibrierter Coulter Modell C-1000 Channelizer verwendet wurde. Die Population auf der linken Seite enthält Lymphozyten. Die mittlere Population enthält mononukleare Zellen. Die Population auf der rechten Seite enthält Granulozyten. Die Population mononuklearer Zellen umfaßt Monozyten und bei seltenen abnormalen Proben kann sie auch Bruchstücke und Promyelozyten enthalten. Die Granulozyten-Population umfaßt segmentierte Neutrophile, Bänder, Metamyelozyten, Eosinophile und Basophile.

Falls die absolute Zahl der Zellen in dem Monozyten-Be-

reich über dem normalen Bereich liegt, würde dies bei Durchführung der Erfindung identifiziert werden. Es wird dann ein Blutabstrichplattchen hergestellt und bestimmt, welcher Art die vorhandenen abnormalen Zellen sind. Im Fall der Überlappung der Zellpopulationen und stark abnormaler Proben wird der Benutzer bei dem automatischen Betrieb des Systems unter Verwendung der Erfindung aufmerksam gemacht, wie den Figuren IC und ID zu entnehmen ist.

Die Verdünnung eines auflösenden Mittels, das sich zur Bildung einer Zweivolumen-Lymphoid-Myeloid-Population bei etwa der Hälfte der Konzentration und bei Verdoppelung des Volumens des auflösenden Mittels eignet, wobei die Konzentrationsverhältnisse der aktiven Bestandteile modifiziert und die Geschwindigkeit des Zusatzes des auflösenden Mittels herabgesetzt wird, verbreitert das Minima öder Tal des Volumenbereiches oberhalb der Lymphozyten während einer Zeitspanne, die ausreichend lang ist, um zu ermöglichen, daß die dritte Population, die Monozyten., durch ^den automatischen Teilchenzähler quantifiziert werden.

Diese Faktoren sind bei den bekannten Reagenzsystemen und der bekannten Methodik nicht vorhanden, um eine hinreichende Erhöhung der dritten Population zu ermöglichen, die in einer sehr geringen Zahl vorliegt.

Es ist hauptsächlich auf den verringerten Konzentrationsgradienten des auflösenden Mittels, das in der verdünnten Blutsuspension verteilt wird, zurückzuführen, daß das un-

3Q erwartete Ergebnis der dritten Population erhalten wird. Durch das modifizierte Reagenz und die Verteilungsmethode werden die Zellen einem viel geringeren auflösenden Konzentrationsgradienten ausgesetzt, wodurch die Kinetik des Auflösens herabgesetzt wird und die Granulozyten-Popüla-

3g tion ein größeres Volumen behält, wodurch die Entdeckung und Zählung der dritten Population , nämlich der Monozyten, ermöglicht wird.

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Die dritte Population ist als Monozyten identifiziert worden, und zwar durch:

a. die Beziehung zwischen angefärbten Abstrichen und manuellen Differenzierungen,

b. die Verwendung von Lymphozyten/Monozyten-Zellpräparationen, um die Position der Monozyten-Population nach der Auflösung zu demonstrieren,und

c. das Sortieren der Monozyten aus den Blutproben unter Verwendung eines Coulter Epics V-Strömungszytometers und anschließendem Durchlauf dieser Zellen durch das Coulter Counter S Plus-System, das entsprechend der Erfindung modifiziert worden ist, wobei die Position in dem Histogramm festgestellt wurde.

Leukozyten-Fraktionen, die nahezu reine Lymphozyten oder Monozyten oder Neutrophile oder Eosinophile enthalten, wurden durch dichte Gradienten-Trennungen hergestellt und diese gereinigten Proben wurden mit "Basis"-Blut kombiniert, um künstlich angereichertes Gesamtblut zu erhalten, um die Leukozyten-Histogramme im Vergleich zu manuellen Differential-Zählungen zu untersuchen. Diese mit Leukozyten-Fraktion angereicherten Proben und normalen Proben wurden mit einem Coulter Counter S Plus-System untersucht, wobei zur manuellen Differential-Zählung Filme hergestellt wurden. Das Coulter Counter S Plus-Gerät ist so modifiziert worden, daß der Lymphozyten-Prozentsatz im Größenbereich zwischen 4 0 und 103 fL, die Monozyten zwischen 103 und 160 fL und die Granulozyten oberhalb 16 0 fL bestimmt werden konnten. Es wurden auch Änderungen der Kon- zentration einiger aktiver Bestandteile des auflösenden Reagenzes vorgenommen.

Ein Größenverteilungs-Histogramm einer normalen Gesamtblutprobe ist in Tabelle 1 wiedergegeben.Die Bestimmungen der Prozentanteile der einzelnen Zelltypen, wie sie mit dem Instrument und durch manuelle Differential-Zählung erhalten werden, sind in Tabelle 1 angegeben.

Lymphozyten	N+E+B =	21,7
Monozyten	5,7
Neutrophile	N
15 Eosinophile	E
Basophile	B
	72,6

1 Tabelle 1

Ein Vergleich der numerischen Bestimmung, die mit -der automatischen, erfindungsgemäß modifizierten Äuflosemethode mit manueller Ablesung der Differential-Zählung von einem gefärbten Blutabstrichplättehen nach Wright
(Standardmethode) einer normalen Blutprobe erhalten wird.

Differential-Zählung %
Coulter Counter S Plus Manuell

2 8 6

63 4 0

Eine mit Lymphozyten-Monozyten angereicherte Probe wurde nach der Standardtechnik von Ficoll-Hypaque hergestellt.

Die Leukozyten wurden mit SBSS gewaschen und zu autologem Gesamtblut hinzugegeben. Die Groß.enverteilungsdaten des Instruments und der manuellen Dif ferential-Bestiminungsn der Prozentanteile der Hauptzelltypen sind in Tabelle 2

25 wiedergegeben.

Tabelle 2
Lymphozyten/Monozyten-Anreicherung

Differential-Zählung %
Coulter Counter S Plus Manuell

4 2 18 34

Lymphozyten	45,5
Monozyten	17,1
Neutrophile	N
35 Eosinophile	E
Basophile	B
	N+E+B = 40,4

Bei normalen Personen stellen die Zellen, die in den Volumenbereich zwischen den Lymphozyten und den Granulozyten fallen, die Monozyten-Population dar. Die roten Blutzellen sind völlig stromatolytisiert, wobei die Bestimmung der roten Blutzellen und Blutplättchen im wesentlichen die gleiche wie bei den bekannten Methoden ist.

In abnormalen Fällen tritt jedoch gelegentlich eine Erhöhung der "Monozyten"-Population aufgrund zerstörter oder anderer unreifer Zellarten auf, welche durch mikroskopische Überprüfung festgestellt werden können. Die Monozyteh-Population kann erheblich in Gegenwart dieser Zellen zunehmen, die in dem Monozyten-Bereich des weißen Zellen-Histogramms gefunden werden. Dies kann beispielsweise demonstriert werden, indem die Leukozyten-Größenverteilungs-Histogramme mit manuellen Differential-Zählungen verglichen werden, die mit Gesamtblut erhalten wurden, das auf Glasplättchen verteilt und angefärbt wurde.

^Das Gerät, das erfindungsgemäß betrieben wird, ist in der Lage, erheblich abnormale Blutproben durch Bestimmung der Positionen und der relativen Größe der Maxima und Minima des Histogramms bei einem abnormal hohen Prozentsatz der Zellen im Monozyten-Bereich und einer abnormalen weißen Gesamtzählung zu bestimmen.

Bestimmte Arten und Zustände von Leukämie würden durch die Gegenwart sehr unreifer Zellen, die als Bruchstücke oder "Blasts" bezeichnet werden, gekennzeichnet, die

nicht in normalem Blut und meistens nicht im abnormalen Blut gefunden werden. Diese "Blasts" werden teilweise
durch ihre sehr große Größe auf den Blutglasplättchen
identifiziert, jedoch sind sie anscheinend sehr empfindlich gegenüber der Auflösung, wobei sie im Volumenbereich von 80 bis 150 fL gefunden werden, und wobei die Lymphozyten- und Monozyten-Bereiche überlappen und ein breites Maximum in diesem Bereich erhalten wird, ohne dem
typischen Lymphozyten/Monozyten-Minimum, das bei 100 fL

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üblicherweise festgestellt wird. Derartige Proben werden im allgemeinen leicht mit dem Gerät aufgrund des ungewöhnlichen Histogramms und der häufig erheblich erhöhten.. Gesamtzählung der. weißen Blutzellen festgestellt.

■ ■ .

Blutproben, die durch zu lange Alterung , durch Einwirkung ungewöhnlich hoher Temperaturen usw. beschädigt worden sind, ergeben gleichfalls abnormale Histogramme, die
leicht von einem geübten Beobachter sowie von der Rechenanlage in dem Gerät festgestellt werden können.

Figur IA und IB zeigen zum Vergleich.Leukozyten-Verteilungs-Histogramme der gleichen Probe, die mit einem automatischen Coulter Counter Modell S Plus Blutzellenzähler durchgeführt worden sind, wobei Figur IA unter Verwendung eines Reagenzsystems nach dem US-Patent 4 346 018 erhalten wurde, während Figur IB mit einem Reagenzsystem und nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten wurde.

, .

Figur IC stellt das Histogramm eines Patienten mit
schwerer Leukopenie dar. Es sind sehr wenige Zellen in der Granulozyten-Zone vorhanden. Das Lymphozyten-Maximum läuft in dem mononuklearen Bereich aus. Das angefärbte Blutglasplättchen zeigt gelegentlich mehrere Lappen aufweisende Neutrophile, eine normale Anzahl an reifen
Lymphozyten und einige "Blasts".

Figur ID zeigt ein Lymphozyten-Maximum, das normal erscheint. Es ist eine deutliche Erhöhung des mononuklearen Bereiches sowie der Granulozyten-Zone festzustellen.

Obgleich einige repräsentative Ausführungsformen und
Einzelheiten zur Veranschaulichung der Erfindung dargestellt worden sind, können zahlreiche Änderungen und Modifizierungen durchgeführt werden, ohne den Rahmen der Erfindung , wie er in den beigefügten Ansprüchen angegeben ist, zu verlassen. ^!

8000

Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur volumetrischen Differenzierung von
wenigstens zwei Populationen von Leukozyten (Monozyten und Granulozyten) aus einer Gesamtblutprobe unter Verwendung eines automatischen Teilchen-Analysiersystems, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:

I. man führt die gesamte Blutprobe und in vorbe-

stimmter Konzentration ein isotonisch ausgeglichenes Blutverdünnungsmittel, das in dem Analysiersystem verwendet wird, zum Vermischen und Analysieren zu, wobei das Verdünnungsmittel auf einen vorbestimmten pH-Wert und eine vorbestimmte Osmolalität eingestellt wird, und

II. man vermischt die gesamte Blutprobe und das Verdünnungsmittel durch das Analysiersystem mit einem demselben, zugeführten auflösenden Reagenz mit einem

vorbestimmten Gesamtvolumen und in einer solchen Art und Weise, daß eine volumetrische Modifizierung der einzelnen Blutzellen von wenigstens einer der Populationen der Leukozyten während einer signifikanten Zeitspanne bewirkt wird, wodurch eine automatische Differenzierung der Leukozyten-Populationen mit dem Analysiersystem ermöglicht wird;

wobei ' .

das auflösende Reagenz ein Gemisch einer wässrigen Lösung von quaternären Ammoniumsalzen mit oberflächenaktiven Eigenschaften ist, welche Salze in einer vorbestimmten Konzentration vorliegen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verdünnungsmittel ein Gemisch umfaßt aus (1) einem Puffer, (2) einem
Zellmembran stabilisierenden Mittel und (3) einem keim-

3J₃ tötenden Mittel, wobei die Endvolumen-Konzentration und die gesamte Menge derselben dazu dienen, die Auflösekinetik wenigstens einer der Leukozyten-Populationen herabzusetzen.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Puffer N-(1-Acetamido)-iminodiessigsäure (ADA) , das zeilstabilisierende Mittel Procain und das keimtötende Mittel Dimethylolharnstoff ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Verdünnungsmittel einen pH von etwa 7,¹O bis + 0,4 und eine Ösmolalität von etwa 320 +_ 50 mOs/kg aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das auflösende Reagenz weiterhin ein Mittel zur Bildung eines geeigneten Chromagens zur Hämoglobin-Bestimmung umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Chromagen bildende Mittel ein Alkalimetallcyanid ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die quaternären Ammoniumsalze ein Gemisch von Dodecyltrimethylammoniumchlorid und .Tetradecyltrimethylammoniumbrpmid sind.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Dodecyltrimethylammoniumchlorid in einem Konzentrationsbereich von

20 bis 55 g/L und das Tetradecyltrimethylammoniumbromid in einer Konzentration von 2 bis 6 g/L vorliegen.
25

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Dodecyltrimethylammoniumchlorid und das Tetradecyltrimethylammoniumbromid in einem Verhältnis von etwa 9,5 t 4:1 vorliegen.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verhältnis des Gesamtbluts zu den aktiven auflösenden Bestandteilen des auflösenden Reagenzes etwa im Verhältnis von

1 uL:l,4 mg vorliegen.
ein

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die quaternären Ammoniumsalze ein Gemisch von Dodecyltrimethylamrnoniurnchlorid und Hexadecyltrimethylammoniumbromid sind.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Dodecyltrimethylammoniumchlorid und das Hexadecyltrimethylammoniumbromid in einem Verhältnis von etwa 13 + 6:1 vorliegen.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die quaternären Ammoniumsalze ein Gemisch aus
Dodecyltriinethylammoniumchlorid und Dimethylethylhexadecylammoniumbromid sind.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Dodecyltrimethylämmoniumchlorid und das Dimethylethylhexadecylammoniumbromid in einem Verhältnis von etwa 14 -f 6:1
vorliegen.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schritte der Zufuhr und der Vermischung in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die Blutzellen-Volumenmodifizierung bewirkt, daß die Granulozyten-Population eine Volumenverteilung mit einem größeren Volumen als das der Monozyten-Population annimt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei bei dem. Schritt des Vermischens mit dem auflösenden Reagenz eine signifikant geringere Konzentration des auflösenden Mittels eingesetzt wird, so daß die Leukozyten einem niedrigen Gradienten des lytischen Schocks ausgesetzt sind.

17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei bei dem Schritt des Vermischens des auflösenden Reagenzes ein Schritt des Zuführens des auflösenden Reagenzes mit einer signifikant niedrigeren Geschwindigkeit durchgeführt wird, so daß die Leukozyten einem niedrigen Gradienten des lytischen Schocks ausgesetzt sind.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Schritt der Zufuhr des auflösenden Reagenzes während einer signifikant langen Zeitspanne durchgeführt wird.

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19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei bei dem Schritt der Vermischung des auflösenden Reagenzes eine signifikant geringere Konzentration des auflösenden Reagenzes angewendet wird, so daß die Leukozyten einem niedrigen Gradienten des lytischen Schocks ausgesetzt sind.

20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gesamtblutprobe Lymphozyten erhält und durch die volumetrische Modifizierung der Blutzellen eine Differenzierung von

drei Populationen durchgeführt werden kann.

21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei die volumetrische Modifizierung der Blutzellen bewirkt, daß die Monozyten-Population volumetrisch zwischen der Lymphozyten- und der Granulozyten-Population angeordnet wird.

22. Verfahren nach Anspruch 1, wobei weiterhin ein Schritt durchgeführt wird, bei dem wenigstens eine der differenzierten Populationen gezählt und klassifiziert wird.

23. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Gesamtblutprobe wenigstens teilweise mit dem Blutverdurinungsmittel vor dem Vermischen mit dem auflösenden Reagenz verdünnt wird.

24. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das auflösende Reagenz wenigstens teilweise mit dem Blutverdünnuhgsmittel vor dem Vermischen mit der Gesamtblütprobe verdünnt wird.

25. Verfahren zur volumetrischen Differenzierung wenigstens der Monozyten- und Granulozyten-Population., die mit einer Gesamtblutprobe erhalten werden, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

, I. die Gesamtblutprobe und das auflösende Reagenz werden zugeführt;

II. die Gesamtblutprobe wird mit dem auflösenden Reagenz in einem vorgegebenen Gesamtvolumen und in einer solchen· Weise vermischt, daß ein niedriger Gradient des lytischen Schocks auftritt und dadurch die volumetrische Modifikation der einzelnen Blutzellen wenigstens einer der Populationen der Monozyten und Granulozyten für eine signifikante Zeitspanne, um eine volumetrische Differenzierung dieser Populationen zu ermöglichen.
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