JPH01148183A - 組み換えワクチニアウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組み換えワクチニアウィルスに関し、更に詳し
くは、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノムＤＮ
Ａ領域にヒト免疫不全症候群ウィルス（ｌｌｕｓａｎ　
ｌｍ５ｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）　Ｈ
Ｉ　Ｖ（ＨＴＬＶ−Ｉｆｆ／ＬＡＶ）由来のｏａｇ遺伝
子等をコードするｃＤＮＡが組み込まれた組み換えワク
チニアウィルスに関する。

（従来の技術） 最近、後天性免疫不全症候群（エイズ）の発症、蔓延が
世界的に憂慮されており、その予防、治療対策が緊急課
題となっている。

数年前より、その原因ウィルスと考えられる種種のレト
ロウィルスが生離され、同定されている（例えＧｊ　Ｈ
Ｔ　Ｌ　Ｖ　−ＤＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ）、　そ（７）後
、これらの遺伝子の全塩基配列が決定され、これらは、
同類又は同一であるらしいと報告されるようになり、そ
してヒト免疫不全症候群ウィルスＨＩ　Ｖ　（Ｈｕｍａ
ｎ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）
と総称されるようになった。

ＨＩ　Ｖ　Ｇ、？、約１０ｋｂ（キロベース）のＲＮＡ
から成るゲノムを有するレトロウィルスであると考えら
れている。このウィルス粒子は、多くの蛋白質で構成さ
れているが、これらの蛋白質は、外皮糖蛋白ｅｎｖ−（
Ｊｇ）１６０　（前駆体）［ａｐＨ０〜１２０及びａｐ
４１　（スパイク）１、逆転写酵素ｐｏｌ蛋白ｐ６５及
びｐ５１、核蛋白ａａａ−ｐ５５　（前駆体）［ｐ１７
、ｐ２４及びｐ１５］等と命名されている。また、ＨＩ
Ｖに独特なものと言われるウィルス遺伝子発現を調節す
るウィルス蛋白（３’　ｏｒｆｌｔａｔ、、ａｒ″ｔ／
ｌｒｓ及び５ｏｒ）等も知られている。

エイズ感染の診断を行なうためには、そのウィルス固有
の抗原蛋白を効率的に生産することが必要である。また
、効果的なエイズワクチンを得ようとする場合には、そ
れはウィルスを中和し得る抗体を誘導するのに適当な抗
原を含んでいることが必要である。現在までのところ、
外皮糖蛋白特にＧＥ）１２０がその最有力候補として選
ばれ、この抗原蛋白をコードする遺伝子を、大ＷＡ菌に
組み換える遺伝子操作技術によって産生ずる研究（例え
ば、雑誌「サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　Ｊ　２２
８巻９３〜９６頁１９８５年）、酵母に組み換える遺伝
子操作技術によって産生ずる研究（例えば、特開昭６１
−１７３，７８２号公報）、哺乳動物細胞を宿主として
組み換え体を発現産生する研究（例えば、特開昭６１−
２３３．７００号公報及び雑誌「サイエンス（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　）　Ｊ　２３３巻、２０９頁１９８６年）、及
びワクチニアウィルスに組み換える遺伝子操作によって
産生ずる？ｉｌｌ究が既に行われている（例えば雑誌「
ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊ　３２０巻、５３５〜
５３７頁１９８６年、及び雑誌「バイオ／テクノロジー
（Ｂｉｏ　／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　Ｊ　４巻、７９
０〜７９５頁１９８６年）。また、逆転写酵素ｐｏｌ蛋
白を大腸菌に組み換え遺伝子操作によって産生ずる研究
（例えば、雑誌［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　Ｊ
　２３６巻３０５〜３０８頁１９８７年）、核蛋白ｇａ
ａ−ｐ５５やｐ２４などを組み換え多角体ウィルスの系
で産生ずる研究も行われている（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　
１５８　。

２４８−２５０　（１９８７））。

ところで、種々の患者や感染者から分離されたＨＩＶの
ゲノム塩基配列の解析結果より、ＨＩＶのｅｎｖｌｌ伝
子は極めて変異が激しい事が明らかとなり（Ｓｃｉ、　
Ａｍ、２５３．８４−９３　（１９８５））、この部位
を利用する手法ではすべてのＨＩＶに対応できない懸念
がある。

これに反し、ウィルス粒子の骨組みとなるタンパク質の
産生に関与するｇａｇや主として逆転写酵素をコードし
ているｐｏｌ遺伝子はｅｎｖ遺伝子とは異なり変異の起
こる確率が低い可能性もありそれだけ有利とも言える。

しかしながら、ＱａＱやｐｏｌ遺伝子産物を大腸菌等の
バクテリアや酵母、あるいは、昆虫ウィルスなどの系を
用いて産生させた場合、例えば、ＨＩＶの感染防御ある
いはヒト免疫不全症候群（エイズ）又はエイズ１！１３
！症候群（ＡＲＣ）の発症予防を目的にする場合には異
物の混入を避けるため複雑な精製工程が必要となってく
る。これに反し、ＱａＱあるいはｐｏｌ遺伝子をコード
するＣＤＮＡを遺伝子操作によって種痘ワクチン株ウィ
ルスに組み込んだ場合には、直接生体に接種できる可能
性があり、それだけ有利と言えるが、ワクチニアウィル
スにこれらｃＤＮＡを組み込んで遺伝子産物を生産させ
た例は未だ知られていない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、ヒト免疫不全症候群ウィルス（ｔｌｕｓａｎ
　Ｉａｖｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　Ｖｉｒｕｓ）　
ｌ−１１Ｖ（ＨＴＬＶ−１１１／ＬＡＶ）由来のａａａ
３１１伝子、あるいはｇａｇ、ｐｏ１両方の遺伝子をコ
ードするＣＤＮＡを、ワクチニアウィルスの増殖に非必
須なゲノム領域に組み込んだ組み換えワクチニアウィル
スを発現され、各遺伝子産物を生産する技術を提供しよ
うとするものである。

本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはワクチニアウィルスに分類されるウィルスであれ
ばいかなるものでもよく、例えばＷＲ株（ジャーナル　
オブ　ヴイロロジ−４９゜８５７、（１９８４）、リス
ター株、リスター株の温度感受性変異株（米国特許第４
，５６７．１４７号、特開昭６２−４４１７８号参照）
）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｏａｒｄ　ｏｒ　１ｌｅａｌ
ｔｈ株、１０１６ｍ８株などの種痘ワクチン株（ワクチ
ン抗原用ベクターとしてのワクチニアウィルス“ｖａｃ
ｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓｅｓａＳ　　Ｖ１３ＣｔＯｒＳ
　　ｆｏｒ　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ　　”
　ｐｐ、８７−１００．ジエイ、　キンナン（Ｊ、　ｏ
ｕｔｎｎａｎ、　）編アムステルダム、ニューヨークお
よびオックスフォード：エルセバー社）　（Ｅｉｓｅｖ
ｉｅｒ）版）などが例示される。

またＱａＱ遺伝子、あるいはｇａｇ、ｐｏ１両方の遺伝
子をコードするＣＤＮＡは、例えばｐＮＬ４３　（Ｊｏ
ｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌｏｏｙ、　Ｖｏ１５９．
　ｔｋｘ２．２８４．１９８６）などのように、エイズ
患者の染色体にプロウィルスの形で組み込まれた）１１
Ｖを一旦λファージ等を用いてクローニングし、その後
プラスミドに移してＨＩＶの全ｃＤＮＡを含むプラスミ
ドを構築するか、あるいは、患者より分離したＨＩＶの
ＲＮＡゲノムを逆転写してＣＤＮＡに変換し、その後プ
ラスミドに移してＨＩＶの全ＣＤＮＡを含むプラスミド
を構築し、得られたプラスミドを適当な制限酵素で切断
し、ＱａＱ、あるいは、ｇａｇ、ｐｏ１両方のコード領
域を含むＤＮＡ断片を調製することによって得られる。

本発明を実施するに当たっては、まずワクチニアウィル
スの増殖に非必須なりＮＡ領領域組み込んだ第一の組み
換えベクターが作製される。同領域にワクチニアウィル
ス内で機能するプロモーターが含まれているものが好ま
しい。ここで言う増殖に非必須なりＮＡ領領域は、例え
ばワクチニアウィルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）ｍ伝
子、血球凝集素（ＨＡ）遺伝子、ワクチニアウィルスＷ
Ｒ株ＤＮＡのＨｉｎｄｌ［ｌ切断Ｆ７ラグメント、Ｍフ
ラグメント、Ｎフラグメント（ウィルス１１（１）、２
３−３３．（１９８６））など、外来性ＤＮＡの挿入に
よる変異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼ
さない領域を言う。

また、ワクチニアウィルス内で機能するプロモーターと
は、合成φ天然を問わずワクチニアウィルスが保有する
転写の系でプロモーターとして有効に機能しえるものな
らいかなる塩基配列のものでも良く、その具体例として
は例えばジャーナルオブ　ヴイロロジ−６６２−６６９
（１９８４）に示されるようなりクチニアウィルスのプ
ロモーター、具体的には７．５にポリペプチドをコード
するワクチニアウィルス遺伝子のプロモーター、１９に
ポリペプチドをコードするワクチニアウィルス遺伝子の
プロモーター、４２にポリペプチドをコードするワクチ
ニアウィルス遺伝子のプロモーター、チミジンキナーゼ
をコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモータ、
２８にポリペプチドをコードするワクチニアウィルス遺
伝子のプロモーターなどが例示される。

第一の組み換えベクターの作製については常法（例えば
特開昭５８−１２９９７１号、特公表昭６０−５００５
１８号、特開昭６２−４４１７８号など）に従えば良く
、例えばワクチニアウィルスの増殖に非必須なりＮＡ断
片を適当なベクターに組み込んだ後、必要に応じて該断
片中に存在する制限酵素切断点を利用しその下流に制限
酵素切断配列を付加したプロモーターを組み込めば良い
。

用いられるベクターの具体例として、例えばｐＢＲ３２
２，ｐＢＲ３２５，ｐＢＲ３２７゜ｐＢＲ３２８，ｐＵ
Ｃ７，ｇ）ＵＯ３，ｐＵｃ９゜ｐＵｃ１９などのごとき
プラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのどと゛
きファージ、ｐＨＣ７９（ジーン、１ユ、２９１．１９
８０年）などのごときコスミドが例示される。

本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流にＨＩＶ由来のｃＤＮＡを挿入して
第二の組み換えベクターが作製される。挿入方法もまた
常法（例えば前記各公報参照）に従えば良く、例えば第
１のベクターのプロモーターの下流に予め設けられた制
限酵素切断点を利用してＨＩＶ由来のｃＤＮＡ断片を挿
入ずれば良い。

これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子操作の容易な大ｌｌｌ菌の系を用いれば良く
、使用するプラスミドベクターも目的にかなうものであ
る限り特に限定されるものではない。

本発明においては、次に、予めワクチニアウィルスを感
染させた動物培養細胸に第二の組み換えベクターを移入
し、ベクターＤＮＡとウイルスゲツムＤＮＡの間に相同
組み換えを起こさせ、組み換えワクチニアウィルスを構
築する。ここで用いられる動物培養細胞はワクチニアウ
ィルスが増殖可能なものであればよく、その具体例とし
て、例えばＴＫ　　１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ（
ヒト羊膜由来）、）ｌｅｌａ（ヒト子宮頚部癌由来）、
ＫＢ（ヒト鼻咽喉癌由来）、ＣＶ−１（サル腎由来）、
Ｂ１０−１（サル腎由来）、ＲＫ１３（ウサギ腎由来）
、Ｌ９２９（マウス結合組織由来）、ＣＥ（鶏胚）ａ胞
、ＤＥＦ（鶏胎児繊維芽細胞）などが例示される。

組み換えワクチニアウィルスの構築に当たっては常法に
従えば良く、例えば、ＤＮＡクーロニング第２巻（Ｄ　
Ｎ　Ａｃ１ｏｎｉｎｏ　Ｖｏｌｕｓ＋ｅＩ［）　、実際
的なアプローチ（ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏ
ａｃｈ）　Ｄ　ｌ）　、　１９１−２１１、デイ、エム
、グローバー（ＯＨＧｌｏｖｅｒ）編、（ＩＲＬブレス
、オックスフォード。

ワシントン）の記述に準じてワクチニアウィルスを感染
させたＣＶ−１細胞にリン酸カルシウム共沈法により処
理した第二の引み換えベクターを移入させ、得られる組
み換えウィルスを含むウィルス集団をＥａａｌｅ　Ｍ　
Ｅ　Ｍ上に培養されたＴＫ陰性細胞に感染させＢＵｄＲ
存在下生育してくるプラークを選択し、組み換えウィル
ス候補株とすれば良い。これら候補株の内からＨＩＶの
ｇａｇ遺伝子、あるいは、ｇａｇ、ｐｏ　１両方の遺伝
子をコードするｃＤＮＡ断片が組み込まれたウィルスを
選択する方法については、候補株をプラーク純化したの
ち、該ＤＮＡをプローブとするハイブリダイゼーション
法を利用するか、あるいは、抗ＨＩＶ抗体を用いるイム
ノアッセイを利用すれば良い。

（発明の効果） かくして本発明によれば、ワクチニアウィルスの増殖に
非必須なゲノム領域にＨＩＶ（トＩＴＬＶ−ＩＩ／ＬＡ
Ｖ）由来のｇａｇ遺伝子、あるいは、ｇａｇ、ｐｏ１両
方の遺伝子をコードするＣＤＮＡがプロモータ機能を有
するＤＮＡと共に発現可能な形で組み込まれた組み換え
ワクチニアウィルスが得られる。

この組み換えウィルスを前記のごとき動物培養細胞に感
染させ、常法に従ってウィルスを増殖させると、感染細
胞中にｇａｇ遺伝子産物、あるいは、ｇａｇ、ｐｏ１両
方の遺伝子産物が生産される。得られた遺伝子産物はヒ
ト免疫不全症候群ウィルスＨＩＶ感染の診断に用いるこ
とができ、またヒト免疫不全症候群ウィルスＨＩＶの抗
原又は抗体陽性者のヒト免疫不全症候群（エイズ）又は
エイズ関連症候群（ＡＲＣ＞の発症の予防に有用である
ことが期待できる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ （１）　　ワクチニアウィルスチミジンキナーゼ（ＴＫ
）遺伝子を含む第１の組み換えベクター（ｐＵＨＫ）の
作製（第１図参照） ｐＵｃ９をＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ及びｐｓｔｌで消化後、ポ
リメラーゼで処理し、切断端を平滑末端したのち、連結
し、ＥＣＯＲ１部位の欠損したＥ）ＵＯ３を作製した。

このＥｃｏＲ１部位欠損ｐｕｃ９をＨｉｎｄｌｌｌで切
断後、ワクチニアウィルスＴＫ遺伝子を含むワクチニア
ウィルスＷＲ株のトｆｉｎｄ１１１Ｊ断片に連結し、第
１の組み換えベクターｐｔＪＨＫを得た。

（２）　　ポリリンカー及びワクチニアウィルス７．５
にプロモーターが挿入されたワクチニアウィルスＴＫ遺
伝子を含む第二の組み換えベクターｐＮＺ６８に２の作
製（第２図参照） ワクチニアウィルスＷＲ株の７．５にプロモーター（モ
スら、セル１２５．ｐ、８０５〜８１３゜１９８１年）
をｐＵｃ１９（ファルマシア社製）の＋ｔｎｃｍ部位に
挿入したのち、ト１ｉｎｄｌｌとＥＣＯＲＩで順次切断
して７．５にプロモーターの前後にポリリンカ一部位を
有するＤＮＡ断片（約３５０　ｂｐ）を得た。

このＤＮＡｌｉ片（第２図参照）及び（１）で得たプラ
スミド１）ＵＨＫのＥＣＯＲＩ消化物をポリメラーゼで
処理したのち、連結し、得られた組み換えプラスミドを
ｐＮ２６８に２と命名した。

（３）７．５にプロモーターの下流にＨＩＶＱａＱ及び
ｐｏ１３！Ｉ伝子を挿入した第二の組み換えプラスミド
（Ｗ−ＱａＧ）の作製（第３図参照）ＨＩＶの全ＣＤＮ
Ａを含むｐＮＬ４３をＢａｌ■とＥＣＯＲＩで消化後、
低融点アガロース電気泳動で約５．１ｋｂｐの断片を分
離し、フェノール抽出によりその断片を回収した。

このようにして得た断片中には、第３図に示すようにＣ
ＪａＱ及びｐｏｌ遺伝子領域が含まれている。

次に（２で得たｐＮＺ６８に２をＢａｍＨＩとＥＣＯＲ
Ｉで消化し先に調製したｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片とライゲーションしてｗ−ａ　ａ　ａを得た
。

なお、第３図にはｅｎｕ蛋白質、ｔａｔ蛋白質、ウィル
スの増殖に関与するＡ、Ｂ、Ｒなどのその他の遺伝子を
コードする領域をも表示しているが、それらの名称及び
機能についてはセル、４７１（ＯＣｔ、１０．１９８６
ＨＣ記載されティる。

（４）　　組換えワクチニアライスルの作出２５α２の
カルチャーボトルに培養されたＣＶ−１細胞にワクチニ
アウィルスＷＲ株（０，１Ｄｒｕ／細胞）を接種し、４
５分後、前記の組換えプラスミドｗ−ａａａを２．２ｍ
の減菌水で溶かし、樋高ら（白質、核酸、酵素、２７，
３４０゜１９８５）の方法によってＤＮＡ−リン酸カル
シウム共沈物をつくり、その０．５ｄを感染Ｃｖ−１細
胞上に滴下した。３０分間３７℃、５％ＣＯ２インキュ
ベーターに静置し、５％牛脂児血清を含むＥａｏｌｅ　
ＭＥＭ４　、５ｄを加えた。その３時間後培養液を交換
し、４８時間後、培養細胞ごと３度凍結融解し、聴音被
処理（３０秒）した。

組み換え体のｑａｑ及びｐｏｌ′ｓｉ伝子挿入を確認す
るため、６ｃＭのベトリ皿に培養されたＴＫ陰性（ＴＫ
　　）１４３１１１１１に上記プラーク形成ウィルスを
接種し、４５分後、１％寒天、１２％牛脂児血清、２５
μｇ／５ｅＢＵｄＲ７１１Ｅａｏｌｅ　ＭＥＭを積層し
、３日間培養後感染ＩＩｌ胞を０．０１％中性紅で染色
した。形成されたプラークをパスツールピペットで単離
しＥａａｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍ中に希釈する。単離したプラ
ークにつき、再度同様の操作を繰り返しプラークを純化
した。純化したプラークより得られたウィルスを増殖さ
せ、増殖ウィルスよりＤＮＡを調製し、ｇａｇ及びｐｏ
ｌ遺伝子をコードするＣＤＮＡをプローブとするドット
プ自ットハイプリダイゼーションにより、得られた組み
換えワクチニアウィルスがＨＩＶ由来の９ｄｇ及びｐｏ
ｌ遺伝子をコードするＤＮＡとゲノム内に持つ組み換え
ウィルスであることを確認し、Ｖ−２０−１−８と命名
した。

（５）　　組換え体の細胞での発現 組織培養用チャンバースライドに培養したＣｖ−１１１
胞に、ｍ、ｏ、ｉ、１又は０．１の本発明ウィルス株Ｖ
−２０−１−８を接種し、３７℃、１時間感染後ウィル
ス液を友ぎとり、ｍｒＩｉをＥａａ！ｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍで
洗浄し、５％牛脂児血清、４０μｇ／−シトシンアラビ
ノシド加Ｅａａｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍを加えた。１６時間後
、Ｅａｇｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍを除き、軽くＰＢＳ　（リン
ＦＩｉ！！衝生理食塩水）で洗い、軽く風乾した後、−
２０℃アセトン中５分間処理し細胞を固定し、−次抗体
として抗ＧａＧ−１）２４モノクロナ一ルマウス抗体を
、二次抗体としてビオチン椋式抗マウスＩ（ＪＧウマ抗
体を、発色方法としてアビジン化パーオキシダーゼと７
ミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）を用いる系を利用す
る酵素抗体法で、ＱａＱ遺伝子産物の産生を確認した。

さらに、感染細胞をＳＤＳで可容化後、ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動で分画しニトロセルロースフィルター
にプロッティング後（Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１２．１９５〜２０３　（１９８１
）　）、検出法として■　　ラベルプロティンＡを利用
する言わゆるウェスターンブロッティング法によっても
このｇａｃｌｌ伝子産物の発現が確認され、■−２０−
１−８感染細胞は、第４図に示す通り分子間約５５．０
００ダルトンのｇａｇ遺伝子産物相当の分子量を持った
蛋白質ならびにその分解物を産生じていることが判明し
た。

（６）　　マウスに対するワクチニアウィルス組換え体
の接種 １ｆｌｆｆｉ、ｔ１４ｉ　Ｕ；Ｊ　１０８Ｐ、Ｆ、Ｕ　
）　ヲ１　！Ｉ間隔テ？ウス（Ｂａ　ｌ　ｂ／ｃ）に２
回接種し、接種１週間後に採血し血清を分離した。この
血清を抗ＨＩＶ抗体を検出できるウェスタンプロットア
ッセイキット（ＢＩＧ−ＲＡＤ　Ｉｇ＋−ｕｎｏｂｌｏ
ｔ　Ａｓ５ａｙ　ｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ａ
ｎｔｉｂＯｄＶ　ｔｏ　　ＨＩＶ　）ならびに■　　ラ
ベルプロティンＡを利用して検定したところ抗ＱａＱ遺
伝子産物抗体の存在が確認され、接種した組み換え体が
ＱａＱ遺伝子産物に対する抗体産生訓導能を有すること
が判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐＵＨＫ、ｍ２図はｐＮＺ６８に２、第３め−
２０−１−８の４１築手順を示す。第４図はＶ−２０−
１−８感染細胞のウェスタンブロッティングの結果を示
す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ワクチニアウイルスの増殖に非必須なゲノムＤＮ
   Ａ領域にヒト免疫不全症候群ウィルスＨＩＶ（ＨＴＬＶ
   −III／ＬＡＶ）由来のｇａｇ遺伝子をコードするＣＤ
   ＮＡを組み込んだ組み換えワクチニアウイルス。
2. （２）該ＣＤＮＡがプロモーターの支配下にある特許請
   求の範囲第１項記載の組み換えワクチニアウイルス。
3. （３）該ｃＤＮＡがｇａｇ遺伝子及びｐｏｌ遺伝子をコ
   ードするものである特許請求の範囲第１項または第２項
   記載の組み換えワクチニアウイルス。