DE2721829C3 - Verfahren zur Herstellung eines immobilisierte mikrobielle Zellen enthaltenden hydrophilen komplexen Xerogels - Google Patents
Verfahren zur Herstellung eines immobilisierte mikrobielle Zellen enthaltenden hydrophilen komplexen XerogelsInfo
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Description
Enzyme sind biologische Katalysatoren und weisen •ine außergewöhnlich hohe Wirksamkeit sowie spezifsiche Eigenschaften auf. Sie können zur Katalysierung
finer Vielzahl von chemischen Reaktionen eingesetzt werden. Derartige enzymatische Reaktionen erfolgen
■nter milderen Bedingungen als übliche chemische Reaktionen und führen nicht zur Bildung schädlicher
Verbindungen. In diesem Zusammenhang wurde neuerdings der durch die chemische Industrie verursachten
Umweltverschmutzung besondere Aufmerksamkeit geschenkt.
Für die chemische Industrie ist es sehr vorteilhaft Enzyme zu verwenden. Der industrielle Einsatz von
Enzymen oder Mikroorganismen erfolgte durch Verwendung löslicher Enzymzubereitungen oder Mikroorganismen. Jedoch können derartige Biokatalysatoren
nur für einen einzigen Reaktions- oder Fermentationslatz verwendet werden. Wenn es dagegen möglich ist
Enzyme und Mikroorganismen zu stabilisieren und nach einem billigen Verfahren ohne Aktivitätsverlust wiederzugewinnen, können Biokatalysatoren in der Industrie
in erheblich größerem Umfang angewandt werden.
In diesem Zusammenhang bietet sich die Immobilisierung von Biokatalysatoren an. Immobilisierte Enzyme
werde immer mehr auf dem Gebiet der Technologie als auch der Medizin und Analytik verwendet. Die meisten
Untersuchungen zur Immobilisierung betrafen zellfreie Enzyme, jedoch wandte man sich in den vergangenen
Jahren in zunehmendem Maß der Verwendung immobilisierter ganzer mikrobieller Zellen zu. Die letztgenannten Systeme vermeiden eine vor der Immobilisierung
erforderliche Isolierung der Zellen sowie Extraktion und Reinigung des Enzyms. Immobilisierte Zellen sind in
weiterem Umfang zur Katalyse von Folgereaktionen einsetzbar und ermöglichen eine Regenerierung in situ
der nötigen Cofaktoren. Wenn es möglich ist, ein Mehrfach-Enzymsystem im immobilisierten Zustand
ίο kontinuierlich zu verwenden, kann das bisher übliche
Fermentationsverfahren durch ein anderes unter Verwendung von immobilisierten Zellen ersetzt werden.
Die Nachteile eines Verfahrens mit immobilisierten Zellen liegen in den Kosten für die Matrix und im
Verlust der katalytischen Aktivität oder in der Schwierigkeit, die Zellen während der Immobilisierung
vollständig zu erhalten. Die meisten mikrobiellen Zellen und Enzyme sind so instabil, daß sie durch die
Immobilisierung einen Verlust oder Veränderungen in
ihren enzymatischen Aktivitäten erleiden. Es ist sehr
schwierig, ein praxisgerechtes Verfahren zur Immobilisierung ohne die vorgenannten Nachteile zu erarbeiten.
Deshalb wurden bisher nur wenige leicht und in größerem Umfang einsetzbare Verfahren zur Immobili
sierung entwickelt
Bei der Immobilisierung mikrobieller Zellen werden
vier Arten von Verfahren unterschieden:
Verfahren unter Verwendung eines Trägers;
Verfahren, bei dem eine Vernetzung bewirkt wird;
Verfahren, bei dem ein Einschluß in ein Gel erfolgt;
Verfahren, bei dem ein Einschluß in Mikrokapseln erreicht wird.
Das Verfahren, bei dem ein Einschluß in ein Gel erfolgt wobei mikrobielle Zellen in der Gelmatrix
immobilisiert werden, wird in der Praxis vielfach
angewandt Jedoch hat dieses bekannte Verfahren eine Reihe von Nachteilen. Bei der Bildung des Gels unter
Einschluß mikrobieller Zellen nehmen deren enzymatische Aktivitäten wegen des häufigen Einflusses von
Faktoren der Umgebung, wie der Temperatur, des pH-Wertes, der lonenstärke und des Drucks, deutlich
ab. Deshalb besteht ein großes Bedürfnis nach einem neuen Verfahren der Gelbildung, bei dem die Stabilität
der Enzyme nicht beeinträchtigt wird. Unter diesem
Gesichtspunkt wurden viele Untersuchungen zur
Vernetzung und Gelbildung unter Verwendung verschiedener Polymerisate durchgeführt Physikalische
Verfahren zur Bildung von Gelen von Polymerisaten, beispielsweise durch Erniedrigen der Temperatur oder
Zugabe von Salzen oder nichtwäßrigen Lösungsmitteln, haben nicht befriedigt, da es im allgemeinen schwierig
ut, durch diese reversiblen Reaktionen stabile Gele zu erhalten.
daß Enzyme in einer Gelmatrix aus einem Polyvinylalkohol eingeschlossen werden können, wobei Enzyme
und Polyvinylalkohol in Wasser gelöst, bei vorzugsweise -25 bis -80°C verfestigt und bei Raumtemperatur
geschmolzen werden, um das die Enzyme einschließen-
6Q de Gel zu bilden. Aber die derart hergestellten Gele
werden instabil bei vergleichsweise hohen Temperaturen, wie 60 oder 700C, was dem Reaktionstemperaturbereich von Glucoseisomerase entspricht Auch die
chemischen Verfahren zur Herstellung einer Gelmatrix
f>5 durch vernetzende Verbindungen verlaufen unter zu
harten Bedingungen, so daß sie für die Verwendung biologischer Substanzen nicht geeignet sind. Dies rührt
von der hohen Reaktivität der vernetzenden Verbindun-
gen und dec hohen Temperatur sowie dem extrem hohen oder niederen pH-Wert bei der Gelbildungsreaktion
her. Wird beispielsweise das Geleinschluß-Verfahren unter Verwendung von Polyacrylamid angewandt,
so wird das Monomere Acrylamid mit N,N'-Meihylenbisacrylamid
in Anwesenheu eines Katalysators, wie Ammoniumpersulfat, polymerisiert. In diesem Fall wird
das Enzym oft durch den hochreaktiven Katalysator desaktiviert Deshalb müssen der pH-Wert und die
Temperatur für die Gelbildungsreaktion sorgfältig gewählt werden, um die enzymatischen Aktivitäten zu
erhalten (vgL Biotech. & Bioeng, Bd. 15 [1973], S. 93).
Darüber hinaus dürfen die erhaltenen Gele nicht im Bereich der pharmazeutischen Industrie oder der
Lebensmittelindustrie verwendet werden, da sie noch toxisch wirkendes monomeres Acrylamid enthalten
könnea In der JP-PS 53 583/75 ist beschrieben, daß Enzyme in eine Gelmatrix aus einem Polyvinylalkohol
eingeschlossen werden können, wobei Enzyme und der Polyvinylalkohol in Wasser gelöst werden und die
erhaltene Lösung mit Borsäure oder Natriumborat gemischt wird, um den gewünschten Geleinschluß der
Enzyme zu erhalten. In der Patentschrift wird v/eiterhin
berichtet, daß Enzyme ohne deutliche Denaturierung bei Geltemperaturen unterhalb 450C immobilisiert
werden können. Da jedoch die Gele nur in einem alkalischen System gebildet werden, kann dieses
Verfahren nur auf im alkalischen Medium stabile Enzyme angewandt werden. Auch muß hierbei die
Toxizität von Borsäure berücksichtigt werden. Andere Verfahren unter Anwendung von Vernetzungsreaktionen,
wobei energiereiche Strahlung, wie γ-, Elektronenoder Röntgenstrahlung, angewandt wird, sind in der
Praxis schwierig durchzuführen, da ein großer apparativer Aufwand erforderlich ist und besondere Vorsicht
darauf zu richten ist, die mit energiereichen Strahlen verbundenen physiologischen Wirkungen zu verhindern
(vgl. Biotech. & Bioeng., Bd. 15 [1973], S. 607).
Die nach bekannten Geleinschluß-Verfahren erhaltenen
immobilisierten Enzyme oder Mikroorganismen tind physikalisch und weisen im nassen Zustand eine
besonders niedrige mechanische Festigkeit ajf. Deshalb ist es auch schwierig, derartige Gele in kontinuierlichen
Umsetzungen über einen längeren Zeitraum zu verwenden. Wird eine Säule mit diesen Gelen für eine
kontinuierliche Umsetzung beschicKt, so werden sie durch den Wasserdruck zerstört, und es kann keine
zufriedenstellende Durchflußleistung für das Reaktionsgemisch erreicht werden.
Weitere Ausführungen auf dem einschlägigen Gebiet sind in Advance in Enzymology. Bd. 34 (1971), S. 445,
veröffentlicht.
Aus dem vorgenannten Stand der Technik ergab sich die Aufgabe, ein Verfahren zur Herstellung eines Gels
zur Immobilisierung mikrobieller Zellen mit enzymatischer
Aktivität zur Verfügung zu stellen, wobei sehr milde Bedingungen angewandt werden und damit die
Aktivität der mikrowellen Zellen nicht beeinträchtigt
wird.
Hierzu wurde die Bildung homogener komplexer Gele aus Siliciumdioxid und verschiedenen Arten
organischer Verbindungen untersucht, da Siliciumdioxid sowohl gegenüber Bioorganismen harmlos ist als auch
billig zur Verfügung steht. Werden ein Siliciumdioxid-Sol
und ein Siliciumdioxid-Gel, die in üblicher Weise hergestellt worden sind, unter verschiedenen
Bedingungen mit in VAsser löslichen Polymerisaten gemischt, so zeigt sich, daß weder ein viel Wasser
enthaltendes homogenes komplexes Lyogel oder homogene; transparentes komplexes Lyogel noch ein
transparentes komplexes Xerogel erhalten werden kann, obwohl hierbei Polymerisate mit sehr unterschiedlicher
Struktur eingesetzt wurden. Wird beispielsweise ein Siliciumdioxid-Sol zu einer wäßrigen Lösung von
Polyvinylalkohol (nachfolgend PVA genannt) gegeben, so wird eine Trennung in zwei Schichten beobachtet (5
bis 20% Siliciumdioxid, 1 bis 5% PVA). Oberhalb eines
ίο pH-Wertes von 5 wird das Gemisch vollständig in zwei
Schichten getrennt, wobei die eine das Siliciumdioxid, die andere den PVA enthält Unterhalb des genannten
pH-Wertes ist das Siliciumdioxid in der PVA-Schicht dispergiert und bildet Flocken. Bei keinem pH-Wert
wird das gewünschte homogene transparente Sol oder Gel gebildet Auch kann mit anorganischen Silicaten,
wie Wasserglas, keine homogene Lösung mit PVA durch saure Hydrolyse erreicht werden, so daß auch auf
diesem Weje das gewünschte homogene transparente komplexe Gel nicht erhalten werden '.,!nn.
Überraschenderweise wurde nun gefi'iden, daß die
vorgenannte Aufgabe gelöst werden kann, wenn das Verfahren angewandt wird, das in den Ansprüchen
gekennzeichnet ist
Das P'findungsgemäße Verfahren beruht darauf, daß
man ein Tetraalkoxysilan, wie Tetraäthoxysilan, in einer
wäßrigen Lösung eines Polymerisats, wie eines Polyvinylalkohole, einer Gelatine oder einer Carboxymethylcellulose
sauer hydrolysiert wobei sich ein homogenes komplexes Sol bildet. Dieses wird durch Trocknen in ein
in Wasser unlösliches Xerogel überführt. Es wurde weiterhin festgestellt daß mikrobielle Zellen mit
enzymatischer Aktivität durch Einschließen in eine Gelmatrix immobilisiert werden können, ohne die
enzymatische Aktivität zu beeinträchtigen, weil das vorgenannte komplexe Sol unter ganz milden Bedingungen
in ein Gel überführt wird.
Der wesentliche Vorteil des erfindur.gsgenäßen
Verfahrens liegt darin, daß ein hydrophiles Gel hergestellt werden kann, das in Wasser unlöslich ist,
bill.^ hergestellt werden kann und eine hervorragende
Verträglichkeit und Affinität gegenüber biologischen Substanzen aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren
erlaubt die Herstellung einer hydrophilen Gelmatrix, die sich gut zur Immobilisierung mikrobieller Zellen mit
enzymatischer Aktivität verwenden läßt. Die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens immobilisierten
mikrowellen Zellen weisen mehr als 50% der enzymatischen Aktivität der unbehandelten mikrobiel-Ien
Zellen auf. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten mikrowellen Zellen können
sowohl in einem kontinuierlichen Verfahren in einem Säulenreaktor oder in einem unter Rühren durchgeführten
Verfahren in einzelnen Chargen eingesetzt werden.
In der Zeichnung ist die Beziehung zwischen dem Umsatz von D-Glucose in D-Fructose und der Anzahl
der Verwendungen der Enzymzubereitung angegeben. Die Kurve 1 zeigt die mit immobilisierten Zellen
erhaltenen Ergcbr.sse. Kurve 2 die mit unbehandelten Zellen erhaltenen Werte.
Erfindungsgemäß wird ein hydrophiles komplexes Gel dadurch hergestellt, daß man aus einem wasserlöslichen
Polymerisat und einem Tetraalkoxysilan ein homogenes Sol herstellt, das nachfolgend unter milden
Bedingungen in ein ο si überführt wird. Das Tetraalkoxysilan
wird in der wäßrigen Lösung des Polymerisats sauer hydrolysiert und bildet dabei ein homogenes Sol.
In das so erhaltene SoI werden mikrobielle Zellen mit
enzymatischer Aktivität gegeben. Das Gemisch wird dann nach dem Einstellen des pH-Wertes getrocknet,
wobei ein in Wasser unlösliches Xerogel erhalten wird. In diesem liegt die enzymatische Aktivität unverändert
vor.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten, in Wasser löslichen Polymerisate weisen viele polare
Gruppen auf, wie Hydroxyl- und Carboxylgruppen, die mit sauren Hydroxylgruppen von Silikaten starke
Wasserstoffbindungen bilden.
Als wasserlösliches Polymerisat wird erfindungsgemäß ein Polyvinylalkohol mit einem mittleren Polymerisationsgrad
von 500 bis 2000 und einem Verseifungsgrad von 70 bis 100%, eine handelsübliche eßbare Gelatine
mit einer Gallertfestigkeit von mehr als 200 g shot/5 Sekunden im Bloom Gelometer (Method of Analysis
Association of Official Analytical Chemists, 11. Auflage,
S. 390 bis 391) oder eine handelsübliche eßbare f^rk^vumpthvl^pllnlrtc*» mit **in«>m f^arHrw vliprnntrc-
Polymerisats ab. Beispielsweise kann ein PVA mit einem mittleren Polymerisationsgrad von 500 bis 2000 und
einem Verseifungsgrad von 70 bis 100% verwendet werden, jedoch beträgt im Falle eines vollständig
j verseiften PVA die Menge an Siliciumdioxid vorzugsweise mehr als 20%, insbesondere mehr als 50%, jeweils
bezogen wie vorstehend angegeben. Dagegen wird eine geringere Menge an Siliciumdioxid verwendet, wenn ein
PVA mit einem niedrigeren Verseifungsgrad eingesetzt wird.
In der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens
trennt sich das Gemisch aus dem in Wasser löslichen Polymerisat und dem Tetraalkoxysilan wegen
ihrer Unverträglichkeit in zwei Schichten. Nach dem
\\ Einstellen des pH-Werts unter 3 durch Zugabe einer
sauren Verbindung wird das Gemisch bei Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Erhitzen bis unter 8O0C. gut
gerührt, um die Hydrolyse zu vervollständigen. Ie nipHricrpr fif*r rvW-Wprt nnH ip höhpr HlP Tpmnpratnr IQt
grad von 0,4 bis 0,8 und einem Natriumgehalt von 7,0 bis 8.5% eingesetzt.
Das in Wasser lösliche Polymerisat wird unter kräftigem Rühren in Wasser bis zu einer Konzentralion
aufgelöst, bei der die Viskosität der Lösung weniger als lOOOOcP, vorzugsweise weniger als 300OcP. beträgt.
Die vorgenannten Viskositäten werden mit einem B-Viskosimeter (Typ BL von Tokyo Keiki Co.. Ltd..
Rotor Nr. 3, 30 oder 12 U/min, Temperatur 40°C) gemessen.
Die im erfindungsgernäßen Verfahren eingesetzten Tetraalkoxysilane weisen die allgemeine Formel
Si(ORJi auf, in der R einen Alkylrest mit höchstens 12
Kohlenstoffatomen, beispielsweise eine Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Octyl- und Laurylgruppe, bedeutet.
Vorzugsweise stellt R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffatomen dar. Tetraäthoxysilan ist besonders
bevorzugt.
Das in Wasser lösliche Polymerisat wird mit dem vorgenannten Tetraalkoxysilan gemischt. Anschließend
wird der pH-Wert des Gemisches mit einer sauren Verbindung, die auch ein saures Salz darstellen kann und
die enzymatischen Aktivitäten der mikrobiellen Zellen ment beeinträchtigt, auf einen wert von unter j
eingestellt. Spezielle Beispiele für die saure Verbindung sind in nachfolgender Tabelle I angegeben.
(A) Anorganische Säuren: HCI. HNO3. H3PO4. H2SO4.
(B) Organische Säuren: Essig-, Glutamin-, Milch-, Malein-. Bernstein-, Ascorbin-, Citronen-, Weinsäure.
(C) Anorganische oder organische saure Salze: AICI3,
Monoammoniumcitrat
Die erforderliche Menge an Tetraalkoxysilan hängt von dessen Art und den Eigenschaften des wasserlöslichen
Polymerisats ab. Die Menge an Siliciumdioxid (das durch saure Hydrolyse gebildete Siliciumdioxd) im
Tetraalkoxysilan soll 5 bis 300 Gewichtsprozent vorzugsweise 50 bis 200 Gewichtsprozent, bezogen auf
das Trockengewicht des wasserlöslichen Polymerisats, betragen. Liegt die genannten Menge an Siliciumdioxid
unter 5%, nimmt die Löslichkeit des gebildeten Gels in Wasser deutlich zu, während bei einer entsprechenden
Menge an Siliciumdioxid von über 300% das Gel brüchig wird. Die Eigenschaften des Gels hängen vom
Gehalt an Siliciumdioxid im Tetraalkoxysilan und/oder der chemischen Struktur des im Wasser löslichen
desto schneller verläuft die Hydrolyse; jedoch werden die Reaktionsbedingungen entsprechend der Art des
gewünschten Gels gewählt. Die wäßrige Lösung des PVA und das Tetraäthoxysilans werden in einem
solchen Verhältnis gemischt, daß die Menge an
r> Siliciumdioxid im Tetraäthoxysilan 100 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht des PVA, beträgt.
Das Gemisch wird bei einem pH-Wert von 3 und bei Raumtemperatur in 2 Stunden vollständig hydrolysiert,
wobei ein farbloses transparentes homogenes kompie-
jn xes Sol erhalten wird. Die Vervollständigung der Hydrolyse kann dadurch bestimmt werden, daß die
Phasengrenze zwischen den beiden sich gebildeten Schichten verschwindet und eine homogene und
transparente Lösung erhalten wird. Dabei ändert sich
ii der zunächst spezifische Geruch des Tetraalkcxysilans
in einen alkoholischen Geruch.
Das gebildete Sol kann unterhalb der Raumtemperatur über einen längeren Zeitraum erhalten werden. Die
Eigenschaften des Sols ändern sich nicht, wenn es bei einerTemperaturvon5°C 1 Monat gelagert wird.
Das komplexe Sol kann durch Trocknen in ein Gel überführt werden. Die unter verschiedenen Bedingungen
aus dem gleichen in Wasser iosiichen Polymerisat erhaltenen komplexen Gele weisen verschiedene Grade
an Trübung auf. Beispielsweise wird ein komplexes Sol aus Gelatine und Tetraäthoxysilan bei einem pH-Wert
von unter 4 in ein transparentes Gel überführt. Das Gel mit der stärksten Trübung wird bei einem pH-Wert von
5 erhalten, während bei einem pH-Wert von über 7 das Gel semitransparent wird.
Die gebildeten komplexen Gele werden übliche-weise
in »Lyogele«, die viel Wasser enthalten, und »Xerogele«, weiche wenig Wasser enthalten, eingeteilt.
Bei den letzteren ist die Feuchtigkeit des Gels fast vollständig durch Trocknung beseitigt worden. Beim
erfindungsgemäßen Verfahren trennen sich die Komponenten des gebildeten Sols nicht sondern erhalten den
homogenen komplexen Zustand während der Verfahrensschritte Solbildung -«· Gelbildung -► Xerogelbildung.
Die hergestellten Xerogele sind in Wasser unlöslich oder schwer löslich, weisen jedoch hydrophilie
Eigenschaften auf.
Wie auch aus den nachfolgenden Beispielen ersichtlich ist, hängen die Eigenschaften der gebildeten
Xerogele von der Art des in Wasser löslichen Polymerisats und vom Verhältnis an Siliciumdioxid zum
Polymerisat ab. Im allgemeinen nimmt mit zunehmender Menge an Siliciumdioxid die Löslichkeit des Gels in
Wasser ab und es steigen Härte und Brüchigkeit. Umgekehrt wird das Gel flexibler mit zunehmender
Menge an im Wasrer löslichem Polymerisat. Was dessen Einfluß betrifft, beispielsweise im Fall des PVA, so
hängen die Eigenschaften des Xerogels vom Verseifungsgrad des PVA ab. Wird ein vollständig verseifter
PVA verwendet, beträgt die kleinste erforderliche Menge an Siliciumdioxid 50%, bezogen auf den PVA.
Wird aber ein ähnliches Xerogel unter Verwendung eines teilweise verseiften PVA (Verseifunpsgrad 87%)
hergestellt, so ist die erforderliche Menge an Siliciumdioxid geringer, muß aber noch über 20% liegen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können mikrobielle Zellen mit enzymatischen Aktivitäten unter
ganz milden Bedingungen dadurch immobilisiert werden, daß sie in eine Matrix aus einem der vorgenannten
komplexen Gele eingeschlossen werden. Die mikrobiellen Zellen werden dem vorgenannten homogenen Sol
entweder ohne tinstellen des pH-Werts oder unter Verwendung basischer Verbindungen, die auch in Form
eines Salzes vorliegen können, zugegeben. Spezielle Beispiele für geeignete basische Verbindungen sind in
nachfolgender Tabelle Il angegeben.
(A) Basen: NaOH1KOH1Ca(OH)2,
NH4OH.
(B) Basische Salze: Na2CO31CH3COONa,
NaHCO3,
K2CO3, K2HPO4, Na2HPO4,
CH3COOK.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbaren mikrobiellen Zellen sind getrocknete Zellen oder nasse
Zellen, die durch Zentrifugieren oder Filtrieren aus einer Brühe geerntet worden sind. Es kann auch die
Kulturbrühe selbst verwendet werden. Diese mikrobiellen Zellen werden in fünf Gruppen unterteilt, nämlich in
Bakterien, Actinomyceten, Fungi, Hefe und Algen. Spezielle Beispiele für entsprechende Bakterien, die
taxonomisch zur Klasse der Shizomyceten gehören, sind die Gattungen Pseudomonas, Acetobacter, Gluconobacter.
Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Leuconostoc. Streptococcus, Clostridium, Brevibacterium,
Arthrobacterund Erwinia.
Spezielle Beispiele für entsprechende Actinomyceten, die taxonomisch zur Klasse der Shizomyceten gehören,
sind die Gattungen Streptomyces, Nocardia und Mycobacterium (vgl. R. E Buchran und N. E. Gibbons,
»Bergeys Manual of Determinative Bacteriology«, 8. Auflage [1974]).
Spezielle Beispiele für entsprechende Fungi, die taxonomisch zur Klasse der Phycomyceten, Ascomyceten.
Fungi imperfecti und Bacidiomyceten gehören, zählen beispielsweise zu den Gattungen Mucor,
Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Monascus und Neurosporium (vgL J. A. von Arx, »The Genera of Fungi
Sporulating in Pure Culture« und H. L Barnett & Barry B. Hunter, »Illustrated Genera of Imperfect Fungi«, 3.
Auflage [1970]).
Spezielle Beispiele für Hefe, die taxonomisch zur Klasse der Ascomyceten gehören, sind beispielsweise
die Gattungen Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Candida, Torulopsis, Rhodotorula
und Kloechera (vgl J. Lodder, »The Yeast-A taxonomic study«, 2. Auflage [1970]).
Spezielle Beispiele für Algen gehören zur Gattung der Einzeller Chlorella und Scedesmus in Grünalgen
und Spirulina in Blaugrünalgen (H. Tamiya, »Studies on Microalgae and Photosynthetic Bacteria« [1963]).
Die meisten dieser mikrobiellen Zellen sind als Einzeller gewachsene Organismen. Die Zellengrößen
der vorgenannten Mikroorganismen sind verschieden, jedoch beträgt der Durchmesser oder die Breite der im
erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Zellen 1 bis 20 μ. Die mikrobiellen Zellen können in wasserhaltigen
Lösungsmitteln dispergiert werden. Einige Arten der Actinomyceten und der Fungi weisen eine Länge von
mehr als 20 μ auf. Größere mikrobielle Zellen mit einer durchschnittlichen Länge von 50 bis IOO μ und/oder
mikrobielle Zellen mit kugelförmiger Gestalt können in eine erfindungsgemäß hergestellte Gelmatrix auch
eingeschlossen werden, jedoch ist dann die Menge der eingeschlossenen Zellen geringer. Deshalb werden
derartige mikrobielle Zellen vorzugsweise auf eine Größe von unter 20 μ zerkleinert. Dies geschieht
beispielsweise durch mechanische Homogenisierung in Wasser. Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten
mikrobiellen Zellen der vorgenannten fünf Gruppen weisen mehr als eine enzymatische Aktivität
auf. Die Enzyme werden in fünf Gruppen unterteilt, wie aus nachfolgender Tabelle III ersichtlich ist.
(A) Oxidoreductasen:
Glucoseoxidase, Nitritreductase,
Catalase, Phenoloxidase, Monoaminoxidase,
Cytochromreductase.
Glucoseoxidase, Nitritreductase,
Catalase, Phenoloxidase, Monoaminoxidase,
Cytochromreductase.
(B) Transferasen:
Glutamatoxaloacetattransaminase,
Glutamatoxaloacetattransaminase,
16gliedrige Macrolid-3-acyltransferase,
ATPiNucleosid-S'-monophosphat-pyrophospho-
transferase.
(C) Hydrolasen:
Protease, Glucoamylase, a-Amylase,
Isoamylase, Lipase, Lactase,
Penicillinamidase, alkalische Phosphatase,
Aminoacyiase, Urease, Cellulase.
Isoamylase, Lipase, Lactase,
Penicillinamidase, alkalische Phosphatase,
Aminoacyiase, Urease, Cellulase.
(D) Isomerasen:
Glucoseisomerase, Alaninracemase.
Glucoseisomerase, Alaninracemase.
(E) Lyasen:
jJ-Tyrosinase, Histidindecarboxylase,
Tryptophanase.
Tryptophanase.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Enzyme sind intrazellulare Enzyme, die im Inneren von
mikrobiellen Zellen, von Mycel oder von Organellen der Bioorganismen vorliegen. Unter dem Ausdruck »Aktivität«
ist in diesem Zusammenhang nicht nur enzymatische Aktivität zu verstehen, sondern es werden damit
auch andere biologische Aktivitäten, wie Aktivitäten von Inhibitoren, Coenzymen, Antibiotika, Antigenen
und Antikörpern, umfaßt
Der pH-Wert des Gemisches aus dem komplexen Gel und den mikrobiellen Zellen soll unter Berücksichtigung
der Enzymstabilität oder der Eigenschaften des gebildeten Gels gewählt werden. Üblicherweise wird
der pH-Wert auf 4 bis 8, vorzugsweise 5 bis 7, eingestellt Bei der Immobilisierung mikrobieller Zellen ist die
Einstellung des pH-Wertes fai den meisten Fällen nicht
erforderlich, da diese Zellen im allgemeinen selbst eine Pufferwirkung aufweisen. Im allgemeinen stellt sich der
pH-Wert des vorgenannten Gemisches nach der Zugabe der Zellen auf 5 bis 6,5 ein.
Das Trockengewicht der zuzugebenen mikrobiellen Zellen beträgt weniger als 1000 Gewichtsprozent,
vorzugsweise 20 bis 500 Gewichtsprozent, bezogen auf das Trockengewicht des homogenen komplexen Sols.
Nach der Zugabe der mikrobiellen Zellen zum homogenen komplexen Sol wird das Gemisch gut
gerührt, um die Zellen homogen zu dispergieren. Die Überführung Jes Sols, das die mikrobiellen Zellen
enthält, in ein Gel findet bei irgendeiner Temperatur statt. Da jedoch die Enzyme bei höheren Temperaturen
instabil sind, wird die Gelbildung bei Temperaturen von 0 bis 70° C, vorzugsweise 10 bis 40° C, durchgeführt, und
ist im allgemeinen in 10 bis 30 Minuten vollständig. Beispielsweise wird das Sol unter kontinuierlichem
Rühren in 10 bis 20 Minuten bei einem pH-Wert von 6,0 und bei Raumtemperatur vollständig in ein Gel
eberführt.
Einer der wesentlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt in der Anwendung milder
Bedingungen bei der Immobilisierung der Zellen, wobei die enzymatischen Aktivitäten während des ganzen
Verfahrens ohne deutliche Beeinträchtigung erhalten bleiben.
Das die mikrobiellen Zellen enthaltende komplexe Gel wird getrocknet und in die gewünschte Form
eberführt. Das Trocknen erfolgt bei Temperaturen unter 75°C. Im Fall der Immobilisierung von Hefezellen
ist die Fermentationsaktivität vergleichsweise stabil, so daß das erfindungsgemäße Verfahren bei Raumtemperatur
durchgeführt werden kann. Sollen jedoch instabile Bakterienzellen, beispielsweise Zellen, wie sie für die
cnzymatische Synthese von L-Thyrosin verwendet werden, immobilisiert werden, wird das erfindungsgemäße
Verfahren bei Temperaturen unter 5° C durchgeführt, um die enzymatischen Aktivitäten zu erhalten,
wobei insbesondere die Trocknung des Gels vorzugsweise durch Gefriertrocknen erfolgt Solange die
Temperatur im vorgenannten Bereich gehalten wird, ist bei den eingesetzten Enzymen praktisch keine Verminderung
der Aktivität zu beobachten. Die Überführung der vorgenannten, immobilisierte mikrobielle Zellen
enthaltenden Lyogele in verschiedene Formen kann in üblicher Weise erfolgen. Das Formen kann vor ouei
nach dem Trocknen stattfinden. Hierzu können hydrophile oder hydrophobe organische Lösungsmittel
verwendet werden, in denen das komplexe Lyogel fast unlöslich ist Spezielle Beispiele für geeignete organische
Lösungsmittel sind in nachfolgender Tabelle IV •ngegeben.
(A) Alkohole:
Methylalkohol, Äthylalkohol,
n-PropylalkohoI, n-Butylalkohol,
Äthylenglykol, Glycerin.
n-PropylalkohoI, n-Butylalkohol,
Äthylenglykol, Glycerin.
(B) Ketone:
Aceton, Methylethylketon.
(Q Äther:
(Q Äther:
Dioxan, Tetrahydrofuran.
(D) Alkane:
n-Heptan, n-Paraffin.
n-Heptan, n-Paraffin.
(E) Aromaten:
Benzol Toluol, XyIoL
Benzol Toluol, XyIoL
(F) Andere:
Methylenchlorid.
Methylenchlorid.
Die Gestalt der im Gel immobilisierten mikrobiellen Zellen kann granulatähnlich (mit einem runden Bereich)
sein und beispielsweise die Form von Kugeln, Granulaten, Kügelchen oder Fäden aufweisen. Werden
die geformten immobilisierten mikrobiellen Zellen in einen Säulenreaktor gegeben, so werden in der damit
durchgeführten kontinuierlichen Umsetzung gute Ergebnisse erzielt, in einigen Fällen können die geformten
immobilisierten mikrobiellen Zellen auch in Form von Filmen, Streifen, unregelmäßigen Granulaten oder
Pulvern vorliegen. Der mittlere Durchmesser und/oder die mittlere Dicke der Teilchen des Gels, das die
mikrobiellen Zellen enthält, kann 0,2 bis 5 mm, vorzugsweise 0,4 bis 1,0 mm, betragen. Bei geformten
Gelen dieser Dicke wird der gewünschte Kontakt zwischen den immobilisierten Zellen und dem Substrat
erreicht. Darüber hinaus wird auch die gewünschte Durchflußgeschwindigkeit des Reaktionsgemisches
durch den Säulenreaktor erhalten.
Die gewünschte Form kann mittels Gießen durch einen Spalt hergestellt werden, da das die mikrobiellen
Zellen enthaltende komplexe Lyogel einen weichen Teig darstellt. Beispielsweise wird das erfindungsgemäß
hergestellte Lyogel durch Gießen durch einen Spalt in ein organisches Lösungsmittel oder in Luft in einen
langen Zylinder überführt und anschließend getrocknet. Auch kann das Lyogel durch Eintropfenlassen in ein
organisches Lösungsmittel oder in Luft und nachfolgendes Trocknen in runde Granulate überführt werden.
Um die gewünschte Form zu erhalten, können die Lyogele auch sprühgetrocknet werden. Die erhaltenen
Granulate weisen eine hohe spezifische Oberfläche und sonstige gute Eigenschaften für eine Verwendung in
einem Säulenreaktor auf.
Gute Ergebnisse werden auch durch Gefriertrocknen erreicht. Die enzymatischen Aktivitäten der auf diese
Weise erhaltenen Granulate werden in zufriedenstellender Weise erhalten. Dies trifft sogar bei Anwendung
dieses Verfahrens auf wärmeempfindliche mikrobielle Zellen zu, beispielsweise auf Bakterienzellen, die zur
enzymatischen Synthese von L-Tyrosin verwendet werden.
Eine anurie bevorzugte Form uci
hergestellten Gele ist der Film, der durch Auftragen des Sols auf die Oberfläche einer Platte erhalten wird. Das Gel in Form eines Films weist gleichfalls eine hohe spezifische Oberfläche auf und ist leicht herzustellen. Granulate der immobilisierten mikrobiellen Zellen können durch Pulverisieren erhalten werden. Im allgemeinen bleiben mehr als 80%, mindestens 50%, der enzymatischen Aktivitäten der unbehandelten mikrobiellen Zellen in den auf diese Weise erhaltenen Granulaten erhalten.
Die erfindungsgemäß erhaltenen immobilisierten mikrobiellen Zellen sind stabil und erhalten ihre Aktivitäten fiber einen längeren Zeitraum, wenigstens für 1 Jahr bei einer Lagertemperatur von 10° C und können für kontinuierlich oder chargenweise arbeitende Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise können die immobilisierten mikrobiellen Zellen von Glucoseisomerase ohne Verlust ihrer Aktivität in einem kontinuierlichen Verfahren unter Verwendung eines Säulenreaktors während 30 Tagen verwendet werden. Bei Ober einen längeren Zeitraum durchgeführten kontinuierlichen Verfahren können Druckverminderungen selbst oei vergleichsweise hohen Durchflußgeschwindigkeiten und bei verschiedenen Ionenstärken vernachlässigt werden.
hergestellten Gele ist der Film, der durch Auftragen des Sols auf die Oberfläche einer Platte erhalten wird. Das Gel in Form eines Films weist gleichfalls eine hohe spezifische Oberfläche auf und ist leicht herzustellen. Granulate der immobilisierten mikrobiellen Zellen können durch Pulverisieren erhalten werden. Im allgemeinen bleiben mehr als 80%, mindestens 50%, der enzymatischen Aktivitäten der unbehandelten mikrobiellen Zellen in den auf diese Weise erhaltenen Granulaten erhalten.
Die erfindungsgemäß erhaltenen immobilisierten mikrobiellen Zellen sind stabil und erhalten ihre Aktivitäten fiber einen längeren Zeitraum, wenigstens für 1 Jahr bei einer Lagertemperatur von 10° C und können für kontinuierlich oder chargenweise arbeitende Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise können die immobilisierten mikrobiellen Zellen von Glucoseisomerase ohne Verlust ihrer Aktivität in einem kontinuierlichen Verfahren unter Verwendung eines Säulenreaktors während 30 Tagen verwendet werden. Bei Ober einen längeren Zeitraum durchgeführten kontinuierlichen Verfahren können Druckverminderungen selbst oei vergleichsweise hohen Durchflußgeschwindigkeiten und bei verschiedenen Ionenstärken vernachlässigt werden.
Die erfindungsgemäß immobilisierten mikrowellen /eilen können als Katalysatoren in biochemischen
Umsetzungen verschiedener Substrate nicht nur in einem Säulenreaktor sondern auch in Reaktoren
verwendet werden, die chargenweise in Betrieb sind. Bei üblichen absatzweise arbeitenden Verfahren, bei denen
gerührt wird, ist ein Austreten von mikrowellen Zellen •us dem Gel oder eine Zerstörung des geformten Gels
praktisch nicht zu beobachten. Auch kann das in Wasser lösliche Polymerisat aus dem die immobilisierten
mikrowellen Zellen enthaltenden Gel wiedergewonnen und wiederholt verwendet werden, wenn die Aktivität
der Zellen nach einem langen Zeitraum der Benutzung abgenommen hat. Das in Wasser lösliche Polymerisat
oder das komplexe Sol kann durch Auflösen des Gels in heißem, alkalischem Wasser, beispielsweise in einer
wäßrigen Ammoniaklösung, Abtrennen der Zellen durch Zentrifugieren oder Filtrieren und nachfolgendes
Einstellen des pH-Wertes wiedergewonnen werden.
Die Beispiel? erläutern die Erfindung.
100 Teile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5)
werden mit 231,5 Teilen destilliertem Wasser, 28,5 Teilen Tetraäthoxysilan und 1 Teil 1 n-Salzsäure
gemischt Nach mehr als 2stündigem Rühren bei Raumtemperatur wird ein transparentes homogenes Sol
mit einem pH-Wert von 3 erhalten, das 5% Feststoff (nachfolgend »PVA-SiO2-Sol« genannt) enthält. 1 Teil
handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) wird in 2 Teilen Wasser suspendiert und
anschließend mit dem PVA-S1O2-SOI gemischt. Nach
dem homogenen Dispergieren der Hefe wird der pH-Wert des Gemisches mit wäßriger 1 n-Ammoniumhydroxidlösung
auf 7,0 eingestellt. Das Gel wird dazu in eine Petrischale gegossen und sofort bei Raumtemperatur
getrocknet. Man erhält einen Hefezellen enthaltenden gelblichbraunen Film. Ein 1 g der immobilisierten
Hefezellen enthaltender Teil des Films wird entnommen und bei 300C in 50 g einer 5prozentigen wäßrigen
Lösung von Glukose inkubiert, um einen Fermentaiiuimesi
durchzuführen. Nach wenigen Minuten beginnt eine starke Gasentwicklung, die nach 30 Minuten auf
der ganzen Oberfläche des Films beobachtet wird. Der Film quillt etwas und verändert seine Farbe, jedoch
bleibt seine Gestalt unverändert. Die Gasentwicklung hält 30 Stunden an. Der Reaktionsverlauf wird durch
Messen des Gewichtsverlusts des Films durch Freisetzen von Kohlendioxid abgeschätzt. Bei der Reaktion
wird ein leichter Geruch festgestellt, wie er bei alkoholischer Fermentation bekannt ist. Eine Zunahme
der Trübheit der Glukoselösung, die durch Austreten von Hefezellen aus dem Film verursacht würde, ist kaum
zu beobachten. Vielmehr bleibt das Gemisch fast transparent Zur Kontrolle wird die gleiche Reaktion
unter Verwendung von 1 g getrockneter Hefezellen durchgeführt, die jedoch nicht immobilisiert worden
sind. Zu Beginn der Reaktion wird dabei eine etwas größere Menge an Kohlendioxid freigesetzt als bei den
immobilisierten Zellen, jedoch war nach 30 Stunden Inkubation die Geschwindigkeit der Kohlendioxidentwicklung
in beiden Medien etwa gleich. Daraus ist ersichtlich, daß die Aktivität der Hefezellen in der
unbehandelten und der immobilisierten Form fast gleich
ist und somit eine Inaktivierung der Enzyme durch das Verfahren der Immobilisierung der Hefezellen nicht
verursacht wird. Da jedoch die nicht immobilisierten Zellen im Reaktionsmedium suspendiert werden müssen,
ist für die Weiterführung der Reaktion leichtes Rühren erforderlich. Die vorstehenden Ergebnsise
zeigen, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren immobilisierten mikrowellen Zellen eine Fermentationsaktivität
aufweisen, die derjenigen von unoehandelten Zellen gleich ist.
Es wird das gleiche PVA-S1O2-SOI wie in Beispiel 1
eingesetzt. 4 Teile handelsüblicher getrockneter Hefe (Saccharomyces cerevisiae) wird in 5 Teilen Wasser
suspendiert. Die Suspension wird in 20 Teilen PVA-S1O2-SOI eingemischt, und das erhaltene Gel auf
eine Platte aufgetragen und durch Belüftung getrocknet, wobei ein gelblichbrauner, Hefezellen enthaltender Film
erhalten wird. Ein 1 g immobilisierter Zellen enthaltender Streifen des Films wird zerkleinert und bei 30°C in
50 g einer 5prozentigen wäßrigen Glukoselösung
inkubiert, um eine Fermentation gemäß Beispiel 1 durchzuführen. Eine große Menge Kohlendioxid wird
bereits in der Anfangsphase der Inkubation freigesetzt, wie es bereits beim Kontrollversuch in Beispiel 1
beobachtet worden ist. Nach Beendigung der Fermentation wird der Film aus dem Reaktionsmedium
genommen und in weitere 50 g einer 5prozentigen wäßrigen Glukoselösung getaucht, wobei in gleichem
Umfang das Freisetzen von Kohlendioxid beobachtet wird wie im Kontroll"/ersuch gemäß Beispiel 1 mit nicht
jo behandelten Zellen. Die vorgenannte Fermentation wird fünfmal wiederholt, wobei der in Glukoselösung
getauchte Film jedesmal etwa die gleiche Fermentationsaktivität zeigt. Eine entsprechende Fermentation
wird unter Verwendung von 1 g nicht immobilisierter Zellen durchgeführt, um die hierbei erhaltenen Ergebnisse
mit den Ergebnissen zu vergleichen, die mit immobilisierten Zellen erhalten worden sind. In beiden
Tests werden die Hefezellen durch Zentrifugieren aus dem Medium abgetrennt und dann erneut in dem
Medium suspendiert Bei jeiiem Test beträgt die Menge an freigesetztem Kohlendioxid aus 50 g einer 5prozentigen
wäßrigen Glukoselösung mehr als 85% d. Th.
100 Teile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines
PVA (Polymerisationsgrad 2000, Verseifungsgrad 88) werden mit 181 Teilen Wasser, 18 Teilen Tetraäthoxysilan
und 1 Teil 1 η-Salzsäure gemischt Das Gemisch wird bei Raumtemperatur über 2 Stunden gut gerührt, wobei
ein homogenes transparentes Sol mit einem pH-Wert von etwa 3 und einem Feststoffgehalt von 5% erhalten
wird. Daneben werden 2 Teile handelsübliche getrocknete Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) in 4 Teilen
Wasser suspendiert Die Suspension wird mit 20 Teilen des vorher erhaltenen PVA-SiOrSoIs gemischt und gut
gerührt Das so erhaltene Gel wird auf eine Platte aufgetragen und durch Belüften bei Raumtemperatur
getrocknet, wobei sich ein gelblichbrauner, 1 g Hefezellen enthaltender Film bildet
Dieser Film wird gemäß Beispiel 1 einem Fermentationstest unterzogen. Die Fermentation verläuft mit
einer Geschwindigkeit, die zwischen den Geschwindigkeiten liegt, wie sie gemäß Beispiel 1 und 2 festgestellt
worden sind. Das bedeutet daß die Menge an freigesetztem Kohlendioxid in der Anfangsphase der
Reaktion etwas geringer als die Menge ist die mit nicht immobilisierten Zellen erhalten worden ist, jedoch die
bis zur Endphase der Reaktion erreichte Menge an
Kohlendioxid 85% &Th- beträgt Dieses Jirgebnis
entspricht fast dem unter Verwendung der nicht immobilisierten Zellen erhaltenen Ergebnis.
100 Teile handelsüblicher Gelatine, die für die Verwendung in Lebensmitteln vorgesehen ist, werden
mit 15 Teilen Tetraäthoxysilan, 66 Teilen Wasser und 5
Teilen 1 η Salzsäure gemischt Das Gemisch wird bei etwa 500C über 2 Stunden gerührt, wobei ein
transparentes homogenes komplexes Sol mit einem pH-Wert von etwa 3 und einen Gehalt an Feststoff von
5% erhalten wird. Daneben werden 2 Teile handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe in 3 Teilen Wasser
suspendiert und die erhaltene Suspension in 20 Teile des vorher erhaltenen PVA-SiOj-SoIs gegeben. Nach gutem
Rühren wird das erhaltene Gel auf eine Platte aufgetragen und bei Raumtemperatur getrocknet Man
erhält einen gelblich-braunen, immobilisierte Hefezellen enthaltenden Film, der zerbrechlicher und spröder war
als die gemäß den Beispielen 1 bis 3 erhaltenen Filme. Ein 1 g der immobilisierten Zellen enthaltender Streifen
des hergestellten Films wird zerkleinert und ;ji 50 g
einer 5prozentigen wäßrigen Glukoselösung getaucht, wonach der Fermentationstest gemäß Beispiel 3
durchgeführt wird. Während der Fermentation werden mehr als 85% der Theorie an Kohlendioxid freigesetzt
wobei ein Austreten von mikrobiellen Zellen aus dem Film nicht beobachtet werden kann. Daraus ist zu
entnehmen, daß die Hefezellen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren stark immobilisiert werden.
Gemäß Beispiel 1 wird ein PVA-SiOrSoI hergestellt. Eine Probe von Erwinia herbicola (ATCC 21434), einem
/J-Tyrosinase-bildenden Stamm, wird im nachfolgend
angegebenen Nährmedium gezüchtet.
L-Tyrosin
KH2PO4
MgSO4
02 g/100 ml 0.05 g/100 ml 0.05 g/100 ml
Pyridoxin HCl
Glycerin
Fumarsäure
L-Phenylalanin
DL-Alanin
Glycin
Mononatriumglutamat
Aji-eki
Zn++
Fe* +
pH-Wert
0,01 g/100 ml
0,6 g/100 ml
0,7 g/l 00 ml
0,2 g/100 ml
0,4 g/100 ml
0,3 g/100 ml
0,45 g/00 ml
1,0 g/100 ml
2,0 ppm
2,0 ppm
7,5
0,6 g/100 ml
0,7 g/l 00 ml
0,2 g/100 ml
0,4 g/100 ml
0,3 g/100 ml
0,45 g/00 ml
1,0 g/100 ml
2,0 ppm
2,0 ppm
7,5
4 g (Trockengewicht 1 g) der kultivierten Bakterienzellen werden durch Zentrifugieren aus der Kulturbrühe
abgetrennt und gemäß Beispiel 1 immobilisiert wobei jedoch die Gefriertrocknung angewandt wird. Alle
Verfahrensstufen werden bei Temperaturen unter 5° C durchgeführt Die enzymatische Aktivität der durch die
vorgenannten immobilisierten Zellen gebildeten /J-Tyrosinase wird durch Messen der Menge an synthetisiertem
L-Tyrosin im nachfolgend angegebenen Medium bestimmt wobei 20 mg immobilisierter Bakterienzellen
verwendet werden.
Medium zur Bildung von L-Tyrosin
Natriumpyruvat | 3,0 g |
Ammoniumacetat | 5.0 g |
EDTA | 03 g |
Natriumsuirt | 0.2 g |
Pyridoxalphosphat | 0,01g |
Phenol | 0.1g |
Wasser Rest bis | |
100 ml |
pH-Wert
8.0
Wie aus nachfolgender Tabelle V ersichtlich ist beträgt die relative Aktivität der gemäß vorstehendem
Beispiel immobilisierten Bakterienzellen zur Synthese von L-Tyrosin etwa 85% oder mehr, verglichen mit der
Aktivität im Kontrollversuch unter Verwendung von nicht-immobilisiertcn Bakterienzellen.
Nasse BaIclcnenzellcn
H2O
PVA-SrO2-SoI
NH4OH
Lösung
Mengenverhältnis getrocknete
Zcllcn/gesamler
Feststoff
Relative
Aktivität
Kontrolle
Versuch 1
Versuch 2
Versuch 3
Versuch 4
Versuch 5
Versuch 1
Versuch 2
Versuch 3
Versuch 4
Versuch 5
0.4
02
0.1
0.067
0.04
1/3
1/2
2/3
3/4
1/2
2/3
3/4
5/6
100
90,4
89,0
85.6
84.2
883
90,4
89,0
85.6
84.2
883
Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die Aktivität immobilisierter Bakterienzellen hervorragend ist. 1 g
der gemäß Versuch 3 in Tabelle V erhaltenen immobilisierten Bakterienzellen werden in eine Säule
gegeben, der kontinuierlich mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 5 ml/Stunde das Reaktionsgemisch
zur Synthese von L-Tyrosin zugeführt wird. Ein gleichbleibender Zustand in dieser L-Tyrosin-Synthesc
wird in der Säule nach 12 Stunden kontinuierlicher Zuführung des Reaktionsmediums erreicht. Dieser
Zustand wird auch 24 Stunden nach Beginn der Zuführung des Reaktionsmediums aufrechterhalten.
wobei die Reaktionsgeschwindigkeit bei etwa 0,6 mg/ml gehalten wird.
Ein PVA-SiO2-SoI wird auf folgende Weise hergestellt:
50 g einer lOprozentigen wäßrigen Lösung von PVA (Polymerisationsgrad 2000. vollständig verseift)
werden mit 20 g Wasser. 5 g Tetraäthoxysilan und Igln
Salzsäure unter Rühren gemischt. Das trübe Gemisch ändert sich allmählich in 2 Stunden bei Raumtemperatur
in ein farbloses, transparentes, homogenes komplexes Sol.
Gemäß Beispiel 5 werden 4 g BakterienzeUen (Trockengewicht 1 g) mit j3-Tyrosmase-Aktivität in 6 g
Wasser suspendiert Die Suspension wird mit 20 g des vorgenannten Sols homogenisiert, das vorher auf 5° C
abgekühlt worden ist Nach dem Einstellen des pH-Werts mit I η wäßriger Ammonturahydrojddlösirag
auf 7,0 wird das Gel in jeweils Aceton, Methylenchlorid
und Isopropanol extrudiert, wobei die Lösungsmittel in
einem Kühlbad aus Trockeneis und Aceton gekühlt werden. Die extrudierten Gele werden unmittelbar
anschließend gefriergetrocknet wobei ein Präparat von immobilisierten Bakterienzellen in granulierter Form
erhalten wird. Die Bildung von L-Tyrosin wird unter
Verwendung von jeweils 40 mg der vorgenannten granulierten Produkte untersucht
Wie aus nachfolgender Tabelle Vl ersichtlich ist,
beträgt die relative Aktivität der immobilisierten
Bakterienzellen für die Bildung von L-Tyrosin jeweils
mehr als 50% int Vergleich zu der Aktivität, die mit 40
mg nicbt-immobflisierten Bakterienzellen erreicht worden ist Im Fall der Verwendung von Methylenchlorid
wird eine relative Aktivität von 70% erreicht Während
der Bildung von L-Tyrosin wird ein Austreten von
Bakterienzellen aus dem granulierten Produkt nicht beobachtet
Nasse Bakterienzellen
H2O
PVA-SiO2-SoI
Mengenverhältnis getrocknete
Zellen/gesamter
Feststoff
Relative
Akrvrtät
Versuch 6
Versuch 7
Versuch 8
4
4
4
20
20
20
Aceton
1/2
1/2
1/2
54,0
703
61,1
100 Gewichtsteile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 993) werden mit 2313 Gewichtsteilen
destilliertem Wasser, 283 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan und 1 Gewichtsteil 1 η Salzsäure gemischt Das
Gemisch wird über 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei ein transparentes homogenes komplexes
Sol mit einem Gehalt an Feststoff von 5% und einem pH-Wert von etwa 3 gebildet wird 5 Gewichtsteile
handelsüblicher mikrobieller Zellen von Glukoseisomerase (taxonomische Bezeichnung: Streptomyces albus)
werden in 10 Gewichtsteilen Wasser suspendiert nachdem das Mycel in einem Homogenisator 3 Minuten
bei 18 000 U/min zerkleinert worden ist Die erhaltene Suspension wird in 20 Gewichtsteile des mit 1 η
Salzsäure auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellten komplexen Sols gegeben und darin durch Rühren
dispergiert Das gebildete Gel wird in eine Petrischale gegossen und bei einer Temperatur von 55" C durch
Belüften getrocknet wobei ein brauner, immobilisierte Zellen enthaltender Film erhalten wird. Der Film wird in
einer Reibschale zerkleinert und durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 1 mm in ein feines Granulat
überführt. Die so hergestellten immobilisierten mikrobiellen Zellen von Glukoseisomerase weisen eine
spezifische Aktivität von 925 Einheiten/g auf, wobei die Aktivität der Glukoseisomerase 88% der ursprünglichen Zellen beträgt.
Die Einheit eines Enzyms ist definiert als diejenige
Menge des Enzyms, die I mg D-Fructose unter den folgenden Bedingungen bildet:
Das Reaktionsgemisch enthält 0,1 Mol D-Glukose und 0.005 Mol MgSO4 7 H2O. und die Reaktion wird I
Stunde bei einer Temperatur von 70° C und einem pH-Wert von 7,2 durchgeführt.
Granulierte immobilisierte Zellen mit einem Gehalt von I g getrockneten Zellen werden in 100 ml einer
40prozeniigen Lösung von D-Glukose, die 0,005 Mol MgSO4 enthält, 24 Stunden bei einer Temperatur von
70°C inkubiert. Nach der Inkubation werden die immobilisierten Zellen durch Filtration abgetrennt und
sechsmal hintereinander für die gleiche Reaktion verwendet um die Stabilität der Enzymaktivität in den
immobilisierten Zellen zu überprüfen. Unter den gleichen Bedingungen wird 1 g (Trockengewicht)
nicht-behandelter (nicht-immobilisierter) Zellen inkubiert Das Ergebnis ist in der Zeichnung erläutert In
dieser ist eine graphische Darstellung gezeigt in der auf der Ordinate das Verhältnis der Gewichtsprozente von
D-Fructose zur gesamten Menge an Feststoff im
Reaktionsgemisch und auf der Abszisse die Anzahl der
Verwendungen der Enzymzubereitung aufgetragen sind. Aus der Zeichnung ist ersichtlich, daß die Menge
der gebildeten Fructose nach sechsmaliger Verwendung der immobilisierten Zellen auf etwa die Hälfte
gegenüber dem Anfangszustand zurückgeht während dies im Fall der nicht-behandelten Zellen bereits nach
zweimaliger Verwendung zutrifft
50 g von gemäß Beispiel 7 hergestellten immobilisierten Zellen von Glukoseisomerase werden in eine Säule
mit den Abmessungen 23 cm χ 20 cm gegeben, wobei das Volumen der immobilisierten Zellen 80 ml beträgt
Die Säule wird auf einer Temperatur von 65° C gehalten
und zur kontinuierlichen Isomerisierung finer 60prozentigen Lösung von D-Glukose verwendet, wobei
diese Lösung 0,005 Mol MgSO4 enthält und einen pH-Wert von 73 aufweist Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt SV 1. Die umgesetzte Lösung wird
gesammelt Der Prozentsatz an D-Fructose im Verhältnis zum Feststoffgehalt der umgesetzten Lösung wird 30
Tage lang auf etwa 50% gehalten und dann allmählich vermindert bis er nach 38 Tagen weniger als 25% ist
Die Durchflußgeschwindigkeit SV 1 bedeutet daß
vom Reaktionsgemisch in 1 Stunde das gleiche Volumen
durch die Säule fließt das auch die immobilisierten Zellen in der Säule belegen.
Gemäß Beispiel 7 hergestellte immobilisierte mikrobielle Zellen mit Glukoseisomeraseaktivität werden in
einen Säulenreaktor gegeben, wobei der Druckabfall durch fließendes Wasser gemäß der Methode von T.
Fukushima et al (vgl »Immobilized Enzyme Technology«, (1975), S. 225) gemessen wird. Der mittlere
Durchmesser der immobilisierten mikrobiellen Zellen mit Glukoseisomeraseaktivität beträgt 0,099 cm. Der
Durchmesser des Säulenreaktors D ist 1,24 cm, die
Länge L der Reaktionszone 6,4 cm. Durch den Reaktor
wird Wasser mit einer Geschwindigkeit von V = 58 cm/Stunde geführt, wobei die Aufstrom-Methode
angewandt wird. Es wird festgestellt, daß der Druckabfall AP/L 0315 m Wassersäule/m Reaktionszone
beträgt Die als Vergleich in einem unter Verwendung von Polyacrylamid hergestellten Gel immobilisierten
mikrobiellen Zellen mit Glukoseisoraerase haben einen Druckabfall von AP/L = 5,438 m Wassersäule/m
Reaktionszone unter Anwendung der gleichen Bedingungen.
10
Gemäß Beispiel 7 wird ein komplexes Sol hergestellt Clukoseoxidase bildende fadenförmige Fungi (Aspergilkis niger ΙΑΜΉ)20) werden 3 Tage bei 300C in einem
Schflttelkolbew gezüchtet, wobei das nachfolgend angegebene Nährmedium verwendet wird:
Lösliche Stärke | 3,0% |
Pepton | OJSVo |
Fleischextrakt | 03% |
KH2PO4 | 0,01% |
MgSO4 | 0,01% |
FeSO4 | 0,001% |
pH-Wert | 6,0 |
Aus der Kulturbrühe w Wd dua Ii Filtration geerntet 4
g der nassen Zellen (entsprechend 1 g Trockengewicht)
werden in 10 ml einer 0,1 m fNosphatpufferlösung luspendiert, wobei ein pH-Wert von 7,0 vorliegt Das
Mycel wird in einem Homogenisator 3 Minuten bei 18 000 U/min zerkleinert Die erhaltene Suspension
wird in 10 g des oben genannten PVA-SiOrSoIs gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt
Das Gemisch wird dann in eine Petrischale gegossen and bei Raumtemperatur belüftet, wobei 14 g eines
gelblich-braunen Films von immobilisierten Zellen erhalten wird. 1 g nicht immobilisierter nasser Zellen
weist 240 Einheiten an Glukoseoxidaseaktivität auf, während 1 g der hergestellten immobilisierten Zellen
einen entsprechenden Wert von 510 Einheiten an Aktivität haben. Die Wiedergewinnung von Glukoseoxidaseaktivität durch dieses Verfahren der Immobilisierung beträgt 87%/g der Zellen.
Eine Einheit der Glukoseoxidaseaktivität bedeutet
die Menge an Enz>m. die 1 μΜοΙ Glukose in 1 Minute
oxidiert
Beispiel 11
100 Gewichtsteile einer Sprozentigen wäßrigen
Lösung einer eßbaren Gelatine werden auf eine Temperatur von 500C erwärmt um rührbar zu werden,
and anschließend mit 15 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan, 66 Gewichtsteilen Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η
Salzsäure gemischt. Das Gemisch wird mehr als 2 Stunden gerührt, wobei sich ein durchsichtiges homogenes komplexes Sol bildet. Dieses weist einen Feststoffgehalt von 5% und einen pH-Wert von etwa 3 auf.
Daneben werden Zellen von Nitritreductase bildender Chlorella fusca 4 Tage bei 25° C und Belüftung im
nachfolgend angegebenen Nährmedium gezüchtet:
Glycerin
Na-Nitrit
KHaPO4
MgSO4
KCI
FeSO4
pH-Wert
03%
0,25%
0,13%
0,24%
0,16%
0,0002%
b,8
geerntet 6 g der nassen Zellen (entsprechend 1 g Trockengewicht) werden in 10 ml Wasser suspendiert
Die erhaltene Suspension wird mit 10 ml Gelatine-SiO2-SoI gemischt und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt Das Gemisch wird anschließend in eine
is Petrischale gegossen und gefriergetrocknet wobei 2,1 g
eines dunkelgrünen Films erhalten werden. 1 g nicht-immobilisierter nasser Zellen weisen 2,6 Einheiten
an Nitritreductaseaktivität auf, während der entsprechende Wert für 1 g immobilisierter Zellen 6,2 Finheiten
beträgt Die Wiedergewinnung der Nitritreductaseaktivität mittels dieses Verfahrens der Immobilisierung
beträgt 83% pro g der Zellen.
Eine Einheit der Nitritreductaseaktivität bedeutet die Menge an Enzym, die ΙμΜοΙ in 1 Minute bei einer
Beispiel 12
100 Gewichtsteile einer wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 99,5) wer
den mit 221 Gewichtsteilen destilliertem Wasser, 36
Gewichtsteilen Tetrapropoxysilan und 3 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt Das Gemisch wird unter Rühren
über 2 Stunden auf eine Temperatur von 500C erhitzt
wobei sich ein transparentes homogenes komplexes Sol
bildet das etwa 5% Feststoff enthält
1 Gewichtsteil handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe wird in 2 Gewichtsteilen Wasser suspendiert Die
Suspension wird durch Rühren gut im vorgenannten Sol dispergiert Der pH-Wert wird mit 1 η wäßriger
Natriumhydroxidlösung auf etwa fi eingestellt Dann wird das Gemisch in eine Petrischale gegossen und
sofort bei einer Temperatur von vnter 300C belüftet
wobei ein gelblich-brauner Film erhalten wird. In 50 g einer Sprozentigen wäßrigen Lösung von Glukose wird
bei 300C ein Fermentationstest durchgeführt, wobei ein
Teil des erhaltenen Films, der 1 g der getrockneten Zellen enthält verwendet wird. Die Fermentation
verläuft gut und es wird die Bildung von Kohlendioxid beobachtet Dessen Menge beträgt etwa 80% d. Th.
Während der Reaktion wird das Austreten von Zellen aus dem Film nicht beobachtet weshalb das Reaktiqnsgemisch während der ganzen Fermentation nicht trübe
100 Gewichtsteile einer lOprozentigen wäßrigen Lösung eines PVA (Polymerisationsgrad 1700, Verseifungsgrad 994) werden mit 27 Gewichtsteilen destilliertem Wasser, 27 Gewichtsteilen Tetramethoxysilan und 2
Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt
Das Gemisch wird mehr als 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, wobei sich ein homogenes
transparentes Sol bildet, das 5% Feststoff enthält. 2 Gewichtsteile handelsüblicher mikrobieller Zellen mit
Glukoseisomeraseaktivität (taxonomische Bezeich
nung: Streptomyces albus) werden gemäß Beispiel 7 in
20 Teilen des vorgenannten komplexen Sols immobilisiert. Die Wiedergewinnung der Aktivität nach diesem
Verfahren der Immobilisierung beträgt 82%.
100 Gewichtsteile einer 5prozentigen wäßrigen Lösung einer eßbaren Gelatine werden auf eine
Temperatur von 500C erhitzt, um sie rührbar zu machen,
und mit 13 Gewichtsteilen Tetramethoxysilan, 85 Gewichtsteilen destilliertem Wasser und 5 Gewichtsteilen
1 η Salzsäure gemischt Das Gemisch wird über 2 Stunden gerührt, wobei sich ein transparentes homogenes
komplexes Sol bildet, das etwa 5% Feststoff enthält 2 Gewichtsteile handelsüblicher getrockneter Bäckerhefe
werden in 3 Gewichtsteilen Wasser suspendiert Die Suspension wird in 20 Gewichtsteilen des
vorgenannten Sols unter Rühren eingemischt, wobei sich eine homogene Lösung bildet Das Gemisch wird in
eine Petrischale gegossen and belüftet Man erhält einen gelblichen Film, der brüchig ist und leicht zerstört wird.
Unter Verwendung eines 1 g der getrockneten Zellen enthaltenden Streifens des hergestellten Films wird ein
Fermentationstest durchgeführt Die Menge an freigesetztem Kohlendioxid beträgt mehr als 80% d. Th. Es
wird kein Austreten von Zellen beobachtet, was zeigt daß die Immobilisierung sehr gut ist
Beispiel 15
100 Gewichtsteile 5prozentiger Carboxymethylcellulose, die als handelsüblicher Zusatz für Lebensmittel
verwendet wird, werden mit 27 Gewichtsteilen Tetraäthoxysilan, 118 GewichtsteUen destilliertem Wasser
und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt Das Gemisch wird mehr als 2 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt, wobei ein komplexes Sol erhalten wird. Dieses ist homogen, aber trüber als das unter Verwendung
eines PVA erhaltenen Sols. 3 Gewichtsteile eine.
handelsüblichen getrockneten Hefe werden gemäß Beispiel 12 mit 20 Teilen des vorgenannten Sols
immobilisiert Der erhaltene Film mit immobilisierten Zellen ist ziemlich spröde und wird in trockener Form
leicht zerstört Unter Verwendung eines 1 g der
ίο getrockneten Zellen enthaltenden Streifens des hergestellten
Films wird gemäß Beispiel 12 ein Fermentationstest durchgeführt Die Menge an freigesetztem
Kohlendioxid beträgt mehr als 85% d. Th, wobei kein
Austreten von Zellen aus dem Film beobachtet wird.
Beispiel 16
100 Gewichtsteile einer 5prozentigen wäßrigen Lösung von Carboxymethylcellulose, die als Zusatz für
Lebensmittel im Handel erhältlich ist, werden mit 195 Gewichtsteilen Tetrarnethoxysilan, 125,5 Gewichtsteilen
destilliertem Wasser und 5 Gewichtsteilen 1 η Salzsäure gemischt Es wird gemLi Beispiel 12 ein
komplexes Sol erhalten. Die Eigenschaf; en des hergestellten Films sind fast die gleichen, wie sie in dem
gemäß Beispiel 14 erhaltenen Film festgestellt werden. Die Menge an freigesetztem Kohlendioxid im Fermentationstsst
beträgt mehr als 80% d. Th, wobei wie beim Verfahren gemäß Beispiel 12 kein Austreten von Zellen
beobachtet wird.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung eines immobilisierte mikrobielle Zellen enthaltenden hydrophilen komplexen
Xerogels, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines Polyvinylalkohol, einer Gelatine oder einer Carboxymethylcellulose bis zu einer Konzentration, bei der die
Viskosität der Lösung weniger als 10 000 cP beträgt,
bei einer Temperatur von 400C, mit einem Tetraalkoxysilan der allgemeinen Formel
Si(OR)4
mischt, in der R einen Alkylrest mit höchstens 12
Kohlenstoffatomen bedeutet, wobei man das Tetraalkoxysilan in einer solchen Menge einsetzt, daß
das Gewicht des darin enthaltenen Siliciumdioxids 5 bis 300% des Trockengewichts des Polyvinylalkohole, der Gelatine oder der Carboxymethylcellulose
beträgt, im erhaltenen Gemisch durch Zugabe einer sauren Verbindung, welche die enzymatischen
Aktivitäten der zuzugebenden mikrowellen Zellen nicht beeinträchtigt, den pH-Wert auf unter 3
einstellt und das Gemisch zu einem homogenen komplexen Sol hydrolysiert, in dem homogenen
komplexen Sol mikrobielle Zellen homogen dispergiert, wobei man die mikrobfeilen Zellen in einer
Menge von 20 bis 1000% (Trockengewicht), bezogen auf das Sol, einsetzt, und das Gemisch aus
dem SoI und den mikrowellen Zellen durch Trocknen in ein Gel überführt
2. Verfahi en nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tetraa!' oxysilan der allgemeinen Formel Si(OR)<
einrstzt in der R einen Alkylrest mit höchstens 3 Kohlenstoffato -.en bedeutet
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung eines
Polyvinylalkohols und Tetraäthoxysilan einsetzt
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