DD294729A5 - Verfahren zur herstellung von immobilisaten mit biologisch aktiven, makromolekularen verbindungen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immobilisaten mit biologisch aktiven, makromolekularen Verbindungen. Erfindungsgemaesz werden Biomakromolekuele in einem waeszrigen, gegebenenfalls gepufferten, Polymerengemisch, das gegebenenfalls zusaetzlich Alkali-, Erdalkali- oder Eisensalze geloest oder suspendiert enthaelt, gleichmaeszig verteilt und anschlieszend durch Verdampfen der waeszrigen Loesungsmittel und Behandlung mit einem Vernetzungsmittel zur Gelbildung zu Membranen oder sphaerischen Partikeln geformt, wonach gegebenenfalls nachbehandelt wird. Anwendungsgebiete der hergestellten Immobilisate sind die Biotechnologie, die Biochemie und die analytische Chemie.{Verfahren; Herstellung; Immobilisat; biologisch aktive Verbindungen; Biomakromolekuele; Polymerengemisch; Alkalisalze; Erdalkalisalze; Eisensalze; Vernetzungsmittel; Biotechnologie; Biochemie; analytische Chemie}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immobilisaten mit biologisch aktiven, makromolekularen Verbindungen. Diese Produkte werden in der Biotechnologie, Biochemie und analytischen Chemie eingepetzt.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Um biologisch aktive Verbindungen - insbesondere biokatalytisch aktive Verbindungen wie Enzyme oder mikrobielle Zellen -kontinuierlichen, biotechnologischen Prozessen in einfacherer Weise zugänglich zu machen, werden sie mit Vorteil in eine unlösliche, d. h. immobilisierte Form gebracht. Als Verfahren zur Herstellung immobilisierter Biokatalysatoren sind Absorptionsverfahren an unlöslicher. Trägermaterialien, kovalente Bindungen an ebenfalls unlösliche Trägermaterialien, Quorvernetzungsverfahren mit bifunktionellen Re&gentien und Einschlußverfahren in makromolekulare Matrizes bekannt geworden. Besonders letzteres Verfahren bietet den Vorteil der schonenden Immobilisierung der Biokatalysatoren, weil hierbei in vielen Fällen eine negative Beeinflussung der Struktur und der Funktionalität der Biokatalysatoren vermieden wird. Bei den Geleinschlußverfahren wird der Biokatalysator selbst nicht am Trägermaterial fixiert, sondern im Gelgitter eingeschlossen. Bei Vet wendung geeigneter Trägermaterialien bleibt deshalb auch die biokatalytische'Aktivität der Biokatalysatoren im wesentlichen erhalten.

Polymere Netzwerke mit eingeschlossenen Biokatalysatoren werden unter besonders milden Reaktionsbedingungen durch ionotrope Gelbildung erzeugt (Angew. Makromol. Chem. 166/167 [1989], 293-309). Bei diesem Immobilisierungsverfaliren werden hydrophile Trägermaterialien wie Alginate, Pectinate, Carrageenane, Chitosan oder Zellulosederivate in Gegenwart der Biokatalysatoren mit quervernetzend wirkenden ionischen Verbindungen behandelt. Dabei werden die Biokatalysatoren im sich bildenden Netzwerk eingeschlossen. Dieses Immobilisierungsverfahren zeichnet sich durch seine Einfachheit aus und führt zu leicht handhabbaren Immobilisaten mit hoher Funktionsstabilität. Besonders in Ca-Alginaten und K-Carrageenanen, den am häufigsten angewendeten ionotropen Netzwerken, eingeschlossene Biokatalysatoren zeichnen sich dabei durch eine hohe biokatalytische Aktivität aus. Nachteilig bei diesen genannten Immobilisierungsverfahren ist allerdings, daß die ionotrope Gelbildung und der damit verbundene Geleinschluß unter bestimmten Bedingungen ein reversibler Prozeß sind, z. B. beim Arbeiten in Gegenwart von Phosphationen oder Natriumionen. Dadurch können dieses schonende und die biokatalytische Aktivität der Biokatalysatoren weitestgehend erhaltene Immobilisierungsverfahren und die danach hergestellten Immobilisate nicht umfassend in biotechnologischen Prozessen angewendet werden.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, biologisch aktive Verbindungen durch Geleinschluß nach einem Irreversiblen Verfahren zu immobilisieren. Es sollen Immobilisate in Membranform oder in Form sphärischer Partikel mit verbesserter Stabilität und Aktivität für den Einsatz in biotechnologischen Prozessen und der Analytik bereitgestellt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen zu entwickeln, bei dem die biologisch aktiven Verbindungen in ein stabiles Gel eingeschlossen werden, so daß sie bei biotechnologischen Prozessen oder in analytischen Systemen nicht in das sie umgebende lösliche Medium eintreten, d. h. das Gelnetzwerk nicht verlassen können. Erfindungsgemäß wird das dadurch erreicht, daß Biomakromoleküle in einem wäßrigen Polymerengemisch, das gegebenenfalls zusätzlich noch Alkali- und/oder Erdalkalisalze und/oder Eisensalze gelöst oder suspendiert enthält, gleichmäßig verteilt werden. Danach werden aus diesen Gemischen Immobilisate in Form von Membranen oder sphärischen

Partikeln entweder durch Verdampfen der wäßrigen Lösungsmittel und/oder durch Behandlung der feuchten bzw. getrockneten Gemische mit einem Vernetzungsmittel zur Golbildung hergestellt. Gegebenenfalls werden die Immobilisate mit wäßrigen Lösungen vom pH-Wert 1,0 bis 12,0 im Verlaufe von 15 Sekunden bis 12 Stunden bei O⁰C bis 70°C nachbehandelt. Nach der Erfindung werden zur Immobilisierung durch Geleinschluß als Biomakromoleküle bevorzugt Biokatalysatoren wie Enzyme, Mikroorganismen, Zellen tierischer, pflanzlicher oder humaner Herkunft, Zellorganellen, Gewebe- und Organschnitte, synthetische Enzyme und makromolekulare Koenzyme eingesetzt. Es können mit Vorteil aber auch biokatalytisch inaktive Proteine, z. B. Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende Proteine oder in vitro hergestellte Konjugate aus den Biokatalysatoren und den biokatalytisch inaktiven Proteinen oder hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Peptide oder Pharmaka n?.ch dieser Methode immobilisiert werden. Die genannten Biomakromoleküle werden nach der Erfindung mit wäßrigen, gegebenenfalls gepufferten, Lösungen von Polyvinylalkohol (PVA) und/oder Karboxymethylzellulose (CMZ) vermischt. Anstelle der zu den PVA/Biomakromolekül- bzw. CMZ/Biomakromolekül-Gemischen alternativ zumischbaren Makromoleküle CMZ bzw. PVA können aber auch andere, zur Gelbildung befähigte, hydrophile Makromoleküle zur Immobilisatbildung herangezogen werden, wie z. B. Dextrane, Agarose, Polyethylenglykole, Gelatine, Chitosan und seine Derivate, Carrageenan, weitere Cellulosen, Pektine oder Alginsäure. Für bestimmte Anwendungsfälle der erfindungsgemäßen Immobilisate in biotechnologischen Prozessen oder analytischen Systemen ist es darüber hinaus von Voiteil bzw. mitunter unumgänglich, daß den gelbildungsfähigen Makromolekül/ Biomakromolekül-Gemischen auch noch Alkali- und/oder Erdalkali- und/oder Eisensalze zugemischt werden. Als solche Salze kommen besonders Ammoniumsalze bzw. Alkali- oder Erdalkalikarbonate oder Chloride bzw. Sulfate des zwei- oder dreiwertigen Eisens bzw. Gemische von Alkali- und Erdalkalikarbonaten mit und ohne Eisensalze in Betracht, die auf Grund ihrer Löslichkeitseigenschaften in den Gemischen golöst oder suspendiert vorliegen können.

Zur Herstellung der Immobilisate durch Gelbildung werden nach der Erfindung verschiedene Methoden angewandt. Die einfachste besteht darin, daß Immobilisate z. B. in Membranform durch Auftragen der vorgenannten Gemische auf ebene Flächen wie Glasplatten oder wasserunlösliche, polymere Stützmembranen in definierten, durch den Anwendungsfall vorbestimmten Mengen und anschließendem Verdampfen der Lösungsmittel bei O⁰C bis 70°C hergestellt werden. Diese neuartig zusammengesetzten, gelartigen Immobilisate in Membranform zeichnen sich durch verbesserte Eigenschaften aus. Überraschend wurde gefunden, daß die Immobilie. <)te aus den PVA/Biomakromolekül/CMZ-Gemischen wesentlich höhere biokatalytische Aktivitäten besitzen als Immobilisate aus PVA/Biomakromolekül- odor CMZ/Biomakromolekül-Gemischen allein. Daraus ergeben sich besonders verbesserte und günstige Einsatzmöglichkeiten als biokatalytisch aktive Membranen in analytischen Systemen wie den Biosensoren. Eine weitere Verbesserung der Eigenschaften der neuartigen Membranen, besonders der chemischen Stabilität, wird dadurch erreicht, daß die feuchten oder auch getrockneten Membranen aus den Gemischen noch nachträglich mit Vernetzungsmitteln behandelt werden. Als solche kommen bifunktionelle Reagentien wie Dialdehyde, diazotierte, aromatische Diamine, Diisocyanate, Diisothiocyanate, gleichzeitig Diisocyanat- und Diisothiocyanatgruppen enthaltende Verbindungen, bisaktivierte Derivate von Dikarbonsäuren wie Säurechloride, Säureazide und aktivierte Ester, Diepoxide, Chinone, Epihalogenhydrine, !Carbodiimide, 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazine oder 2-substituierte, 4,6-Dihalogen-1,3,5-triazine in Frage, die besonders in organischen Lösungsmitteln eingesetzt werden oder multivalente Kationen wie Ca²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Al³⁺, Fe^2+/3+ oder Karbon- bzw. Mineralsäuren, von letzteren besonders Borsäure und ihre Salze, die überwiegend in wäßrigen Lösungen eingesetzt werden.

Neben Immobilisaten in Membranform können nach der Erfindung aber auch sphärische Immobilisate hergestellt werden, indem die Makromolekül/Biomakromolekül-Gemische in wäßrige Lösungen oder organische Lösungsmittel oder Gemische beider Lösungsmittelarten, dis die Gelbildungsmittel in der Regel gelöst enthalten, eingetropft werden. Nach dem Abtrennen der Immobilisate von den Lösungsmitteln und dem Waschen zum Entfernen überschüssiger Gelbildungsmittel können die stabilen Immobilisate in biotechnologischen Prozessen, z. ß. zur Stoffwandlung, eingesetzt werden. Dazu empfiehlt es sich, für diesen speziellen Anwendungsfall in den meisten Fällen die Immobilisate, die gegebenenfalls Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze und/oder Eisensalze enthalten, mit wäßrigen Lösungen vom pH-Wert 1,0 bis 12,0 15 Sekunden bis 12 Stunden bei 0°C bis 70°C nachzubehandeln. Im Falle des Einsatzes von Ammoniumsalzen und Eisensalzen arbeitet man dabei vorteilhafterweise bei pH-Werten größer 7,0 und im Falle der Verwendung von Alkali- und/oder Erdalkalikarbonaten bevorzugt bei pH-Werten kleiner als 7,0. Werden jedoch Eisensalze bei der Gemischherstellung verwendet, so wird die Nachbehandlung der Immobilisate bei pH-Werten vorzugsweise größer 9,0 vorgenommen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Immobilisate finden ein breites Arwendungsfeld, bevorzugt aber in stoffwandelnden Prozessen und in Membranform in analytischen Systemen wie den Biosensoren.

Im letzteren Fall werden die flächigen Immobilisate zwischen zwei wasserunlösliche, polymere Membranen plaziert und in dieser Sandwich-Form in Biosensorsystemen eingesetzt.

Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens beruhen darauf, daß hinreichend große Biomakromoleküle schonend und ohne großen Aktivitätsverlust immobilisiert werden können und daß die Immobilisate mechanisch stabil sind auch beim Arbeiten in Gegenwart von Phosphat- oder Natriumionen.

Durch das Verfahren bleiben die bekannten, stabilisierenden Effekte ionotroper Gele auf Biokatalysatoren z. B. erhalten - sie werden gemeinsam im Gelnetz bzw. zwischen den wasserunlöslichen, polymeren Membranen eingeschlossen -woraus sich erweiterte Einsatzmöglichkeiten ergeben, vor allem in der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und analytischen Chemie. Die Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert.

Ausführung.'belsplole

Beispiel 1

Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und ein Milliliter einer 1%igen Lösung von Polyethylenglykol (MG 6000) werden miteinander vermischt, und zu diesem Polymerengemisch werden nach bekannten Methoden fermentierte und abzentrifugierte Zellen vom Mikroorganismus Trichosporon cutaneum mit einem Feuchtgewicht von 2 mg addiert.

Polymeren-Mikroorganismen-Gemisches werden auf eine gasdurchlässige Polymerenmembran aufgetragen und bei 20°C bis 25°C getrocknet. Zur Herstellung eines mikrowellen Biosensors zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs wird die Membran vor eine Sauerstoffelektrode gespannt, der Sensor in eine Meßlösung eingetaucht und der Sauerstoffverbrauch nach Substratzugabe zur Meßlösung gemessen.

Beispiel 2

Entsprechend Beispiel 1, anstelle von Polyethylenglykol wird aber Monomethoxypolyethylenglykol (MG 5000) eingesetzt, wird eine mikrobielle Membran aus 4mg von einer Fermentationslösung abzentrifugierte Zellen vom Mikroorganismus Bacillus subtilüs hergestellt. Diese Membran kann ebenfalls in einem mikrowellen Biosensor zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs von Meßproben eingesetzt werden.

Beispiel 3 Zu einem nach Beispiel 1 hergestellten Polymerengemisch aus Polyvinylalkohol und Karboxymethylzellulose werden zuerst

10mg Calciumkarbonat und danach 4mg feuchte Zellen vom MikroorganismusTrichosporoncutaneum addiert. Dieses Gemischwird gut durchmischt, und 10μΙ davon werden auf eine gasdurchlässige Polymerenmembran aufgetragen. Das Polymeren-

Mikroorganismen-Gemisch wird bei Umgebungstemperatur getrocknet, und die Membran wird anschließend in einer

0,1 molaren Aluminiumchloridlösung vom pH-Wert 4,0 30 Sekunden eingetaucht. Membranen dieser Art werden in mikrobiellen

Sensoren zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs eingesetzt.. Beispiel 4

Zu einem nach Beispiel 3 hergestellten Polymerengemisch aus Polyvinylalkohol und Karboxymethylzellulose werden zuerst 25mg Ammoniumchlorid addiert, und der pH-Wert des Gemisches wird auf 7,0 eingestellt. Dazu werden 4mg feuchte Zellen vom Mikroorganismus Bacillus subtillis addiert. Dieses Gemisch wird zur gleichmäßigen Verteilung der Zellen gut durchmischt, und 10 μΙ davon werden auf eine gasdurchlässige Polymerenmembran aufgetragen. Das Polymeren-Mikroorganismen-Gemisch wird bei Umgebungstemperatur getrocknet, und die Membran wird anschließend in einer 0,1 molaren Borsäurelösung vom pH-Wert7,5 1 Minute eingetaucht. Diese Membran ist als mikrobielle Membran in Biosensoren zur Bestimmung des biologischen Sauerstoffbedarfs geeignet.

Beispiel 5

Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und 2ml einer 5%igen Lösung von Polyethylenglykol (MG6000) werden zusammen mit 25mg Glukoseoxidase (aus Penicillium notatum mit einer Aktivität von 43U/mg Einv/aage) und 20mg CaCO₃ vermischt. Das Gemisch wird auf einer Glasplatte (2cm χ 10cm) gleichmäßig verteilt und bei Umgebungstemperatur getrocknet. Die Glasplatte mit der Glukoseoxidasemembran wird anschließend 2 Minuten In eine 0,1 molare Borsäurelösung vom pH-Wert 5,0 und danach 3 Stunden in einen Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 eingetaucht. Ein Teil dieser Membran, fixiert vor einer Sauerstoff elektrode, kann zur Bestimmung von Glukose in Meßproben mit einer Enzymelektrode verwendet werden.

Beispiel β

Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und ein Milliliter einer 2%igen Lösung von Chitosan (in 1%iger Ameisensäurelösung) werden miteinander gemischt. Der pH-Wert der Polymerenlösung wird mit verdünnter Natronlauge auf 7,0 eingestellt. Zur Polymerenlösung werden 50mg Urease (Aktivität: 5U/mg Einwaage) und 25mg Ammoniumchlorid addiert und darin gleichmäßig verteilt. In die Polymeren-Urease-Lösung wird die pH-sensitive Fläche einer pH-Einstabelektrode eingetaucht. Unter Drehen der pH-Elektrode wird das Lösungsmittel verdampft bei Umgebungstemperatur. Die pH-Elektrode wird anschließend in eine 5%ige Glutaraldehydlösung vom pH-Wert8,0 2 Minuten und danach 5 Stunden in einen Boratpuffer vom pH-Wert8,0 eingetaucht. Die so modifizierte pH-Elektrode wird als Enzymelektrode zur Bestimmung von Harnstoff in Meßproben verwendet.

Beispiel 7

Ein Milliliter einer 2%igen Lösung von Karboxymethylzellulose und 1 ml einer4%igen Lösung von Alginsäure mit einem pH-Wert von 6,0 werden zusammen miat 25mg Glukoseoxidase und 15mg Katalase vermischt. Dieses Gemisch wird unter Rühren in 25ml einer 0,1 molaren Lösung von essigsaurer Tonerde vom pH-Wert4,3 eingetropft. Nach 5 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt und mit 500 Milliliter destilliertem Wasser gewaschen. Dieses Immobilisat wird zur Herstellung von Glukonsäure aus Glukose eingesetzt.

Beispiel 8

Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und ein Milliliter einer 2%igen Lösung von Carrageenan werden zusammen mit 25 Milligramm Penicillinacylase und 15mg Ammoniumchlorid vermischt. Dieses Gemisch v/ird unter Rühren in 25ml einerO,1 molaren Lösung von Borsäure mit einem pH-Wert9,0 eingetropft. Nach 5 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt, in eine wäßrige Lösung vom pH-Wert9,0 bis 10,0 eingetragen, und diese Suspension wird 3 bis 4 Stunden gerührt. Das Immobilisat wird von der Lösung abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und kann zur Spaltung von Penicillin G in 6-Aminopenicillin und Phenylessigsäure verwendet werden.

Beispiel 9

Zwei Milliliter einer 3%igen Lösung von Karboxymethylzellulose und 1 ml einer 2%igen Lösung von Dextran in destilliertem Wasser werden zusammen mit 50mg Chymotrypsin und 15mg Calciumkarbonat vermischt. Dieses Gemisch wird unter Rühren in 25 ml einer 0,1 molaren Lösung von essigsaurer Tonerde vom pH-Wert 3,0 eingetropft. Nach 5 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen, in eine wäßrige Lösung vom pH-Wert 3,0 eingetragen, und die resultierende Suspension wird 4-5 Stunden gerührt. Das Immobilisat wird von der Lösung abgetrennt, wieder mit destilliertem Wasser gewaschen und kann zur Esterspaltung bzw. Amidbildung in organischen Lösungsmitteln eingesetzt werden.

Beispiel 10

Ein Milliliter einer 10%igen Lösung von Polyvinylalkohol und 1 ml einer 10%igen Lösung von Dextran in destilliertem Wasser werden zusammen mit 25mg Penlcilllnacylase, 1,0g EisendD-sulfat und 0,5g Ammoniumchlorid vermischt. Dieses Gemisch wird unter Rühren in 25ml einer 0,1 molaren Natriumboratlösung vorn pH-Wert9,0 eingetragen. Nach 3 Minuten Rühren werden die sphärischen Partikel abgetrennt, in 50ml einer 3%igen Ammoniaklösung eingetragen, und die Suspension wird 5 Stunden gerührt. Das Immobilisat wird von der Lösung abgetrennt, mit destilliertem Wasser gewaschen und kann zur Spaltung von Penicillin G in 6-Aminepenicillin und Phenylessigsäure eingesetzt werden.

Claims (11)

1. Verfahren zur Herstellung von Immcbilisaten mit biologisch aktiven Verbindungen in Membranform oder in Form sphärischer Partikel durch Geleinschluß, dadurch gekennzeichnet, daß man Biomakromoleküle in einem wäßrigen - gegebenenfalls gepufferten Polymerengemisch, das gegebenenfalls zusätzlich noch Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze und/ oder Eisensalze gelöst oder suspendiert enthält, gleichmäßig verteilt und anschließend durch Verdampfen der wäßrigen Lösungsmittel und/oder durch Behandlung der feuchten bzw. getrockneten Gemische mit einem Vernetzungsmittel zur Gelbildung zu Membranen oder sphärischen Partikeln formt und gegebenenfalls nachbehandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomakromoleküle Biokatalysatoren wie Enzyme, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme, makromolekulare Koenzyme oder biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Biutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende Proteine oder in vitro hergestellte Konjugate aus Biokataiysatoren und biokatalytisch inaktiven Proteinen oder hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Peptide, Pharmaka verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymerengemisch aus Karboxymethylzellulose und Polyvinylalkohol oder aus Karboxymethylzellulose bzw. Polyvinylalkohol im Gemisch mit Dextranen, Agarose, Poly(oxyalkylenglykolen), Gelatine, Chitosan, Carrageenan, Zellulosen, Pektinen oder Alginsäure besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vernetzungsmittel zur Gelbildung multivalente Kationen wie Ca²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Al³⁺ oder Karbon- bzw. Mineralsäuren oder bifunktionelle Reagentien wie Dialdehyde, diazotierte aromatische Diamine, Diisocyanate, Diisothiocyanate, gleichzeitig Diisocyanate und Diisothiocyanatgruppen enthaltende Verbindungen, bisaktivierte Derivate von Dikarbonsäuren wie Säurechloride, Säureazide und aktivierte Ester, Diepoxide, Chinone, Epihalogenhydrine, Karbodiimide, 2,4,6-Trihalogen-1,3,5-triazine oder 2-substituierte, 4,6-Dihalogen-1,3,5-triazine eingesetzt werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Immobilisate, die Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze und/oder Eisensalze gelöst oder suspendiert enthalten, mit wäßrigen Lösungen vom pH-Wert 1,0 bis 12,0 15 Sekunden bis 12 Stunden bei 0⁰C bis 7O⁰C nachbehandelt werden.

6. Verfahren zur Herstellung von Immobilisaten in Membranform nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Auftragen der Gemische auf ebene Flächen wie Glasplatten oder wasserunlösliche polymere Stützmembranen in definierten Mengen und anschließendem Verdampfen der Lösungsmittel bei 0⁰C bis 70⁰C oder durch Behandlung der feuchten bzw. getrockneten Membranen mit Vernetzungsmitteln zur Gelbildung hergestellt werden.

7. Verfahren zur Herstellung der Immobilisate in Form sphärischer Partikel nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Eintragen der Gemische in wäßrige Lösungen oder organische Lösungsmittel oder Gemische beider Lösungsmittelarten, die die Vernetzungsmittel zur Gelbildung enthalten, hergestellt werden.

8. Membranen mit biokatalytische Aktivität enthaltenden Biomakromolekülen zur Anwendung in analytischen Systemen, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Verbund einer wasserunlöslichen, polymeren Stützmembran und einer Schicht aus einem Biokatalysator oder einem Konjugat aus Biokatalysator und biokatalytisch inaktivem Protein und einem Polymerengemisch aus Karboxymethylzellulose und Polyvinylalkohol oder aus Karboxymethylzellulose bzw. Polyvinylalkohol im Gemisch mit Dextranen, Agarose, Poly(oxyalkylenglykolen), Gelatine, Chitosan, Carrageenan, Zellulosen, Pektinen oder Alginsäure bestehen und die gegebenenfalls noch Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze enthalten.

9. Sphärische Immobilisate mit biokatalytische Aktivität enthaltenden Biomakromolekülen zur Anwendung in der Stoffwandlung und Analytik, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mit Vernetzungsmittel gebildeten Gelen aus einem Biokatalysator oder einem Konjugat aus Biokatalysator und biokatalytisch inaktivem Protein und einem Polymerengemisch aus Karboxymethylzellulose und Polyvinylalkohol oder aus Karboxymethylzellulose bzw. Polyvinylalkohol im Gemisch mit Dextranen, Agarose, Poly(oxyalkylenglykole), Gelatine, Chitosan, Carrageenan, Zellulosen, Pektinen oder Alginsäure bestehen und die gegebenenfalls noch Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze und/oder Eisensalze und/oder Partikel elementaren Eisens enthalten.

10. Sphärische Immobilisate und Membranen mit Biomakromolekülen zur Anwendung in der Chromatographie, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Biokatalysator oder einem Konjugat aus Biokatalysator und biokatalytisch inaktivem Protein oder einem biokatalytisch inaktiven Protein und einem Polymerengemisch aus Karboxymethylzellulose und Polyvinylalkohol oder aus Karboxymethylzellulose bzw. Polyvinylalkohol im Gemisch mit Dextranen, Agarose, Poly(oxyalkylenglykole), Gelatine, Chitosan, Carrageenan, Zellulosen, Pektinen oder Alginsäure bestehen und die gegebenenfalls noch Alkalisalze und/oder Erdalkalisalze und/oder Eisensalze und/oder Partikel elementaren Eisens enthalten.

11. Membranen und sphärische Immobilisate nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Biomakromoleküle

- Bickatdlysatoren wie Enzyme, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme, makromolekulare Koenzyme

- biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende Proteine

- Konjugate aus Biokatalysatoren und biokatalytisch inaktiven Proteinen

- hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Peptide, Pharmaka sind.