DE3138096A1 - Human-fibroblasten-interferon und dessen herstellung - Google Patents

Description

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24. September 1981 GE 4100/15 A

GENENTECH, INC.

460 Point San Bruno Boulevard South San Francisco, Californien USA

Human-Fibroblasten-Tnterferon und dessen Herste! lunc

■J5 Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der rekombinanten DNS-Technologie, d.h. Verfahren, die auf diesem Gebiet verwendet werden und Produkte, die mit diesen Verfahren erhalten werden.

Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptide, insbesondere reifes Human-Fibroblasten-Jriterferon, diese enthaltende pharmazeutische Präparate und ein Verfahren zu deren Herstellung, dass darin besteht, das man eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem zur Expression eines solchen Polypeptids befähigten, replikablen Vektor transformiert ist, zur Expression anregt und das Polypeptid isoliert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Expressions-Vektoren (im folgenden kurz Vektoren genannt), die in diesem Verfahren verwendet werden und die neuen Mikroorganismen, die diese Vektoren enthalten, sowie Verfahren zu deren Herstellung. Schliesslich betrifft die Erfindung DNS-Sequenzen, die die Aminosäuresequenz von reifem Human-Fibroblasten-Interferon kodieren.

Mez/16.9.81

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Hintergrund der Erfindung

Human-Fibroblasten-Interferon (FIF) ist ein Protein, das antivirale sowie ein weites Spektrum anderer biologischer Aktivitäten aufweist (Uebersicht siehe W.E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag, New York-Wien, 19 79). Angeblich ist es bis zur Homogenität gereinigt worden. Es handelt sich um ein einzelnes Polypeptid mit einem Molekulargewicht von 19000-20000, mit einer spezifischen Aktivität von 2-10 χ 10 Einheiten/mg (E. Knight, Proc. Natl. Acad. Sei. USA J3., 520-523 [1976]; W. Berthold et al., J. Biol. Chem. 253, 5206-5212 [1978]). Die Sequenz der 13 NH„-terminalen Aminosäuren des FIF wurde als Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser bestimmt (E.

Knight et al., Science 207, 525-526 [1980]). Houghton et al. (Nucleic Acids Res. _§_, 1913-1931 [1980]) haben synthetische Deoxyolxgonucleotide (vorausgesagt aus der vorstehend angegebenen Aminosäuresequenz) verwendet, um die Sequenz der 276 5'-terminalen Nucleotide von FIF-mRNS zu bestimmen.

Taniguchi et al. (Nature 285, 547-549 [1980]; Gene JJD, 11-15 [1980]) und Derynck et al. (Nature 285, 542.-547 [l'J80]) waren kürzlich in der Lage, die Nucleotidsequenz klonierter cDNS-Kopien von FIF-mRNS in E. coli zu bestimmen und haben daraus die vollständige Aminosäuresequenz von Human-FIF einschliesslich einer 21 Aminosäure umfassenden Signalsequenz abgeleitet. Das reife Peptid umfasst 166 Aminosäuren. Schliesslich haben Taniguchi et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA ΊΊ_, 5230-5233 [1980]) ein Plasmid konstruiert, welches die Expression des Human-FIF-Gens in E. coli veranlasst, so dass reifes FIF erhalten wird.

Durch rekombinante DNS-Technologie ist es inzwischen qelungen, nine grosso Anzahl wertvoller Polypopl i<lo kontrolliert mikrobiell herzustellen. So existieren j.nzw Ischen bereits Bakterien, die durch diese Technologie so modifiziert wurden, dass sie die Herstellung von Polypeptiden wie Somatostatin, die A und B Ketten des Human-Insulins

und Human-Wachstumshormon gestatten (itakura et al., Science 198, 1056-1063 [1977]; Goeddel et al., Nature 281 , ^ci.1 4-54H [1979]). Kürzlich gelang durch die Anwendung der rekombinanten DNS-Technik die bakterielle Herstellung von Proinsulin, Thymosin α. und Leukozyten-Interferon.

Das Zugpferd der rekombinanten DNS-Technologie ist das Plasmid, eine nicht-chromosomale Schleife doppeisträngiger DNS, die in Bakterien und anderen Mikroben oft in vielen Kopien pro Zelle vorliegt. Die in der Plasmid-DNS enthaltene Information umfasst diejenige zur Reproduktion des Plasmids in Tochterzellen (d.h. ein "Replicon") und gewöhnlich ein oder mehrere Selektions-Charakteristiken wie, im Fall von Bakterien, die Resistenz gegenüber Antibiotika, ^° die es erlauben, Klone der Wirts-Zelle, die das interessierende Pl. .!ami d cjnUhal Iren, zu erkennen und in einem ausgewählten Medium selektiv zu züchten. Die Nützlichkeit der Plasmide liegt in der Tatsache, dass sie spezifisch durch die eine oder andere Restriktions-Endonuclease (auch

Restriktionsenzym genannt) gespalten werden können, wobei jede Endonuclease eine andere Stelle der Plasmid-DNS erkennt. Heterologe Gene oder Genfragmente können in das Plasmid an den Spaltstellen oder ananschliessend an die Spaltstellen rekonstruierte Enden eingefügt werden. Die

DNS-Rekombination wird ausserhalb der Zelle durchgeführt aber das erhaltene rekombinante Plasmid wird durch "inen Vorgang, der als Transformation bekannt ist, in die Zelle eingeführt und grosse Mengen an heterologe Gene enthaltenden, rekombinierten Plasmiden können durch Kultivierung

der transformierten Zellen erhalten werden. Ist das heterologe Gen in richtiger Weise (d.h. operabel) bezüglich derjenigen Teile des Plasmids eingefügt, die für die Transcription und Translation der kodierten DNS-Nachricht verantwortlich sind, dann kann das erhaltene rekombinierte Plasnid (Expressionsvektor, Vektor) zur Herstellung des Polypeptids verwendet werden, dass durch das heterologe Gen kodiert wird. Dieser Prozess wird als Expression bezeichnet.

Die Expression wird ausgelöst in der Promoter-Region, die durch RNS-Polymerase erkannt und gebunden wird. In einigen Fällen, wie z.B. beim Tryptophan- oder "Trp"-Prometer, der in"Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt ist, werden Promotor-Regionen von sogenannten Ojerator-Regionen überlappt und bilden dann einen kombinierten Promotor-Operator. Operatoren sind DNS-Sequenzen, die von sogenannten Repressor-Proteinen erkannt werden, die wiederum die Frequenz des Transkriptionsbeginns an einem speziellen Promotor regulieren. Die Polymerase wandert an der DNS entlang und überschreibt die Information, die der kodierende Strang enthält, vom 5¹- zum 3'-Ende in mRNS, die dann wiederum in das Polypeptid mit der durch die DNS kodierten Aminosäuresequenz übersetzt wird. Jede Aminosäure eines Polypeptids wird innerhalb des sogenannten Strukturgens durch ein Nukleotid-Triplett oder Codon kodiert. Nach der Bindung an den Promotor transkribiert die RNS-Polymerase zunächst Nukleotide, die eine Ribosomen-Bindungsstelle kodieren, dann ein Translations-Startsignal (gewohnlich ATG, das in der mRNS zu AUG wird) und schliesslich cUe Nukleotid—Sequenzen des Strukturgens selbst. Am Ende des Strukturgens werden sogenannte Stopcodons transkribiert, nach denen die Polymerase noch weitere mRNS-Sequenzen bilden kann, die' aber wegen des vorhandenen Stopsignals von den Ribosomen nicht mehr übersetzt werden. Die Ribosomen lagern sich an die vorgesehene Bindungsstelle der mRNS an, in Bakterien gewöhnlich während diese entsteht, und stellen dann ihrerseits das kodierte Polypeptid her, beginnend am Translations-Startsignal und endend mit dem bereits erwähnten Stopsignal. Das gewünschte Produkt wird hergestellt, wenn die Sequenzen, die die Ribosomen-Bindungsstelle kodieren richtig liegen in Bezug auf das AUG-Startsignal und wenn alle übrigen Kodons mit dem Startsignal in Phase sind. Das gewünschte Polypeptid kann erhalten werden durch Lyse der Wirts-Zelle, Abtrennung von anderen Bakterienproteinen und Reinigung in üblicher Weise.

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Während das aus Spender-Fibroblasten isolierte homogene· Fibroblasten-Interferon ausreichte zur partiellen Charakterisierung und für limitierte klinische Studien, reicht diese Quelle bei weitem nicht aus für die Gewinnung derjenigen Mengen an Interferon, die für breite klinische Prüfungen und die anschliessende prophylaktische und/odnr therapeutische Verwendung notwendig sein werden. Tatsächlich bediente man sich bei den bisherigen klinischen Untersuchungen zur Evaluation des Human-Fibroblasten-Interferons in Antitumor- und antiviralen Testen hauptsächlich rohen Materials (Reinheit ^1%) und die langen Zeiten, die nötig sind, um genügende Mengen reinen Materials zu erhalten haben zu einer starken Verzögerung von Untersuchungen in grösserem Masstab geführt.

Der vorliegenden Erfindung lag der Gedanke zugrunde, dass die Anwendung der rekornbinanten DNS-Technologie (d.h. die Einfügung eines Interferongens in mikrobielle Vektoren und deren Expression unter der Kontrolle mikrobieller genregulatorischer Elemente) der wirkungsvollste Weg zur Gewinnung grosser Mengen reinsten Fibroblastsn-Interferons wäre, welches trotz der Tatsache, dass es nicht glykosyliert ist, wie vielleicht das natürliche, zur klinischen Behandlung vieler viraler und neoplastischer Erkrankungen verwendet werden könnte.

Ein Fibroblasten-Interferon-Gen wurde erfindungsgemäss durch die folgenden Massnahmen erhalten:

i) Aminosaurepartxalsequenzen von homogenem Human-Fibroblasten-Interferon wurden verwendet, um synthetische DNS-Sonden zu konstruieren, deren Codons insgesamt alle möglichen Nucleotidkombinationen repräsentierten, durch die die Aminosaurepartxalsequenzen kodiert werden.

2) Es wurden Bänke von Bakterienkolonien hergestellt, die komplementäre DNS (cDNS) aus induzierter mRNS enthielten. Die gemäss (1) erhaltenen Sonden wurden als Starter

für die Synthese radiomarkierter einsträngiger cDNS verwendet, die wiederum als Hybridisierungssonden benutzt wurden. Die synthetischen Sonden hybridisierten mit induzierter mRNS als Matrize und wurden ferner mittels reverser Transkription dazu verwendet, induzierte, radiomarkierte " cDNS zu bilden. In dieser Weise erhaltene Klone der Koloniebank, die mit radiomarkierter cDNS hybridisierten, wurden weiterhin untersucht auf das Vorliegen eines Interferon vollständig kodierenden Gens. Jedes so erhaltene, möglicherweise eine Teilsequenz des Interferons kodierende Genfragment wurde als Sonde für ein vollständiges Gen verwendet.

3) Das so erhaltene ungekürzte Gen wurde massgeschnoidert unter Verwendung synthetischer DNS₁ um jegliche Leader-Seauenz, die die mikrobielle Expression des reifen Polypeptides verhindern könnte, auszuschliessen und um es :.n einem Vektor in die richtige Position bringen zu können bezüglich der Startsignale und der Ribosomenbindungsstelle· eines mikrobiellen Promoters. Das exprimierte Interferon wurde so weit gereinigt, dass es charakterisiert und seine Aktivität bestimmt werden konnte.

Unter Anwendung der vorstehend kurz beschriebenen Methoden der rekombinanten DNS-Technologie konnte eine Reihe replizierbarer Plasmid-Vektoren hergestellt werden, die die Synthese eines reifen Polypeptids mit den Eigenschaften von authentischem Human-Fibroblasten-Interfe.ron in einem transformierten Mikroorganismus mit hohen Ausbeuten veranlassen. Das erhaltene Polypeptid weist die Aminosäuresequenz des PIF auf und ist in in-vitro-Testen aktiv ungeachtet fehlender Glykosylierung wie sie für Material, das aus natürlichen menschlichen Zellen gewonnen wurde, charakteristisch ist. Der Ausdruck "Expression von reifem Fibroblasten-Interferon" bezeichnet die mikrobielle (z.B.

bakterielle) Herstellung eines Interferonmoleküls, das weder Glykosylcjruppen noch eine Präsequenz enthalt, die unmittelbar die mRNS-Translation des Human-Fibroblastsn-Interferon-Genoms veranlassen. Reifes Fibroblasten-Interferon

wird erfindungsgemäss unmittelbar von einem Translations-Startsignal (ATG) exprimiert, das gleichzeitig die erste Aminosäure des natürlichen Produkts kodiert. Die An- oder Abwesenheit von Methionin als erster Aminosäure im mikrobiell hergestellten Produkt ist kinetisch bedingt und hängt ab von den Fermentationsbedingungen und/oder der Höhe der Expression in dem transformierten Mikroorganismus. Reifes Fibroblasten-Interferon kann zusammen mit einem konjugierten Protein, das nicht ein üblicher Leader ist, expriroiert werden, wobei das Konjugat spezifisch intra- oder extrazellulär gespalten werden kann (vergleiche britische Patentanmeldung Nr. 2007676A). Schliesslich kann das reife Interferon zusammen mit einem mikrobiellen "Signal-Peptid" hergestellt werden, das das Konjugat an die Zellwand trans-

•jgportiert, wo die Signalsequenz abgespalten und das reife Polypeptid sezerniert wird.

Die zum Inhalt dieser Beschreibung gehörenden Figuren 1-5 werden an den geeigneten Textstellen genauer beschrieben. Figur 6 stellt schematisch die Herstellung der Plasmide dar, die die direkte Expression von reifem Fibroblasten-Interferon kodieren. Die Restriktionsstellen und -fragmente sind angegeben ("Pst I", usw.). "Ap " und "Tc " bezeichnen diejenigen Orte des Plasmids, die für die Expression der Ampicillin- bzw. Tetracyclin-Resistenz verantwortlich sind. Die Abkürzung "p o" steht für "Promoter-Operator" .

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFUEHRUNGSFORMEN

A. Die verwendeten Mikroorganismen

Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Mikroorganismus ist E. coli K-12 Stamm 294 (end A, thi~, hsr~, hsm, ), wie in der britischen Patentpublikation Nr. 255382 A beschrieben. Dieser Stamm wurde bei der American Type

am 28.Okt.1978 Culture Collection (ATCC Nr. 31446/ hinterlegt. Die gesamte Arbeit wurde unter Beachtung der Richtlinien des National

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Institutes of Health durchgeführt.

Die vorliegende Erfindung, obgleich in ihrer bevorzugtesten Ausführungsform an E. coli K-12 Stamm 294 beschrieben, umfasst auch die Verwendung anderer E. coli-Stämme wie E. coli B, E- coli χ 1776 und E. coli W 3110, sowie andere Mikroorganismen, von denen viele bei einem offiziellen Depositorium (z.B. der American Type Culture Collection, ATCC) hinterlegt wurden und von dort (moglicherweise) erhältlich sind (vergleiche auch deutsche Offenlegungsschrift Nr. 2644432). Weitere Mikroorganismen, die erfindungsgemäss verwendet werden können, sind z.B. Bacilli, wie Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae, unter denen vor allem Salmonella typhimurium und Serratia marcescens zu nennen wären, die mit Hilfe von sich vermehrenden Plasmiden heterologe Gene zur Expression bringen können. Auch in Hefen, beispielsweise in Saccharomyces cerevisiae, können Interferongene zur Expression gebracht werden unter der Kontrolle eines Hefe-Promotors.

B. Allgemeine Methoden

Die Restriktionsenzyme wurden bei New England Biolabs gekauft und vorschriftsmässig verwendet. Die Plasmid-DNS wurde nach einem Standard-Verfahren (D.B. Clewell, J. Bacteriol. 110, 667-676 [1972]) hergestellt und durch Säulenchromatographie an Biogel A-50 M gereinigt. Die DNS-Sequenzierung erfolgte nach der Methode von Maxam und Gilbert (Methods Enzymol. 65_, 499-560 [1989]). Die durch Restriktion erhaltenen DNS-Fragmente wurden durch Elektroelution aus Polyacrylamidgelen erhalten. Die Radiomarkierung der DNS-Fragmente zwecks Verwendung als Hybridisierungssonden erfolgte nach der Methode von Taylor et al. (Biochim. Biophys. Acta 442, 324-330 [1976]).

Die in-situ-Koloniehybridisierung wurde nach der Methode von Grünstein und Hogness durchgeführt (Proc. Natl. Äcad. Sei. USA 72, 3961-3965 [1975]).

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C. Synthese der Deoxyoligonucleotide

Die Deoxyoligonucleotide wurden synthetisiert nach der modifizierten Phosphotriester-Methode in Lösung (Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA _75, 5765-5769 [1978]) unter Verwendung von Trideoxynucleotxden als Bausteinen (Hirose et al., Tetrahedron Letters 2j3, 2449-2452 [1978]). Die Materialien und allgemeinen Verfahren ähnelten den von Crea et al. beschriebenen (Nucleic Acids Res. 8_, 2331-2348 [1980]). Die 6 Starter-Pools (Figur 1), die jeweils Dodecanucleotide enthielten, wurden durch separate Kopplung von 2 Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 5'-terminalen Sequenzen) mit 3 verschiedenen Hexamer-Pools (mit jeweils 2 unterschiedlichen 3'-terminalen Sequenzen) erhalten.

D. Induktion der Fibroblasten

Human-Fibroblasten (Zellinie GM-2504A) wurden gezüchtet wie bereits von Pestka et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 12_, 3898-3901 [1975]). Das Nährmedium (Eagle's Minimalmedium mit einem Gehalt von 10% fötalem Kälberserum) wurde aus den Rollflaschen (850 cm ) entfernt und ersetzt durch 5 0 ml Nährmedium, enthaltend 50 ug/ml PoIy(I) : Poly(C) und 10 ug/ml Cycloheximid. Dieses Induktionsmedium wurde nach 4 Stunden bei 3 7°C entfernt und die Zell-Monoschichten wurden mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen (PBS; 0,14M NaCl, 3mM KCl, 1,5 mM KH₂PO , 8mM Na₂HPO ). Jede Flasche wurde bei 37°C mit 10 ml

einer Trypsin-EDTA-Lösung (Gibco 610-5305) inkubiert bis die Zellen sich ablösten. Dann wurde fötales Kälberserum bis zu einer Konzentration von 10% zugesetzt. Das Zellmaterial wurde 15 Minuten bei 500 χ g zentrifugiert, der Rückstand nochmals in PBS suspendiert und sedimentiert. Die Zellen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren. Pro Rollflasche wurden etwa 0,17 g Zellmaterial erhalten.

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E- Herstellung und Assay von Interferon-mRNS

PoIy(A)-enthaltende mRNS wurde nach der von Green et al. (Arch. Biochem. Biophys. 172, 74-89 [1975]) beschriebenen Methode aus Humanfibroblasten durch Phenolextraktion und Oligo(dT)-Zellulose-Chromatographie erhalten. Die PoIy(A)-enthaltende RNS wurde bezüglich Interferon-mRNS durch Zentrifugieren in einem linearen Saccharose-Gradienten (5-20%, w/v) angereichert. Die RNS-proben wurden während 2 Minuten auf 80⁰C erhitzt, schnell abgekühlt, über den Gradienten gegeben und 20 Stunden bei 30000 U/min, bei 4°C in einem Beckman SW-40 Rotor zentrifugiert. Die Fraktionen wurden gesammelt, mit Ethanol gefällt und in Wasser gelöst.

Ein-Mikrogramm-Proben von mRNS wurden, wie von Cavalieri et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA JA· 3287-3291 [1977]), Xenopus laevis-Oocyton xnjiZ-UTt.. nie Oocytun wurden 24 Stunden bei 21°C inkubiert, homogenisiert und 5 Minuten mit 10000 χ g zentrifugiert. Im Ueberstand wurde das Interferon nach dem CPE-Hemmtest (Stewart, The Interferon System, Springer-Verlag, New-York-Wien, 19 79) bestimmt unter Verwendung von Sindbis-Virus und humanen diploiden Zellen (WISH). Für die 12 S-Fraktion der mRNS wurden Interferontiter von 1000 bis 6 000 Einheiten/mg injizierter RNS festgestellt (NIH Referenzstandard) .

F. Synthese und Clonierung von cDNS 30

Einstrangige cDNS wurde hergestellt in 100 ml Reaktionen, aus 5 uq der 12S mRNS-Fraktion, 20 mM Tris-HCl (pH 8,3), 20 mM KCl, 8mM MgCl,, 30 mM ß-Mercaptoethanol,

3?
100 uCi (α P)dCTP und 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Der Starter war das synthetische Hindlll-Decamer dCCAAGCTTGG (Scheller et al., Science 196, 177-180 [1977]), das auf der 3'-terminalen Seite um etwa 20-30 Deoxythymidinreste unter Verwendung der terminalen Deoxynucleotidyl-Trans-

ferase (Chang et al., Nature 275, 617-624 [1978]) verlängert worden war. 100 Einheiten reverser Transkriptase wurden zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 3 0 Minuten lang bei 42°C inkubiert. Die Synthese des zweiten Stranges der DNS wurde wie von Goeddel et al. bereits beschrieben (Nature 281, 544-548 [1979]) ausgeführt. Die doppelsträngige cDNS wurde mit 1200 Einheiten Sl-Nuklease während 2 Stunden bei 3 7°C in 25 mM Natriumacetat (pH 4,5), 1 mM ZnCl₂ und 0,3 M NaCl behandelt. Nach Phenolextraktion wurde das Gemisch elektrophoretisch an einem 8%igen Polyakrylamidgel aufgetrennt. Durch Elektroelution wurden etwa 0,5 ug cDNS von 550-1500 Basenpaaren (bp) erhalten. Ein aliquoter Teil (20 ng) wurde mit DeoxyfC)-Resten verlängert unter Verwendung terrainaler Deoxynucleotidyl-Transferase (Chang et al., supra) und mit ng des Plasmids pBR322, welches mit Deoxyguanosinres^.en an der Pstl-Spaltstelle (Chang et al., supra) verlängert worden war, verbunden. Das Gemisch wurde zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 nach einem publizierten Verfahren (Hershfield et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71, 3455-3459 [1974]) verwendet.

G. Herstellung von induzierten und nicht induzierten

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P-cDNS-Sonden

5 ug 12S-mRNS wurden mit entweder 2 ug Oligo(dT). .„ oder je 5ug der synthetischen Starter-Pools (Figur 1) in 60 ul 10 mM Tris-HCl (pH 8) und 1 mM EDTH kombiniert. Die Gemische wurden 3 Minuten gekocht, auf Eis gegeben und mit 60 ul 40 mM Tris-HCl (pH 8,3), 40 mM KCl, 16 mM MgCl₉, 5 0 mM ß-Mercaptoethanol, 1 mM dATP, dGTP, dTTP und

-7 3?
5 x 10 M (α- P)dCTP (2000-3000 Ci/mM) bei 0^pC versetzt.

Nach Zusatz von 100 Einheiten reverser Transkriptase wurde 30 Minuten lang bei 42⁰C inkubiert und durch Passage über eine 10 ml-Sephadex G-50-Säule gereinigt. Die Produkte wurden mit 0,3 N NaOH während 3 0 Minuten bei 70°C behandelt, neutralisiert und mit Ethanol gefällt.

32
Die P-cDNSs wurden mit 100 ug Poly(A)-mRNS aus nicht-

inciuzierten Fibroblasten in 50 μΐ 0,4M Natriumphosphat (pH 6,8) und 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS) versetzt. Die Gemische wurden 5 Minuten auf 98°C erhitzt und 15 stunden bei 45"C getempert. Durch Chromatographie an Hydroxyapatit, wie von Galau et al. beschrieben (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1±, 1020-1023 [1977]), wurden die DNS-RNS-Hybride (enthaltend nichtinduzierte cDNS-Sequenzen) von einsträngiger DNS (induzierten cDNS-Sequenzen) getrennt.

Die DNS-RNS-Hybride wurden mit Alkali zwecks Entfernung von RNS behandelt.

32 H. Screening rekombinanter Plasmide mit ' P-cDNS-

Sonden
15

Plasmid-DNS-Proben von etwa 1 ug wurden aus individuellen Transformanten nach einem bekannten Verfahren (Birnboim et al., Nucleic Acids Res. _7» 1513-1523 [1979]) hergestellt. Die DNS-Proben wurden durch Behandlung mit EccRI linearisiert, in Alkali denaturiert und jeweils aui 3 Nitrocellulosefilter nach der Tüpfelshybridisationsmethode (Kafatos et al., Nucleic Acids Res. 1_, 1541-1552

32 [1&79]) gebracht. Die Filter wurden mit den P-cDNS-Sonden während 16 Stunden bei 42⁰C in 50% Formamid, 10 χ Denhardt's Lösung (Biochem. Biophys. Res. Comm. J_3_, 641-646 [1966]), 6x£SC, 40 itiM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM EDTA und 40 ug/ml Heie-RNS hybridisiert. (SSC enthält 0,15 M NaCl und 0,015 M Nairiumcitrat, pH 7,0). Die Filter wurden gewaschen mit 0,1 χ SSC sowie 2 χ 30 Minuten lang bei 42°C mit 0,1% SDS, getrocknet und der Autoradiographie unterworfen.

I. Konstruktion von Plasmiden für direkte Expression von FIF

Die synthetischen Starter I (dATGAGCTACAAC) und II (dOATGAGCTACAAC) wurden nach der von Goeddel et al., Proc. Nail. Acad. Sei. USA T§_, 106-110 [1979], beschriebenen Methode phosphoryliert unter Verwendung von T4-PolynucLi-Ot;idkiniisf.'

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32
und (γ- P)ATP bis zu einer spezifischen Aktivität von 700 Ci/mM. Die Starterreparatur wurde folgendermassen

3?
durchgeführt: 250 pM der 'P-Starter wurden vereinig! mit 8 ug (10 pM) eines 1200 Basenpaare langen Hhal-Restrxktionsfragments, das die FIF-cDNS-Sequenz enthielt. Das Gemisch wurde mit Ethanol präzipitiert, in 50 μΐ Wasser resuspendiert, 3 Minuten gekocht, in Trockeneis-Ethanol gegeben und mit 5 0 μΐ einer Lösung von 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 14 mM MgCl₃, 120 mM NaCl, 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP bei 0⁰C vermischt. Nach Zusat:·-. von 10 Einheiten DNS-Polymerase I Klenowfragment wurde 4 1/2 Stunden bei 3 7°C inkubiert. Nach Extraktion mit Phenol/ CHCl, und Restriktion mit Pstl wurde das gewünschte Produkt an einer 6%igen Polyacrylamidgelsäule gereinigt. Die anschliessenden Verknüpfungen erfolgten bei Raumtemperatur (kohäsive Enden) oder bei 4⁰C (stumpfe Enden) unter den von Goeddel et al., supra, angegebenen Bedingungen.

^J· Assay für Interferonexpression in E. coli

Bakterienextrakte für den Interferon-Assay wurden folgendermassen hergestellt: 1 ml Kulturen wurden über Nacht in LB (Luria-Bertani) Medium, enthaltend 5 ug/ml Tetracyclin, gezüchtet und auf 25 ml mit M9-Medium, das durch 0,2% Glukose, 0,5% Casaminosäuren und 5 ug/ml Tetracyclin ergänzt war, verdünnt. 10 ml-Proben wurden zentrifugiert wenn die Absorption bei 550 nm (A₁₅₅₀) den Wert 1,0 erreichte. Die Zellkuchen wurden schnell in Trockene Ls-Ethanol gefroren und geklärte Lysate wurden, wie von Clewell (supra) beschrieben, hergestellt. Die Interferonakti/ität in den Ueberständen wurde durch Vergleich mit NIH-FI^-Standard nach dem CPE-Hemmtest bestimmt. Es wurden 2 verschiedene Tests verwendet: (a) WISH-Zellen (humane Amnionzellen) wurden auf Mikrotiterplatten verteilt. Nach 16-20 Stunden wurden die Proben zugesetzt und seriell zweifach verdünnt. Nach einer Inkubationszeit von mindestens 3 Stunden wurde Sidbis-Virus zugesetzt. Die Platten wurden nach 20-24 Stunden mit Kristallviolett angefärbt, (b) MDBK-Zellen

(aus Rindernieren) wurden ausgesät unter gleichzeitiger zweifacher Verdünnung der Proben. Nach einer Inkubationszeit von 2-3 Stunden wurden vesikuläre Stomatitisviren zugesetzt und nach weiteren 16-18 Stunden wurden die Platten mit Kristallviolett angefärbt. Um die Stabilität bei pH 2 zu testen, wurden die Bakterienextrakte und Standarde in Minimalraedium auf eine Konzentration von 1000 Einheiten/ml verdünnt. Aliquote Teile von 1 ml wurden mit IN HCl auf pH 2 gebracht, 16 Stunden bei 4⁰C inkubiert und durch Zusatz

"Ό von NaOH neutralisiert. Die Interferonaktivität wurde nach dem CPE-Hemmtest unter Verwendung menschlicher Amnionzellen bestimmt. Um antigenische Identität herzustellen, wurden aliquote Teile (25 μΐ) der 1000 Einheiten/ml enthaltenden Interferon-proben (unbehandelt) 60 Minuten lang bei 37⁰C juxt 25 μΐ Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon inkubiert, 5 Minuten mit 12000 χ g zentrifugiert und der Ueborstand getestet. FIF- und LIF-Standarde wurden vom NIH erhalten. Kaninchen-Anti-Human-Leukozyten-Interferon wurde vom National Institut of Allergy and Infectious Diseases erhalten.

K. Synthese von Starterpools, die komplementär sind zu FIF-mRNS

Von der bekannten aminoterminalen Aminosäuresequenz des Human-Fibroblasten-Interferons wurden die 24 möglichen mRNS-Sequenzen, die für die Kodierung der ersten 4 Aminosäuren in Frage kommen, abgeleitet. Die theoretisch möglichen 24 komplementären Deoxyoligonucleotide wurden in 6 Pools zu je 4 Dodecameren synthetisiert (Figur 1). Die Synthese erfolgte nach der modifizierten Phosphotriester-Methode in Lösung und an Festphasen (Crea et al., supra). Die grundlegende Strategie beruhte auf der Umsetzung' zweier 3'-geschützter Trimerer mit einem Ueberschuss eines einzelnen 5'-geschützten Trimeren zu einem Pool von 2 Hexameren, die beide gleich stark vertreten waren. Die Kupplung von 2 Pools, die jeweils 2 Hexamere enthielten, lieferte dann einen Pool mit 4 Dodecameren.

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L. Identifizierung von FIF-cDNS-Klonen

Unter Verwendung von 12S-mRNS aus induzierten Human-Fibroblasten (1000 Einheiten Interferon-Aktivität/ug im

5 Oocytentest) wurde doppelsträngige cDNS hergestellt und in das Plasmid pBR322 an der Pstl-Restriktionsstelle nach der Standard dG:dC-Tailing-Methode, wie von Chang et al. (supra) beschrieben, eingefügt. Eine FIF-cDNS-Bibliothek aus 30000 Ampicillin-empfindlichen, Tetracyclin-resistenten Transformanten von E. coli K-12 Stamm 294 wurde aus 20 ng cDNS, enthaltend 550-1300 Basenpaare, angelegt. Aus 600 der Transformanten wurde Plasmid-DNS hergestellt und auf 3 Sätze von Nitrocellulosefiltern, wie oben beschrieben, gebracht.

Die Methode zur Identifizierung hybrider Plasmide, die FIF-cDNS-Sequenzen enthielten, ähnelte der, die angewandt wurde zur Identifizierung entsprechender hybrider Plasmide mit LIF-cDNS Sequenzen (Goeddel et al., Nature 287, 411-416 [1980]). Radiomarkierte cDNS-Hybridisierungssonden wurden hergestellt unter Verwendung von entweder den 24 synthetischen Dodecameren oder von Oligo (dT)_1?_₁₈ als Starter und 12S-RNS aus induzierten Fibroblasten (5000 Einheiten/ug im Oocytentest) als Matrize.

32

Die erhaltenen P-cDNSs (spezifische Aktivität > 5 χ 10 cpm/ug) wurden mit einem grossen Ueberschuss an mRNS, aus nicht induzierten Human-Fibroblasten isoliert, hybridisiert und die mRNS-cDNS-Hybride wurden von nicht umgesetzter cDNS mittels Chromatographie an Hydroxyapatit (Galau et al., supra) abgetrennt. Die einsträngigen cDNS-Fraktionen sollten angereichert sein mit Sequenzen, tde in induzierten Pibroblayton vorhanden, in nicht-indu: ierten Zellen aber abwesend sind, und die mRNS-cDNS Hybride sollten Sequenzen darstellen, die sowohl in induzierten wie nichtinduzierten Zellen vorkommen. Etwa 4 χ 10 cpm einsträngige cDNS (Hybridisierungssonde A) und 8 χ IQ cpm cDNS-mP.NS-Hybride wurden unter Verwendung der mit Oligo (dT).« .g gestarteten cDNS erhalten, während von der mit den synthe-

tischen Dodecamerpools 1-6 gestarteten cDNS 1,5 χ 10 cpm einsträngige cDNS (Hybridisierungssonde B) und 1,5 χ 10 cpm Hyoride erhalten wurden. Die cDNS-mRNS-Hybride aus beiden Friktionierungen wurden vereinigt, die RNS durch Behandlung

32

mit Alkali hydrolysiert und die P-cDNS wurde als Hybridisier ungs sonde C verwendet. Viele der 600 Plasmidproben hyoridisierten sowohl mit der Sonde A wie mit der Sonde C, was darauf hinwies, dass die Hybridisierungsreaktionen

32 zwischen nicht induzierter mRNS und P-cDNS (vor der Hydroxyapatitfraktionierung) nicht vollständig verlaufen waren. Nur 1 der 600 Plasmide (pF526) hybridisierte stark mit der speziell gestarteten, induzierten cDNS-Sonde B (Figur 2), Plasmid pF526 hybridisierte auch mit der Oligo (dT)_{10 1P} gestarteten, induzierten cDNS-Sonde A und lieferte keine nachweisbare Hybridisierung mit der kombinierten nicht-induzierten Sonde C.

Pstl-Behandlung mit pF526 zeigte, dass der klonierte cDNS-Abschnitt etwa 550 Basenpaare lang war, wahrscheinlich zu kurz, um den gesamten kodierenden Bereich für Fibro-

32

blasten-Interferon zu enthalten. Daher wurde eine P-markierte DNS Sonde aus diesem Pstl-Fragment hergestellt mittels DNS-Starter aus Kälberthymus (Taylor et al., supra). Diose Sonde wurde gebraucht, um 2000 einzelne Kolonien einer neu hergestellten Fibroblasten-cDNS-Bibliothek zu screenen. Die neue cDNS-Bibliothek wurde unter Verwendung von 12S-mRNS aus induzierten Fibroblaston mit einem Titer von 6000 Einheiten/ml im Oocytentest hergestellt. 16 Kldne hybridisierten mit der Sonde. Die aus der Mehrzahl dieser Klone gewonnenen Plasmide lieferten bei Spaltung mit Psti 2 Fragmente, d.h. sie besassen eine interne Pstl-Spalt- . stelle. Klon pFIF3 enthielt den längsten cDNS-Abschnitt von etwa 800 Basenpaaren. Die DNS-Sequenz dieses Abschnitts wurde nach der Maxam-Gilbert Methode (supra) bestimmt und ist in Figur 3 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des Human-Fibroblasten-Interferons, die aus der Nucleotidst3quonz vorhtrgesagt wurde, ist mit der kürzlich von Tanigurhi ot al. (Gone 10, 11-15 [1980]) sowie von Derynck et al. (supra)

beschriebenen identisch. Es wird zunächst eine Präsequenz oder ein Signalpeptid von 21 Aminosäuren kodiert, dann eine Aminosäuresequenz von 166 Aminosäuren, die das reife Interferon darstellen. Schliesslich folgen 196 nicht übersetzte Nucleotide und ein PoIy(A)-Schwanz. Die 20 aminoterminalen Aminosäuren des reifen FIF sind direkt bestimmt worden durch Sequenzierung und stimmen überein mit der aus der DNS-Sequenz vorhergesagten Sequenz.

μ. Direkte Expression von Fibroblasten-Interferon

Um eine möglichst hohe Expression von reifem Fibroblasten-Interferon in E. coli zu erhalten, sollte der Start der Proteinsynthese am ATG-Codon des reifen Polypeptids (Aminosäure 1) und nicht am ATG-Codon des Signalpeptids (Aminosäure Sl) stattfinden (Figur 3).

Wie die das Signalpeptid kodierende Region aus dem Plasmid pFIF3 entfernt wurde ist in Figur 4 dargestellt.

Ein DNS-Fragment aus 1200 Basenpaaren, das den gesamten, FIF kodierenden cDNS Abschnitt enthielt, wurde nach Behandlung von pFIF3 mit Hhal an einem Polyacrylamidgel isoliert. Zwei synthetische Deoxyoligonucleotidstarter, dATGAGCTACAAC(I) und dCATGAGCTACAAC(II) wurden hergestellt.

Beide Starter enthalten die die ersten 4-Aminosäure <■ es reifen Fibroblasten-Interferons kodierenden Sequenzen und Starter II besitzt zusätzlich ein C am 5'-Ende. Star+erreparatur und anschliessende Verknüpfungen wurden für jeden der beiden Starter I und II getrennt durchgeführt und liefertet nahezu identische Resultate. Es werden daher hier nur die Reaktionen mit dem Starter I im Detail beschrieben. Die

Starter wurden 5'-radiomarkiert unter Verwendung von (γ- P) ATP und T4 Polynucleotidkinase und mit dem 1200 Basenpaare enthaltenden Hhal-DNS-Fragment kombiniert. Das Gemisch wurde durch Erhitzen denaturiert. Nach Hybridisierung des Starters an das denaturierte Hhal-DNS-Fragment, wurde die Reparatur des oberen (+)-Stranges mit E. coli-DNS-Polymerase I Klenowfragment (Klenow et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA

65, 168-175 [1969]) katalysiert (Figur 4). Gleichzeitig wird durch die 3'. . 5·-Exonucleaseaktivifcät des Klenow-" fragments das in 3'-Richtung vorragende Ende des unteren (-)-Stranges entfernt unter Schaffung eines glatten Enies. Die Analyse des Reaktionsgemische durch Polyacrylamidgelelektrophorese zeigte, dass die Reparatur nicht vollständig war sondern an verschiedenen bestimmten Stellen aurgehört hatte. Daher wurde das gesamte Reaktionsgemisch mii pstl behandelt und das gewünschte 141 nasenpaare-enthaltendes Fragment (180000 Corenkow cpm; ca. 0,3 pM) wu -de durch Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt (Figur 5). Die Bindung dieses Fragments an 1 ug (ca. 4 pM) des 36 3 Basenpaare-enthaltenden Pstl-Bglll-Fragments, das aus pFIF3 isoliert wurde, mit anschliessender BgIII-Behandlung, Ii iferte etwa 30 ng (ca. 0,1 pM, 50,000 Cerenkow cpm) de 5 504 Basenpaare-enthaltenden DNS-Fragments, das die gesamte reifes Fibroblasten-Interferon kodierende Sequenz enthielt. Dieselben Reaktionen mit dem Starter II lieferten etwa 50 ng (ca. 0,15 pM, 83,000 Cerenkow cpm) des 505 Basenpaare-enthaltenden Produkts.

Die Konstruktion von Plasmiden, die die Synthese von Human-Fibroblasten-Interferonen lenken, ist in Figur dargestellt. Es wurden verschiedene Plasmide konstruiert, die die FIF-Synthese unter die Kontrolle von E. coli Lac- oder Trp-Promotor-Operatorsystemen brachte. Diese beiden Systeme haben sich bereits als geeignet für die direkte Expression von Eukaryoten-Genen in E. coli erwiesen: humanes Wachstumshormon wurde unter Verwendung des Lacsystems (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]) synthetisiert, während Human-Leukozyten-Interferon in hohen Ausbeuten unter Verwendung des Trp-Systems erhalten wurde (Goeddel et al., Nature 287, 411 [1980]).

pBRH-trp wurde mit EcoRI behandelt und das erhaltene Fragment wurde durch PAGE und Elektroelution isoliert. EcoRI-behandeltes Plasmid pSomll (itakura et .il. , Science 198, 1056-1063 [1977]); brit. Patentpublikation Nr. 2007676 A)

- ir

wurde mit dem obigen Fragment kombiniert. Das Gemisch wurde nit T. DNS-Ligase behandelt und die erhaltene DNS zur Transformation von E. coli K-12 Stamm 294 in der bereits beschriebenen Weise verwendet. Die transformierten Bakterien wurden auf Grund ihrer Ampxcillxnresistenz selektioniert und nach der Koloniehybridisationsmethode von Grünste in et al. (supra) getestet, wobei das obige, aus pBRHtrp isolierte Fragment, das den Trp-Promotor-Operator enthielt

32
und mit P radioaktiv markiert war, als Sonde verwerdet wurde. Die Plasmid-DNS verschiedener im Koloniehybririsationstest positiver Kolonien wurde isoliert und die ( rientierung der eingefügten Fragmente wurde durch Restrictionsanalyse mit den Enzymen BgIII und BamHI bestimmt. E. coli 294 mit dem Plasmid pSOM7A2, das das Trp-Promotor-Operator-Fragment in der gewünschten Orientierung enthielt, wurde in LB-Medium, enthaltend 10 ug/ml Ampicillin, gezüchtet. Man liess die Zellen bis zu einer optischen Dichte von 1 (bei 550 nm) wachsen, zentrifugierte und suspendierte in M9-Medium bei 10-facher Verdünnung. Die Zellen wurder nochmais 2-3 Stunden zu einer optischen Dichte 1 wachsen gelassen, dann lysiert und das gesamte Zellprotein wurce durch SDS-Harnstoff (15%) PAGE (Maizel et al., Methoc.s Virol. 5_, 180-246 [1971]) analysiert.

Das Plasmid pBR3 22 wurde mit Hindlll behandelt ι nd die vorstehenden Hindlll-Enden wurden mit Sl-Nucleas'-entfernt. Für letztere Reaktion wurden 10 ug Hindlllgespaltenes pBR322 in 30 μΐ Sl-Puffer (0,3 M NaCl, 1 mM ZnCl₂, 25 mM Natriumacetat, pH 4,5) mit 300 Einheiten Sl-Nuclease 3 0 Minuten lang bei 15⁰C behandelt. Die Reaktion wurde beendet durch Zusatz von 1 μΐ 30 χ Sl-Nuclease-Stoplösung (0,8 M Trisbase, 5 0 mM EDTA). Das Gemisch wurde mit Phenol und anschliessend mit Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und schliesslich mit EcoRI, wie be-.

reits beschrieben, behandelt. Nach PAGE und Elektroelution wurde das grosse Fragment (1) erhalten, das ein EcoRI kohäsives Ende und ein stumpfes Ende, dessen kodierender Strang mit Thymidin beginnt, besitzt.

Das Plasmid pSom7A2 wurde mit BgIII behandelt und die resultierenden kohäsiven Enden wurden mittels Klenow-Polymerase I unter Verwendung aller 4 Deoxynucleotidtriphosphite doppelsträngig gemacht. Spaltung mit EcoRI sowie

° PAOE und Elektroelution lieferten ein kurzes lineares DN3-Fragment (2), das den Tryptophan-Promotor-Operator en-.hielt sowie Codons der LE¹ "proximalen" Sequenz stromaufwärts von der Bglll-Spaltstelle ("LE¹ (p)"). Dieses Fr igment besass ein kohäsives EcoRI-Ende und ein stumpfes

'^ EnIe, das von der Auffüllung der Bglll-Spaltstelle herrührte. Aus den beiden Fragmenten (1) und (2) wurde mit Hilfe von T .-DNS-Ligase das Plasmid pHKY 10 gebildet, mit dem kompetente E. coli Stamm 294-Zellen transformiert wurden.

Das Plasmid pGMI trägt das E. coli-Tryptophan-Operon mit der Deletion ALE1413 (Miozzari et al., J. Bateriology 13 3, 1457-1466 [1978]) und exprimiert daher ein Fusionsprotein mit den ersten 6 Aminosäuren des Trp-Leaders und etwa dem letzten Drittel des Trp E-Polypeptids (im folgenden LE¹ genannt), sowie dem vollständigen T rp D-Polypept.id, und zwar unter der Kontrolle des Trp-Promotor-Operator-Systems. Das Plasmid (20 \ig) wurde mit dem Restriktionsenzym PvuII an 5 Stellen gespalten. Die Genfragmente wurden dann mit EcoRI-Verbindungssequenzen (bestehend aus einer selbstkomplementären Polynukleotidsequenz pCATGAATTCATG) kombiniert, um eine EcoRI-Spaltstelle für das spätere Klonieren in ein Plasmid mit einer solchen EcoRI-Spaltstelle zu schaffen. Die 20 ug der aus pGMl erhaltenen DNS-Fragmente wurden mit 10 Einheiten T, DNS-Ligase in

Gegenwart von 200 pMol des 5'-phosphorylierten synthetischen Oligonucleotids pCATGAATTCATG in 20 μΐ T₄ DNS-Ligase-Puffer C:0 mMol Tr is, pH 7,6, 0,5 mMol ATP, 10 mMol MgCl₂., 5 mMol Dithiothreit) bei 4°C über Nacht behandelt. Die Lösung wurde dann 10 Minuten auf 70⁰C erwärmt. Die Verbindungssequenzen wurden mit EcoRI gespalten und die Fragmente, die nun EcoRI-Enden enthielten, wurden mittels 5% Polyacrylamid-

gelelektrophorese (PAGE) aufgetrennt. Die drei grössten Fragmente wurden aus dem Gel isoliert. Dazu wurde zunächst mit Ethidiumbromid angefärbt, die lokalisierten Fragmente wurden unter UV-Licht ausgemacht und die betreffenden Regionen aus dem Gel herausgeschnitten. Jedes Gelfragment wurde mit 300 Microliter 0,1 χ TBE in eine Dialysetasche gebracht und während 1 Stunde in 0,1 χ TBE-Puffer der Elektrophorese bei 100 Volt ausgesetzt (TBE-Puffer enthält: 10,8 g Tris-Base, 5,5 g Borsäure, 0,09 g Na„EDTA in 1 Liter H„O). Die wässrige Losung wurde gesammelt, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und 0,2M an Natriumchlorid gemacht. Die DNS wurde nach Ethanolfällung in wässriger Lösung erhalten. Das den trp-Promoter-Operator enthaltende Gen mit EcoRI kohäsiven Enden wurde nach der im folgenden beschriebenen Methode identifiziert, die darin besteht, dass man Fragmente in ein Tetracyclin-empfindliches Plasmid einbaut, die durch Einbau eines Promc tor-Operators Tetracyclin-resistent werden.

Das Plasmid ρBRHI (Rodriguez et al., Nucleic Afids Res, 6_, 3267-3287 [1979]) exprimiert Ampicxllinresis tenz und enthält das Gen für Tetracyclinresistenz, aber, weil kein zugehöriger Promoter existiert, exprimiert diese Resistenz nicht. Das Plasmid ist daher Tetracyclinempfindlich. Durch Einfügung eines Promoter-Operator-Systems an der EcoRI-Spaltstelle kann das Plasmid Tetracyclin-resistent gemacht werden.

pBRHl wurde rait EcoRI behandelt und das Enzym durch P lenolextraktion und Chloroformextraktion enfernt. Das η ich Ethanolpräzipitation in Wasser erhaltene DNS-Molekül w irde in getrennten Reaktionsgemischen kombiniert mit jedem dir drei DNS-Fragmente, die oben erhalten wurden und mit Tj, D IS-Ligase,wie bereits beschrieben verbunden. Die DNS des R2aktionsgemischs wufd3 zur Transformation kompetenter E. coli K-12 Stamm 294-Organismen nach Standardmethoden (Hershfield e- al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 71, 3455-3459 [1974]) verwendet. Die Bakterien wurden auf LB (Luria-Bertani)--P Latten gebracht,die 20 ug/ml Ampicillin und 5 ug/ml TetracAclin enthielten. Es wurden verschiedene Tretacyclin-restistente Kolonien ausgewählt, die Plasmid-DNS isoliert und dar V jrhandensein des gewünschten Fragmentes durch Restriktion.senzymanalysen bestätigt. Das entstandene Plasmid wurde p3RHtrp genannt.

Ein EcoRI und BamHI Digestionsprodukt des Genoms des Hepatitis B-Virus wurde nach bekannten Methoden erhalten und in die EcoRI und BamHI Spaltstellen des Plasmids pGH6 eingefügt (Goeddel et al., Nature 28l, 544 [19791), wodurch das Plasmid pHS32 entstand. Das Plasmid pHS32 wurde mit Xbal gespalten, mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und d'?r Ethanolpräzipitation unterworfen. Es wurde dann mit 1 y. L

E. coli DNS-Polymerase I, Klenow Fragment (Boehringer-Mannheim), in 30 μΐ Polymerase-Puffer (50 mM Kaliumphosphat, pH 7.4, 7 mM MgCl₂, 1 mM ß-Mercaptoethanol),enthaltend 0,1 mM dTTP und 3,1 mM dCTP, während 30 Minuten.bei O⁰C und 2 Stunden bei 37°C behandelt. Durch diese Behandlung wurde die Xbal Spaltstelle

folgendermassen verändert :

5' CTAGA — 5' CTAGA— 3' T— 3' TCT —

Dieser lineare Rest des Plasmids pHS32 (nach Phenol- und Chloroform-Extraktion und Ethanolpräzipitation in Wasser) wurde mit EcoRI gespalten. Das grosse Plasmidfragment wurde vom

»*#*♦» · VVt)VW S ·

- aer" " "

kleinen EcoRI-Xbal-Fragraent abgetrennt durch PAGE und nach Elektroelution isoliert. Dieses DNS-Fragment von pHS32 (0,2 Ug) wurde unter ähnlichen Bedingungen wie den obenbeschriebenen an das EcoRI-Taql-Fragment des Tryptophanoperons (etwa 0,01 ug) aus pBRHtrp gebunden. Dabei geschieht folgendes:

— T CTAGA--- —TCTAGA--

-- AGC TCT — AGCTCT--

mit der ungewöhnlichen Basenpaarung T-C. Ein Teil des Reaktionsgemisches wurde in E. coli 294—Zellen transformiert, hitzebehandelt und auf LB-Platten, die Ampicillin enthielten, gebracht. Es wurden 24 Kolonien ausgewählt, in 3 ml LB-Medium aufgezogen und das Plasmid isoliert. Es wurde festgestellt, dass sechs davon die Xbal-Spaltstellen im E. coli durch katalysierte DNS-Ausbesserung und Replikation regeniert hatten in folgender Weise:

-TCTAGA- -TCTAGA-

- AG_-CTCT- ^ -AGATCT-

Diese Plasmide konnten auch mit EcoRI und Hpal gespalten werden und lieferten die erwarteten Restriktionsfragmente. Ein Plasmid, pTrpl4 bezeichnet, wurde für die Expression heterologer Peptide, wie im folgenden beschrieben, verwendet.

-—-. Das Plasmid pHGH 107 (Goeddel et al., Nature 281, 544, [1979]) enthält ein Gen für das menschliche Wachstumshormon bestehend aus 23 synthetisch hergestellten Aminosäurecodons und 153 Aminosäurecodons^die von cDNS über reverse Transcription der mRNS erhalten wurde. Dieses Gen, obgleich es den Codon der Präsequenz des menschlichen Wachstumshormcns nicht enthält, besitzt ein ATG-Translations-Startcodon. Las Gen wurde aus 10 \ig pHGH 107 isoliert nach Behandlung mit EcoRI und E. coli DNA Polymerase I Klenow-Fragment_; sowie c:TTP und dATP^wie oben beschrieben. Nach Phenol- und Chloroformextraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde das Plasmid mit BamHI behandelt.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment wurde durch P/GE und Elektroelution isoliert. Das erhaltene DNS-Fragnu-nt enthält auch die ersten 350 Nukleotide des Tetracyclineresistenz-verleihenden Strukturgens,aber es fehlt ihm das Tetracyclin Promoter-Operatorr-System, so dass, wenn es anschliessend in ein Expressionsplasmid kloniert wird, diejenigen Plasmide, die diesen Abschnitt enthalten, durch die vr.edergewonnene Tetracyclinresistenz identifiziert werden können. Weil das EcoRI-Ende des Fragments aufgefüllt wurde nach dem Klenow-Polymerase I -Verfahren, hat das Fragment e:'-n stumpfes Ende und ein kohäsives Ende, wodurch die richtige Orientierung gesichert ist, wenn es später in ein ExpressÄonsplasmid eingefügt wird.

Als nächstes wurde das Plasmid pTrpl4 für den Empfang des das HGH-Gen enthaltende Fragment, das oben hergestellt wurde, vorbereitet. pTrpl4 wurde mit Xbal behandelt und die entstehenden kohäsiven Enden wurden nach dem Klenow-Polymsrase I-Verfahren unter Verwendung von dATP, dTTP, dGTP und d"TP aufgefüllt. Nach Phenol- und Chloroform-Extraktion sowie Ethanolpräzipitation wurde die erhaltene DNS mit BamHI behandelt und das entstandene gross Plasmidfragment wurde durch PAGE und Elektroelution eluiert. Dieses Fragment beoass ein st-umpfes und ein kohäsives Ende und erlaubte die Rekombination in der richtigen Richtung mit dem das HGH-Gen enthaltenden Fragment, dessen Herstellung oben beschrieben wurde.

Das das HGH-Gen enthaltende Fragment und das pTrpl4

AXba-BamHI-Fragment wurden kombiniert und miteinander verbun-

den unter ähnlichen Bedingungen wie diejenigen_;die vorstehend beschrieben sind. Durch die Verbindung der aufgefüllten Xbal- und EcoRI-Enden wurden die Xbal- und EcoRI-Restriktionsstellen wieder hergestellt:

Xbal aufgefüllt EcoRI aufgefüllt HGH-Gen-Anfang

-TCTAG AATTCTATG- -^CTAGAJlTTCTATG-

-AGATC S ..TTAAGATAC- -AGATCTTAAHΑΤΛΠ-

Xbal Eco.u

α ψ μ «■ w »t * « w - » -

i/

Durch diese Konstruktion wurde auch das Tetracyclinresistenz-Gen wiederhergestellt. Weil das Plasmid pHGH 107 Tetracyclinresistenz von einem Promoter, der stromaufxrärts vom HGH-Gen (Lac-Promotor) liegt, exprimiert, erlaubt das vorstehend konstruierte Plasmid, bezeichnet pHGH 207, die Expression des Gens für Tetracyclinresistenz unter der Kontrolle des Tryptophan-Promotor-Operators. Das erhaltene Gemisch wurde in E. coli 294 transformiert und die Kolonien wurden auf LB-Platten, die 5 ug/ml Tetracyclin enthielten, selektiomert. 10

Das Plasmid pHGH 207 wurde mit EcoRI behandelt und das den Trp-Promotor enthaltende Fragment wurde mittels PAGE und Elektroelution isoliert. Das Plasmid pBRHl wurde mit EcoRI behandelt und die Spaltstellen mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP, 1 ug, in 50 iM Tris, pH 8, und 10 mM MgCl₃) 30 Minuten lang bei 65⁰C behandelt, um die Phosphatgruppen an den vorstehenden EcoRI-Enden zu entfernen. Ueberschüssige bakterielle aLkalische Phosphatase wurde durch Phenolextraktion, Chloroformextraktion und Ethanol-Fällung entfernt. Infolge der an den überstehenden Enden fehlenden Phosphatgruppen kann das erhaltene lineare DNS-Fragment sich nicht selbst zu einem Kreis schliessen sondern nur mit solchen anderen DNS-Fragmenten reagieren, deren kohäsive Enden phosphoryliert sind.

Das EcoRT-Fragment aus pHGH 20 7 wurde mit dem aus pBRHl erhaltenen Linearem DNS-Fragment in Gegenwart von wie? vorstehend boschrieben verbunden. Ein Teil

T.-des erhaltenen Gemischs wurde zur Transformation von E. coli Stamm 294 in der vorstehend beschriebenen Weise verwendet.

12 Tetracyclin-resistente Kolonien wurden selektioniert (LB-Medium mit einem Gehalt von 5 ug/ml Tetracyclin).

Aus jeder Kolonie wurde Plasmid-DNS isoliert und durch Behandlung mit EcoRI und Xbal auf das Vorhandensein des gewünschten DNS-Abschnitts untersucht. Ein Plasmid, das den gewünschten Abschnitt enthielt, wurde pHKYl bezeichnet.

Das Plasmid pHKYlO ist ein Derivat von pBR322, das eine Bglll-Spaltstelle zwischen dem Tetracyclinresistenz (Tc )-Promotor und dem Strukturgen enthält. Das grosse DNS-Fragment, das nach Behandlung von pHKYlO mit Pstl und BgIII isoliert wurde, enthält daher einen Teil des Ampicillinresistenz (Ap )-Gens und das gesamte Tc -Strukturgen aber

■n

nicht den Tc -Promotor (Figur 6). Das Plasmid pGH6 (Goeddel et al., Nature 281, 544-548 [1979]) wurde mit EcoRI behandelt, die einsträngigen Enden wurden mit DNS-Polymerase I aufgefüllt und das Plasmid wurde mit Pstl gespalten. Das kleine Fragment, enthaltend einen Teil des Ap -Gens, einen doppelten Lac-Promotor und die Lac-Ribosomenbindungsstelle, nicht aber den ATG-Startcodon, wurde isoliert. Ein ähnliches Trp-Promotor-Fragment, das die Trp-Leader-Riboscmenbindungsstelle enthält, nicht aber eine ATG-Sequenz (Goeddel et al., Nature 287, 411-416 [1980]), kann aus pHKYl isoliert werden.

Das soeben erwähnte Trp-Fragment ist ein analoges des E-. coli-Tryptophan-Operons, aus dem der sogenannte Trp-Attenuator entfernt wurde (Miozzari et al., J. Bact. 13 3, 1457-1466 [1978]), um die Expression kontrolliert zu erhöhen. Expressionsplasmide, die das modifizierte Trp-Regulon enthalten, können bis zu vorgegebenen Konzentrationen in einem Nährmedium, das genügend zusätzliches Tryptophan enthält um das Promotor-Operator-System zu unterdrücken, gezüchtet werden. Entzug des Tryptophans, wodurch der Promotor-Operator in Aktion tritt, bewirkt die Expression des gewünschten Produktes.

Die Expressionsplasmide können zusammengesetzt werden über 3-stufige Verbindungsschritte, wie in Figur 6 gezeigt. 15 ng (0,05 pM) des FIF-Gens (504 bzw. 505 Basenpaare), 0,5 \xg (0,2 pM) des grossen Pstl-Bglll-Fragments von pHKYlO und 0,2 ug (0,3 pM) des geeigneten Promotorfragments wurden miteinander verbunden und das Gemisch wurde verwendet zur Transformation von E. coli 294 (Goeddel et al., Nature 287, 411-416 [1980]). Aus den einzelnen

U V

"$0

Transformanten wurde Plasmid-DNS isoliert und mittels Restriktionsenzymen analysiert. Bei korrekter Verbindung des FIF-Gens mit dem Promotorfragment wird die EcoRI (Lac)- oder die Xbal (Trp)-Erkennungssequenz wieder hergestellt. Die überwiegende Zahl der Plasmide lieferten das erwartete Restriktionsmuster. Einzelne Klone wurden hochgezüchtet (12 mit dem Trp-Promotor und 12 mit dem Lac-Promotor). Für den Interferon-Assay wurden aus ihnen Extrakte, wie bereits beschrieben, hergestellt.

Im CPE-Hemmtest auf menschlichen Amnionzellen (WISH)

waren 5 Trp-Transformanten positiv (alle etwa gleich stark) und 11 der Lac-Transformanten zeigten äquivalente Interferonaktivitäten. Daher wurde aus jeder Serie ein Transformant für die weiteren Untersuchungen ausgesucht (pFIFac9 und pFIFtrp69, Tabelle 1). Die DNS-Sequenzanalyse bestätigte, dass in beiden Fällen die gewünschte Verknüpfung des Promotors an das FIF-Strukturgen stattgefunden hatte.

Tabelle 1. Interferon-Aktivität in Extrakten von E. coli

	E. coli K-12	Zelldichte	Zellen/ml)	IF-Aktivität	106	FIF	-	Moleküle
25	Stamm 294	(		(E/l	107	pro	2,	Zelle
	transformiert		,5 χ 108		107		4,
	mit	3	r5 χ 108	Kultur)		20,
	pBR322	3	5 χ 108			250
30	pFIFlac9	3	5 χ 108	-	5CO
	pFIFtrp69	3	9,0 χ	2GO
	pFIFtrp369	1,8 χ
	8,1 χ

Die Züchtung der Zellen und die Herstellung der Extrakte erfolgte in der oben angegebenen Weise. Die menschliche Amnionzellinie (WISH) wurde für den CPE-Hemmtest verwendet. Die angegebenen Aktivitäten sind Mittelwerte aus

unabhängigen Versuchen. Um die Anzahl der Interferonmoleküle pro Zelle zu bestimmen, wurde eine spezifische FIF-Aktivität

von 4 χ 10 Einheiten/mg verwendet (Knight, supra).

Die mit pFIFlac9 und pFIFtrp69 erhaltenen FIF-Mengen sind in Tabelle 1 wiedergegeben. Der Trp-Promotor lieferte eine höhere Expression als der Lac-Promotor. Um die FIF-Expression weiter zu erhöhen, wurde pFIFtrp69 mit EcoRI gespalten und zwei 300 Basenpaar-lange EcoRI-Fragmente, die den Trp-Promotor enthielten (Goeddel et al., Nature 287, 411-416 [1980]), wurden eingefügt. Das erhaltene Plasmid, pFIFtrp 69, enthält drei aufeinanderfolgende Trp-Promotoren, die in Richtung des FIF-Gens orientiert sind. Di'; von E. coli K-12 Stamm 294/pFIF trp 69 produzierte FIP-Menge ist vier- bis fünfmal so gross wie die von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 produzierte (Tabelle 1). Das von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 hergestellte FIF verhält sich wie authentisches Human-FIF. Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, ist seine antivirale Aktivität etwa 30mal grosser bei menschlichen Zellen als bei.Rinderzellen. Zusätzlich ist das bakteriell hergestellte FIF bei pH über Nacht stabil und wird nicht durch Kaninchen-Anti-Human -Leukozyten-Interferon- Antikörper neutralisiert (Tabelle 3) .

Tabelle 2. Interferon-Aktivitäten verschiedener Zelltypen

30	Zellen	(human) (Rind)	LeIF	000 000	Interferon-Aktivität (E/ml)
	Amnion Niere		20 13	FIF E. coli K-12 Stamm 29 4/pFIFtrp69-Extrakt
35			10,000 1280 400 40

ν ·

-VS-

Tabelle 3. Vergleich der Interferon-Aktivitäten aus

Extrakten von E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69 mit Human-LelF- und -FIF-Standard

	Interferon-Aktivität (E/ml)
unbehandelt pH 2 Kaninchen-anti- Human-LelF-Anti körper	LeIF FIF E. coli K-12 Stamm 294/pFIFtrp69
1000 1000 1000 1000 1000 1000 16 1000 1000

LeIF und FIF sind NIH-Standardlösungen mit 20,000 bzw. 10,000 Einheiten/ml.

N. Reinigung

Bakteriell hergestelltes Fibroblasten-Interferon wird folgendermassen gereinigt:

1. Die gefrorenen Zellen werden in der 12-fachen Menge (v/w) eines Saccharosepuffers (100 mM Tris-HCl, 10% Saccharose, 0,2 M NaCl, 50 mM EDTA, 0,2 mM PMSF [Phenylmethylsulfonylchlorid], pH 7,9), enthaltend 1 mg/ml Lysozym, suspendiert. Die Zellsuspension wird 1 Stunde bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Fibroblasten-Interferonaktivität findet sich im üeberstand.

2. Der mit Ultraschall behandelte Üeberstand wird mit 5%igem Polyethylenimin (v/v) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% (v/v) versetzt. Die Lösung wird 1 Stunde bei 4⁰C gerührt und dann zentrifugiert. Die Interferonaktivität verbleibt im Üeberstand.

3. Der Üeberstand wird mit festem Ammoniumsulfat bis zu einer Endkonzentration von 50% versetzt, 3 0 Minuten bei

ft t- ββ «5 (1 ftf»

4°C gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im Niederschlag.

4. Der Ammoniumsulfatniederschlag wird in PBS (20 mM Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 7,4) suspendiert und zwar in einem Volumen, das halb so gross ist wie das der 50%igen Ammoniumsulfat-Suspension. Es wird Polyethylenglykol 6000 (50%, w/v, in PBS) zugesetzt bis zu einer Endkonzentration von 12,5% (v/v), 2 Stunden bei 4°C gerührt und zentrifugiert. Die Interferonaktivität befindet sich im Niederschlag, der in einer minimalen Menge des unker (1) definierten Saccharosepuffers suspendiert und durch zentrifugieren geklärt wird.

Durch dieses Extraktionsverfahren wird eine Anreicherung des Fibroblasten-Interferons von 0,001% Gesamtprotein auf 0,05% Gesamtprotein erreicht. Das Material kann weiter bis zur Homogenität durch folgende säulenchromatographischen Verfahren gereinigt werden:

5. Affinitätschromatographie an Amicon-Blau B in dem un'-.er (1) definierten Saccharose puffer.-

6. Anionenaustauschchromatographie an QAE Sephadex in

dem unter (1) definierten Saccharosepuffer bei Abwesenheit von 0,2 M NaCl.

7. Grössenausschlusschromatographie an Sephadex G-75 in dem unter (1) definierten Saccharosepuffer.

8. HPLC an Umkehrphasen.

O. Parenterale Applikation

FIF kann parenteral verabreicht werden an Individuen, die eine antitumor- oder antivirale Behandlung benötigen und an solche, die immundepressive Zustände aufweisen. Die Dosierung kann sich an die des zur Zeit in klinischer

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Prüfung befindlichen Materials, das aus menschlichen Zellen gewonnen wurde, anlehnen und kann z.B. etwa 1-10 χ 10 Einheiten/Tag, im Fall von Material mit einer Reinheit, die grosser ist als 1%, bis zu etwa 15 χ 10 Einheiten/Tag betragen. Die Dosierungen von bakteriell hergestelltem FIF können zur Erzielung eines besseren Effekts markant erhöht werden, wegen der höheren Reinheit und der weitgehenden Abwesenheit anderer Human-Proteine, die als Pyrogene wirken können und für unerwünschte Nebenwirkungen verant- c..

wortlich sein können, beispielsweise erhöhte Temperatur, Uebelkeit usw.

Ein für die parenterale Applikation geeignetes Präparat kann beispielsweise dadurch hergestellt werden, dass man 3 mg bakteriell hergestelltes FIF mit einer spezifischen

Aktivität von etwa 2 χ 10 Einheiten/mg in 25 ml 5%iqem. humanen Serumalbumin löst, die Lösung durch ein bakteriologisches Filter gibt und die filtrierte Lösung aseptisch in 100 Ampullen abfüllt, von denen jede 6 χ 10 Einheiten reines Interferon enthält. Die Ampullen werden vorzugsweise in der Kälte (-20⁰C) aufbewahrt.

Die Herstellung pharmazeutischer Präparate, die erfindungsgemässe Verbindungen enthalten, kann nach den allgemein bekannten Methoden der Galenik unter Verwendung der üblichen Hilfs- und Trägermaterialien, wie sie in der einschlägigen Literatur beschrieben sind, erfolgen.

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Claims (1)

1. - 3* - DS GE 41OO/15A Patentansprüche

   1. Mikrobiell hergestellte Polypeptide mit der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons ohne Präsequenz oder Teil einer solchen.

   2. Polypeptide gemäss Anspruch 1, dadurch geker.nzeichnet, dass sie keine Glykosylgruppen enthalten.

   3· Polypeptide gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der normalerweise aminoendständige Methioninrest fehlt.

   4. Polypeptide gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie aminoendständig um ein abspaltbares Konjugat oder mikrobielles Signalprotein verlängert sind.

   5· Eine DNS-Sequenz, die die Aminosäuresequenz eine; Polypeptids gemäss den Ansprüchen 1, 3 oder 4 codier':.

   6. Eine DNS-Sequenz gemäss Anspruch 5> die operabel verbunden ist mit einer DNS-Sequenz, die die mikrobielle Expression eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1, 3 oder 4 bewirken kann.

   7. Ein replikabler tnikrobieller Vektor, der in eine.η transformierten Mikroorganismus ein Polypeptid gemäss ein-ira der Ansprüche 1, 3 oder 4 zur Expression bringen kann.

   8. Ein Vektor gemäss Anspruch J, der ein Plasmid ist.

   9. Ein Plasmid aus der Gruppe pPIPlac9, pPIFtrp69 unl pFIFtrp-^69.

   10. Ein mit einem Vektor gemäss den Ansprüchen 7-9 transformierter Mikroorganismus.

   * β β

   DS GE 41OO/15A

   11. Ein mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 7-9 transformierter Stamm von E. coli.

   12. E. coli K-12 Stamm 294 transformiert mit einem Vektor .^emäas einem der Ansprüche 7-9.

   IJ). Bacillus subtilis transformiert mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 7-9·

   14. Saccharomyces cerevisiae transformiert mit einem Vektor gemäss einem der Ansprüche 7-9.

   15. Bakterienextrakte mit einem Gehalt von mindestens 95i& eines Polypeptids, das im wesentlichen aus der Aminosäuresequenz eines reifen Human-Fibroblasten-Interferons gemäss einem der Ansprüche 1-4 besteht.

   16. Pharmazeutische Präparate auf der Basis eines reifen Human-Pibroblasten-Interferons gemäss einem der An-Sprüche 1-4.

   17. Pharmazeutische Präparate gemäss Anspruch 16 zur parenteralen Applikation.

   18. Eine Kultur von Mikroorganismen, die zur Produktion von reifem Human-Pibroblasten-Interferon fähig sind.

   19· Eine Kultur von Mikroorganismen gemäss eiaem der Ansprüche 11-14.

   P.O. Die Verwendung eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1, 3 oder 4 zur Behandlung von Tumoren und viralen Infektionen oder zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, die für derartige Behandlungen geeignet sind.

   - >* - DS GE 41OO/15A

   21. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gern iss einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass mm eine Kultur eines Mikroorganismus, der mit einem zur Ecpression eines solchen Polypeptids befähigten replikable:i V3ktor transformiert ist, zur Expression anregt und das Polypeptid isoliert.

   22. Verfahren zur Herstellung eines Mikroorganismus, dar zur Expression eines Polypeptids gemäss einem der Ansprüche 1-4 fähig ist, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus mit einem die Expression dieses Polypeptids bewirkenden, replikablen Vektor transformiert und kultiviert.

   23· Verfahren zur Herstellung eines replikablen, in einem Mikroorganismus die Expression eines Polypeptids ge- IS rrlss einem der Ansprüche 1-4 bewirkenden Vektors, dadurch gekennzeichnet, dass man eine dieses Polypeptid codierende * ENS-Sequenz operabel mit einer DNS-Sequenz, die die für dia f Expression notwendigen Codons enthält, verbindet.

   24. Verfahren gemäss Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite DNS-Sequenz einen mehrfachen Trp-' Promotor-Operator enthält.