DE3137668A1 - Verfahren zum testen auf vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) und testsatz zu seiner durchfuehrung - Google Patents
Verfahren zum testen auf vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) und testsatz zu seiner durchfuehrungInfo
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Description
DR. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER R. F. MEYER-ROXLAU
DIPL.-ING. (1934-1974) DIPL-CHEM. DIPL--1NG.
8000 MÖNCHEN 80 LUCILE-GRAHN-STRASSE 22
TELEFON: (089) 472947 TELEX: 624624 LEDER D TELEGR..-LEDERERPATENT
22. Sept. 1981 4925
AMERSHAM INTERNATIONAL LIMITED
White Lion Road
Amersham, Buckinghamshire, HP7 9LL, England
Amersham, Buckinghamshire, HP7 9LL, England
Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 und Testsatz zu seiner
Durchführung
Serum-B-2r an Trägerprotein gebunden, muß freigesetzt werden,
bevor darauf getestet werden kann. Bei herkömmlichen Methoden wird das Serum 15 bis 30 min in Gegenwart von Cyanid erwärmt.
Bei in großen klinischen Chemielaboratorien durchgeführten Tests ist jedes Erhitzen unerwünscht, da es den Arbeitsfluß
unterbricht. Ein Erwärmungsvorgang, der aufgrund der Gegenwart
von Cyanid (insbesondere bei saurer Lösung) die Verwendung eines Abzugs erfordert, ist höchst unerwünscht.
Ein Aufsatz in Clinical Chemistry, Band 26, Nr. 2, 1980, Seiten
323 - 326, schlägt einen Test vor, bei dem endogenes Serums' aus seinen Proteinkomplexen bei Raumtemperatur mit NaOH
bei pH 13,6 freigesetzt wird. Das Arbeitsprotokoll weist aber auf die Verwendung sehr großer Cyanid-Konzentrationen (2000
μg/ml Serum) bei der Denaturierung hin. Auch wird Auster-Krötenfisch-Serum
als spezifisches Reagens für Vitamin B12
anstelle des üblicheren Schweine-Intrinsikfaktors verwendet. Soweit bekannt, ist dieser Test nicht gewerblich verwertet
worden. Es besteht ein klar erkannter und lange verspürter
Jt-S
Bedarf an einem Test auf Vitamin B12 unter Verwendung des
Intrinsikfaktors, wobei bindende Serumproteine denaturiert werden, ohne Wärme oder hohe Cyanidkonzentrationen anzuwenden.
Bekannt ist, daß Dithiopolyole, wie Dithiothreitol (DTT), die Freisetzung von Vitamin B12 aus bindenden Serumproteinen
fördern können. Ein Aufsatz im American Journal of Clinical
Pathology, August 1980, Band 74, Nr. 2, Seiten 209 bis 213, vergleicht drei handelsübliche Vitarain B1„-Testsätze, bei
denen die Denaturierung von Serumproteinen durch Kochen erfolgt. Ein bei einem der Testsätze auftretendes Problem
nicht-spezifischer Bindung wurde durch Einbeziehen von DTT
und Cöbinamid zusammen mit den anderen Testbestandteilen behandelt.
Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Testen auf Vitamin
B12 in Serum mit folgenden Schritten:
a) Mischen einer Probe des zu testenden Serums mit Alkali,
Cyanid und einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen,
,^-V b) Inkubieren des Gemischs bei einer Temperatur nicht
über 50 0C ausreichend lange, um das Vitamin B.. von den bindenden
Serumproteinen abzutrennen und die Proteine im wesentlichen zu denaturieren,
c) entweder vor, während oder nach der Stufe b) Bildung
einer Standardmenge an radioaktiv markiertem Vitamin B12 und
einem Vitamin B1„-Analogon, das sich fest an die bindenden
Serumproteine der Probe bindet, nicht aber an den Intrinsikfaktor, ·
d) Senken des pH-, erts des inkubierten Gemischs aus der
Stufe b), Zugabe einer Standardmenge an Intrinsikfaktor, die
nicht ausreicht, um das gesamte Vitamin B12 in der Probe
und das radioaktiv markierte Vitamin B^? zu binden, und
e) Inkubieren des Gemischs, um einen Teil des Vitamins
B12 in der Probe und einen Teil des radioaktiv markierten
Vitamins B12 an äen Intrinsikfaktor gebunden werden zu lassen,
Abtrennen des gebundenen Anteils vom nicht so gebundenen Anteil, Messen des Radioaktivitätswerts wenigstens
eines Anteils und Verwerten der Messung zur Bestimmung der Konzentration an Vitamin B1? in der Probe.
Ein Merkmal der Erfindung ist das Einbeziehen eines Dithiopolyols mit 4 bis,6 Kohlenstoffatomen in Stufe a) zur Förderung
der Abtrennung des Vitamins B12 von den bindenden
Serumproteinen. Bevorzugte Dithiopolyole sind 1,4-Dithiotetritole,
einschließlich die beiden Isomeren Dithiothreitol und Dithioerythritol. Diese werden vorzugsweise in Anteilen
von 2 bis 20, insbesondere 4 bis 10 mg/ml Serumprobe verwendet.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung von Cyanid in Stufe a). Cyanid wandelt die verschiedenen vorhandenen
Cobalamine in Cyanocobalamine um. Vermutlich fördert das Dithiopolyol die Freisetzung von Cyanocobalaminen
aus bindenden. Serumproteinen. Dithiopolyole sind besonders wirksam in Gegenwart von Cyanid, was vermuten läßt, daß sie
besser in der Lage sind, Cyanocobalamine als andere Cobalamine aus bindenden Serumproteinen freizusetzen. Die erfindungsgemäß
bevorzugte Cyanidkonzentration ist 10 bis 1000, insbesondere 20 bis 200 μg/ml Serumprobe.
Cyanid und Dithiopolyole fördern die Abtrennung von Vitamin B12 von bindenden Serumproteinen, denaturieren aber selbst
nicht die Proteine. Daher besteht, wenn der pH-Wert in Stufe b) herabgesetzt wird, die Gefahr, daß die bindenden
Serumproteine in gewissem Ausmaß mit dem Vitamin B1- rekombinieren.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird diese Gefahr dadurch vermieden, daß in das Gemisch bei Stufe d)
ein Vitamin B1„-Analogon einbezogen wird, das jegliche verbliebenen nicht-denaturierten bindenden Serumproteine der
Probe bindet, nicht aber den zugesetzten Intrinsikfaktor.
Die verwendete Menge des Vitamin B12-Analogons sollte wenigstens
ausreichen, alle Bindungsstellen der nicht-denaturierten bindenden Serumproteine der Probe zu besetzen, und sie ist
das vorzugsweise 10- bis 1000-fache der zum Besetzen aller
Bindungsstellen erforderlichen Menge. Ein geeignetes Vitamin B1?-Analogon ist Cobinamid, das fest an bindende Serumproteine
gebunden wird, aber überhaupt kaum an den Intrinsikfaktor. Andere Vitamin B1„-Analoga können verwendet werden.
In Stufe b) erfolgt die Trennung und teilweise Denaturierung von den bindenden Serumproteinen bei einer Temperatur nicht
über 50 eC und vorzugsweise bei Raumtemperatur. Der pH-Wert
der Probe sollte wenigstens 12,0, vorzugsweise 12,5 bis 13,7, insbesondere 12,9 bis 13,5, sein. Das Alkali, das bequemerweise
Natriumhydroxid ist, wird in einer Menge verwendet, die
den gewünschten pH-Wert zu erreichen erlaubt. Die für die Umsetzung erforderliche Zeit ist im allgemeinen 5 bis 60 min,
typischerweise etwa 15 min, und kann durch Versuch und Irrtum leicht bestimmt werden.
In Stufe b) wird das Gemisch der behandelten Probe und des
Intrinsikfaktors unter pH- und Temperaturbedingungen inkubiert, bei denen der Intrinsikfaktor Vitam B12 stark bindet.
Diese Bedingungen können pH 9,3 bei Raumtemperatur sein.
Der Vitamin B12~Tracer kann herkömmlicherweise mit Kobalt-57
markiert sein. Der Tracer kann der Serumprobe entweder
vor, während oder nae. Stufe b) zugesetzt werden. Es kann
bequem sein, ein einziges Reagens zur Verfügung zu stellen,
das markiertes Vitamin B12 und Cyanid enthält, zur Zugabe
zur Probe in Stufe a).
Das Vitamin B12-Analogon, z.B. Cobinamid, kann vor, während
oder nach der Stufe b)· zugesetzt werden. Vorzugsweise wird es nach der Stufe b) zugesetzt. Es kann bequem sein, ein
einziges Reagens, das Cobinamid und Intrinsikfaktor enthält, in Stufe d) vorzusehen.
Die Stabilität des Dithiopolyols ist stets problematisch gewesen.
Bei einem handelsüblichen Vitamin B.. .,-Testsatz wird
DTT als wässrige Lösung zugeführt, die bei 4 eC bis zu 30 Tage nach Öffnen des Gefäßes gelagert werden kann. Vor
der Verwendung wird die DTT-Lösung mit dem radioaktiven Tracer gemischt, um eine arbeitende Tracerlösung zu ergeben,
die nur einen Tag stabil ist. Bei einem weiteren handelsüblichen Testsatz wird DTT als gefriergetrocknetes Pulver zur
Verfügung gestellt, das als solches bei 2 bis 8 0C gelagert
werden kann. Nach dem Rekonstituieren muß es bei -20 0C gelagert
werden. Vor dem Gebrauch wird es mit dem markierten Vitamin B1^ zu einer arbeitenden Tracerlösung gemischt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, daß das Dithiopolyol im Gemisch mit dem zum Denaturieren der Serumproteine
verwendeten Alkali vorgesehen werden kann. Dies ist unerwartet, da es seit langem bekannt ist, daß Mercaptane
durch Luft leicht zum Disulfid oxidiert werden, insbesondere
in alkalischer Lösung. Der erfindungsgemäße Test, der ohne
ein Dithiopolyol nicht arbeitet, arbeitet mit Lösungen von DTT in NaOH, die über 14 Wochen bei 2 bis 4 0C oder bis zu
2 Wochen bei 37 0G aufbewahrt worden sind, völlig zufriedenstellend.
•Die Erfindung liefert somit ferner einen Testsatz zur Durchführung
eines Tests auf Vitamin B1 „ in Serum mit Quellen für
Alkali/ einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cyanid, radioaktiv markiertem Vitamin Β.«, IntrinsikEaktor
und einem Vitamin B12~Analogon, das in Serum fest an bindende
Serumproteine gebunden wird, nicht aber an den Intrinsikfaktor, wobei die Quellen für Alkali und Dithiopolyol im Gemisch
vorliegen.
Es ist ziemlich üblich, einen Doppeltest auf Vitamin B12 und
Folat durchzuführen, und zwar unter Zugabe von mit Kobalt-57
markiertem Vitamin B12 und mit Jod-125 oder Jod-131 markiertem
Folat und spezifischen bindenden Proteinen für beide Materialien zur selben Serumprobe. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 kann vorteilhafterweise zusammen mit einem Folat-Test durchgeführt werden. Folat liegt
normalerweise in Serum zusammen mit Folat bindenden Proteinen vor. Stufe b) des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei tiefer
Temperatur durchgeführt, um bindende Serumproteine zu entfernen, hat keinen schädlichen Einfluß auf den Folattest.
Die Quelle für den Intrinsikfaktor ist unwichtig. Gewöhnlich wird Intrinsikfaktor vom Menschen oder Schwein verwendet.
Reagentien und Arbeitsvorschrift für einen erfindungsgemäßen
Test.
a) Standards enthalten Vitamin B12 in geeichten Mengen,
auf Puffer-Basis, menschliches Serumalbumin enthaltend.
b) Tracer ist Co-Cyanocobalamin in einem konservierten
10 mM Phosphatpuff r, 0,1 Gew.-%/Vol.-% Kaliumcyanid enthaltend.
c) Denaturierungsreagens ist eine 1,2m Natriumhydroxidlösung
mit 1,0 % Dithiothreitol.
d) Bindendes Reagens ist gereinigter Intrinsikfaktor
vom Schwein in einem konservierten 0,2 m Boratpuffer, menschliches Serumalbumin und 20 |ig/l· Cobinamid enthaltend.
e) Kohletabletten sind ein Gemisch aus mit Protein überzogener
Aktivkohle mit mikrokristalliner Cellulose in einem Gewichtsverhältnis von 1:3.
1. Die Teströhrchen werden markiert und in Gestellen
aufgestellt nach dem in Tabelle I wiedergegebenen Protokoll.
2. 200 μΙ-Teilmengen der Standards und unbekannte
Sera werden in die geeigneten Röhrchen mit einer frischen Pipettenspitze für jede neue Lösung pipettiert.
3. 100 μΙ-Mengen Tracer werden in alle Röhrchen pipettiort.
4. 100 μΙ-Teilmengen Denaturierungsreagens werden in alle Röhrchen pipettiert.
5. Gründliches Wirbelmischen aller Röhrchen, damit keine Tropfen unvermischten Reagens übrig bleiben. Bedecken
der Röhrchen mit einem Gewebe und Inkubieren in gedämpftem Licht für 15 min bei Raumtemperatur.
6. 10Ö0 μΐ des bindenden Reagens werden in alle Röhrchen
pipettiert/ mit Ausnahme der "Totais" und Blindprobenröhrchen.
1000 μΐ destilliertes Wasser werden in die "Totais" und Blindprobenröhrchen pipettiert.
7. Alle Röhrchen werden gründlich wirbelgemiscbt und
45 min bei Raumtemperatur in gedämpftem Licht inkubjert.
45 min bei Raumtemperatur in gedämpftem Licht inkubjert.
8. Gegen Ende der Inkubationsperiode wird mit einer
Pinzette eine Aktivkohletablette in jedes Röhrchen, mit
Ausnahme der "totals",gegeben.
Pinzette eine Aktivkohletablette in jedes Röhrchen, mit
Ausnahme der "totals",gegeben.
9. Die Tabletten können für wenigstens 5 bis 10 s zerfallen.
1 bis 2 s wird durchwirbelt, entfernt und sofort
wieder weitere 6 bis 10 s durchwirbelt»
wieder weitere 6 bis 10 s durchwirbelt»
10. Alle Röhrchen werden bei Raumtemperatur 15 min inkubiert.
11. Alle Röhrchen (ausgenommen die "totals")werden wenigstens
10 min bei 1500 g zentrifugiert. Das freie Vitamin B12 wird von der Aktivkohle adsorbiert; das gebundene Vitamin
B12 bleibt in der überstehenden Flüssigkeit.
12. Nach dem Zentrifugieren werden die überstehenden
Flüssigkeiten in einen klaren Satz markierter Röhrchen dekantiert, die Röhrchenränder leicht aneinander geklopft, um die überstehende Flüssigkeit vollständig zu überführen.
Flüssigkeiten in einen klaren Satz markierter Röhrchen dekantiert, die Röhrchenränder leicht aneinander geklopft, um die überstehende Flüssigkeit vollständig zu überführen.
13. Alle Röhrchen werden in einem geeignet programmierten ^-Zähler 60 s oder auf wenigstens 10 000 Zählimpulse in
den Röhrchen 5 bis 6 gezählt.
1. Auf log/lin.-Papier werden zwei Standardkurven erstellt, indem die Zählimpulse pro Zeiteinheit auf der linearen
Achse gegen die Konzentration an Vitamin B12 oder
Folat auf der log-Acvi~e aufgetragen werden. Es werden die
besten Standardkurven ^urch das Mittel doppelter Punkte unter Ausschluß stark abweichender Punkte erstellt.
Folat auf der log-Acvi~e aufgetragen werden. Es werden die
besten Standardkurven ^urch das Mittel doppelter Punkte unter Ausschluß stark abweichender Punkte erstellt.
2. Unter Verwendung des Mittels der Zählimpulse für die unbekannten Proben werden deren Vitamin B1^- oder FoIat-Konzentrationen
aus der jeweiligen Standardkurve abgelesen.
Der obige Test wurde mit einem führenden kommerziellen Testsatz (der ein Kochen der Probe zwecks Denaturierung erfordert)
und mit einem herkömmlichen mikrobiologischen Test (der als eine genaue Bestimmung liefernd anerkannt ist, aber
zu langsam und zu schwer zu handhaben ist) verglichen. In beiden Fällen wurde eine lineare Beziehung mit einem hohen
Korrelationskoeffizienten über 0,94 gefunden. Dies zeigt,
daß der erfindungsgemäße Test genaue Ergebnisse erzielt, ohne unter den Nachteilen bestehender Tests zu leiden, nämlich
der Notwendigkeit, die Probe in Alkali mit Cyanid zum Denaturieren der Serumproteine zu kochen.
Die Abkürzung "totals" steht für die Gesamtradioaktivität des radioaktiven Tracers, die in Lösung vorliegt, wenn
keine Aktivkohle zur (teilweisen) Ausfällung den Röhrchen • zugesetzt wurde.
Testprotokoll
| Anmerkung: Alle Volumina | "Totais" 1 - 2 |
in μΐ | 0 5-6 |
50 7-8 |
1000 | 150 9-10 |
STANDARDS | 1000 13-14 |
2000 15-16 |
UNBEKANNT | 1 | 1000 | 1000 | 1000 | 2 etc. |
| Röhrchen | — | Blind probe 3-4 |
200 | 200 | — | 200 | 400 11-12 |
200 | 200 | — | — | — | — | _ | |
| Standards | 200 | _ | _ | 200 | mm | _ | 200 | 200 | |||||||
| Rontrollen oder unbekannte Proben |
100 | _ | 100 | 100 | 100 | _ | 100 | 100 | 100 | 100 | |||||
| Zweifach-Tracer | — | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | |||||
| Denature ^rungs- reagens |
100 | Wirbelmischen. | 15 min | 100 | Inkubation bei Raumtemperatur | ||||||||||
| - | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | |||||||||||
| Lösung binden den Proteins |
1000 | - | — | — | — | - | |||||||||
| Wasser | 1000 | ||||||||||||||
Wirbelmischen. 45 min Inkubation bei Raumtenperatur
Zugabe einer Aktivkohle-Tablette zu allen Röhrchen (ausgenommen den "Totais"), 1-2 s Wirbelmischen,
Entfernen und Wirbelmischen für weitere. 6 bis 10 s.
15 min Inkubation aller Röhrchen bei Raumtemperatur.
Zentrifugieren aller Röhrchen 10 min bei 1500 g. Dekantieren der überstehenden Flüssigkeiten in einen
sauberen Satz markierter Röhrchen und Auszählen.
CO CO
CJ) CT) 00
- jar-"
Die folgenden Reagentien und Arbeitsweisen wurden zur Bestimmung der Serum-Blindproben (nicht-spezifische Bindung
von Vitamin B13)/ erhalten unter verschiedenen Bedingungen
in der/alkalischen Denaturierungsstufe des Vitamin B15-TeStS,
angtiwandt. Aus den späteren Daten wird klar, daß einzigartig
definierte Bedingungen für die wirksame Denaturierung von Vitamin B-. „ bindenden Proteinen in menschlichem Serum mit
Natriumhydroxid nötig sind.
1a. i ,.5 η Natronlauge.
1b. Destilliertes Wasser. ·
2a. 1,5 \iCi ( Co) Vitamin B1 „-Tracer in Kaliumphosphatpuffer
mit menschlichem Serumalbumin und Konservierungsstoff.
2b. Wie 2a, aber auch KCN (0,5 mg/ml) enthaltend.
2c. Wie 2a, aber auch Dithiothreitol (1 Gew./Vol.-?.) enthaltend.
2d. Wie 2a, aber auch KCN (0,5 mg/ml) und Dithiothreitol (1 Gew./Vol.-%)-Testlösung enthaltend.
3a. Natriumborat-Puff er, pH 7,2, mit menschlichem Serumalbumin
und .Natriumchlorid.
3b. Wie 3a, aber auch Dithiothreitol (0,1 Gew./Vol.-%) enthaltend.
3c. Wie 3a, aber auch KCN (50 ug/ml) enthaltend.
3d. Wie 3a, aber auch Dithiothreitol (0,1 Gew./Vol.-%)
. und KCN (50 μg/ml) enthaltend.
3e. Wie 3a, aber auch Cobinamid (20 ng/ml) enthaltend.
4. Mit Protein überzogene Kohle-Suspension in 0,9 (Gew./Vol.) % Natriumchloridlösung mit Konservierungsstoff
(75 mg Aktivkohle/ml).
| 1 | Testbedingungen 2 3 4 5 6 |
2a | 2b | 2c | 2d | 7 | Röhrchen mit Gesamtradio aktivität |
| 1a | 1a | 1a | Ta | ||||
| 2a | 2d | — | — | — | —. | 2d | 2a |
| 1b | 1a | 1a | 1a | ||||
| 3a | — | ||||||
Zugabe von 200 μΐ Serum * Zugabe von 100 μΐ Reagens
Zugabe von 100 μΐ Reagens Zugabe von 100Ομ1 Reagens
Wirbelmischen und Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur (ausgenommen
die Röhrchen unter Testbedingung 2, die 15 min bei 100 0C inkubiert werden)
.
| Zugabe | von 1000μ1 | von 200 μΐ | Reagens | 3a | - | 3d | 3b 3c 3a 3e | 3a |
| Wirbelmischen und | Inkubieren | für | 45 | min bei | Raumtemperatur | |||
| Zugabe | Reagens | 4 | 4 | 4 | 4 4 4 4 | - |
Wirbelmischen und 5 min stehenlassen. Zentrifugieren aller Röhrchen
ausgenommen die "Totais" 10 min bei 1500 g, Dekantieren überstehender
Flüssigkeiten in einen klaren Satz markierter Röhrchen. Alle überstehenden Flüssigkeiten und der Gesamtgehalt der "Total"-Röhrchen werden in
einem ^-Zähler gezählt.
* Zwölf menschliche Serumproben wurden unter jeder Bedingung getestet.
·- jar--
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Werte sind die mittleren Zählwerte, erhalten an 12 einzelnen
Serumproben, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtzählimpulse.
Mittlere (n = 12) Serum-Blindwerte,erhalten unter verschiedenem Bedingungen beim Vitarn B., -,-Test
Testbedingungen ' Serum-Blindwert
(% nicht-spezif.Bindung)
1. Test ohne Denaturierung endogener 87,1 (+7,5)
bindender Proteine
2. Test mit Wärmedenaturierung (sieden- 7,2 (+ 0,9)
des Wasserbad
Alkalische Denaturierung:
3. DTT und KCN in der Testlösung (pH 9,3) 23,7 (+ 3,2)
4. KCN in Tracer-Lösung (pH 13). DTT in 28,9 (+ 3,0)
der Testlösung (pH 9,3)
5. DTT in Tracer-Lösung (pH 13). KCN in
der Testlösung (pH 9,3) 15,6 (+3,4)
6. OTT und KCN in Tracer-Lösung (pH 13) 8,9 (+ 0,8)
7. DTT und KCN in Tracer-Lösung (pH 13) 4,3 (+ 0,4)
20 ng/ml Cobinamid in der Testlösung
(pH 9,3).
Die Bedingung 1, bei der es keine Denaturierung gab, zeigt,
daß die Masse des Vitamins B1- im Serum in gebundener. Form
vorliegt. Bei der Bedingung 2 erfolgte die Denaturierung durch Kochen mit Cyanid, eine unbequeme Stufe, die aber die
nicht-spezifische Bindung auf einen annehmbaren Wert senkte.
Raumtemperatur-Denaturierung, mit oder ohne Cyanid (Bedingnng 4 und 3) beließ 20 bis 30 % des Vitamins B12 gebunden an
nicht-spezifische Serum-Proteine. Raumtemperatur-Denaturierung in Gegenwart von Dithiothreitol (Bedingung 5) lieferte bessere Ergebnisse, und diese wurden weiter erheblich verbessert, wenn Cyanid auch vor dem Denaturieren zugesetzt wurde (Bedingung 6). Das Ergebnis der Bedingung 6 wurde noch weiter verbessert, wenn Cobinamid in der Testlösung zugegen war (Bedingung 7).
nicht-spezifische Serum-Proteine. Raumtemperatur-Denaturierung in Gegenwart von Dithiothreitol (Bedingung 5) lieferte bessere Ergebnisse, und diese wurden weiter erheblich verbessert, wenn Cyanid auch vor dem Denaturieren zugesetzt wurde (Bedingung 6). Das Ergebnis der Bedingung 6 wurde noch weiter verbessert, wenn Cobinamid in der Testlösung zugegen war (Bedingung 7).
,»*■» Die Ergebnisse der Bedingung 2, 6 und 7 waren unter dem Gesichtspunkt
der Genauigkeit alle annehmbar, aber die Bedingung 6 und 7 hatten gegenüber der Bedingung 2 den großen
Vorteil, daß Ergebnisse unter Anwendung lediglich von Raumtemperaturen erzielt wurden.
Vorteil, daß Ergebnisse unter Anwendung lediglich von Raumtemperaturen erzielt wurden.
Claims (10)
- Patentansprüche1 ./Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 in Serum, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:a) Mischen einer Probe des zu testenden Serums mit
Alkali, Cyanid und einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen,b) Inkubieren des Gemischs bei einer Temperatur nicht
über 50 0C ausreichend lange, um das Vitamin B12 von den bindenden Serumproteinen abzutrennen und die Proteine im we-" ■■ sentlichen zu denaturieren,c) entweder vor, während oder nach der Stufe b) Bildung einer Standardmenge an radioaktiv markiertem Vitamin B12 und einem Vitamin B12~Analogon, das sich fest an die bindenden
Serumproteine der Probe bindet, nicht aber an den Intrinsikfaktor,d) Senken des pH-Werts des inkubierten Gemischs aus der Stufe b), Zugabe einer Standardmenge an Intrinsikfaktor, die nicht ausreicht, um des gesamte Vitamin B12 in der Probe unddas radioaktiv markierte Vitamin B12 zu binden, unde) Inkubieren des Gemischs, um einen Teil des Vitamins B12 in der Probe und einen Teil des radioaktiv markierten Vitamins B1- an den Intrinsikfaktor gebunden werden zu lassen, Abtrennen des gebundenen Anteils vom nicht so gebundenen Anteil, Messen des Radioaktivitätswerts wenigstens eines Anteils und Verwerten der Messung zur Bestimmung der Konzentration an Vitamin B12 in der Probe. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe a) das Alkali und das Dithiopolyol als vorgebildetes Gemisch der Serumprobe zugesetzt werden.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch.gekennzeichnet, daß als Dithiopolyol· Dithiothreitol oder Dithioerythritol verwendet wird.
- 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B^-Analogon Cobinamid ist.
- 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Cyanid in Stufe a) in einer Menge· entsprechend 20 bis 200 μg Kaliumcyanid/ml Serum verwendet wird.
- 6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Dithiopolyol in Stufe a) in einer Menge von 4 bis 10 mg/ml Serum verwendet wird.
- 7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B1„-Analogon in der 10- bis TOOO-fachen Menge der zum Besetzen aller Bindungsstellen der bindenden Serumproteine, die durch die Inkuba-tionsstufe b) nicht denaturiert worden sind, erforderlichen Menge verwendet wird.
- 8. Testsatz zur Durchführung eines Tests auf Vitamin B12 in Serum mit Quellen für Alkali, ein Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cyanid, radioaktiv markiertes Vitamin B1-, Intrinsikfaktor und ein Vitamin B1 ,,-Analogon, das sich in Serum stark an bindende Serumproteine bindet, aber nicht an den Intrinsikfaktor, wobei die Quellen für Alkali und Dithiopolyol im Gemisch vorgelegt sind.
- 9. Testsatz nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Quellen für radioaktiv markiertes Vitamin B12 und Cyanid im Gemisch vorgelegt sind.
- 10. Testsatz nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B12-Analogon Cobinamid ist.
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