CN109709253A - 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 - Google Patents
液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109709253A CN109709253A CN201910097240.0A CN201910097240A CN109709253A CN 109709253 A CN109709253 A CN 109709253A CN 201910097240 A CN201910097240 A CN 201910097240A CN 109709253 A CN109709253 A CN 109709253A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vitamin
- mass spectrometry
- tandem mass
- liquid chromatography
- methanol
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开一液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒,取检测血清或检测血浆,加入甲氨喋呤内标定量,通过将游离维生素B12从维生素B12中游离出来,提供氰基离子,稳定钴胺素异构体为氰钴胺素;利用固相萃取法对维生素B12进行富集的步骤,并采用串联质谱检测进行人体血浆或血清内维生素B12的测定,特异性强,灵敏度高,可满足临床检测的需求。
Description
技术领域
本发明涉及维生素检测领域,特别涉及一种液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒。
背景技术
维生素B12是一类含有咕啉(corrin)环的类咕啉(corrinoids)化合物,维生素B12通俗名称又叫做“钴胺素(cobalamin)”,是唯一的一种含金属元素的维生素。然而人血清中大约1/3的维生素B12并非钴胺素,而是其他的类咕啉,它们在代谢上对人体是不具有生物学活性的。甲钴胺素和5′-脱氧腺苷钴胺素是维生素B12的活性型,也是血液中存在的主要形式。
人体不能合成维生素B12,主要依靠动物性食品提供,含量丰富者有肝肾组织、肉类、蛋类和乳类制品。维生素B12在人体代谢当中起到非常重要的作用,其可作为甲基丙二酸单酰辅酶A异构酶的辅酶,参与甲基丙二酸单酰辅酶A转变为琥珀酸单酰辅酶A的反应,该反应在奇数碳原子脂肪酸的代谢中起重要作用。维生素B12亦可作为β-甲基天门冬氨酸变构酶的辅酶,参与β-甲基天门冬氨酸向谷氨酸转化的过程。此外,维生素B12与叶酸协同参与甲基转移作用,影响体内的多种代谢过程。维生素B12缺乏时,可导致DNA合成障碍和巨幼细胞贫血,影响神经髓鞘形成,从而出现神经***症状。
另外,人类血浆中存在3种维生素B12的结合蛋白,即TCⅠ、TCⅡ、TCⅢ(transcobalaminⅠ、Ⅱ、Ⅲ),正常情况下,约80%以上的血清维生素B12 会与TCⅠ和TCⅢ结合,称为血清全结合咕啉,仅20%与TCⅡ相结合,形成holoTCⅡ。全结合咕啉的半衰期约为240小时,holoTCⅡ的半衰期仅为6分钟。因此总血清维生素B12含量可作为一类主要的生物标志物用于体现机体维生素B12水平。
目前,维生素B12的检测方法有多种,包括化学发光免疫法、微生物法和同位素放射免疫方法等,然而免疫检测方法和微生物方法有很多的弊端,如下:
第一、免疫反应对反应条件的要求比较严苛,必须保证适宜的pH、电解质环境和排除交叉反应;
第二,不同厂商检测试剂盒检测结果存在显著差异,即免疫反应的检测准确度得不到保障;
第三,特异性差,不能有效区分钴胺素和类咕啉,不能给出准确的维生素B12含量;
第四,放射性免疫法存在放射线辐射和污染等问题。
发明内容
本发明的目的在于针对目前检测维生素B12存在的缺陷,提出一种液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒,特异性强,灵敏度高,可满足临床检测的需求。
为了实现以上任一发明目的,本发明提供一液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,适用于测定血清或血浆中维生素B12,包括以下步骤:
(1)维生素B12的提取和稳定:
维生素B12的提取:将结合态维生素B12从钴胺素结合蛋白中游离出来;
维生素B12的稳定:提供氰基离子,转化钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等)为相对稳定的氰钴胺素;
(2)净化浓缩氰钴胺素;以及
(3)串联质谱检测;
其中色谱条件选择为:
色谱柱:2.6μm Polar C18LC Column 50x 2.1mm;
流动相A液:含有甲酸的乙酸铵水溶液;
流动相B液:含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液:
流速:0.3-0.4mL/min;
进样量:20μL-40μL;
柱温:30-40℃;
其中质谱条件为:
离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子模式;离子喷雾电压:4500-5500V;离子源温度(TEM):400-500℃;气帘气(CUR):20-35psi;碰撞气(CAD):9psi;离子源雾化气(GS1):40-55psi;离子源加热辅助气(GS2):40-60psi;扫描模式:MRM。
对应维生素B12的检测离子对及其他条件如下表一,表一:
另外,在本发明中,采用甲氨喋呤作为内标定量,由于甲氨喋呤和维生素B12的色谱保留行为非常类似,故可被选为内标定量标准物,此时,对应甲氨喋呤的检测离子以及其他条件如表二,表二:
(4)定量检测:
采用维生素B12标准品制作标准曲线:
以标准溶液浓度为X轴,标准品和内标峰面积的比值为Y轴,进行线性回归分析,经“I/X”权重得回归方程;
获取检测结果,代入回归方程得到血清或血浆中B12的含量。
在维生素B12的提取步骤当中,有以下几种可选的提取当值:
1、采用蛋白释放剂还原维生素B12结合蛋白中的二硫键,利用强碱破坏维生素B12和结合单元的氢键和组氨酸的配位键从而将维生素B12游离出来;
2、在缓冲液中利用高温条件控制蛋白质变性,从而将维生素B12从维生素B12结合蛋白中游离出来;
3、利用蛋白酶水解蛋白,将维生素B12从维生素B12结合蛋白中游离出来、
其中,第一种提取方式中,蛋白释放剂可选择DTT(二硫代苏糖醇)或TCEP(三(2-羰基乙基)磷盐酸盐),强碱可选择氧化钠或氢氧化钾。
第二种提取方式中,缓冲剂可选择乙酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液,蛋白变性的条件选择为:水浴100℃加热或121℃高压灭菌器。
第三种提取方式中,蛋白酶可选择胰腺蛋白酶或木瓜蛋白酶。
在维生素B12的稳定步骤,采用氰基离子将钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素等)转化为较稳定的氰钴胺素,稳定的原理如图2。与化学免疫方法的前处理步骤不同的是,在本发明的实施例中,只需要提供氰基离子而不需要提供显色离子,因为本发明检测原理是通过液相色谱质谱的方式进行检测,而不需要采用化学免疫法,故本发明的氰基离子可选择为:用***或***或含氰基的络合物溶液,降低样品前处理的难度和成本。
值得一提的是,维生素B12的提取和维生素B12的稳定步骤可同步进行,提高检测效率。
在净化浓缩氰钴胺素步骤当中,也可选择两种方式进行净化:
1、通过HLB固相萃取柱除盐、净化、浓缩。
2、选择维生素B12免疫亲和净化柱净化浓缩。
HLB指的是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物,选择的规格条件如下:1cc/30mg,厂家不限。活化平衡:500-1000μL甲醇活化,500-1000μL超纯水平衡。
维生素B12免疫亲和净化柱采用高特异性的单克隆抗体,抗体对维生素B12具有高亲和性,当样品提取液通过免疫亲和柱时,维生素B12与抗体结合,加水洗脱非键合成分,加甲醇将抗体吸附的维生素B12洗脱下来。
另外,本发明提供一种液相色谱串联质谱测定维生素B12的试剂盒,如表三:
相较现有技术,本发明具有以下的有益效果:
1、本发明提供的测定维生素B12的方法及试剂盒采用液相色谱串联质谱检测人体内维生素B12的含量,避免采用免疫方法进行检测,从而避免了免疫方法检测时产生的各种问题。
2、相较检测食品中维生素B12的试剂盒和方法,对氰钴胺素进行了净化浓缩,适用于检测血清和血浆中低浓度的维生素B12。
3、本试剂盒检测特异性高,在较短时间内即可获取准确的维生素B12的浓度,在生物检测领域中有极大的应用。
附图说明
图1是根据维生素B12的化学结构图。
图2是根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒的维生素B12检测原理图。
图3.是根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒的维生素B12定量标准工作曲线。
图4根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒的维生素B12标准品的色谱图。
图5根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒的维生素B12内标甲氨喋呤的色谱图。
图6根据本发明的一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒的人血清样品中维生素B12的色谱图。
图7根据本发明的另一实施例的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法及试剂盒的人血清样品中维生素B12的色谱图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
可以理解的是,术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”,即在一个实施例中,一个元件的数量可以为一个,而在另外的实施例中,该元件的数量可以为多个,术语“一”不能理解为对数量的限制。
本发明提供具体实施例验证本发明的方法的可行性:
一、材料:
1.1方法学研究实验的样本:血清、血浆,来自于杭州度安医学检验实验室;
1.2仪器
氮吹机(MD200,杭州奥盛仪器有限公司);96孔板(U型0.2mL,博纳艾杰尔);离心机(1-14K,SIGMA);离心管(1.5mL,AxyGen);色谱***,质谱***,(Waters Xevo TQD/I-Class三重四级杆质谱仪,Waters公司);
1.3试剂耗材:
HLB固相萃取柱,1cc/30mg;色谱柱:Polar C18;***溶液(1mg/mL,含2%氢氧化钠,百灵威);二硫苏糖醇(1mol/L,用pH5.2浓度为0.01mol/L的乙酸钠作为溶液自配制,阿拉丁);1%-2%冰醋酸溶液;5%甲醇;含有甲酸的乙酸铵水溶液;含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液。
1.4标准品:维生素B12标准品,(氰钴胺素100mg,麦克林);
1.5内标物:0.1μg/mL甲氨喋呤,(0.2%氨水甲醇作为溶剂配制浓度为1mg/mL的甲氨喋呤储备液,用甲醇稀释至10μg/mL,然后用含有甲酸的乙酸铵水溶液稀释至0.1μg/mL,标准品购自百灵威);
1.6质控样品:(自配制);
二、样品前处理:
样品前处理后,用固相萃取法对试剂提取液中的维生素B12进行富集并除去杂质,高效液相色谱串联质谱测定,以甲氨喋呤为内标定量,该方法检测速度快,且可用于检测人血清或血浆中的维生素B12。
标准溶液的制备:配制1mg/mL的氰钴胺素甲醇储备液(含0.1%乙酸),用含0.1%乙酸的甲醇分别稀释至2ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL工作储备液,分别移取10μL上述工作储备液至1.5mL离心管中,分别加入190μLPBS缓冲液,混匀,制成浓度为0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的标准曲线。
质控样品的制备:用含0.1%乙酸的甲醇分别稀释1mg/mL的氰钴胺素甲醇储备液至4ng/mL、12ng/mL、24ng/mL,分别移取10μL上述工作储备液至1.5mL离心管中,分别加入190μLPBS缓冲液,混匀,制成浓度为0.2ng/mL、0.6ng/mL、1.2ng/mL的质控样品。
实施例1:
样品前处理:
精密量取标准溶液,质控样品,或人血清置于洁净离心管中;以10:1的体积比例加入内标(0.1μg/mL甲氨喋呤),加入2.5-4体积倍内标的***(1mg/mL,含2%氢氧化钠)溶液,加入0.5体积倍内标的二硫苏糖醇溶液,混匀3-5分钟,避光超声15-30分钟;
加入1%-2%冰醋酸溶液中和样品,混匀2分钟,12000rpm/min离心5分钟。取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱,待样品流出后,5%甲醇水洗杂,干燥1-2min,用甲醇分两次洗脱,氮吹,复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min,进样LC-MS-MS。
另外,如果是采用离心浓缩仪要换为50%甲醇水分两次洗脱,50%甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干后,复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min,进样LC-MS-MS。
具体而言,精密量取标准溶液,质控样品,或人血清200μL置于洁净离心管中;加入内标(0.1μg/mL甲氨喋呤)20μL,加入50μL-200μL***(1mg/mL,含2%氢氧化钠)溶液或一定浓度的含氰根的络合物,加入10μL二硫苏糖醇溶液,混匀3-5分钟,避光超声15-30分钟。加入1%-2%冰醋酸溶液中和样品,混匀2分钟,12000rpm/min离心5分钟。取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱,待样品流出后,分别加入1mL超纯水(也可省略此部),1mL5%甲醇水洗杂,干燥1-2min(注意将固相萃取柱上残留的水分清除干净,对后续氮吹的时间影响很大),600μL甲醇(如果有离心浓缩仪要换为50%甲醇水洗脱)分两次洗脱,氮吹(50%甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干),复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min,进样LC-MS-MS。
实施例2:
样品前处理:精密量取标准溶液,质控样品,或人血浆置于洁净离心管中;以10:1的体积比例加入内标(0.1μg/mL甲氨喋呤),加入40-60体积倍内标的0.1M/L pH4.0-4.6之间的乙酸钠缓冲液(含一定浓度***),混匀3-5分钟,100℃水浴30分钟,放于冰浴冷却,12000rpm/min离心5分钟。
取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱,待样品流出后,分别加入超纯水(也可省略此步骤),5%甲醇水洗杂,干燥1-2min(注意将固相萃取柱上残留的水分清除干净,对后续氮吹的时间影响很大),用甲醇分两次洗脱,氮吹,复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min,进样LC-MS-MS。
具体而言,精密量取标准溶液,质控样品,或人血清200μL置于洁净离心管中;加入内标(0.1μg/mL甲氨喋呤)20μL,加入800μL-1200μL 0.1M/L pH4.0-4.6之间的乙酸钠缓冲液(含一定浓度***),混匀3-5分钟,100℃水浴30分钟,放于冰浴冷却。12000rpm/min离心5分钟。取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱,待样品流出后,分别加入1mL超纯水(也可省略此部),1mL 5%甲醇水洗杂,干燥1-2min(注意将固相萃取柱上残留的水分清除干净,对后续氮吹的时间影响很大),600μL甲醇(如果有离心浓缩仪要换为50%甲醇水洗脱)分两次洗脱,氮吹(50%甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干),复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min,进样LC-MS-MS。
三、液相色谱串联质谱检测:
色谱条件:
色谱柱:Polar C18;流动相:A液:含有甲酸的乙酸铵水溶液,B液:含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液;流速:0.4mL/min,柱温为35℃,进样20μL;等度洗脱。
质谱条件:
离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子模式;离子喷雾电压:5500V;离子源温度(TEM):500℃;气帘气(CUR):20psi;碰撞气(CAD):9psi;离子源雾化气(GS1):55psi;离子源加热辅助气(GS2):60psi;扫描模式:MRM。
维生素B12以及内标的MRM方法设置
四、数据处理:
4.1获取维生素标准品的色谱图
获取维生素B12标准品的色谱图如图4所示,作为标准曲线的定量下限。
4.2获取维生素B12内标内标甲氨喋呤的色谱图。
获取维生素B12内标甲氨喋呤的色谱图如图5所示,其色谱峰保留时间与维生素B12接近,可以很好的校准样品前处理过程中和色谱分离过程产生的波动,提高分析结果的准确度。
4.3获取维生素B12的定量标准工作曲线:
获取不同浓度的维生素B12标准曲线进行测定,得到检测数据,以标准溶液浓度为X轴,标准和内标峰面积的比值为Y轴,进行线性回归分析,经“1/X”权重得回归方程:y=0.01672x+0.099974,其线性系数为0.99974,如图3所示,线性拟合方程,线性良好,满足定量要求。
五、检测结果:
5.1检测结果1:
以实施例1制备得到的样品进行检测,检测得到的色谱图如图6,由图6可知,色谱峰形较好,保留时间与维生素B12标准品对应,测定值为0.41ng/mL。
5.2检测结果2:
以实施例2制备得到的样品进行检测,检测得到的色谱图如图7,由图7可知,色谱峰形较好,保留时间与维生素B12标准品对应,测定值为0.59ng/mL。
六、该方法的可行性检测:
6.1、检出限:
配制0.03ng/mL的维生素B12标准溶液,上仪器进行测定,重复测定3次,计算信噪比均值,结果为4。该方法仪器检出限为0.03ng/mL。
6.2精密度:
0.2ng/mL、0.6ng/mL、1.2ng/mL浓度的批内批间精密度度均在15%以内,符合临床检测对精密度的要求。
6.3准确度:
0.2ng/mL、0.6ng/mL、1.2ng/mL浓度的批内批间准确度均在质控样品标示值的±15%以内,符合临床检测对准确度的要求。
七、液相色谱串联质谱测定维生素B12的试剂盒:
本发明不局限于上述最佳实施方式,任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品,但不论在其形状或结构上作任何变化,凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案,均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,测定血清或血浆中维生素B12,其特征在于,包括:
(1)取检测血清或检测血浆,加入甲氨喋呤内标;
(2)维生素B12的提取和稳定:
维生素B12的提取:将结合态维生素B12从钴胺素结合蛋白中游离出来;
维生素B12的稳定:提供氰基离子,转化钴胺素异构体(羟钴胺素、甲钴胺素和5-脫氧腺苷钴胺素)为相对稳定的氰钴胺素;
(3)净化浓缩氰钴胺素:
利用固相萃取法对维生素B12进行净化富集;以及
(4)串联质谱检测;
其中色谱条件选择为:
色谱柱:Kinetex 2.6μm Polar C18LC Column 50 x 2.1mm;
流动相A液:含有甲酸的乙酸铵水溶液;
流动相B液:含有甲酸的乙酸铵甲醇溶液:
流速:0.3-0.4mL/min;
进样量:20μL-40μL;
柱温:30-40℃;
其中质谱条件为:
离子源:电喷雾离子源;扫描方式:正离子模式;离子喷雾电压:4500-5500V;离子源温度:400-500℃;气帘气:20-35psi;碰撞气:9psi;离子源雾化气:40-55psi;离子源加热辅助气:40-60psi;扫描模式:MRM;
对应维生素B12和内标的检测离子对及其他条件如下表:
(4)定量检测:
获取检测结果,代入维生素B12标准品回归方程得到血清或血浆中B12的含量,其中维生素B12标准品回归方程以标准溶液浓度为X轴,标准品和内标峰面积的比值为Y轴,进行线性回归分析得到。
2.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,其特征在于,所述色谱条件为:流速:0.4mL/min,柱温为35℃,进样20μL;等梯度洗脱,所述质谱条件为:离子喷雾电压:5500V;离子源温度:500℃;气帘气:20psi;碰撞气:9psi;离子源雾化气:55psi;离子源加热辅助气:60psi;扫描模式:MRM。
3.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,所述维生素B12的稳定步骤中,提供的氰基离子选择***或***或含氰基的络合物溶液。
4.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,其特征在于,选择通过HLB固相萃取柱除盐、净化、浓缩;条件控制为:活化平衡:500-1000μL甲醇活化,500-1000μL超纯水平衡。
5.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,其特征在于,所述维生素B12的提取选择以下三种方法之一:
采用蛋白释放剂还原维生素B12结合蛋白中的二硫键,利用强碱破坏维生素B12和结合单元的氢键和组氨酸的配位键;
在缓冲液中利用高温条件控制蛋白质变性;
利用蛋白酶水解蛋白,将维生素B12从维生素B12结合蛋白中游离出来;
其中所述蛋白释放剂选自二硫代苏糖醇或三(2-羰基乙基)磷盐酸盐的一种;所述缓冲液选自乙酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液,蛋白变性的条件选择为:水浴100℃加热或121℃高压灭菌器;所述蛋白酶选自胰腺蛋白酶或木瓜蛋白酶。
6.根据权利要求5所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,其特征在于,量取1体积份的检测血清或检测血浆置于洁净离心管中;加入0.1体积份0.1μg/mL的甲氨喋呤,加入0.4-1体积份的***溶液,其中所述***溶液含浓度为1mg/mL的2%氢氧化钠,加入0.05体积份的二硫苏糖醇溶液,混匀3-5分钟,避光超声15-30分钟;加入1%-2%冰醋酸溶液中和样品,混匀2分钟,12000rpm/min离心5分钟,取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱,待样品流出后,5%甲醇水洗杂,干燥1-2min,用甲醇分两次洗脱,氮吹,复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min。
7.根据权利要求5所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,其特征在于,量取1体积份的检测血清或检测血浆置于洁净离心管中;0.1体积份0.1μg/mL的甲氨喋呤,加入4-6体积份内标的0.1M/L的pH为4.0-4.6之间的含一定浓度***的乙酸钠缓冲液,混匀3-5分钟,100℃水浴30分钟,放于冰浴冷却,12000rpm/min离心5分钟,取上清液上样至活化平衡好的HLB固相萃取柱,待样品流出后,待样品流出后,5%甲醇水洗杂,干燥1-2min,用甲醇分两次洗脱,氮吹,复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min。
8.根据权利要求6-7任一所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,其特征在于,采用离心浓缩仪要换为50%甲醇水分两次洗脱,50%甲醇水洗脱要用离心浓缩仪浓缩至干后,复溶,涡旋混匀5min,移取至96孔板,离心5min。
9.根据权利要求1所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,其特征在于,标准品溶液和质控品同于检测样品的检测步骤进行检测,标准品溶液的浓度选择为:0.1ng/mL-10ng/mL;
所述标准品溶液的配置:配制1mg/mL的氰钴胺素甲醇储备液(含0.1%乙酸),用含0.1%乙酸的甲醇分别稀释至2ng/mL-200ng/mL的工作储备液,分别移取1体积份的上述工作储备液至1.5mL离心管中,分别加入19体积份的μLPBS缓冲液,混匀,制成浓度为0.1ng/mL-10ng/mL的标准曲线。
10.相色谱串联质谱测定维生素B12的试剂盒,其特征在于,包括:
该试剂盒采用如权利要求1到9任一所述的液相色谱串联质谱测定维生素B12的方法,测定血清或血浆中维生素B12。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910097240.0A CN109709253A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910097240.0A CN109709253A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109709253A true CN109709253A (zh) | 2019-05-03 |
Family
ID=66263449
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910097240.0A Pending CN109709253A (zh) | 2019-01-31 | 2019-01-31 | 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109709253A (zh) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111398439A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-10 | 权丽 | 一种血清中b族维生素的液相色谱-串联质谱检测方法 |
CN111624074A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-04 | 江苏拜明生物技术有限公司 | 一种用于血清中维生素b12含量检测的释放剂、制备及应用 |
CN112697936A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-23 | 卓和药业集团有限公司 | 一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法 |
CN113009013A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-22 | 北京斯利安药业有限公司 | 一种甲钴胺样品中杂质的分析方法 |
CN113138236A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-20 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种定量检测血清中维生素b12的方法及预处理试剂盒 |
CN113189252A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-07-30 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法及其检测试剂盒和应用 |
CN113984943A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-01-28 | 哈尔滨医科大学 | 一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法 |
CN114011111A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-02-08 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 用于结合蛋白中萃取维生素的萃取液及其制备方法和应用 |
CN114216982A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-22 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 维生素b12的检测方法 |
CN116990423A (zh) * | 2023-07-14 | 2023-11-03 | 河北伊莱莎生物技术有限公司 | 维生素b12定量检测方法及其快速绘制标准曲线的方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4300907A (en) * | 1980-02-04 | 1981-11-17 | Becton, Dickinson And Company | Serum vitamin B12 assay and kit therefor |
US4426455A (en) * | 1980-09-22 | 1984-01-17 | Amersham International Limited | Assay of vitamin B12 |
CN104198598A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-12-10 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种维生素b12的测定方法 |
CN107219373A (zh) * | 2016-03-22 | 2017-09-29 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 维生素b12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法 |
-
2019
- 2019-01-31 CN CN201910097240.0A patent/CN109709253A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4300907A (en) * | 1980-02-04 | 1981-11-17 | Becton, Dickinson And Company | Serum vitamin B12 assay and kit therefor |
US4426455A (en) * | 1980-09-22 | 1984-01-17 | Amersham International Limited | Assay of vitamin B12 |
CN104198598A (zh) * | 2014-07-15 | 2014-12-10 | 汤臣倍健股份有限公司 | 一种维生素b12的测定方法 |
CN107219373A (zh) * | 2016-03-22 | 2017-09-29 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 维生素b12检测试剂盒和方法及其样本前处理方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
E. ZIRONI ET AL: "Technical note: Development and validation of a method using ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry for determination of vitamin B12 concentrations in milk and dairy products", 《J. DAIRY SCI.》 * |
Cited By (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111398439A (zh) * | 2020-03-06 | 2020-07-10 | 权丽 | 一种血清中b族维生素的液相色谱-串联质谱检测方法 |
CN111624074A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-09-04 | 江苏拜明生物技术有限公司 | 一种用于血清中维生素b12含量检测的释放剂、制备及应用 |
CN111624074B (zh) * | 2020-07-07 | 2024-01-30 | 江苏拜明生物技术有限公司 | 一种用于血清中维生素b12含量检测的释放剂、制备及应用 |
CN112697936A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-04-23 | 卓和药业集团有限公司 | 一种甲钴胺颗粒有关物质的测定方法 |
CN113009013A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-06-22 | 北京斯利安药业有限公司 | 一种甲钴胺样品中杂质的分析方法 |
CN113138236A (zh) * | 2021-03-31 | 2021-07-20 | 山东英盛生物技术有限公司 | 一种定量检测血清中维生素b12的方法及预处理试剂盒 |
CN113189252A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-07-30 | 中国医学科学院北京协和医院 | 一种总钴胺素和氰钴胺的检测方法及其检测试剂盒和应用 |
CN113984943A (zh) * | 2021-10-29 | 2022-01-28 | 哈尔滨医科大学 | 一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法 |
CN113984943B (zh) * | 2021-10-29 | 2023-12-22 | 哈尔滨医科大学 | 一种同时检测血浆或血清中钆对比剂与游离钆离子的方法 |
CN114216982A (zh) * | 2021-12-14 | 2022-03-22 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 维生素b12的检测方法 |
CN114011111A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-02-08 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 用于结合蛋白中萃取维生素的萃取液及其制备方法和应用 |
CN116990423A (zh) * | 2023-07-14 | 2023-11-03 | 河北伊莱莎生物技术有限公司 | 维生素b12定量检测方法及其快速绘制标准曲线的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109709253A (zh) | 液相色谱串联质谱测定维生素b12的方法及试剂盒 | |
Kuhn et al. | Fully validated method for rapid and simultaneous measurement of six antiepileptic drugs in serum and plasma using ultra-performance liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry | |
CN105158394B (zh) | 一种同时检测血液样品中多种脂溶性维生素的方法 | |
Chwatko et al. | Determination of cysteine in human plasma by high-performance liquid chromatography and ultraviolet detection after pre-column derivatization with 2-chloro-1-methylpyridinium iodide | |
Giustarini et al. | An improved HPLC measurement for GSH and GSSG in human blood | |
CN112083108B (zh) | 一种血液中叶酸的精准检测方法和试剂盒 | |
Purdie et al. | Analytical applications of circular dichroism | |
CN105136957B (zh) | 一种同时测定人血浆中oxc以及代谢产物mhd和mhd-g的检测方法 | |
Jenčo et al. | Recent trends in determination of thiamine and its derivatives in clinical practice | |
Spanidis et al. | Oxidation of human serum albumin exhibits inter-individual variability after an ultra-marathon mountain race | |
Cheng et al. | Measurements of drug–protein binding by using immobilized human serum albumin liquid chromatography–mass spectrometry | |
CN111562322B (zh) | 一种血样中五种抗肿瘤药物的富集检测方法及应用 | |
CN110007044A (zh) | 一种人体尿液中多种有机酸的定量检测方法 | |
Hart et al. | Determination of 5-methyltetrahydrofolate (13C-labeled and unlabeled) in human plasma and urine by combined liquid chromatography mass spectrometry | |
CN112684075A (zh) | 液质联用结合超滤法测定美罗培南或亚胺培南的血浆蛋白结合率 | |
CN111239301A (zh) | 一种检测叶酸杂质d含量的方法 | |
CN110045028A (zh) | 一种贝伐珠单抗的临床前药代动力学研究质谱分析方法 | |
WO2013010553A1 (en) | Method and analytical kit for simultaneous quantification of b-complex vitamin content in food | |
CN113125600B (zh) | 一种同时测定血清中3种维生素b12的浓度的方法 | |
CN107505409B (zh) | 一种测定人参皂苷rz1原料或制剂中异构体杂质人参皂苷rk1的方法 | |
Brown et al. | Use of high pressure liquid chromatography to investigate the in vitro reactions of human erythrocytes with guanosine | |
Lee et al. | Analytical determination of vitamin B12 content in infant and toddler milk formulas by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) | |
Jacobsen | Cardiovascular disorders (risk assessment) | |
Sun et al. | A rapid and sensitive HPLC-MS/MS method for determination of endogenous creatine biosynthesis precursors in plasma of children with viral myocarditis | |
Kammerer et al. | Achiral–chiral LC/LC–MS/MS coupling for determination of chiral discrimination effects in phenprocoumon metabolism |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190503 |