DE3134585C2

DE3134585C2 -

Info

Publication number: DE3134585C2
Application number: DE19813134585
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Tokio/Tokyo Jp Motobayashi
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1981-09-01
Filing date: 1981-09-01
Publication date: 1993-02-25
Also published as: DE3134585A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut, insbesondere eine stabile Testeinheit zum einfachen Nachweis von Blut und sonstigen peroxidaseaktiven Substanzen in Körperfluiden.

Die Anwesenheit von Blut oder peroxidaseaktivem Hämoglobin in Körperfluiden, wie Urin, Kot oder Erbrochenem, kann als Anzeichen für bestimmte Erkrankungen, z. B. entzündliche Geschwüre oder Tumore des Magens, der Nieren, des Darms oder sonstiger Harnorgane angesehen werden. In diesen Fällen ist es aus klinischen Gesichtspunkten von wesentlicher Bedeutung, in der kürzest möglichen Zeit eine Diagnose zu stellen oder eine Therapie einzuleiten, weswegen ein genauer Nachweis von in Körperfluiden vorhandenem Blut oder vorhandenen peroxidaseaktiven Substanzen erforderlich ist.

Nahezu sämtliche bisherigen Maßnahmen zum Nachweis von okkultem Blut in gegebenen Körperfluiden nutzen die Peroxidaseaktivität von okkultem Blut aus. So gibt es beispielsweise eine Testeinheit, die durch Imprägnieren eines Trägers, wie Filterpapier, mit einem organischen Hydroperoxid und einem organischen, farbbildenden Indikator als Chromogen hergestellt wurden. Wenn peroxidaseaktives Blut oder freies Hämoglobin mit dieser Testeinheit in Berührung gelangt, zersetzt es das darin enthaltene Hydroperoxid unter Freisetzung von Sauerstoff. Der freigesetzte Sauerstoff oxidiert den organischen, farbbildenden Indikator unter Bildung eines farbigen Oxidationsprodukts.

Der in der Testeinheit enthaltene organische, farbbildende Indikator ist oxidationsfähig. Auch bei dem in der Testeinheit enthaltenen organischen Hydroperoxid handelt es sich um eine reaktionsfähige Substanz, die möglicherweise mit dem Indikator unverträglich ist. Da diese (möglicherweise) unverträglichen Bestandteile gemeinsam in der Testeinheit enthalten sind, können sie ohne weiteres miteinander reagieren, so daß die Testeinheit nicht über längere Zeit hinweg haltbar ist. Zur Hemmung dieser unerwünschten Reaktion der beiden Bestandteile während der Lagerung der Testeinheit wurde der Testeinheit bereits ein Stabilisator einverleibt. Beispiele für zu diesem Zweck verwendete Stabilisatoren sind Di- oder Trimorpholidphosphate (vgl. US-PS 38 53 471), Aminsalze organischer Hydroperoxide (vgl. US-PS 40 17 261) und Borsäureester (vgl. US-PS 40 71 321). Eine bekannte Stabilisiermaßnahme besteht auch darin, von dem organischen Hydroperoxid mit Hilfe leimartiger Substanzen, wie Gelatine, Mikrokapseln herzustellen.

Die bisherige Mitverwendung von Stabilisatoren hatte zum Ziel, die möglicherweise miteinander unverträglichen Reagentien (organisches Hydroperoxid und organischer, farbbildender Indikator) dadurch zu stabilisieren, daß man sie an einer raschen Vermischung miteinander hindert. Di- und Trimorpholidphosphate sind vornehmlich Mittel zur Verhinderung der Fortpflanzung von Insekten. Wegen ihrer großen Reaktionsfähigkeit ist ihre Herstellung gefährlich und bedarf ihre Handhabung größter Sorgfalt. Die Aminsalze organischer Hydroperoxide sind hochflüchtig, so daß solche Verbindungen enthaltende Testeinheiten ohne weiteres in ihrer Nachbarschaft gelagerte andere Testeinheiten beeinträchtigen können. Da Borsäureester in Kombination mit Dimethylsulfoxid verwendet werden, können diese beiden Verbindungen enthaltende Testeinheiten in ähnlicher Weise in ihrer Nachbarschaft gelagerte andere Testeinheiten beeinträchtigen. Somit lassen die bisher verwendeten Stabilisatoren noch erheblich zu wünschen übrig. Im Falle der Mikroeinkapselung organischer Hydroperoxide ist von Nachteil, daß die Mikrokapseln bei der Alterung so starr werden, daß die Reaktionsfähigkeit beeinträchtigt und die Reaktion in der Testeinheit ungleichmäßig wird, was dazu führt, daß eine ungleichmäßige Farbbildung erfolgt. Da, wie bereits ausgeführt, die üblichen Reagentien und Testeinheiten instabil sind, kam es bei ihrer Verwendung häufig vor, daß die in den Testeinheiten gebildeten Farben nicht mehr genau unterscheidbar sind.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, eine neuartige und stabile Testeinheit zum einfachen Nachweis von okultem Blut in Körperfluiden, die sich durch eine verbesserte Farbempfindlichkeit auszeichnet, zu entwickeln.

Gegenstand der Erfindung ist somit eine Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut, d. h. einer peroxidaseaktiven Substanz, in Körperfluiden, die durch Imprägnieren eines Substrats mit einem organischen Hydroperoxid, einem Chromogen, einem Puffer und einem Stabilisator hergestellt wurde und welche dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als Stabilisator p-Brombenzoyldimethylamid, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-dimethylhydrazin, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylhydrazin, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylethylendiamin, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylhexamethylendiamin, N,N′-Ditoluoyl-N,N′-diethylendiamin, p-Toluolsulfonyl-N-diethylamid und/oder p-Methoxybenzolsulfonyl-N-diethylamid enthält.

Im Gegensatz zu den Boratester einer bestimmten Struktur enthaltenden Testmittel der bereits erwähnten US-PS 40 71 321 weisen die erfindungsgemäßen Testeinheiten ohne weitere Zusätze eine deutlich verbesserte Stabilität auf und sind dabei auch in der Farbbildung verläßlicher.

Im folgenden wird die Herstellung des erfindungsgemäß als Stabilisator in einer Testeinheit der fraglichen Art verwendbaren N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylethylendiamins näher erläutert:

Herstellungsbeispiel

11,5 ml Benzoylchlorid werden in 50 ml Chloroform gelöst. Ferner wird eine Lösung von 7,1 ml N,N′-Diethylethylendiamin in 50 ml Chloroform zubereitet. Danach werden die beiden Lösungen unter Kühlen und schwachem Mischen miteinander vereinigt. Das erhaltene Gemisch wird mit 25 ml einer wäßrigen 20%igen Natriumcarbonatlösung versetzt, worauf das Ganze 1 h lang auf eine Temperatur von 60°C erwärmt und danach mit Hilfe einer Verdampfungsvorrichtung vakuumgetrocknet wird. Zur Entfernung des vorhandenen Salzes wird das Reaktionsprodukt erneut in Chloroform gelöst, worauf die hierbei erhaltene Lösung mit Hilfe einer Verdampfungsvorrichtung getrocknet wird. Letztlich erhält man 14,2 g N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylethylendiamin.

Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer organischer Hydroperoxide sind 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid, Cumolhydroperoxid, 2,5-Dimethylhexanon-2,5-dihydroperoxid, Diisopropylbenzolhydroperoxid, 6-Butylhydroperoxid, p-Menthanhydroperoxid und 4-Methylphenylisopropylhydroperoxid, vorzugsweise (wegen ihrer relativ niedrigen Zersetzungsgeschwindigkeit) 2,5-Dimethylhexanon-2,5-dihydroperoxid, Cumolhydroperoxid und 2,5-Dimethylhexanon-2,5-dihydroperoxid.

Erfindungsgemäß verwendbare Chromogene, d. h. Verbindungen, die bei der Oxidation Farbstoffe bilden und als sog. "Oxidationsindikatoren" bezeichnet werden, sind beispielsweise o-Toluidin, Benzidin, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin, 2,7-Diaminofluoren, Mischungen der genannten Verbindungen in wechselnden Mengen, Guaiakole, verschieden substituierte Phenylendiamine, Pyridinderivate, substituierte Azine und Leucomalachitgrün.

Wenn die Testeinheit in ein Körperfluidum eingetaucht wird, muß deren pH-Wert im Bereich von 4 bis 8, vorzugsweise von 5 bis 7, gehalten werden. Um einen solchen pH-Wert in der Testeinheit aufrecht zu erhalten, wird ihr ein Puffer einverleibt. Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Puffer sind Zitronensäure/Natriumcitrat-, Weinsäure/Natriumtartrat-, Äpfelsäure-, Kaliumhydrogenphthalat/Dialkaliumphthalat- und Natriumhydrogensuccinat/Dinatriumsuccinat-Puffer.

Damit das Körperfluidum gleichmäßig in die Testeinheit eindringen kann, ist es zweckmäßig, der Testeinheit ein Netzmittel einzuverleiben. Typische verwendbare Netzmittel sind oberflächenaktive Mittel, wie Alkylsulfate, z. B. Natriumlaurylsulfat, Natriumdodecylsulfat und Natriumtetradecylsulfat, Alkylbenzolsulfonate, wie Natriumdodecylbenzolsulfonat, und die Alkylsulfosuccinate, wie Natriumdioctylsulfosuccinat und Natriumdiheptylsulfosuccinat.

Gegebenenfalls kann eine erfindungsgemäße Testeinheit auch ein Mittel zur Steigerung der Peroxidaseaktivität von Hämoglobin enthalten. Typische derartige Mittel sind Chinoline und dessen Derivate, z. B. Chinin, Cinchonin, 6-Methoxychinolin, Chinaldin, 8-Amino-6-methoxychinolin, 2-Chinolinol, Isochinolin, Benzo[f]chinolin und 3-Aminochinolin. Infolge der Anwesenheit eines solchen Peroxidaseverstärkungsmittels in der Testeinheit wird in der Regel die Reaktionsgeschwindigkeit der Oxidation beschleunigt und die Empfindlichkeit der Testeinheit erhöht.

Damit die Reagentien nicht aus der Testeinheit "ausschwitzen", kann ihr ein Haftmittel einverleibt werden. Geeignete derartige Mittel sind beispielsweise Polymerisate, wie Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglykol, Polyacrylate, Polyacrylamid, Poly(hydroxyethylmethacrylat), Poly(hydroxyethylacrylat) und Carboxymethylcellulose sowie Gelatine und Gummiarabikum.

Jeweils bezogen auf 100 Gew.-Teile des organischen Hydroperoxids enthält eine erfindungsgemäße Testeinheit 1 bis 10 000, vorzugsweise 100 bis 1000 Gew.-Teil(e) Chromogen, 10 bis 10 000, vorzugsweise 100 bis 1000 Gew.-Teile Puffer, 10 bis 10 000, vorzugsweise 100 bis 1000 Gew.-Teile Stabilisator, 0 bis 1000, vorzugsweise 10 bis 100 Gew.-Teil(e Netzmittel, 0 bis 10 000, vorzugsweise 100 bis 1000 Gew.-Teil(e) Peroxidaseaktivitätverstärkungsmittel und 0 bis 10 000, vorzugsweise 100 bis 1000 Gew.-Teil(e) Haftmittel. Die Gesamtmenge der Reagentien kann bis zu 50, vorzugsweise bis zu 10 Gew.-%, bezogen auf das Substrat, ausmachen.

Die verschiedenen Reagentien werden zunächst in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Methanol, Ethanol, Chloroform oder Wasser, gelöst, worauf die erhaltene Lösung zum Tränken des Substrats verwendet wird. So werden beispielsweise ein organisches Hydroperoxid und ein Stabilisator in einem Lösungsmittel gelöst, worauf das Substrat mit der erhaltenen Lösung durchtränkt wird. Danach wird das feuchte Substrat getrocknet. Nun werden in einem Lösungsmittel ein Haftmittel und ein Puffer gelöst, worauf das getrocknete Substrat mit der Lösung gründlich durchfeuchtet und anschließend getrocknet wird. Schließlich werden in einem geeigneten Lösungsmittel ein Chromogen und ein Peroxidaseaktivitätverstärkungsmittel gelöst. Mit dieser Lösung wird das trockene Substrat durchfeuchtet und schließlich getrocknet, wobei letztlich eine zum Nachweis von okkultem Blut geeignete Testeinheit erhalten wird.

Als Substrat eignen sich Filterpapier, Glasfasern oder aus Kunststoffen hergestellte Gewirke oder Gestricke. Selbstverständlich eignen sich auch noch andere Substrate, sofern sie nicht mit den Reagentien reagieren oder sich in diesen lösen und absorptionsfähig sind.

Eine erfindungsgemäße Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut wird etwa 1 s lang in das Körperfluidum getaucht, danach herausgenommen und an der Luft 60 s lang liegen gelassen. Danach kann die Testeinheit ausgewertet werden. Die Auswertung erfolgt durch Vergleich der auf der Testeinheit gebildeten Farbe mit einer Standardfarbtabelle zur Auffindung der jeweils passenden Farbe. Die Konzentration an okkultem Blut in dem jeweiligen Körperfluidum ergibt sich aus der Farbtiefe im Vergleich mit der Standardfarbtabelle.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel 1

Durch vermischen der folgenden Bestandteile:

2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid\|1,5 g
Natriumdioctylsulfosuccinat	1,0 g
p-Brombenzoyldimethylamid	10 g
Methanol	100 ml

wird eine Lösung A zubereitet. Mit der erhaltenen Lösung A wird durch Eintauchen ein Filterpapier gründlich durchfeuchtet. Nach dem Herausnehmen des Filterpapiers aus der Lösung A wird es 20 min lang in einem Ofen bei einer Temperatur von 40°C getrocknet.

Durch Vermischen der folgenden Bestandteile:

Gelatine\|2,0 g
Zitronensäure	2,5 g
Natriumcitrat	7,5 g
Wasser	100 ml

wird eine Lösung B zubereitet. Das mit der Lösung A imprägnierte und getrocknete Filterpapier wird nun in die Lösung B getaucht, danach aus der Lösung B herausgenommen und schließlich 50 min lang in einem Ofen bei einer Temperatur von 40°C getrocknet.

Schließlich wird durch Vermischen der folgenden Bestandteile:

o-Toluidin\|0,3 g
3-Aminochinolin	0,3 g
Benzol	100 ml

eine Lösung C zubereitet. Das mit den Lösungen A und B imprägnierte und getrocknete Filterpapier wird nun noch mit der Lösung C getränkt. Nach dem Herausnehmen aus der Lösung C wird das Filterpapier 10 min lang in einem Ofen bei einer Temperatur von 50°C getrocknet. Hierbei erhält man eine Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut.

Beispiel 2

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch in der Lösung A als Stabilisator anstelle des p-Brombenzoyldimethylamids N,N′-Dibenzoyl-N,N′-dimethylhydrazin verwendet wird. Hierbei erhält man eine Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut.

Beispiel 3

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch in der Lösung A als Stabilisator anstelle des p-Brombenzoyldimethylamids N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylethylendiamin verwendet wird.

Beispiel 4

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch in der Lösung A als Stabilisator anstelle des p-Brombenzoyldimethylamids p-Toluolsulfonyl-N-diethylamin verwendet wird.

Beispiel 5

Beispiel 1 wird wiederholt, wobei jedoch in der Lösung A als Stabilisator anstelle des p-Brombenzoyldimethylamids N,N′-Ditoluoyl-N,N′-diethylendiamin verwendet wird.

Beispiel 6

Ein Mörser wird in der angegebenen Reihenfolge mit 100 ml Gummiarabikumschleim (hergestellt durch Zugabe von 200 g Gummiarabikum zu 500 ml siedendem Wasser) und 2 ml einer 5gew.-%igen Lösung von Natriumdioctylsulfosuccinat und schließlich mit 5 ml Cumolhydroperoxid beschickt. Danach wird das Gemisch 5 min lang in dem Mörser vermahlen, wobei eine grobe Emulsion erhalten wird.

Durch Eintragen von 163 g Natriumcitrat und 37 g Zitronensäure in 1500 ml siedenden Wasser wird eine Citratpufferlösung zubereitet. Diese wird mit 0,7 g Gelatine gemischt.

50 ml der erhaltenen Puffer/Gelatine-Mischung werden nun gründlich mit der groben Emulsion verrührt, worauf unter kräftigem Rühren 1 ml einer 1%igen Dialdehydstärkedispersion zugegeben wird. Schließlich werden nach 12 ml einer wäßrigen 5%igen Natriumlauratlösung zugesetzt, worauf das Ganze in einem von Hand betätigten Homogenisator homogenisiert wird.

Unter Rühren werden 50 ml einer in der geschilderten Weise unter Verwendung von 500 ml Wasser, 163 g Natriumcitrat und 37 g Zitronensäure zubereiteten Pufferlösung zu der homogenisierten Masse zugegeben. In die hierbei erhaltene Emulsion wird zum Imprägnieren ein dünnes Blatt Papier eingetaucht. Das nasse Stück Papier wird 24 h lang in einem Ofen bei einer Temperatur von 75° bis 80°C getrocknet. Schließlich wird das dünne Stück Papier in eine Lösung von 320 mg o-Toluidin in 16 ml Chloroform eingetaucht. Zum Verdunsten des überschüssigen Chloroforms wird das nasse Papier schwach erwärmt. Auf diese Weise erhält man eine bekannte Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut.

Beispiel 7

Die gemäß den Beispielen 1 bis 5 erhaltenen erfindungsgemäßen Testeinheiten und die gemäß Beispiel 6 hergestellten Vergleichstesteinheit werden bei 37°C liegen gelassen und auf etwaige Veränderungen durch Alterung hin überwacht. Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle. Die Ergebnisse ermöglichen eine Bewertung der verschiedenen Testeinheiten hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Veränderungen durch Alterung.

Tabelle

Aus der Tabelle geht hervor, daß die erfindungsgemäßen Testeinheiten der Beispiele 1 bis 5 während des 3wöchigen Liegenlassens überhaupt keine Änderung erfahren. Im Gegensatz dazu wird die Vergleichstesteinheit des Vergleichsbeispiels 6 bereits nach 2wöchigem Liegenlassen schwarz. Dies zeigt, daß lediglich die erfindungsgemäßen Testeinheiten eine hervorragende Stabilität besitzen.

Wenn die erfindungsgemäßen Testeinheiten zum Testen von Fluiden, z. B. von Urinproben mit okkultem Blut, verwendet werden, zeigen sie eine stabile Farbbildung.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung mindestens einer Verbindung der allgemeinen Formel (I) als Stabilisator in Kombination mit einem Hydroperoxid, einem Chromogen und einem Puffer, in einer Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut läßt sich deren Stabilität gegen Abbau infolge Alterung merklich verbessern und deren Empfindlichkeit beim Nachweis von okkultem Blut in Körperfluiden erheblich steigern. Beim Inberührungsgelangen mit okkultem Blut erfolgt mit Hilfe einer erfindungsgemäßen Testeinheit eine saubere und genaue Farbbildung. Mit Hilfe einer erfindungsgemäßen Testeinheit läßt sich somit ein empfindlicher und genauer Nachweis von okkultem Blut in Körperfluiden führen.

Claims

1. Testeinheit zum Nachweis von okkultem Blut, d. h. einer peroxidativ wirksamen Substanz, in Körperfluiden, die durch Imprägnieren eines Substrats mit einem organischen Hydroperoxid, einem Chromogen, einem Puffer und einem Stabilisator hergestellt wurde, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Stabilisator p-Brombenzoyldimethylamid, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-dimethylhydrazin, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylhydrazin, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylethylendiamin, N,N′-Dibenzoyl-N,N′-diethylhexamethylendiamin, N,N′-Ditoluoyl-N,N′-diethylendiamin, p-Toluolsulfonyl-N-diethylamid und/oder p-Methoxybenzolsulfonyl-N-diethylamid enthält.

2. Testeinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Netzmittel und ein Verstärkungsmittel für die Peroxidaseaktivität enthält.

3. Testeinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Hilfsmittel enthält.

4. Testeinheit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie als organisches Hydroperoxid 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid, Cumolhydroperoxid und/oder 2,5-Dimethylhexanon-2,5-dihydroperoxid enthält.