DE3123937C2 - Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder seiner Derivate - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder seiner Derivate

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DE3123937C2
DE3123937C2 DE3123937A DE3123937A DE3123937C2 DE 3123937 C2 DE3123937 C2 DE 3123937C2 DE 3123937 A DE3123937 A DE 3123937A DE 3123937 A DE3123937 A DE 3123937A DE 3123937 C2 DE3123937 C2 DE 3123937C2
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan oder einem seiner Derivate, wobei man eine Indolverbindung mit Serin oder mit Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen in Gegenwart einer Kultur oder einer behandelten Kultur eines Mikroorganismus vom Genus Aeromonas oder Genus Klebsiella umsetzt, der L-Tryptophan oder eines seiner Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und Ammoniumionen erzeugen kann; die Erfindung betrifft ferner eine biologisch reine Kultur eines Mikroorganismus vom Genus Aeromonas oder Genus Klebsiella, der für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist.

Description

25
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hersiellung von L-Tryptophan oder seiner Derivate unter Verwendung von Mikroorganismen gemäß den Patentansprüchen 1 und 2.
L-Trypthophan ist eine der essentiellen Aminosäuren, die die Körper von Tieren bilden, und ist als Medikament, Nahrungsmittel oder als Zusatzstoff zu Tierfutter wichtig. Einige L-Tryptophanderivate wirken als Antago-*= πϋΛβη gegen den Metabolismus von L-Tryptophan und umfassen physiologisch aktive Substanzen, die man zur Herstellung von Pharmaka verwenden kann, welche auf das Zentralnervensystem einwirken. L-Tryptophan und seine Derivate kann man auf bekannte Weise durch Synthexe, biologische Methoden und viele andere Methoden herstellen. Bekannte Methoden zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von Mikroorganismen sind beispielsweise: (1) Direkte Fermentation unter Verwendung von Zuckern zur Steigerung des L-Tryptophangehalts in einer Kultur; und (2) Zugabe von Indol oder Anthranilsäure gleichzeitig mit Zucker zu einer Kultur, wobei man den L-Tryptophangehalt in der Kultur ansteigen läßt. L-Tryptophan kann man auch aus Indol und Serin oder aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniumionen unter Verwendung einer Tryptophanase herstellen, welche man mit einem Mikroorganismus erzeugt hat. Diese Methode unter Verwendung von Tryptophanase hat den Vorteil, daß man durch Aus; tausch des Indols gegen andere Indolverbindungen verschiedene entsprechende L-Tryptophanderivate herstellen kann und man daher eine Reaktion auswählen kann, die am besten dem speziellen Zweck angepaßt ist.
Es sind viele Methoden zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von Tryptophanase bekannt. In der JP-Patentveröffentiichung Serien-Nr. 46 917/74 Ist eine Methode beschrieben, wobei man L-Tryptophan aus Indol und Serin oder aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniumionen unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Escherlchla, Genus Proteus, Genus Pseudomonas, Genus Aerobacter oder Genus Erwinla herstellt; und in der FR-PS 12 07 437, der JP-OS 39 693/72 (OPl) und der JP-Patentveröffentllchung Serien-Nr. 1 836/78 ist eine Methode beschrieben, wobei man L-Tryptophan aus Indol und Serin unter VerDiese Methoden, bei welchen man Mikroorganismen verwendet, weisen gegenüber den Herstellungsmethoden für L-Tryptophan oder seinen Derivaten durch chemische Synthese den Vorteil auf, daß sie nur Verbindungen der L-Form liefern, die optisch aktiv sind. Sie machen die Herstellung großer Mengen von L-Tryptophan oder L-Tryptophanderivaten aus technischen Ausgangsstoffen möglich, wie z. B. Indolverbindungen, Serin oder Brenztraubensäure.
Es ist üblich und bekannt, daß verschiedene Mikroorganismen Tryptophanase herstellen, die L-Tryptophan zersetzen und Indol herstellen, aber nicht alle Mikroorganismen, die Tryptophanase herstellen, können eine merkliche Menge von L-Tryptophan herstellen. Mikroorganismen, die Tryptophanase herstellen und die rationell bzw. wirksam L-Tryptophan oder eines seiner Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung. Brenztraubensäure und/oder ihrem Salt und Ammoniumionen herstellen, müssen die nachstehenden Anforderungen erfüllen: (1) Die in den Mikroorganismen erzeugte Tryptophanase weist eine hohe Aktivität auf; (2) die Mikroorganismen zersetzen nicht die Ausgangsstoffe, wie z. B. die Indolverbindungen, Serin und Brenztraubensäure; und (3) die Mikroorganismen zersetzen nicht das erhaltene L-Tryptophan oder seine Derivate, außer mit Hilfe der Tryptophanase.
Bisher wurde von keinerlei Mikroorganismen vom Genus Aeromonas festgestellt, daß sie L-Tryptophan aus Indol mit Hilfe von Tryptophanase herstellen können (5 Agriculture] and Biological Chemistry, Bd. 36,
Erfindungsgemäß wurde jedoch festgestellt, daß einige bestimmte Mikroorganismen, die man aus dem Erdboden Isoliert hatte und bisher nicht bekannte Mikroorganismen vom Genus Aeromonas und Genus Klebsiella umfassen, Tryptophanase erzeugen und rationell bzw. wirksam L-Tryptophan oder seine Derivate erzeugen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung L-Tryptophan oder eines seiner Derivate durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium, das eine Indolverbindung und Serin oder eine Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihr Salz und Ammonium-Ionen enthält, und Isolieren des L-Tryptophans oder eines seiner Derivate auf übliche Weise, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als Mikroorganismus Aeromonas sp. ATCC 31897, Aeromonas sp. ATCC 31898,
Klebsiella sp. ATCC 31899 oder Klebsiella sp. ATCC 31900 einsetzt.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß man mit diesen neuen Mikroorganismen L-Tryptophan und seine Derivate in hoher Ausbeute erzeugen kann.
Die mykologlschen Eigenschaften dieser vier Mikroorganismen sind nachstehend angegeben.
(I) Aeromonas sp. ATCC 31897:
(A) Morphologische Eigenschaften
(Inkubation in einer Nährbrühe bei 32° C 24 h lang):
Gestalt: kurzes Stäbchen, einzelne Stäbchen oder eine Kette von zwei Stäbchen, mit einer Geisel oder Geiseln an einem Ende des Bakteriums
Größe: 0,9 bis 1,2 μπ χ 1,2 bis 2,0 μίτι
Beweglichkeit: vorhanden
Gramfärbung: negativ
Säurefestigkeit negativ
Sporen: nicht gebildet
Pleomorphismur «einer
(B) Wachstum im Medium (32° C)
Nährbrühe: gut. keine Filmbildung, keine Ringbildung, mit Niederschlag, trüb, keine Pigmentbil-' dung
Nährbrühe/Agarplatten-Kultur: gut, kreisförmig, glatte Oberfläche, erhaben bzw. gesteigert, vollkommen kreisförmig, glänzend, schwache Farbe von Manilapapier (d. h. leicht bräunlich oder lederfarben), leicht viskos, keine Pigmentbildung
Nährbrühe/Agarkeil-Kultur: gut, fadenförmig, glänzend, schwächt Farbe von Manilapapier, keine Pigmentbildung
Nährbrühe/Gelatinestichkulti"- (20° C): gutes Wachstum im oberen Teil, schwach* Färbung von Manilapapier, geringes Wachstum im gestochenen Teil, keine Gasbildung im gestochenen Teil, keine Verflüssigung
(C) Physiologische Eigenschaften:
Wachstumstemperatur: Wachstum bei 13 bis 37° C,
kein Wachstum bei 45° C
Wachstums-pH-Wert: 5 bis 9
Sauerstoffbedarf: wahlweise anaerob
OF-Test (Hug Lelfson's-Medium): Fermentation
Gaserzeugung (Glucosemedium): Gaserzeugung
Lackmusmilch: gutes Wachstum, Bildung eines Ringes mit schwacher Farbe von Manila-Papier.
Lackmus wechselte zu rosa, mit Niederschlag,
keine Veränderung in der Milch
Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung
Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung
Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung
Reduktion von Nitrat: Erzeugung von salpetriger
Säure
Catalase-Aktivität: positiv
Oxldase-Aktivität: positiv
Urease-Aktlvität: negativ
Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ
Lysindecarboxylase-Aktivität: negativ
Alginindihydrolase-Aktlvität: positiv
OFnithindecarboxylase»Aktivität: positiv
Erzeugung von Indol: positiv
Erzeugung von Ammoniak: positiv
VP-Reaktion: negativ
MR-Test: positiv
Denitrifikation: positiv
Verwertung von Zitronensäure:
Koser-Medlum: verwertet
Chrlstensen-Medium: verwertet
Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum in einer NaCl-Konzentration bis zu 5%
Pigmenterzeugung (King Α-Medium): keine Erzeugung
Verwertung von Stickstoffquellen: Verwertung von Ammoniumsalz und Nitrat
Verwertung von Zuckern und Erzeugung von Säure und Gas: s. die nachstehende Tabelle 1
hi Tabelle 1:
Wachstum
Säureerzeugung
Gaserzeugung
D-Glukose + + +
D-Fruktose + + +
D-Mannose + + +
D-Galaktose + + · +
D-Rhamnose + + +
D-Arabinose + + +
L-Arabinose + + +
D-Xylose + + +
Saccharose + + +
Laktose +
Maltose + + +
Trehalose + + +
Raffinose + + +
D-Inoslt + - -
D-Mannit + + +
D-Adonit -
D-Dulcit -
D-Sorbit + + +
Saiizin + - -
Glycerin + + -
Äthanol -
Isoliert aus: Boden eines Reisfeldes bei Fuji-shi. Shizuoka. Japan.
(II) Aeromonas sp. ATCC 31898:
(A) Morphologische Eigenschaften (Inkubation in Nährbrühe bei 32° C 24 h lang):
Gestalt: kurzes Stäbchen, einzelne Stäbchen oder eine Kette von zwei oder drei Stäbchen, mit einer Geisel oder Geiseln an einem Ende des Bakteriums.
Größe: 0,8 bis 1,0 Mm χ 1,2 bis 1,8 Mm Beweglichkeit: vorhanden
Gramfärbung: negativ
Säurefestigkeit: negativ
Sporen: nicht gebildet
Pleomorphismus: keiner
(B) Wachstum im Medium (32° C):
Nährbrühe: gut, keine Filmbildung, Ringbildung, mit Niederschlag, trüb, keine Pigmentblldung Nährbrühe/Agarplatten-Kultur: gut. kreisförmig, glatte Oberfläche, erhaben bzw. erhöht, vollkommen kreisförmig, glänzend, grau-weiß, leicht viskos, keine Pigmentblldung
Nährbrühe/Agarkeil-Kultur: gut, schwach flüssig, fadenförmig, glänzend, grau-weiß, keine Pigmentbildung
Nährbrühe/Gelatlnestich-Kultur (20° C): gutes Wachstum im oberen Teil, grau-weiß, grau im gestochenen Teil, keine Gasbildung im gestocheb5 nen Teil, keine Verflüssigung
(C) Physlogische Eigenschaften.
Wachstumstemperatur: Wachstum bei 9 bis 45° C, kein Wachstum bei 50° C
Wachstums-pH-Wert: 5 bis !O
Sauerstoffbedarf: wahlweise anaerob OF-Test (Hugh Leifson's-Medium): Fermentation Gaserzeugung (Glukosemedium): Gaserzeugung Lackmusmilch: gutes Wachstum. Lackmus entfärbt.
Milch koaguliert, roU Niederschlag Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung Reduktion von Nitrat: Erzeugung von salpetriger Säure
Catalase-Aktivität: positiv
Oxidase-Aktiviiät: positiv
Urease-Aktivität: positiv
Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ Lysindecarboxylase-Aktivität: negativ Alginindihydrolase-Aktivität: negativ
Ornithindecarboxylase-Aktivität: positiv
Erzeugung von Indol: positiv
Erzeugung von Ammoniak: positiv
VP-Reaktion: positiv
MR-Test: negativ
Denitrifikation: positiv
Verwertung von Zitronensäure:
Koser-Medium: verwertet
Christensen-Medium: verwertet
N3triumchloridbeständigkeit: Wachstum in NaCl-Konzentration bis zu 5%
Pigmenterzeugung (King Α-Medium): keine Erzeugung
Verwertung von Stickstoffquellen: Verwertung von Ainmoniunisalz, Nitrat und Harnstoff
Verwertung von Zuckern und Erzeugung von Säure und Gas: s. die nachstehende Tabelle 2
Tabelle 2:
Säure- Gaserzeugung erzeugung
D-Glukose + + +
D-Fruktose + + +
D-Mannose + + +
D-Galaktose + + +
D-Rhamnose + + +
D-Arabinose - - -
L-Arabinose + + +
D-Xylose + + +
Saccharose + + +
Laktose + + +
Maltose + + +
Trehalose + + +
Ra ff i nose + + +
D-lnosit + + +
D-Mannit + + +
D-Adonit + + + D-Dulcit
D-Sorbit + + +
Salizin + + +
Glycerin + + +
Äthanol + . Isoliert aus: Boden eines Reisfeldes bei Fuji-shi. Shizuoka. Japan
Die genannten Daten geben die mykologischen Eigenschaften von Aeromonas sp. ATCC 31897 und ATCC 31898 an. Die Identifizierung gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 8. Ausgabe. 1974, zeigte das nachstehende Ergebnis: Die Mikroorganismen ordnet man am vernünftigsten dem Genus Aeromonas, Familie Vibrionacease zu, weil sie jeweils ein gramnegativer Bazillus in Form eines kurzen Stäbchens sind, wahlweise anaerob sind, eine Geisel oder eine Büschelgeisel an einem Ende aufweisen, beweglich sind, eine positive Catalase-Aktivität und eine positive Oxidase-Aktivität aufweisen, und Glukose aktiv zur Bildung einer Säure und von Gas fermentieren.
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, M) 8. Ausgabe, beschreibt drei Mikroorganismen vom Genus Aeromonas, nämlich Aeromonas hydrophila. Aeromonas punetata und Aeromonas salmonicida. Aeromonas salmonieida unterscheidet sich von Aeromonas sp. ATCC 31897 und ATCC 31898 gemäß der Erfindung, weil Aeromonas salmcnicida bei 27° C nicht wachsen kann, während die Mikroorganismen gemäß der Erfindung bei d^.se.r Temperatur gut wachsen; und Aeromonas hydrophila und Aeromonas punetata unterscheiden sich von den Mikroorganismen gemäß der Erfindung in vielen taxonomischen Eigenschaften, wie ir. der nachstehenden Tabelle 3 angegeben ist. Daher unterscheiden sich die drei Mikroorganismen vom Genus Aeromonas, die in Bergey's Manual beschrieben sind, von den neuen Mikrooiganismen gemäß der Erfindung, Aeromonas sp. ATCC 31897 und Aeromonas sp. ATCC 31898.
65
Tabelle 3
Taxonomlsche Aeromonas hydrophlla Aeromonas ATCC ATCC
Eigenschaften Hydro- Aero- Proteo- punctata 31897 31898
phlla genes- lytlca Punctata Cavlae
Verflüssigung +■(- + + + -
von Gelatine
Erzeugung + + - + + --
von Hydrogensulfld Lyslndecarboxylase- - ' - +
Aktivität
VP-Reaktlon +—*) +—*) +
Beständigkeit __ + ----
gegenüber 7,5%lger
NaCl-Lösiing
Gaserzeugung + __--- +
aus Glycerin
Gaserzeugung + __ + - + +
aus Glucose
*) +—: Die Spezies umfaßt verschiedene Stämme, von denen einige »+«-Werte und einige »-«-Werte
aufweisen.
(III) Klebsiella sp. ATCC 31899: Ornlthlndecarboxy.ase-Aktivltät: negativ
(A) Morphologische Eigenschaften 25 Indolerzeugung: positiv
(Inkubation In Nährbrühe bei 32° C 24 h lang): Ammoniakerzeugung: positiv
Gestalt: kurze Stäbchen, ein einzelnes Stäbchen oder VP-ReaKtlon: positiv
eine Kette von zwei oder drei Stäbchen, keine MR-TeS; negativ
Geiseln Denitrifikation: positiv
Größe: 1,1 bis 1,3 μίτ» χ 1,8 bis 2,0 μπι x Verwertung von Zitronensäure:
Beweglichkeit: nicht vorhanden Koser-Medlum: verwertet
Gramfärbung: negativ Chrlstensen-Medlum: verwertet
Säurefestigkeit: negativ Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum in NaCI
Sporen: nicht gebildet mit einer Konzentration bis zu 4%
Pleomorphismus: keiner 35 Pigmenterzeugung (King A-Medlum): keine Erzeu-
(B) Wachstum im Medium (32° C): gung
Nährbrühe: gui, keine FUmbÜdung, Ringbildung.. Verwertung von Stickstoffquelien: Verwertung von
mit Niederschlag, trüb, keine Pigmentbildung Ammoniumsalz, Nitrat und Harnstoff
Nährbrühe/Agarplatten-Kultur: gut, kreisförmig. Verwertung von Zuckern und Erzeugung von Säure glatte Oberfläche, erhaben bzw. erhöht, vollkom- 40 und Gas: s. die nachstehende Tabelle 4
men kreisförmig, glänzend, grau-weiß, etwas viskos, keine Pigmentbildung Tabelle 4
Nährbrühe/Agarkeil-Kultur: gut, fadenförmig, glän-
zend, grau-weiß, keine Pigmentbildung Wachs- Säure- Gas-Nährbrühe/Gelatinestichkultur (20° C): gutes 45 turn erzeugung erzeugung
Wachstum im oberen Teil, grau-weiß, grau im
gestochenen Teil, keine Gasbildung im gestoche- ifrlu*ose + + +
nen Teil, keine Verflüssigung η μ + + +
(C) Physiologische Eigenschaften: U'-Mannose + + + Wachstumstemperatur: Wachstum bei 9 bis 42° C, 50 "galaktose + + +
kein Wachstum öe! 45° C D-Rhamnose + + +
Wacnstums-pH-Wert: 4 bis 9 D-Arabinose + + +
Sauerstoffbedarf: wahlweise anaerob L-Araomose + + +
OF-Test (Hugh Leifson's-Medium): Fermentation U'-Xyiose + + +
Gaserzeugung (Glucosemedium): Gaserzeugung 55 ^a£cnarose + + +
Lackmusmilch: gutes Wachstum, Lackmus entfärbt. Γ,,, + + +
Milch koaguliert. Niederschlag, keine Peptonisie- ^*1?** + + +
Trehalose + + +
ning _ „..
Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung Ka.nnose + + +
Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung 6O " "os + + +
Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung η ah- + + +
Reduktion von Nitrat: Bildung von salpetriger Säure f» „ , 1J'1 + + +
Catalase-Aktivität: positiv η w, + + +
Oxidase-Aktivität: negativ Jr',.™11 + + +
ürease-ASctivitSt: positiv 65 ΪΤ " + + +
Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ χ h 1 + - t
Lysindecarboxyiase-Aktivität: positiv Äthanol +
Alginindihydrolase-Aktivität: negativ Isoliert aus: Boden eines Reisfeldes bei Fuji-shi, Shizuoka, Japan
(IV) Klebsieila sp. ATCC 31900:
(A) Morphologische Eigenschaften
(Inkubation in Nährbrühe bei 32° C 24 h lang):
Gestalt: kurzes Stäbchen, ein einzelnes Stilbchen oder eine Kette von zwei oder drei Stäbchen, keine Geisel
Größe: 1,0 bis 1,2 μΐη χ 2,2 bis 3,0 um
Beweglichkeit: nicht vorhanden
Gramfärbung: negativ
Säurefestigkeit: negativ
Sporen: nicht gebildet
Pleomorphismus: keiner
(B) Wachstum im Medium (32° C):
Nährbrühe: gut, keine Filmbildung, Bildung eines grau-weißen Ringes, Niederschlag, trüb, keine Pigmentbildung
Nährbrühe/Agarplattenkultur: gut, kreisförmig, giaüc OuciftäCnC, cmäberi u/.'iV. erhöht, vollko™
men kreisförmig, glänzend, grau-weiß, leicht viskos, keine Pigmentbildung
Nährbrühe/Agarkeilkultur: gut, leicht wellig, fadenförmig, glänzend, grau-weiß, keine Pigmentbildung
Nährbrühe/Gclatincstichkultur (20° C): gutes Wachstum Im oberen Teil, grau-weiß, schwaches Wachstum Im gestochenen Teil, keine Gasbildung im gestochenen Teil, keine Verflüssigung
(C) Physiologische Eigenschaften:
Wachstumstemperatur: Wachstum bei 13 bis 42° C, kein Wachstum bei 45° C
Wachstums-pH-Wert: 5 bis 9
Sauestoffbedarf: wahlweise anaerob
OF-Test (Hugh Leifson's-Medium): Fermentation
Gaserzeugung (Glukosemedium): Gaserzeugung
Lackmusmilch: gutes Wachstum, Lackmus entfärbt. Milch koaguliert, Niederschlag, keine Peninnisierung
Verflüssigung von Gelatine: keine Verflüssigung
Erzeugung von Hydrogensulfid: keine Erzeugung
Zersetzung von Stärke: keine Zersetzung
Reduktion von Nitrat: Erzeugung von salpetriger Säure
Catalase-Aktivität: positiv
Oxidase-Aktivität: negativ
Urease-Aktivität: positiv
Phenylalanindeaminase-Aktivität: negativ
Lysindecarboxylase-Aktivität: positiv
Alginindlhydrolase-Aktivltät: negativ
Ornithindecarboxylase-Aktivität: negativ
Indolerzeugung: positiv
Ammoniakerzeugung: positiv
VP-Reakion: positiv
MR-Test: positiv
Denitrifikation: positiv
Verwertung von Zitronensäure:
Koser-Medium: verwertet
Christensen-Medium: verwertet
Natriumchloridbeständigkeit: Wachstum in einer NaCl-Konzentration bis zu 4%
Pigmentbildung (King Α-Medium): keine Pigmentbildung
Verwertung von Stickstoffquellen: Verwertung von Ammoniumsalz, Nitrat und Harnstoff
Verwertung von Zuckern und Erzeugung von Säure und Gas: s. die nachstehende Tabelle 5
Tabelle 5: Wachs Säure Gas
tum erzeugung erzeugung
+ + +
D-Giukose 4- 4- +
D-Fruktose + 4- 4-
D-Mannose + 4- +
D-Galaktose 4- + 4-
D-Rhamnose - - -
D-Arablnose + + 4-
L-Arablnose 4- 4- +
D-Xylose 4- 4-
Saccharose 4- 4- 4-
Laktose 4- + +
Maltose 4- 4- 4-
Trehalose + 4- +
Rafflnose 4· 4- +
D-Inosit 4- + 4.
D-Mannlt 4- 4- 4-
D-Adonlt - _ _
D-Dulcit 4- 4- +
D-Sorbit 4- 4- 4-
Salizin + + 4-
Glycerin _ _
Äthanol
isoliert aus: Boden eines Reisfeldes bei Fuji-shi, Shizuoka. Japan
J5 Die angegebenen Daten zeigen die mykologischen Eigenschaften von Klebsiella sp. ATCC 31899 und ATCC 31900 gemäß der Erfindung. Die Identifizierung gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, 1974, zeigte das nachstehende Ergebnis: Die Mikroorganismen gehören zur Familie Enterobacteriaceae, weil sie ein Gram-negativer Bazillus sind, wahlweise anaerob sind, eine positive Catalase-Aktivität aufweisen, eine negative Oxidase-Aktivität aufweisen, eine Säure aus Glucose erzeugen und Salpetersäure zu salpetriger Säure reduzieren; man kann sie am vernünftigsten dem Genus Klebsiella im Trlbus Klebsiella zuordnen, weil sie eine positive VP-Reaktion zeigen, eine negative Phenylalanindeaminase-Aktivität aufweisen, keine Erzeugung von Hydrogensulfid aufweisen, eine positive Lysindecarboxylase-Aktivität aufweisen, eine negative Ornithindecarboxylase-Aktivität aufweisen, eine negative Alginindihydrolase-Aktivität aufweisen und nicht beweglich sind.
Es waren bisher keine Mikroorganismen vom Genus Klebsiella bekannt, die L-Tryptophan aus Indol, Brenztraubensäure und Ammoniumionen erzeugen. Die Tabelle 6 vergleicht die mykologischen Eigenschaften von Klebsiella sp. ATCC 31899 und ATCC 31900 mit jenen der drei Bakterien vom Genus Klebsiella, die in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, beschrieben sind.
ii
Tabelle 6
VP-ReakMon
MR-Tesi
Indolerzeugung
Urease-Aktlvltät
Lysindecarboxylase-
Aktivltät
Alginindlhydrolase-
Aktlvliät
Ornitrindecarboxylase-
Aktlvltät
Taxonomische ATCC ATCC Mikroorganismen Klebslella
Eigenschaften 31899 31900 Klebslella KIeHsIeIIa rhino-
pneumoniae ozaenae scleromatls
von Zitronensäure
Verwertung + +
von Malonsäure
Gaserzeugung:
Glukose + +
Glycerin + +
Säureerzeugung:
Laktose + +
Dulcit +
·) +—: s. Tabelle 3
Aufgrund dieser taxonomischen Daten kann man schließen, daß Klebsiella sp. ATCC 31899 und ATCC 31900 Mikroorganismen sind, die sich von den drei Mikroorganismen vom Genus Klebsiella unterscheiden, die In Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe, beschrieben sind.
Die Erfindung betrifft also die Herstellung von L-Typtophan und seinen Derivaten unter Verwendung von Aeromonas sp. ATCC 31899, Aeromonas sp. ATCC 31898, Klebslella sp. ATCC 31899 und Klebsiella sp. ATCC 31900, die oben beschrieben wurden. Die Mikroorganismen kann man auf einem üblichen synthetischen of)er natürlichen Medium kultivieren. Die Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Zucker, wie z. B. Glukose, Fruktpse, Mannose, Saccharose, Galaktose, Xylose oder Melasse; Zuckeralkohole, beispielsweise Glycerin oder Sorbit; oder organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Apfelsäure oder Bernsteinsäure. Diese Kohlenstoff quellen gibt man zu dem Medium Im allgemeinen in einer Menge von etwa 0,1 bis 10 Gew.-% zu. Stickstoffquetlen sind beispielsweise Ammoniumverbindungen, wie z. B. Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Ammoniumacetat oder Ammoniakwasser; und organische Stickstoffquellen, wie beispielsweise Harnstoff, Fleischextrakt, Pepton, Kaseinhydrolysat, Maiswasser, entfettetes Sojabonnenmehl oder Proteinhydrolysat. Stoffe, die das Wachstum der verwendeten Mikroorganismen fördern, verwendet man vorteilhaft und gibt sie zu dem Medium zu. Die Stoffe können anorganisch oder organisch sein. Anorganische Stoffe sind beispielsweise Kaliummonophosphat, Kaliumdiphosphat, Phosphorsäure, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat und Natriumchlorid, sowie Metallionen, wie z. B. Eisen-, Zink-, Mangan-, Kupfer- und Calciumionen. Organische Stoffe sind beispielsweise Aminosäuren, Vitamine, organische Säuren, aliphatäsche Säuren, sowie natürliche Stoffe, wie z. B. Pepton, Hefeextraki, getrocknete Hefe. Maiswasser. Kasein und Hydrolysat von entfetteten Sojabohnen.
Tryptophanase. die man mit den erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen hergestellt hat, betrachtet man als ein anpassungsfähiges Enzym; und man gibt L-Tryptophan vorzugsweise zum Medium zu und stellt eine Kultur der Mikroorganismen in einer Menge von eiwa 0,1 bis 0,7 Gew.-% her. Die Mikroorganismen inkubiert man in dem erhaltenen Medium bei 25 bis 37° C 16 bis 96 h lang.
Die derart hergestellte Kultur der Mikroorganismen weist ein Enzymsystem auf, das L-Tryptophan oder seine Derivate aus einer Indolverbindung und Serin oder aus einer Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und einem Ammoniumion erzeugt. Die Kultur kann man unmittelbar in der gewünschten enzymatischen Reaktion verwenden, oder man kann sie nach geeigneten Vorbehandlungen verwenden. Beispielsweise kann man die Zellen des Mikroorganismus aus der Kultur beispielsweise durch Zentrifugieren abtrennen. Die Zellen kann man ferner trocknen, mit Ultraschallwellen behandeln, autolysieren oder homogenisieren. Wahlweise kann man die abgetrennten Zellen als immobilisierte Zellen verwenden, wie man sie durch ihre Polymerisation mit beispielsweise einem Acrylsäureamid-Monomeren erhalten hat.
Die Zellen mit einem Tryptophanasegehalt, die behandelten Zellen oder die immobilisierten Zellen, die man derart erhalten hat, verwendet man als Katalysator für eine enzymatische Reaktion in einer Reaktionsflüssigkeit, die eine Indolverbindung und Serin, oder eine Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihr Salz und Ammoniumionen enthält, zur Herstellung von L-Tryrtophan oder seinen Derivaten. Zusätzlich zur Indoiverbindung, dem Serin, der Brenztraubensäure und/oder ihrem Salz und den Ammoniumionen, die man als Substrat verwendet, enthält die Reaktionsflüssigkeit voizugs-
Tabelle 8
weise Athylcndiamintetraess'gsäure und Pyrldoxalphosphat, wodurch man eine höhere Ausbeute an L-Tryptophan oJer seinen Derivaten erzieh. Es besteh: keine spezielle Begrenzung bezüglich der verwendeten Subsiiatmenge. und im allgemeinen betrügt sie 0.1 bis 10 Gew.-V Die enzymatische Reaktion führt man im allgemeinen bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 11 und bei einer Temperatur von 10 bis 60° C durch. Beispiele für die Indolverblndung, die man dem Reaktionssystem zusetzt, sind Indol, 5-Hydroxyindol. 5-Chlorindol, 5-Bromindol, 5-Aminoindol, 5-Methoxyindul, 5-Methoxy-2-mcthylindol und 2-Methylindol.
Das L-Tryptophan oder seine Derivate, die man in der Reaktionsflüssigkeit hergestellt hat. kann man auf übliche Weise isolieren, beispielsweise durch Adsorption an )5 einem loncnaustausche.rharz oder Aktivkohle. Das L-Tryptophan oder seine Derivate kann man durch Hochdruck-Flüssig-Chromatographie oder DünnschichtchroiViäiographic an Siüciurndioxidge! qusÜU'.Uv und nnnniil&tiv bestimmen. >o
Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert:
ImIoI-verbindung
erzeugte
L-Tryptophar,-
dcrlvate
Menge (g/l)
Indol
5 Hydroxyindol
5-Chlorindol
5-Bromindol
5-Aminoindol
5-Mcthoxyindol
L-Tryptophan
5-llydroxytryptophan
5-Chloriryptophan
5-Bromtryptophan
5-Aminotryptophan
5-Methoxy tryptophan
10,3 2,9 0.9 0,7 1,1 0,6
Beispiel 1
5 ml eines Mediums mit dem Ansät/1 gemäß Tabelle 7 _,5 setzte man in Proberöhrchen mit einem Durchmesser von 18 mm ein und sterilisierte bei 1200C 10 min lang. In jedes der sterilisierten Medien impfte man eine Öse Aeromonas sp. ATCC 31897 ein und kultivierte bei 32° C 20 h lang unter Schütteln. 5 ml dieser Kultur übertrug J0 man in ein Fermentationsmedium, das man durch Sterilisieren von 100 ml eines Mediums (dem gleichen wie in Tabelle 7) bei 120° C 10 min lang in einem 500-ml-Schüttelkolben hergestellt hatte und führte die Fermentation bei 32° C 20 h lang unter Schütteln durch. Nach Beendi- J5 gung der Fermentation zentrifugierte man 2 1 der Kultur, gewann die Mikrnnraanismuszellen und suspendierte die Zellen in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 2 g Natriumpyruvat, 2 g Ammoniumacetat. 10 mg Pyridoxalphosphat. 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Die Suspension teilte man in 6 gleiche Mengen. 30 ml jeder Suspension mischte man mit 600 mg Indolverbindung, wie in Tabelle 8 gezeigt, erwärmte jede Mischung bei 32° C 72 h unter Schütteln und bewirkte eine enzymatische Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion gab man 30 ml Methanol zu jeder Reaktionsmischung unter heftigem Rühren und zentrifugierte die Mischung. Die erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten unterwarf man der Hochdruck-Flüssig-Chromatographie; 50 c die L-Tryptophanderivate, die den eingesetzten Indolverbindungen entsprachen, erzeugte man in den Mengen, die in der nachsiehenden Tabelle 8 gezeigt sind.
Zu dem Reaktionsprodukt, das man unter Verwendung von Indol erhalten hatte, gab man Natriumhydroxid (Ätznatron) zu, brachte den pH-Wert auf 10, führte die Mischung durch eine Säule eines stark sau-en lonenaustauscherharzes, die mit Ammoniumloncn beladen war, und eluierte das adsorbierte L-Tryptophan mit 2 η Ammoniakwasser. Das Eluat engte man ein, und bildete rohe L-Tryptophiinkristalle, die man mit Aceton wusch und trocknete, und man erhielt 185 mg L-Tryptophankristalle.
Beispiel 2
Aeromonas sp. ATCC 31897 fermentierte man wie in Beispiel 1 und erhielt 2 I einer Kultur. Die Kultur zentrifugierte man; gewann die Mikroorganismuszellen und suspendierte die Zellen in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 1,5 g L-Serin. 10 mg Pyridoxalphosphat, 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Die Suspension teilte man in 6 gleiche Mengen. 30 ml jeder Suspension mischte man mit 600 mg einer der Indolverbindungen, die in Tabelle 9 angegeben sind, erwärmte jede Mischung bei 32° C 72 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatische Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion behandelte man die Reaktionsprodukte wie in Beispiel 1 und unterwarf sie der Hochdruck-Flüssig-Chromaiographie; man erzeugte I.-Tryptophanderivate entsprechend den verwendeten Indolverbindungen in den Mengen, die in Tabelle 9 angegeben sind.
Tabelle 9
Indolvcrbinduni!
erzeugte
L-Tryptophanderivate
Menge (g/l)
Indol
5-Hydroxyindol
5-Chlorindol
5-Bromindol
5-Aminoindol
5-Methoxvindol
Tabelle 7
55
L-Tryptophan 11,8
5-Hydroxytryptophan 2,5
5-Chlortryptophan 1.1
5-Brcmtryptophan 1.3
5-Aminotryptophan 1,2
5-Methoxytryptophan 0,8
Beispiel 3
Gew.-",
Pepton
Kaseinhydrolysate
Hefeextrakt
Maiswasser
L-Tryptophan
KH2PO4
MgSO4 · 7H2O
FeSO4 · 7H2O
MnSO1 ■ 4H2O
üH-Wert
0,5
0.2
0.05
0.05
0.003
0,003
7.2 Aeromonas sp. ATCC 31898 fermentierte man wie in Beispiel 1 und erhielt 4 1 einer Kultur. Die Kultur zentrifugierte man und gewann die Mikroorganismuszellen, von denen man die Hälfte in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9.0 suspendierte, die aus 2 g Natriumpyruvat, 2 g Ammoniumacetat, 10 mg Pyridoxalphosphat, 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure und !00 ml Wasser bestand. Die andere Hälfte suspendierte man in 180 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0. die aus 1,5 g L-Serin, iOmg Pyridoxalphosphat, 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Jede der beiden Reakiions-
flüssigkeiten teilte man In 6 gleiche Mengen wie in Bei-, spiel 1 und 2 und mischte sie mit je 600 mg einer der Indolverbindungen, die in der nachstehenden Tabelle 10 angegeben sind; jede Mischung erwärmte man bei 32° C 72 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatische Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion behandelte man die Reaktionsprodukte wie in Beispiel 1 und unterwarf sie einer Hochdruck-Flüssig-Chromatographie: Fian erzeugte L-Tryptophanderivate entsprechend den Indolverbindungen in den Mengen, die in Tabelle 10 angegeben sind.
Beispiel 5
Tabelle 10 Menge der erzeugten L-Trypl°phan-
Indol- derivate (g/l)
verblnd,ung pyruvat- L-serin-
haltiges haltiges
System System
14,4 17.2
Indol 1,9 ■Λ 4
5-Hydroxyindoi 1,1 i,4
5-Chlorindol 1,0 1,0
5-BromIndol 1,5 1,6
5-Aminoindol 1.2 1,5
5-Methoxyindol
Wie in Beispiel 4 fermentierte man die Mikroorganismen gemäß Tabelle 13 auf einem Medium mit dem Ansatz gemäß Tabelle 7. 11 jeder Kultur zentrifugierte man, gewann die Zellen jedes Mikroorganismus und suspendierte sie in 200 ml einer Reaktionsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 9,0, die aus 2 g Indol, 3 g L-Serin, 10 mg Pyridoxaiphosphat, 200 mg Äthylendiamintetraessigsäure und 100 ml Wasser bestand. Jede Suspension erwärmte man bei 32° C 36 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymattsche Reaktion. Nach Beendigung der Reaktion mischte man 10 ml jeder Suspension mit 10 ml Methanol unter heftigem Rühren und zentrifugierte die Mischung. Die Analyse der erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten mit Hochdruck-Flüssig-Chromatographie zeigte, daß man L-Tryptophan in den Reaktionsflüssigkeiten in den Mengen erzeugt hatte, die in Tabelle 13 gezeigt sind.
Tabelle 13
Mikroorganismus
Beispiel 4
5 ml eines Mediums mit dem Ansatz wie in Tabelle 7 seme man in Proberöhrchen mit einem Durchmesser von 18 mm ein und sterilisierte bei 120° C 10 min lang. In jedes der sterilisierten Medien impfte man eine Öse der Mikroorganismen gemäß Tabelle U ein und kultivierte bei 32* C 20 h lang unter Schütteln. 5 ml jeder Kultur aberführte man in ein Fermentationsmedium, das man durch Sterilisieren von 100 mi eines Mediums (dem gleichen wie in Tabelle 7) bei 120° C 10 min lang in einem 50Q-ml-Schüttelkolben erhalten hatte; die Fermentation führte man bei 32° C 20 h lang unter Schütteln durch. Nach Beendigung der Fermentation zentrifugierte man 11 der Kultur und gewann die Zellen jedes Mikroorganismus; die Zellen suspendierte man in 200 ml eines Reaktionsmediums mit dem Ansatz gemäß Tabelle 12 und erwärmte jede Suspension bei 32° C 48 h lang unter Schütteln und bewirkte eine enzymatische Reaktion. Nach. Beendigung der Reakt.on mischte man 10 ml jeder Suspension mit 10 mi Methanol unter heftigem Rühren und. zentrifugierte die Mischung. Die Analyse der erhaltenen überstehenden Flüssigkeiten dutch Hochdruck-Flüssig-Chromatographie zeigte, daß man L-Tryptophan in den Reaktionsflüssigketten in den Mengen erzeugt hatte, die in Tabelle 11 angegeben sind.
Tabelle U
erzeugtes
L-Tryptophan
(g/l)
Klebsiella sp ATCC 31899
Klebsiellasp ATCC 31900
15.4 16,2
Beispiel 6
Wie in Beispiel 4 fermentierte man Klebsiella sp. ATCC 31900 auf einem Medium mit dem Ansatz gemäß Tabelle 7. 4 I der Kultur zentrifugierte man und gewann die Mikroorganismuszellen. Die Hälfte der Zellen suspendierte man in einer Reaktionsflüssigkeit, die Natriumpyruvat und Ammoniumacetat wie in Beispiel 4 enthielt, und mischte sie mit den Indolverbindungen gemäß Tabelle 14. Die andere Hälfte der Zellen suspendierte man in einer Reaktionsflüssigkeit, die L-Serin wie in Beispiel 5 enthielt, und mischte sie mit den Indolverbindungen gemäß Tabelle 14. Jede Mischung unterwarf man danach einer enzymatischen Reaktion bei 32° C 72 h lang unter Schütteln. Nach Beendigung der Reaktion unterwarf man die Reaktionsmischungen der Hochdruck-FIüssig-Chromatographie; man erzeugte L-Tryptophanderivate entsprechend den verwendeten Indolverbindungen in den Mengen, die in Tabelle 14 angegeben sind.
Tabelle 14
Mikroorganismus
erzeugtes
L-Tryptophan
(g/l)
Indolverbindung Menge der erzeugten L-Trypto-
phanderivate (g/l)
pyruvat- L-serin-
hiiltiges haltigcs
System System
Klebsiella sp. ATCC 31899
Klebsiella sp. ATCC 31900
Tabelle 12
Natrlumpyruvat
Arnmoniumacetat
Pyridoxaiphosphat
Äthylendlamlntetraesslgsäure
Wasser
pH-Wert
11,2 g
13,4 g
20 g
20 mg
20 g
100 I
2 0
1
9,
5-Hydroxyindol 1.8
5-Chlorindol 1.1
5-Bromindol 1,2
5-Aminoindol 0,9
5-Methoxyindol 0,8
5-Methoxy-2-melhylindol 0.9
2-Methylindol 1,3
5-Methoxy-2-methylindol 0,9
2-Methylindol 1.3
2,4 1.3 1.3 1,2 1,0 0.9 1.4 0,9 1.4

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von L-Trypthophan oder eines seiner Derivate durch Züchten eines Mikroorganismus in einem Nährmedium, das eine Indolverbindung und Serin oder eine Indolverbindung, Brenztraubensäure und/oder ihr Salz und Ammoniumionen enthält, und Isolieren des L-Tryptophans oder eines seiner Derivate auf übliche Weise, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aeromonas sp. ATCC 31897, Aeromonas sp. ATCC 31898, Klebsiella sp. ATCC 31899 oder Klebsiella ATCC 31900 einsetzt.
2. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aeromonas sp. ATCC 31897, Aeromonas sp. ATCC 31898, Klebsiella sp. ATCC 31899 oder Klebsiella ATCC 31900 und als Indolverbindung Indol, 5-Hydroxyindol, 5-Chlorindol, 5-Bromindol, 5-Aminoindol, 5-Methoxyindol, 5-Methoxy-2-methylindoI oder 2-Methylindol einsetzt.
wendung eines Mikroorganismus vom Genus EscherichiaGenus Claviceps, Genus Neurospora, Genus Saccharomyces, Genus Bacillus, Genus Achromobacter oder Genus Alcaligenes herstellt. Es sind ferner verschiedene Methoden zur Herstellung von L-Tryptophanderivaten bekannt, die verschiedenen Indolverbindungen entsprechen: In der JP-Patentveröffentlichung Serien-Nn 46 917/74 ist eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Proteus, Genus Escherlchla, Genus Pseudomonas, Genus Aerobacter oder Genus Erwinia beschrieben; in der JP-Patentveröffentlichung Serien-Nr. 1 835/78 ist eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Achromobacter, Genus Escherlchia, Genus Pseudomonas, Genus Alcaligenes oder Genus Proteus beschrieben; und in den JP-Patentveröffentlichungen Serien-Nr. 5 479/76 und 8 400/77 ist eine Methode zur Herstellung von 5-Hydroxytryp.ophan und Methoxytryptophan unter Verwendung eines Mikroorganismus vom Genus Corynebacterium oder Genus Brevl·
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