DE2241091C3

DE2241091C3 -

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Publication number: DE2241091C3
Application number: DE19722241091
Authority: DE
Priority date: 1971-08-20
Filing date: 1972-08-21
Publication date: 1976-10-07

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-(D-»-Aminophenylacetamido)-desacetoxycephalosporansäure (= Cephalexin) durch enzymatische Acylierung von 7-Amino-desacetoxy-cephalosporansäure (= 7-ADCA) mit D-Phenylglycinmethyl- oder -äthylester.

Bisher wurde Cephalexin durch Desacetoxylierung von 7-(D-*-Aminophenylacetamido)-cephalosporansäure durch katalytische Hydrierung (vgl. NL-PS 67 04 294), Ringerweiterung von 6-(D-a-substituierten Amino - phenylacetamido) - penicillansäure - sulfoxidestern durch Erhitzen in Anwesenheit eines Katalysators und von Xylol (vgl. NL-PS 67 04 294) und Acylierung von 7-ADCA durch D-a-substituierte Aminophenylessigsäure und nachfolgende Entfernung der Schutzgruppe (vgl. NL-PS 69 05 073) hergestellt.

Dieser Stand der Technik hat jedoch Nachteile. Beispielsweise muß das chemische Acylierungsverfahren von 7-ADCA unter Verwendung des aminogruppengeschützten Phenylglycins durchgeführt werden, außerdem ist diese Schutzgruppe zu entfernen. Diese Nachteile machen das Verfahren unwirtschaftlieh.

Ein Acylierungsverfahren zur direkten Herstellung von Cephalexin aus 7-Phenylacetamido-3-methyl-4³-cephem-4-carbonsäure, die ein Ringerweiterungsprodukt von Penicillin G ist, unter Verwendung eines Enzympräparates, das vom Bacillus Megaterium stammt, ist bereits vorgeschlagen worden (vgl. DT-OS 22 14 444); dieses Verfahren ist jedoch wegen der niedrigen Cephalexinausbeute nicht immer industriell vorteilhaft gewesen.

Eine Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung von chemotherapeutisch brauchbarem Cephalexin aus 7-ADCA in hoher Ausbeute. Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines industriellen Verfahrens zur Herstellung von Cephalexin.

Die Aufgabe der Erfindung wird durch Schaffung eines enzymatischen Acylierungsverfahrens gelöst. Im Verlaufe einer Untersuchung über Acylierungsenzyme erzeugende Bakterien, die eine Phenylglycylgruppe in eine Aminogruppe in 7-ADCA einführen, wurde jetzt ein Mikroorganismus gefunden, der zur Gattung Achromobacter gehört und nachfolgend als B-402-2 bezeichnet wird, der eine starke acylierende Wirksamkeit für die Aminogruppe in 7-ADCA hat und der Cephalexin nahezu quantitativ aus 7-ADCA und Phenylglycinmethyl- oder -äthylester bildet.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von 7-(D-a-Aminophenylacetamido)-desacetoxy-cephalosporansäure, das dadurch gekennzeichnet ist, daß 7-Aminodesacetoxy-cephaIosporansäure mit D-Phenylglycinmethyl- oder -äthylester in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit eines acylierenden Enzyms, das von einem Mikroorganismus des Stammes Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 oder Beneckea hyperoptica ATCC 15803 stammt, bei 20 bis 45° C und einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 umgesetzt wird.

Es folgt eine taxonomische Beschreibung des erfindungsgemäß verwendeten Stammes B-402-2.

a) Beobachtungen auf Bouillonagar-Schrägkultur bei 30° C 24 Stunden lang:

1. Gestalt und Größe der Bakterienzellen: Kurze Stäbchen, runde Ränder. 0,5 bis 0,8 X 2,0 bis 2,5 μ.

2. Zellenform: Beinahe Einzelzellen, schwach kettig, keine Membran.

3. Mobilität: Keine:

4. Sporen: Keine.

5. Gramsche Färbung: Negativ.

6. Säurefestigkeit: Negativ.

b) Wachstum auf verschiedenen Medien:

1. Bouillon-Plattenagar (bei 3O⁰C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, erhebt sich konvex, keine Ausbreitung, weiß oder hellgelb, glänzend, weich, feucht, semitransparent, keine Änderung der Farbe des Mediums.

2. Bouillon-Schrägagar (30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, glatte Oberfläche, keine Ausbreitung, glänzend, feucht, milchigweiße Kolonie, semitransparent, keine Änderung der Farbe des Mediums.

3. Bouillonbrühe (bei 30° C, 2 Tage): Gutes Wachstum, gleichmäßig trübe, keine Ausfällung, keine Membranbildung, keine Pigmentierung.

4. Bouillongelatine - Einstich: Oberflächenwachstum entlang der Stichlinie bis zur halben Tiefe, keine Verflüssigung der Gelatine.

5. Sojabohnen-Schrägagar (30° C, 24 Stunden): Gutes Wachstum, weiße oder hellgelbe Kolonie, glatte und weiche Oberfläche, semitransparent, keine Änderung der Farbe des Mediums.

6. Kartoffelagar (30°C, 5 Tage): Gutes Wachstum, milchigweiße Kolonie, glatte und weiche Oberfläche, konvexe Erhebung, keine Änderung der Farbe des Mediums.

7. Lackmusmilch: Sauer, Peptonisierung.

c) Physiologische Eigenschaften:

1. Nitratreduktion: Negativ.

2. Denitrierungsreaktion: Negativ.

3. MR-Test: Negativ.

4. VP-Test: Negativ.

5. Indolbildung: Schwache Bildung.

6. Hydrogensulfatbildung: Positiv.

7. Stärke-Hydrolyse: Positiv.

8. Zitratverwertung: Positiv (stark).

9. Verwertung anorganischer Stickstoffquellen: Nitrat-und Ammoniumsalzverwertung.

10. Pigmentbildung: Keine.

11. Urease: Positiv (schwach).

12. Oxidase: Positiv.

13. Katalase: Positiv.

14. Bereich des Wachstums: Wachstums-pH: 5 bis 9; optimaler Wachstums-pH: 7 bis 8; Wachstumstemperatur: 7 bis 40⁰C; optimale Temperatur: 24 bis 3O⁰C.

15. Aerob oder anaerob: Aerob.

16. O-F-Test: O-Typ.

17. Kohlenhydratfermentation:

Säurebildung Gasbildung L-Arabinose — —

D-Xylose — -

D-Glukose — —

D-Mannose + -

D-Fructose — — ^J5

D-Galactose — —

Maltose — -

Saccharose —

Lactose — -

Trehalose - -

D-Sorbit
Inosit

Glycerin — -

Stärke

Rhamnose - ^S5

Ribose
Cellobiose
Raffinose
Melezitose

Inulin -

Salicin
Glucitol

Nach Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, wird der taxonomische Standort des obigen Stammes B-402-2 bestimmt und gehört demnach zur Gattung Achromobacter, da er Agar nicht zersetzt, kein Pigment bildet und auf Lackmusmilch sauer reagiert. Außerdem ähnelt er Achromobacter parbulus, weil er keine Mobilität zeigt und keine Säurebildung aus Glukose. Er unterecheidet sich jedoch in den folgenden Punkten:

Stamm B-402-2 Achromobacter

parvulus *·>

Indolbildung	schwache	keine
	Bildung	Bildung
Stärkehydrolyse	positiv	negativ
Nitratreduktion	negativ	positiv

Bei dem Stamm B-402-2 kann es. sich daher um eine andersartige Spezies von Achromobacter parbulus handeln, und Achromobacter B-402-2 wird daher als neue Spezies geführt. Dieser Stamm ist im »Institut for Microbiological Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology« hinterlegt worden und trägt die Hinterlegungsbezeichnung FERM-P Nr. 1095. Dieser Stamm ist auch im US-Department of Agriculture, Agricultural Research Service, unter der Bezeichnung NRRL-B-5393 hinterlegt worden.

Eine weitere Mikroorganismenspe/ies, die für die erfindungsgemäße Herstellung von Cephalexin verwendet werden kann, ist Bencckea hiperoptica ATCC 15803.

Die beiden oben beschriebenen Mikroorganismenstämme oder deren Enzympräparate haben eine spezifische Wirkung auf Cephalexin und die Fähigkeit, nahezu quantitativ Cephalexin aus 7-ADCA und D-Phenylglycin-melhyl- oder -äthylester zu bilden.

Gemäß den angewendeten Bedingungen haben die Enzympräparate die Wirksamkeit, die Amidbindung in Cephalexin zu spalten und 7-ADCA zu bilden. Es war nicht bekannt, daß das acylierende Enzym die spezifische Aktivität in bezug auf die Acylierung der Aminogruppe in 7-ADCA hat.

Die in der Erfindung verwendete 7-ADCA wird nach Verfahren hergestellt, die dem Stand der Technik angehören [vergleiche z. B. die Herstellung aus Cephalosporin-C (vgl. US-PS 3124 576), Verfahren zur Herstellung aus 7-Aminocephalosporansäure (vgl. US-PS 31 24 576), Herstellung nach dem Verfahren aus 7-Phenoxyacetamido- oder 7-Phenylacetamido-desacetoxy-cephalosporansäureester (ve!. US-PS 32 75 626, BE-PS 6 96 026, NL-PS 68 06 532, BE-PS 7 45 845, GB-PS 12 04 394, BE-PS 7 46 860 und BE-P3 7 47 118 und 7 47 120) oder die enzymatische Deacylierung von 7-Acylamido-desacetoxycephalosporansäure (vgl. DT-OS 22 12 276)].

Um die Phenylglycy!gruppe in eine Aminogruppc in 7-ADCA einzuführen, verwendet man D-Phenylglycinmethylester oder D-Phenylglycinäthylester, das bevorzugte Derivat ist D-Phenylglycinmethylester.

Der das Aeylierungsenzym erzeugende Mikroorganismus der Erfindung kann durch aerobe Kultivierung mit einem Nährmittel, das organische oder anorganische Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Mais-Einweichbrühe, Hefeextrakt, trockene Hefe, Sojabohnenprotein-Hydrolysate, Sojabohnenextrakt, Nitrat- oder Ammoniumsalz, eine Kohlenstoffquelle, wie Melasse, Glukose oder Stärkehydrolysat, und anorganisches Salz, gewünschtenfalls auch andere geeignete wachstumsstimulierende wichtige Substanzen enthält, bei 20 bis 35 C in 12 bis 48 Stunden hergestellt werden.

Für eine industrielle Produktion wird im allgemeinen die submerse aerobe Kultivierung angewendet.

Das acylierende Enzym für die Aminogruppe in 7-ADCA kann im allgemeinen als Endn-Enzym vorliegen. Als Enzympräparate können Mikroorganismenkulturen, nach der Kultivierung isolierte native Bakterienzellen oder Suspensionen davon in einer Enzymreaktion verwendet werden. Außerdem können chemische oder physikalisch behandelte Mikroorganismenzellen im Verfahren der Erfindung angewendet werden, sofern die acylierende Enzymaktivität erhalten bleibt. Derartige vorbehandelte Mikroorganismenzellen sind z. B. aceton-, methanol- oder äthanolgetrocknete Zellen; sprühgetrocknete Zellen, zerriebene oder beschallte Zellen; durch Pufferlösung oder Cetylpyridiniumchlorid hergestellte Zell-Lysate; gereinigte Enzyme, erhalten nach bekannten Trennungs- und Reinigungsverfahren, wie z. B. Aussalzen, fraktionierte Ausfällung, Dialyse, Absorptionschromatographie, Ionen auslauschchromatographie oder Gelfiltration; zerriebene Zellen oder von Zell-Lysaten; und die festen Enzympräparatc oder unlöslich gemachtes Enzym, hergestellt durch Adsorption des Acylierungsenzyms oder der erzeugenden Mikroorganismen auf einem inerten Träger, der gegenüber den Substraten nicht aktiv ist und die Aktivität des acylierenden Enzyms nicht inaktiviert.

Gewöhnlich wird bei der erfindungsgemäßen Acylierung die freie 7-ADCA in einer Konzentration von 0,1 bis 20 mg/ml, vorzugsweise 2 bis 5 mg/ml,

verwendet. Der Phenylglycinmethyl- oder -äthylester wird im allgemeinen in einem 2- bis 20molaren Überschuß für 7-ADCA verwendet, dieses Molverhaltnis kann jedoch je nach der Konzentration von 7-ADCA in der Reaktionsmischung geändert werden; die bevorzugteste Menge ist ein 6- bis lOmolarcr Überschuß. Die Reaktionstempcraiur liegt bei 20 bis 45' C, vorzugsweise bei 30 bis 37° C. Man kann cliie stationäre, geschüttelte oder gerührte Kultur verwenden. Der pH der Reaktionsmischung wird bei pH 5,5 bis 7,5, am günstigsten bei 6,0 bis 6,5, gehalten. Die Reaktionszeit kann je nach den Reaktionsbedingungen 0,5 bis 3 Stunden betragen, und die Umsetzung kann beendet wurden, wenn die stärkste Cephalexinbildung erreicht ist.

Im Falle der Acylierung mit einem festen Enzympräparat wird zuerst das acylicrende Enzym oder der erzeugende Mikroorganismus auf dem Träger adsorbiert. Wenn es sich um Exo-Enzym handelt, kann das Acvlierungsenzym adsorbiert werden, indem man das Kulturfilirat des das Acylierungsenzym erzeugenden Stammes auf den Träger gibt. Im Falle von Endo-Enzym werden native Mikroorganismenzellen aus der Kultur des das Acylierungscnz\m erzeugenden Mikroorganismus isoliert und auf dem Träger adsorbiert, oder es werden mit Aceton oder Äthanol getrocknete Zellen auf dem Träger adsorbiert; oder eine Lösung des acylierenden Enzyms, extrahiert aus Mikroorganismenzellen, wird auf dem Trager adsorbiert.

Die in der Erfindung verwendeten Träger, die je nach der Art des Mikroorganismus oder je nach der Herstellung des Acvlierungsenzyms oder der Mikroorganismenzellen variiert werden sollten, müssen unter Benicksichtigung der Eigenschaften der das Enzym oder die Mikroorganismenzellen adsorbierenden Träger ausgewählt werden, so daß sie die Aktivität des Acvlierungsenzyms nicht inaktivieren. Dabei müssen die Träger so beschaffen sein, daß das adsorbierte Enzym oder die Mikroorganismenzellen nicht durch Waschen entfernt werden. Die Träger sollen gegenüber dem Substrat inaktiv sein und das entstehende Cephalcxinprodukt nicht adsorbieren. Beispiele für Träger, die vorteilhafterweise für die Adsorption einer wäßrigen Enzymlösung verwendet werden, sind aktives Aluminiumoxid, Diatomeenerde, saurer Ton, aktiver Ton, Kaolin, Calciumphosphat oder Hydroxyapatit. Zur Adsorption der Mikroorganismenzellen verwendet man vorteilhafterweise Carboxymethylcellulose, vernetztes Carboxymethyl-Dextran, Diäthylenaminoäthanolcellulose, Triäthylaminoälhanolcellulose oder Diatomeenerde.

Es empfiehlt sich, den pH vorher so zu regeln, daß das acylierende Enzym bei der Adsorption auf dem Träger einen stabilen pH hat. Die Adsorption kann ansatzweise oder in Kolonnen durchgeführt werden. Die Kolonnenadsorption verwendet man vorzugsweise für die kontinuierliche Enzymreaktion. Die Trägcrmenge kann je nach der Menge der Mikro Organismenzellen, dem Volumen der Kulturfiltrate, dem Enzymgchalt oder dem Adsorptionsverhältnis des Trägers schwanken. Im allgemeinen kann bei einer ansatzweise durchgeführten Adsorption die Trägcrmengc 5 bis 15 Gcwichtsteile/Volumen für Kulturfiltrat oder 5 bis 20 Voluminaüberschuß für native Zellen betragen. Bei der Adsorption auf Kolonnen wird eine Kolonne mit einem Träger gefüllt, mit Wasser oder Pufferlosung befeuchtet, wobei die gleiche Pufferlösung verwendet wird, die für die Einstellung des optimalen pH-Wertes des Enzyms verwendet wird, dann wird die Kulturbrühe oder Enzymlösung hindurchgeschickt, die Kolonne mit Wasser oder Pufferlösung nachgewaschen, so daß man ein Enzympräparat auf fester Phase erhält. Bei der Adsorption der Mikroorganismenzellen auf dem Träger wird eine Zellsuspension in Wasser oder Pufferlösung mit dem Träger vereinigt. Dabei ist der Effekt des pH-Wertes zu berücksichtigen, da die Adsorption stark von der lonenstärke beeinflußt wird.

Ein festes Enzympräparat — bestehend aus dem Träger und dem darauf adsorbierten, acylierenden Enzym bzw. Mikroorganismenzellen — kann der Gefahr einer Denaturierung oder eines Aktivitätsverlustes unterliegen; es sollte daher im feuchten Zustand gehalten werden.

7-ADCA wird mit Phenylglycinmeihyl- oder -äthylester in Anwesenheit des festphasigen Enzympräparates umgesetzt. Obwohl die Konzentration des Substrates in Abhängigkeit von der Enzymstärke oder der Ausfließrate aus der Kolonne schwanken kann, sollte sie vorzugsweise so festgelegt werden, daß eine bestimmte Menge an nicht umgesetzter 7-ADCA und Phen>!glycin im Abstrom nicht erhöht wird. Im allgemeinen beträgt die Konzentration an 7-ADCA 0,1 bis 2 Gewichts-ZVolumprozent, vorzugsweise 0,2 bis 1 Gewichts-/Volumprozent, und der Phenylglycinmethyl- oder äthylester wird in 2- bis lOmoIarem Überschuß gegenüber der 7-ADCA verwendet. Die Acylierungsreaktion sollte bei dem für die Enzymaktivität günstigsten pH und der günstigsten Temperatur durchgeführt werden. Die Reaktionszeit kann im Falle der Umsetzung in einer Kolonne durch Änderung des Substrat-Abflußvolumens geregelt werden. Üblicherweise wird die Umsetzung beim Durchgang durch eine mit einem festphasigen Enzympräparat gefüllte Kolonne durchgeführt, wobei ein kontinuierlicher Betrieb leicht durch kontinuierliche Zugabe der Substrate erreicht werden kann. Wenn jedoch die Substrate im Abstrom gefunden werden, ist zweckmäßig die Abfließrate zu verringern oder der Abstrom in die Kolonne zurückzuführen. Sobald die Enzymaktivität abnimmt oder verlorengeht, sollte natürlich die Operation beendet werden. Das so hergestellte Cephalexin wird nach bekannten Isolierungsverfahren abgetrennt. Beispielsweise wird die Reaktionsmischung durch ein Anionenaustauscherharz oder durch Aktivkohle geschickt, und danach wird mit einer wäßrig-sauren Lösung oder einem organischen Lösungsmittel-Wasser-Gemisch eluiert. Das Eluat, das das Cephalexin enthält, wird eingeengt und isoelektrisch ausgefällt. Oder die Reaktionsmischung wird durch Zugabe von Trifluoressigsäure auf einen pH-Wert von 1 eingestellt und danach mit organischem Lösungsmittel, wie Methylisobutylketon, extrahiert, wodurch nach Auflösen in saurem Wasser isoelektrisch ausgefällt wird. Außerdem wird die Reaktionsmischung mit einem Anionenaustauscherharz in Anwesenheit eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels behandelt, und die erhaltene wäßrige Schicht wird konzentriert oder der Gefriertrocknung unterworfen, um das Cephalexin als freie Säure zu isolieren.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die Prüfung auf Cephalexin wird hierbei folgendermaßen durchgeführt:

Eine TcsllÖSUIlP. Hie Ppnhnlpvin nnihyit η,;·-Λ

mikrobiologisch nach der Papierscheibenmethode oder nach der Schalcnmctliodc mit Bacillus subtilis PCI-219 16 Stunden lang bei 37° C geprüft. Die sich ergebende Inhibicrungszonc wird gemessen, daraus läßt sich die Cephalcxinstärkc mit Hilfe dcrSlandard-Ccphalexinkurvc berechnen.

Beispiel 1

100 ml wäßriges Medium (pH 7,0), das 3%> Glukose, l°/o Hefeextrakt, 0,1 »/„ K₀HPO₄, 0,05% MgSO₄-7H₂O, 0,05% KCl und Ο,ΟΟΊ % FeSO₄ enthält, werden bei 120⁰C 20 Minuten lang sterilisiert.

Man impft mit Achromobacter B-402-2, NRRL B-5393 an und schüttelt die Kultur bei 26° C 72 Stunden lang. Das Kulturmedium wird auf pH 6,5 eingestellt, dann gibt man 100 ml 0,1 m Phosphatpufier (pH 6,5), der 2 mg/ml 7-ADCA und 20 mg/ml D-Phenylglycinmethyleslcrhydrochlorid enthält, hinzu, danach wird 3 Stunden lang bei 37° C enzymatisch umgesetzt. Man findet lOO°/o Cephalexin im Fillrat der Reaktionsmischung. Das Filtrat wird auf eine Kiesclgel-Dünnschicht-Chromatographieplatte aufgctüpfelt, die fluoreszierendes Material enthält und mit Hilfe eines Lösungsmittelsystems aus n-Butanol: F.ssigsäure : Wasser (3:1:1) entwickelt. Die Untersuchung mit Hilfe von UV-Licht von 2536 A 7eigt einen purpurroten Fleck in der Nähe von Rf - 0.50, der auch mit dem biologisch geprüften Muster einer authentischen Probe identisch ist.

Beispiel 2

Man wiederholt Beispiel 1 mit der Ausnahme, daß Bcncckca hiperoptica ATCC 15803 an Stelle von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 verwendet wird. Cephalexin gebildet: 100%.

Beispiel 3

1,3 1 eines Mediums (pH 7,0), das aus 3% Glukose. 1% Hefeextrakt, 0,1 % K_nHPO,,, 0,05%> MpSO₄- 7 H„O, 0,05 °/o KCl und 0,001% FeSO₄ bes'cht, werden bei 120⁰C 20 Minuten lang sterilisiert, aseptisch in jeweils 100-ml-Portionen unterteilt und in 500-ml-Kolben gegeben, mit einem Stamm von Achromobacter B-402-2 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung gezüchtet.

1 I Kulturbriihe wird zentrifugiert, und die so erhaltenen feuchten nativen Zellen werden zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in 1,2 1 einer 0,1 -m-Phosphatpufferlösung (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 400 ml wäßrige Lösung, die 5 mg/ml 7-ADCA und 50 mg/ml D-Phenylglydnmethylesterhydrochlorid enthält, und stellt die Mischung bei 37° C 2 Stunden lang in den Brutschrank. Man stellt fest, daß in der Reaktionsmischung 98,8«/o Cephalexin gebildet worden sind.

Beispiel 4

Man wiederholt Beispiel 3, mit der Ausnahme, daß Beneckea hiperoptica ATCC 15803 an Stelle von Achromobacter B 402-2 NRRL B-5393 verwendet wird.

Cephalexin gebildet: 99«/o.

65 Beispiel 5

Ein wäßriges Medium (pH 7,0), das 3Vo Glukose, 1·/· Hefeextrakt, 0,1 % K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7H₂O, 0,05 KCl und 0,001 % FeSO₄ enthält, wird mit einem Stamm Beneckea hiperoptica ATCC 15803 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung kultiviert. 1 1 der Kulturbriihe wird zentrifugiert, und die isolierten nativen feuchten Zellen werden zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, danach zentrifugiert und in 1 I destilliertem Wasser suspendiert. Man gibt 8 I Aceton hinzu und erhält dabei durch Aceton gepulverte Zellen. 165 mg des Acetonpulvers werden in 5 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers (pH 6,5) suspendiert, dazu gibt man eine wäßrige Lösung von 2 ml 7-ADCA (5 mg/ml) und 2 ml D-Phenylglycin-methylestcr-hydroch'iorid (50 rng/m!) und 0,1 m Phosphatpuffcrlösung (pH 6,5), so daß sich eine Reaktionsmischung von 100 ml ergibt; diese Reaktionsmischung wird bei 37° C 90 Minuten lang in den Brutschrank gestellt. Das in der erhaltenen Reaktionsmischung gebildete Cephalexin wird quantitativ bestimmt, man findet 90,5%.

Beispiel 6

500 mg mit Aceton gepulverte Zellen von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393, erhalten nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren, werden in 100 ml einer 0,1m PhosphatpufTerlösung (pH 6,5) suspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 50 ml wäßrige 7-ADCA-Lösung (4 mg/ml) und 50 ml wäßrige D-Phenylglycinmethylesler-Lösung (20 mg/ml). Nach 2stündigem Bebrüten bei 37° C wird die Reaktionsmischung zentrifugiert, und man erhält einen Überstand, der 1260 y/ml Cephalexin enthält, Acylierungsausbcute 80,3 %.

Der Überstand wird auf eine Kolonne (2 · 20 cm) eines Polystyrol-Anionenaustauscherharzes in der Acetatform gegeben. 400 ml der durchgelaufenen Lösung werden nach dem Waschen mit Wasser auf pH 8,0 eingestellt und erneut in eine Kolonne (2-15 cm) mit einem Polystyrol-Anionenaustauscherharz in der Acetatform gegeben. Anschließend wird mit 0,05 m Essigsäure eluiert, wobei jede Fraktion (etwa 15 ml) dünnschichtchromatographisch geprüft wird. Die cephalexinhaltigen Fraktionen werden aufgefangen, und man erhält 490 mg Cephalexinpulver aus der Gefriertrocknung. Die UV-spektroskopische Untersuchung zeigt, daß das Pulver 60%ige Reinheit besitzt. Dieses getrocknete Pulver wird durch isoelektrische Ausfällung gereinigt, und man erhält 294 mg weißes Pulver (Ausbeute ^90 %, Reinheit 98%, Gesamtausbeute 88 %).

Beispiel 7

A. 201 wäßriges Medium (pH 7,0), das 3% Glukose, 1% Hefeextrakt, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H.O, 0,05% KCl und 0,001 »/0 FeSO₄ enthält, gibt man m ein 30-1-Fermentationsgefäß, sterilisiert 20 Minuten lang bei 120° C und gibt dazu aseptisch 400 ml Saaskultur, die zuvor im gleichen Medium gezüchtet worden ist, von Achromobacter B-402-2 NRRLB-5393 and kultiviert unter aeroben Bedingungen bei einer Belüftung von 20 l/min, einei Rührung von 300 UpM 72 Stunden lang bei 26° C. Nach der Fermentation werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren isoliert, zweimal mit physiologischer Salzlösung gewaschen, wobei man 170 g feuchte native Zellen erhalt

B. 3 g der oben in A erhaltenen nativen Zellen werden in 100 ml einer 0,1 m AcetatpuSerlösung

609641/197

(pH 6,0) suspendiert. Dieser Suspension gibt man unter Rühren zu 180 g Diälhylaminoäthanolcellulosc in 1,5 I einer 0,1 in AcetalpufTcrlösung bei 0° C. Nach 6stiindigcm Stehen gewinnt man das enzympräparat auf fester Phase.

Das Enzympräparat wird in eine Kolonne (3,5 · 47,5 cm) gefüllt, danach mit 0,1m Acclatpuffcrlüsung (pH 6,0) gewaschen, dann werden 121 einer 0,16 m AcetatpulTcrlösung (pH 6,0), die 0,1V» 7-ADCA und 0,5¹¹Ai D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, innerhalb 24 Stunden hindurch geschickt.

Die so erhaltenen 12 I Eluat schickt man durch eine Kolonne mit 120 g Aktivkohle (7,2· 13 cm), um das Cephalexin zu adsorbieren, dann wäscht man mit Wasser und cluiert mit einem Lösungsmitlclgcmisch aus Aceton/0,5 n-Essigsäure (1:1).

1 1 der cephalexinhaltigen aktiven Fraktionen wird im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit einer Mischung aus Wasser und Acetonitril umkristallisiert, um das Cephalexin abzutrennen, das mit warmem Wasser gewaschen und dann getrocknet wird, wobei man 12,3 g Kristalle erhält; Ausbeute: 60¹Vo.

Das Produkt zeigt einen einzigen Fleck bei einer dünnschichtchromatographischen Prüfung auf Kieselgel. Das NMR-Spektrum zeigt die Identität der beiden Verbindungen. Reinheit: 90% auf Grund der Bioautographie und UV-Absorption.

Beispiel 8

40 g native Zellen, erhalten im Verfahren des Beispiels 7 A, werden in 30 ml destilliertem Wasser suspendiert und zu 1 I Aceton gegeben, wobei man durch Filtration 10 g acetongelrockneter Zellen erhält.

160 mg der getrockneten Zellen von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 suspendiert man in 4 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) und gibt sie unter Rühren zu 10 g Diäthylaminoäthanolcellulose in 20 ml einer 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0). Nach östündigem Stehen wird der Träger, der die Mikroorganismenzellen adsorbiert hat (= das Enzympräparat auf fester Phase), in eine Kolonne (1-26 cm), gefüllt und mit 0,1 m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gewaschen. Dann schickt man 100 ml einer 0,1m Acetatpufferlösung (pH 6,0), die 0,1 °/o 7-ADCA und 0,5% D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid enthält, innerhalb 5 Stunden hindurch. Die Acylierung, geprüft als Cephalexin im Eluat, beträgt 85%.

Beispiel 9

Man wiederholt Beispiel 8, mit der Ausnahme, daß die folgenden Träger an Stelle von Diäthylaminoäthanolcellulose für die Herstellung von Cephalexin verwendet werden.

Beispiel 10

Zu einer Suspension von 4 g getrockneter Zellen von Achromobactcr B-402-2, erhalten in Beispiel 8, in 500 ml einer 0,1m Acetatpufferlösung (pH 6,0) gibt man 50 mg Lysozym, inkubiert 60 Stunden lang bei 37° C und gibt 2 mg Desoxyribonuclease hinzu

und inkubiert weitere 10 Minuten lang,
ίο Die Reaktionsmischung wird zentrifugiert, man gibt 10 g Hydroxyapatit zu 200 ml des Überstandes und läßt danach I Stunde lang stehen.

Das Enzympräparat auf fester Phase wird in eine

Kolonne gefüllt, und die Enzymreaktion wird wie in Beispiel 8 durchgeführt, wobei man 90% Cephalexinbildung findet.

Beispiel 11

100 ml wäßriges Medium, das 3% Glukose, 1% Hefeextrakt, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄-7 H„O, 0,05% KCl und 0,001 % FeSO₄ enthält, wird 20 Minuten lang bei 120° C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wird das Medium mit Bcneckea hiperoptica

ATCC 15803 angeimpft und bei 26° C 72 Stunden lang unter Hin- und Herbewegung kultiviert. Die Kulturbrühe wird auf pH 6,5 eingestellt, die Baktcrienzellcn werden nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 8 isoliert, wobei man 200 mg trockene

Zellen erhält. Dann werden die in Beispiel 8 verwendeten getrockneten Zellen von Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 durch 200 mg der oben erhaltenen getrockneten Mikroorganismenzellen ersetzt, um mit ihnen das Cephalexin herzustellen.
Gebildetes Cephalexin: 80%.

Träger

GebOdctcs Cephalexin (·/)

Beispiel 12

Carboxymethylcellulose
"riäthylaminoäthanolcellulose

40 80

6001 eines Mediums (pH 7,0), das 4% Glukose, 1,2% Hefeextrakt, 0,15% K₂HPO,, 0,05% MgSO₄-7 H₂O, 0,05% KCl und 0,001% FeSO₄ enthält, werden mit 301 Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 Saatkultur angeimpft und submers

kultiviert, wobei man 72 Stunden lang bei 26° C belüftet. Nach der Fermentierung werden die Baktcrienzellen durch Abzentrifugieren aus 5701 Brühe isoliert. Die nativen, feuchten Zellen, die 970 g trockenen Zellen entsprechen, werden in 27 1 einer

0,1m Acetatpufferlösung (pH 6,5) suspendiert. Dann gibt man 1,18 kg 7-ADCA (Reinheit 84,8%) und 30 kg D-Phenylglycinmethylester-hydrochlorid hinzu und gibt schließlich 0,1 m Acetatpuffer (pH 6,5) hinzu, bis das Volumen der Reaktionsmischung 2001

beträgt Die Reaktiorsmischung wird bei 37° C 3 Stunden lang unter Rühren bebrütet. In der Reaktionsmischung werden 1,28 kg Cephalexin auf Grund des UV-Absorptionsspektrums ermittelt (Acylierung 80%). Die Lösung wird zentrifugiert und filtriert. Zur

klaren Lösung gibt man 4 kg Aktivkohle, und nach der Filtration wird die wäßrige Schicht im Vakuum eingeengt, wobei man 1,03 kg Cephalexin erhält (Ausbeute: 64%, Reinheit: 98%).

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 7-(D-,\-Aminophenylaceiamidoj-desacetoxy-cephalosporansäure, dadurch gekennzeichnet, daß 7-Aminodesacetoxy-cephalosporansäure mit D-Phenylglycin-rnethyl- oder -äthylester in einem wäßrigen Medium in Anwesenheit eines acylierenden Enzyms, das von einem Mikroorganismus des Stammes Achromobacter B-402-2 NRRL B-5393 oder Beneckea hyperoptica ATCC 15803 stammt, bei 20 bis 45° C und einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 umgesetzt wird.

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