DE2855827A1

DE2855827A1 - Verfahren zur gewinnung von human- chorion somatomammotropin

Info

Publication number: DE2855827A1
Application number: DE19782855827
Authority: DE
Inventors: Paolo Neri; Berislay Pende
Original assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Current assignee: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano Sclavo SpA
Priority date: 1977-12-27
Filing date: 1978-12-22
Publication date: 1979-06-28
Also published as: CA1113859A; IT1114943B; JPS6157290B2; JPS5498309A; GB2010849B; FR2413363B1; NL7812567A; GB2010849A; ES476706A1; US4219467A; BE873094A; DE2855827C2; FR2413363A1; AR231990A1

Description

PATENTANWÄLTE

WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOETZ

professional representatives before the european patent office agrees pres l'office europeen des brevets

DP..-ING. FRANZ VUESTHOFF D.;. PHIL. FREDA 'WUESTHOFF (1927-1956) DIPL.-ING. GERHARD PULS (1952-I971) DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMANN DR.-ING. DIETER BEHRENS DIPL.-ING.; DIPL.-VIRTSCH.-ING. RUPERT GOETZ

D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2 telefon: (089) 66 20 ji

TELEGRAMM: PROTECTPATENT

telex: J24070

Patentanmeldun

Anmelder: Istituto Sieroterapico e Vaccinogeno Toscano

»Sclavo» S.p.A.

Via Fiorentina 1 - Siena, Italien

Titel:

Verfahren zur Gewinnung von Human-Chorion Somatomammotropin

909826/0 9 88

DR.-ING. FRANZ IFUESTHOPF

PATENTANWÄLTE _Dp_ _{pHIL pREDA WESTHOFF} _{9?9$

WUESTHOFF - ν. PECHMANN - BEHRENS - GOETZ _UKfD1), gerhard puls (i₉j₂-i₉₇i)

dipl.-chem. dr. e. freiherr von pechmann professional representatives before the european patent office dr.-ing. dieter behrens

agrees pres l'office europeen des brevets dipl.-ing.; dipi.-virtsch.-ing. rupert goetz

2855827 d-soooMünchen90

SCHWEIGERSTRASSE 2

telefon: (089) 66ίο ji telegramm: protectpatent telex: j 24 070

Anm.: Ist. Sieroterapico Unser Zeichen: 1A-51

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung bzw. Gewinnung von Human-Chorion-Somatomammotropin (das im folgenden als HCS bezeichnet wird), ausgehend von Placentaauszügen oder daraus gewonnenen Protein-Fraktionen.

HCS ist ein hormonelles Protein, das in der menschlichen Placenta enthalten ist, und das therapeutisch angewandt werden kann, wenn ein Abort zu befürchten ist, oder in anderen pathologischen Situationen in der Schwangerschaft.

Es konnte gesichert werden, daß HCS ausschließlich durch die Placenta synthetisiert wird: es besitzt verschiedene biologische Aktivitäten und es wird angenommen, daß es einen wesentlichen Einfluß auf die Regelung des Anabolismus' während der Schwangerschaft besitzt.

Die bisher bekannten Verfahren zur Extraction von HCS ermöglichen keine Herstellung bzw. Gewinnung von Produkte mit einer ausreichenden Reinheit, mit deren Hilfe es möglich ist, chemische Untersuchungen im großen Maßstab durchzuführen, um

909826/0988

eine praktische Anwendung eines derartigen Hormons zu erreichen. Derartige Verfahren beruhen hauptsächlich auf einer ersten Extraktion mit Salzlösungen und anschließende Ausfällung mit kaltem Äthanol. Der Niederschlag wird erneut gelöst und mit Ionenaustauschern und durch Gelfiltration fraktioniert. Unter anderem ist das Friesen-Verfahren zu erwähnen (Friesen, H.G.,Nature, 208 (1965) S. 1214), das nach dem oben zusammengefaßten Verfahren eine Ausbeute von 7 % ergibt, bezogen auf die Menge an HCS, die in dem Ausgangsmaterial enthalten ist (die Anfangskonzentration an HCS liegt in der Größenordnung von 0,01 bis 0,05 Gew.-%, bezogen auf das Gewicht der ausgestoßenen Plazenta).

Es hat sich nun gezeigt, daß es möglich ist, HCS bis zu einer Ausbeute von 50 % und darüber mit einer Reinheit von mehr als 90 % zu gewinnen, indem man aus einem Plazenta-Auszug oder einer Protein-Fraktion davon eine Phase abtrennt, die HCS enthält und diese Phase nacheinander abwechselnden Behandlungen zur Anreicherung,Ultrafiltration und Chromatographie unterwirft. Die Anwendung der Ultrafiltration ermöglicht es unter anderem, eine wiederholte Ausfällung zu vermeiden und die zu behandelnden Volumina zu verringern. Die Ausschaltung (oder zumindest außerordentliche Verringerung) der Ausfällstufen führt dazu, daß die biologisch wirksamen Moleküle des HCS ständig in wässriger Lösung gehalten werden,- ohne daß die Gefahr der Denaturierung oder Modifizierung der biologischen Eigenschaften besteht. Im Gegensatz dazu besteht diese Gefahr ständig bei den bekannten Verfahren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist anwendbar auf verschiedene Ausgangssubstanzen wie Plazenta-Extrakte, rohe immunologische Fraktionen oder Fraktionen,die während der Reinigung von Immunoglobulinen abgetrennt worden sind.

909826/0988

Wie oben angegeben, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Stufen: zunächst Abtrennung einer an HCS reichen Phase von dem Placentaextrakt oder einer Protein-Fraktion davon und anschließend aufeinander folgende abwechselnde Behandlungen zur Anreicherung Ultrafiltration und Chromatographie.

Die Anreicherung wird vorzugsweise durch Ionenaustausch durchgeführt. Eine entsprechende Auswahl der Ionenaustauscher erlaubt eine sehr genaue Auswahl der Komponenten der Polypeptid-Fraktion, die eine ähnliche elektrostatische Oberflächenladung besitasn. Eine genaue Überwachung der Chromatographie (Gel-Chromatographie) ermöglicht es, eine sehr reine Fraktion mit einer begrenzten Variation des Molekulargewichts der Polypeptide zu isolieren. Die Ultrafiltration erfolgt schließlich durch Membranen mit einer Durchlaßgrenze (pass-threshold) für Moleküle mit einem Molgewicht von 10000.

Die Reihenfolge, die Anzahl der abwechselnd durchgeführten Stufen, sowie die Auswahl der günstigsten Mittel, um die erwünschten Ergebnisse zu erzielen, liegen im Rahmen des fachmännischen Könnens, so daß der Fachmann, wenn er das Prinzip der Erfindung verstanden hat, optimale Modifikationen durchführen kann, ohne von der Erfindung abzuweichen.

Im folgenden wird eine spezielle Reihenfolge der verschiedenen oben erwähnten Stufen beschrieben. In diesem Zusammenhang wird auf das beiliegende Fließschema verwiesen, das eine beispielhafte Arbeitsweise angibt..

Das Ausgangsmaterial (ein Plazentaextrakt oder eine Proteinfraktion) werden in 0,1 m Puffer mit einem pH-Wert von 8 bis 9 gelöst, wobei man eine Lösung erhält, in der das HCS weniger als 1 % der Proteine ausmacht. Anschließend werden unlösliche Teilchen durch Zentrifugieren (De Laval Separator) ent-

909826/0988

fernt und die schillernden Kolloidenaggregate mit einer Kugelzentrifuge entfernt. Die klare überstehende Flüssigkeit, die nahezu farblos ist, kann leicht durch einfaches Abfiltrieren abgetrennt werden. Das Filtrat wird einer Ultrafiltration unterworfen und die geklärte und konzentrierte Lösung wird mit einem Ionenaustauscher zusammengebracht, um Verunreinigungen mit einem ähnlichen Molekulargewicht, aber einer unterschiedlichen elektrischen Ladung zu entfernen.

Es wird eine weitere Ultrafiltration durchgeführt, und anschließend eine nochmalige Behandlung mit Ionenaustauscher und einige nochmalige Ultrafiltration.

In dieser Stufe beginnt man mit dem Chromatographieverfahren: eine Fraktion, enthaltend hochgereinigtes HCS, wird gefriergetrocknet. Eine erste Fraktion wird '.verworfen, während eine zweite Fraktion (enthaltend unreines HCS) der Ultrafiltration unterworfen und erneut chromatographiert wird. Diese Stufen werden wiederholt und insgesamt erhält man nach dem Gefriertrocknen (Lyophilisieren) HCS mit einer Reinheit von mehr als '90 % in einer Menge die mehr als 50 % der Ausgangsmenge beträgt.

Im einzelnen wird das Verfahren entsprechend der beiliegenden Zeichnung folgendermaßen durchgeführt: das Ausgangsmaterial (100 kg) wird durch 1 nach 2 geleitet, wo über 3 eine Pufferlösung (0,1 m. pH 8,3) zugeführt wird. Die trübe Lösung (HCS macht weniger als 1 % der Proteine aus) wird über 4 nach 5 geleitet, wo es mit Hilfe eines De Laval Seperators mit einer Geschwindigkeit von 250 l/h geklärt wird. Man erhält ungefähr 450 1 einer nicht filtrierbaren schillernden Lösung. Diese wird in 7 weitergeklärt, um die kolloidalen schillernden Aggregate mit Hilfe einer KugeLzentrifuge (Sharpies) zu entfernen. Die klare überstehende Flüssigkeit, die nahezu farblos ist,

_ 5 90 9 826/0988

wird filtriert und über 8 nach 9 geleitet, wo sie weiter durch Filtration durch eine Filterpresse (20 χ 20 cm) mit Hilfe von Seitz K/7 Filtern filtriert wird. Es werden 100 Filter zur Filtration von 420 1 benötigt. Das Filtrat wird durch 11 nach 10 geleitet, wo es mit Hilfe eines DDS-Moduls mit einer Oberfläche von 1,7 m bei 15 bar und einer Temperatur von 7 bis 10⁰C ultrafiltriert wird. Man erhält 35 l/h eines Filtrats, das über 12 verworfen wird. Das Endvolumen beträgt 80 1. Die Lösung wird, nachdem sie geklärt und eingeengt ist, über 13 nach 14 geleitet, wo sie mit einem Ionenaustauscher (DEAE-Cellulose, Whatman DE-23) zusammengebracht wird, um Verunreinigungen zu entfernen, die ein ähnliches Molgewicht, aber eine andere elektrische Ladung besitzen. Die Elution wird\mit 0,5 m Puffer, pH 8,3 (der über 15 zugeleitet wird) durchgeführt. Das 0,1 m Eluat und die Waschflüssigkeiten werden (über 16) verworfen, während die 0,5 m Fraktion von 80 1 eingeengt wird. Die Ultrafiltration wird (in 18) mit UF-Millipore-Kassetten durchgeführt unter Verwendung einer Menbran mit einer Rückhaltegrenze von 10000 Dalton, um die Berührung mit dem Ionenaustauscher auf einer Säule von 10 χ 100 cm (17) zu wiederholen. Das zurückgehaltene Produkt beträgt 4 1.

Über die Leitung 20 wird ein Puffer (pH 8,3, 0,1m) zugegeben. Über die Leitung 21 wird das Ultrafiltrat ausgetragen. Der Ionenaustauscher, den. das Filtrat über 22 erreicht, besteht aus DEAE-Sephadex A-25, wo eine Reinigung wiederholt wird und gleichzeitig eine Molekularfiltration durchgeführt wird. Durch 23 wird der übliche Puffer (0,5 m, pH 8,3) zugeführt und über 24 das zu verwerfende Eluat (o,1 m) ausgetragen. Aufgrund des verringerten Volumens ist es möglich, eine 0,5 m Fraktion in einer Menge von 16 1 zu gewinnen. Diese Fraktion wird über die Leitung 25 zu einer weiteren Ultrafiltrationstufe bei 26 über UF Millipore Kassetten geleitet (über 27 wird der 0,1 m Puffer, pH 8,3 zugeführt und über 28 wird das Ultrafiltrat verworfen), Das Endvolumen beträgtpun 1 1.

909 8 28/0988

Ein so verringertes Volumen erlaubt es, daß man die gesamte Probe auf eine Ciiromatopraphiesäule (30, über 29) aufgibt. Über 31 wird wieder ein 0,2 bis 0,5 m Puffer, pH 8 bis 9 zugegeben. HCS wird durch radiale Immunodiffusion gemessen und das chromatographische Profil wird in drei Fraktionen aufgetrennt. Die erste Fraktion, die kein HCS enthält, wird über 32 verworfen. Die zweite Fraktion, die HCS mit einer Reinheit von 50 % enthält, wird über 33 in eine Ultrazentrifuge (34) zurückgeleitet. Die dritte Fraktion enthält HCS mit einer Reinheit über 90 % und wird über 35 in die Gefriertrockenvorrichtung 36 geleitet.

Die zurückgeleitete Fraktion wird nach der Ultrafiltration bei 38 (wohin sie über 37 gelangt), chromatographiert und ergibt zwei Hauptfraktionen: die erste enthält Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht und wird über 39 verworfen und die zweite enthält HCS mit einer Reinheit von mehr als 90° und wird über 40 in die Gefriertrockenvorrichtung 36 geleitet, wo sie mit der dritten Fraktion aus der ersten Chromatographie zusammen kommt. Die beiden Anteile werden zusammen gefriergetrocknet. Es ist günstig, die zusammengegebenen Fraktionen vor denrLyophilisieren durch Ultrafiltration einzuengen.

Das nach dem Gefriertrocknen erhaltene HCS, das in Form eines cremefarbenen Pulvers vorliegt, wird in 42 getrocknet und besitzt eine Reinheit von über 90 %.

Beispiel

100 kg einer B1+1 Fraktion nach dem Merieux Verfahren, die durch Lösen in Äthanol und ieder usfällen, ausgehend von Placentaextrakt gewonnen worden sind, und von denen die Albumine ( Eiweiße) und der Hauptanteil der Hämoglobine, Lipoproteine und Immunoglobuline entfernt worden ist. init einem Proteingehalt von ungefähr 30 % wurden innerhalb von 3 Stunden in 700 1 einer 0,1 m

909826/0388 - 7 -

Lösung von NH^HCO^, pH 8,2 gelöst. Die Lösung wurde zur Entfernung unlöslicher Anteile mit Hilfe eines De Laval Separators geklärt. Da die Lösung noch trüb bzw. schillernd war, wurde sie mit 16000 g zentrifugiert, mit Hilfe einer kleinen Kugelzentrifuge bei einer Temperatur die nicht über 4 C hinaus ging. Die entstehende Lösung wurde durch eine Membran mit einer Trenngrenze von 10000 Dalton zentrifugiert, bis sie eine entsprechende Proteinkonzentration (4%) erreicht hatte.

Ungefähr 40 g/l, feuchte DEAE-Cellulose, die vorher aktiviert worden war, wurden zu der HCS-Lösung gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt und ungefähr 200 1 eines 0,1 m Eluats verworfen. Es wurden 80 1 eines 0,5 m Puffers, pH 8,2 zu dem Ionenaustauscherharz gegeben und das Ganze 2 Stunden gerührt. So wurde ein 0,5 m Eluat gesammelt, dessen Volumen auf 20 1 verringert wurde, mit einem 0,1 m Puffer gewaschen und das Verfahren wiederholt, wobei 20 1 auf einen Ionenaustauscher DEAE-Sephadex A-25 gegeben wurden. 80 1 eines 0,5 m Eluats wurden erneut auf ein Volumen von 2 1 ultrafiltriert und mit Sephadex G-75 chromatographiert. Die erste Fraktion wurde verworfen und 16 1 der HCS-Lösung gewonnen, auf 150 ml ultrafiltriert und erneut/Gel-chromatographie unterworfen. 8 1 einer gereinigten HCS-Lösung wurden auf ein Volumen von 500 ml filtriert und gefriergetrocknet. Die Ausbeute an HCS betrug 50 % und die Reinheit 92 %.

909326/0988

Claims

DR.-ING. FRANZ TUESTHOFF PATENTANWÄLTE Dr< pHIL. pREDA WESTHOFP ( ^^ WUESTHOFF-v. PEGHMANN-BEHRENS-GOETZ d,pl,ing.GErhard puls (1952-1971) DIPL.-CHEM. DR. E. FREIHERR VON PECHMAIs PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEFORE THE EUROPEAN PATENT OFPICE DR.-ING. DIETER BEHRENS MANDATAIRES AGREED PRES l'OFFICE EUROPEEN DES BREVETS DIPL1-ING^DIPL1-VIRTSCH1-ING1RUPERTgO D-8000 MÜNCHEN 90 SCHWEIGERSTRASSE 2 Telefon: (089) 66 20 51 telegramm: protectpatent Telex: 524070 Anm.: Ist. Sieraterapic Unser Zeichen: 1A-51 Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Humaa-Chcrion Somatomammotropin (HCS) mit hoher Reinheit aus Placentaextrakten, dadurch gekennzeichnet , daß man von einem Placentaextrakt oder einer Proteinfraktion davon eine Phase abtrennt, die HCS enthält und diese Phase nacheinander abwechselnden Behandlungen zur Anreicherung Ultrafiltration und Chromatographie unterwirft .

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzei chn e t , daß man in der ersten Stufe die Proteinphase abtrennt durch Behandlung des Auszuges oder der davon erhaltenen Fraktion

einem
mit/Fällmittel.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzei chn e t , daß man als Fällmittel Ammoniumsulfat, Natriumsulfat oder Polyäthylenglykol verwendet.

4. Verfahren.nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anreicherung an HCS durch Ionenaustausch vornimmt.

909826/0988 - 2 -

5. Verfahren nach Anspruch 1 "bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß man die Ultrafiltration mit Hilfe von Membranen durchführt, die Moleküle mit einem Molgewicht von 10000 und darüber zurückhalten.

909826/0988