DE102012108720A1

DE102012108720A1 - Chloridbestimmung

Info

Publication number: DE102012108720A1
Application number: DE102012108720.2A
Authority: DE
Inventors: Erwin Metzmann; Pia Schu
Original assignee: Diasys Diagnostic Systems GmbH
Current assignee: Diasys Diagnostic Systems GmbH
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2014-03-20
Also published as: WO2014040821A1

Abstract

Verfahren zum Bestimmen der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, umfassend die folgenden Schritte: (a) Versetzen der Probe mit einem ersten Reagenz (Reagenz 1), welches wenigstens Eisen(III)-Perchlorat, Methansulfonsäure und Detergens, ausgewählt unter nicht-ionischem Detergens, ionischem Detergens oder einem Gemisch davon, in Wasser oder wässrigorganischem Lösungsmittel enthält und bei 25°C einen pH-Wert < 1,5 aufweist, (b) Messen der Absorption des Reaktionsgemisches bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern, (c) Versetzen des Reaktionsgemisches mit einem zweiten Reagenz (Reagenz 2), welches wenigstens ein wasserlösliches Fluorid in Wasser oder wässrig-organischem Lösungsmittel enthält, (d) Messen der Absorption des Reaktionsgemisches bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern.

Description

Gegenstand der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, insbesondere einer Körperflüssigkeit, sowie eine Zusammenstellung von Reagenzien oder einen diagnostischen Kit mit den Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens.
Hintergrund der Erfindung
Chlorid ist das im menschlichen und tierischen Körper am häufigsten vorkommende extrazelluläre Anion und ein wesentlicher Faktor für eine Vielzahl physiologischer Vorgänge. Es spielt beispielsweise eine wesentliche Rolle bei der Hydration, der Steuerung des osmotischen Drucks und des Ionengleichgewicht an zellulären Membranen.
Der Normwert der Serumchlorid-Konzentration liegt beim erwachsenen Menschen im Bereich von 96 bis 110 mmol/l und bei Säuglingen und Kindern im Bereich von 95 bis 112 mmol/l. Erniedrigte Serumchlorid-Konzentrationen können metabolische Azidose oder chronische Phyelonephritis zur Folge haben. Erhöhte Serumchlorid-Konzentrationen werden bei der Hydration und anderen Bedingungen, die den renalen Blutfluss herabsetzen, wie kongestivem Herzversagen, beobachtet. Für die klinische Diagnostik ist es daher wichtig, über ein genaues und einfaches Verfahren zur Bestimmung der Chlorid-Konzentration in Körperflüssigkeiten zu verfügen, das möglichst auch wirtschaftliche Reihenuntersuchungen erlaubt.
Zur Bestimmung der Chlorid-Konzentration in Körperflüssigkeiten sind verschiedene Verfahren bekannt. Derzeit werden in großem Umfang ionenselektive Elektroden für die Chloridbestimmung eingesetzt. Diese sind allerdings verhältnismäßig teuer und sehr pflegeintensiv. Moderne Analyseautomaten, welche photometrische Messungen zur Bestimmung verschiedener Analyten einsetzen, werden sowohl für Großlabors als auch für kleine und mittlere Labors zunehmend günstiger, weshalb ein Bedarf nach genauen und preiswerten Analyseverfahren besteht, die sich in solchen Automaten in großem Umfang einsetzen lassen.
Bekannte automatisierbare Methoden zur Bestimmung der Chloridkonzentration beruhen auf der bekannten Quecksilber-Thiocyanat-Reaktion. Das Verfahren hat jedoch sowohl messtechnische Nachteile, da es in dem üblichen Bereich der Serumchlorid-Konzentrationen nicht strikt linear ist und andere Halogene störende Interferenzen verursachen, als auch umwelttechnische Nachteile aufgrund der Entstehung giftiger Quecksilbersalze, die ein Entsorgungsproblem darstellen. Reagenzien auf Quecksilberbasis sind zwar noch erhältlich, ihre Verwendung soll aber aus den vorgenannten Gründen eingeschränkt werden.
Bereits früh wurde an der Entwicklung von Verfahren zur Bestimmung der Chlorid-Konzentration mit quecksilberfreien Reagenzien gearbeitet. Dabei wurden Methoden entwickelt, die auf der Bildung eines spektroskopisch nachweisbaren Komplexes von Chlor und Eisen(III) aus Eisenperchlorat in saurer Umgebung beruht.
Die EP-A 0 355 655 beschreibt ein Verfahren zum Messen der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, bei dem man die Probe mit einem ersten Reagenz versetzt, welches Methansulfonsäure und ionisches Netzmittel enthält, die Absorption des Reaktionsgemisches bei 320–380 Nanometern misst, anschließend das Reaktionsgemisch mit einem zweiten Reagenz versetzt, welches Eisen(III)-Perchlorat, Methansulfonsäure und ein ionisches Netzmittel enthält, erneut die Absorption des Reaktionsgemisches bei 320–380 Nanometern misst und anschließend die Differenz der gemessenen Absorptionen anhand einer Kalibrationskurve mit der Konzentration vom Chlorid in der Probe korreliert.
Ein erheblicher Nachteil dieser Methode gemäß EP-A 0 355 655 besteht darin, dass die zweite Absorptionsmessung innerhalb eines sehr kurzen Zeitraums nach der Zugabe und dem Mischen mit dem zweiten Reagens erfolgen muss, da ansonsten große Messfehler auftreten, verursacht durch unspezifische Reaktionen.
Aufgabe
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand daher darin, ein kostengünstiges, automatisierbares und gegenüber dem Stand der Technik genaueres Verfahren und Mittel zur Bestimmung der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zum Bestimmen der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Versetzen der Probe mit einem ersten Reagenz (Reagenz 1), welches wenigstens Eisen(III)-Perchlorat, Methansulfonsäure und Detergens, ausgewählt unter nicht-ionischem Detergens, ionischem Detergens oder einem Gemisch davon, in Wasser oder wässrigorganischem Lösungsmittel enthält und bei 25°C einen pH-Wert < 1,5 aufweist,
(b) Messen der Absorption des Reaktionsgemisches bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern,
(c) Versetzen des Reaktionsgemisches mit einem zweiten Reagenz (Reagenz 2), welches wenigstens ein wasserlösliches Fluorid, vorzugsweise Kaliumfluorid, in Wasser oder wässrig-organischem Lösungsmittel enthält,
(d) Messen der Absorption des Reaktionsgemisches bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die biologische Flüssigkeit Blutserum, Blutplasma, Urin, Liquor, Speichel oder Tränenflüssigkeit. Üblicherweise ist die biologische Flüssigkeit eine Probe von Blutserum. Vollblut ist hingegen aufgrund der starken Eigenfärbung ungeeignet.
Es wurde festgestellt, dass bei bekannten Verfahren zur Bestimmung der Chloridkonzentration in biologischen Proben mittel Absorptionsmessung Störungen und Messfehler aufgrund von Interferenzen mit in der Probe enthaltenen Triglyceriden und anderen Lipiden auftreten. Diese Fehler wurden entweder ignoriert oder mussten durch Messkorrekturverfahren ausgeglichen werden. Es wurde nun überraschend gefunden, dass die Zugabe von ionischem und/oder nicht-ionischem Detergens, vorzugsweise beidem, zu Reagenz 1 solche Störungen durch Lipidinterferenzen ausräumen kann und daher eine zusätzliche Messkorrektur nicht erforderlich ist. Es wird angenommen, dass die in der biologischen Probe enthaltenen Lipide durch die Zugabe der Detergenzien wenigstens teilweise aufgelöst oder anderweitig beeinflusst werden, dass sie die Absorptionsmessung nicht mehr signifikant beeinflussen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das nicht-ionische Detergens in Reagenz 1 ein Octylphenolethoxylat, ein Nonylphenolethoxylat oder ein Derivat davon. Besonders bevorzugt ist das nicht-ionische Detergens in Reagenz 1 Octylphenoxypolyethoxyethanol, beispielsweise handelsüblich erhältlich unter dem Namen Nonidet P-40. Weitere geeignete nicht-ionische Detergenzien in Reagenz 1 umfassen Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Octoxinol-9, Nonoxynol-40 oder Derivate davon. Die oben genannte Auflösung der Lipidinterferenz ist mit den vorgenannten bevorzugten nicht-ionischen Detergenzien besonders effektiv.
Zweckmäßigerweise enthält das Reagenz 1 das nicht-ionische Detergens in einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise von 3 bis 7 Gew.-%, besonders bevorzugt von 4,5 bis 5,5 Gew.-%. Eine zu hohe Konzentration des nicht-ionischen Detergens führt mit Nachteil zu Schaumbildung. Eine zu niedrige Konzentration des nicht-ionischen Detergens hat den Nachteil, dass die erwünschte Wirkung des Detergens nicht erzielt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das ionische Detergens in Reagenz 1 ein kationisches Fettsäureaminethoxylat, vorzugsweise ein kationisches tertiäres Stearylaminpolyethoxylat, beispielsweise handelsüblich erhältlich unter dem Namen Chemeen 18-50.
Zweckmäßigerweise enthält das Reagenz 1 das ionisches Detergens in einer Konzentration von 0,5 bis 8 Gew.-%, vorzugsweise von 1,5 bis 5 Gew.-%, besonders bevorzugt von 2,5 bis 3,5 Gew.-%. Eine zu hohe Konzentration des ionischen Detergens führt mit Nachteil zu Schaumbildung. Eine zu niedrige Konzentration des ionischen Detergens hat den Nachteil, dass die erwünschte Wirkung des Detergens nicht erzielt wird.
Das Eisen(III)-Perchlorat in Reagenz 1 bildet in stark saurer Lösung mit den Chloridionen in der biologischen Probe einen Komplex, der eine starke Absorption bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern aufweist und sich daher für eine spektrometrische Messung gut eignet. Das Absorptionsmaximum liegt bei etwa 340 Nanometern, weshalb die Absorption des Reaktionsgemisches in den Stufen (b) und (d) bevorzugt bei einer Wellenlänge im Bereich von 330 bis 350 Nanometern, besonders bevorzugt bei einer Wellenlänge von etwa 340 Nanometern gemessen wird.
Zweckmäßigerweise enthält das Reagenz 1 das Eisen(III)-Perchlorat in einer Konzentration von 5 bis 30 mmol/l, vorzugsweise von 10 bis 25 mmol/l, besonders bevorzugt von 15 bis 20 mmol/l. Eine zu hohe Konzentration des Eisen(III)-Perchlorats in Reagenz 1 hat den Nachteil, dass bei der Dosierung sehr geringe Volumina zu pipettieren sind und damit die Genauigkeit abnimmt. Darüber hinaus kann eine zu hohe Konzentration des Eisen(III)-Perchlorats in Reagenz 1 zu einer Ausfällung von Perchlorat in dem Reagenz führen. Eine zu niedrige Konzentration des Eisen(III)-Perchlorats hat den Nachteil, dass man zum Erreichen einer Konzentration des Eisen(III)-Perchlorats, die ausreichend ist, um für den relevanten Messbereich ausreichend Chloridionen in der Probe zu komplexieren, große Volumina zugeben muss, was den Reaktionsansatz sehr stark verdünnt.
Die stark saure Reaktionsumgebung, welche zur Ausbildung des Eisen-Chlor-Komplexes erforderlich ist, wird durch die in Reagenz 1 enthaltene Methansulfonsäure bereitgestellt. Der pH-Wert des Reagenz 1 liegt bei 25°C unter 1,5. Zweckmäßigerweise weist das Reagenz 1 bei 25°C einen noch niedrigeren pH-Wert im Bereich von 0 bis 1,0, vorzugsweise von 0,2 bis 0,8, besonders bevorzugt von etwa 0,5 auf. Ist der pH-Wert zu hoch, kann das Eisen aus dem Eisen(III)-Perchlorat als Eisenoxid ausfallen, was eine korrekte Chlorid-Bestimmung unmöglich machen würde.
Zweckmäßigerweise enthält das Reagenz 1 die Methansulfonsäure in einer Konzentration von 150 bis 450 mmol/l, vorzugsweise von 250 bis 350 mmol/l, besonders bevorzugt von 280 bis 320 mmol/l. Eine zu hohe Konzentration der Methansulfonsäure hat umwelttechnische Nachteile. Eine zu niedrige Konzentration der Methansulfonsäure kann dazu führen, dass der pH-Wert nicht niedrig genug ist, was wiederum eine Ausfällung von Eisenoxid zur Folge haben kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Reagenz 1 Eisen(III)-Perchlorat in einer Konzentration von etwa 17 mmol/l, Methansulfonsäure in einer Konzentration von etwa 300 mmol/l, nicht-ionisches Detergens in einer Konzentration von etwa 5,0 Gew.-% und ionisches Detergens in einer Konzentration von etwa 3,0 Gew.-%.
Das Reagenz 2 enthält ein wasserlösliches Fluorid, vorzugsweise Kaliumfluorid, und wird dem Reaktionsgemisch in einer solchen Menge zugesetzt, dass die Fluoridionen in einem molaren Überschuss gegenüber dem durch das Eisen(III)-Perchlorat in das Reaktionsgemisch eingebrachten Eisen vorliegt. Die Fluoridionen lösen den nach der Zugabe des Reagenz 1 gebildeten Eisen-Chlor-Komplex unter Bildung eines Eisen-Fluor-Komplexes [FeF₆]^3– wieder auf. Der Eisen-Fluor-Komplex ist farblos, stabil und absorbiert nicht in dem Wellenlängenbereich um 340 Nanometer herum, bei dem der Eisen-Chlor-Komplex absorbiert. Die Differenz der Absorptionswerte, welche nach Zugabe des Reagenz 1 gemessen wurden, und der Absorptionswerte, welche nach Zugabe des Reagenz 2 gemessen wurden, korrelieren daher mit dem Chloridgehalt in der biologischen Probe, abgesehen von Störfaktoren, die hierin beschrieben werden und sich durch hierin ebenfalls beschriebene Maßnahmen mindern oder beseitigen lassen.
Zweckmäßigerweise enthält das Reagenz 2 das wasserlösliche Fluorid, vorzugsweise Kaliumfluorid, in einer Konzentration von 0,5 bis 8,0 Gew.-%, vorzugsweise von 1,5 bis 5,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 2,0 bis 3,5 Gew.-%. Eine zu hohe Konzentration an Fluorid kann nachteilig für die Dosierung sein, da man zu geringe Volumina pipettieren muss und damit die Genauigkeit abnimmt. Eine zu niedrige Konzentration an Fluorid kann nachteilig sein, da man zum Erreichen des erforderlichen molaren Überschusses an Fluorid große Volumina zugeben muss, was den Reaktionsansatz zu stark verdünnt.
Es versteht sich, dass die Reagenzien 1 und 2 weitere Bestandteile enthalten können, sofern diese die beschriebenen Reaktionen und die Absorptionsmessungen nicht nachteilig beeinflussen. Des Weiteren versteht es sich, dass die Bestandteile der Reagenzien 1 und 2, insbesondere des Reagenz 1, auch auf zwei oder mehr separate Lösungen aufgeteilt sein können, die der biologischen Probe nacheinander oder gleichzeitig zugegeben werden, sofern das hierin beschriebene Reaktionsprinzip dabei weiterhin eingehalten wird. Eine solche Aufteilung auf separate Lösungen ist vom Umfang der Erfindung umfasst. Beispielsweise könnten die Detergezien und die Methansulfonsäure in einer oder mehreren von dem Eisen(III)-Perchlorat separaten Lösungen bereitgestellt und vor dem Eisen(III)-Perchlorat der biologischen Probe zugegeben werden.
Ein erheblicher Störfaktor bei der Bestimmung der Chloridkonzentration durch Messung der Absorption des Eisen-Chlor-Komplexes bei etwa 340 Nanometern ist die Gegenwart von Bilirubin in der biologischen Probe. Der Bilirubingehalt im Blut ist insbesondere bei Patienten mit Gallen- und/oder Lebererkrankungen erhöht. Da Bilirubin ebenfalls wie der Eisen-Chlor-Komplex bei etwa 340 Nanometern absorbiert, kann er die Bestimmung der Chlorid-Konzentration erheblich beeinflussen und Abweichungen der gemessenen von der tatsächlichen Chlorid-Konzentration von bis zu 5% und sogar mehr verursachen. Da der Normbereich für die Serumchlorid-Konzentration beim erwachsenen Menschen von 96 bis 110 mmol/l relativ eng ist, kann ein derart hoher Fehlerbereich die Aussagekraft der Chloridbestimmung erheblich beeinträchtigen.
Um Fehler bei der Chloridbestimmung durch Bilirubininterferenz zu verringern oder gänzlich auszuräumen wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens daher die Absorption des Reaktionsgemisches in den Stufen (b) und (d) zusätzlich bei einer zweiten Wellenlänge im Bereich von 650 bis 670 Nanometern, vorzugsweise bei etwa 660 Nanometern gemessen und die jeweiligen gemessenen Absorptionswerte von den bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern, vorzugsweise 330 bis 350 Nanometern, besonders bevorzugt etwa 340 Nanometern gemessenen Absorptionswerten subtrahiert.
Die Absorption von Bilirubin ist bei 340 Nanometern und 660 Nanometern etwa gleich hoch. Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren entstehende Eisen-Chlor-Komplex absorbiert hingegen bei 340 Nanometern, aber im Wesentlichen nicht bei 660 Nanometern. Durch die Messung bei der zweiten Wellenlänge (Nebenwellenlänge) und anschließende Subtraktion von der bei der ersten Wellenlänge (Hauptwellenlänge) von etwa 340 Nanometern gemessenen Absorption kann somit der Anteil des Bilirubins an dem erhaltenen Messergebnis eliminiert werden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist weitgehend temperaturunempfindlich und kann in einem sehr breiten Temperaturbereich durchgeführt werden. Zweckmäßigerweise wird das Verfahren bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 40°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt, da dies in der Regel der natürlichen Umgebungstemperatur der biologischen Probe entspricht und viele Analyseautomaten bei dieser Temperatur arbeiten. Das Verfahren kann aber auch bei Raumtemperatur von 25°C durchgeführt werden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hat gegenüber dem bekannten Verfahren gemäß EP 0 355 655 den weiteren Vorteil, dass es hinsichtlich der Zeiträume, die zwischen den einzelnen Reaktionsstufen und den Absorptionsmessungen liegen, vergleichsweise unempfindlich ist. Für das Verfahren gemäß EP 0 355 655 wird ausdrücklich empfohlen, die zweite Absorptionsmessung innerhalb von 60 Sekunden, vorzugsweise früher, nach Zugabe der zweiten Reagenzlösung durchzuführen, um die Störung der Messung durch Bilirubin gering zu halten. Diese Notwendigkeit für eine sehr schnelle Messung der Absorption nach Zugabe des Reagenz 2 ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht gegeben. Bereits das Reaktionsgemisch nach der Zugabe des Reagenz 1 ist sehr stabil und kann nahezu beliebig lange aufbewahrt werden, ohne dass Störungen der Messung auftreten. Aber auch nach Zugabe des Reagenz 2 kann das Reaktionsgemisch problemlos für weitere 2 bis 10 Minuten oder länger stehen gelassen werden, bevor die Absorptionsmessung durchgeführt wird, da die Bilirubinstörung erfindungsgemäß eliminiert werden kann.
Die Chlorid-Konzentration in einer biologischen Probe erhält man nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zweckmäßigerweise dadurch, dass man die Differenz der in den Stufen (b) und (d) gemessenen Absorptionswerte bildet und die Chloridkonzentration in der Probe durch Vergleich mit bzw. Interpolation anhand einer mit Referenzstandards bekannter Chloridkonzentrationen erhaltenen Kalibrationskurve ermittelt, die nach dem gleichen Verfahren erstellt wurde. Zur Eliminierung der Bilirubininterferenz wird dabei vorzugsweise eine Korrektur der bei der ersten Wellenlänge gemessenen Absorptionswerte durch Subtraktion der bei der zweiten Wellenlänge gemessenen Absorptionswerte vorgenommen, wie es oben beschrieben ist.
Die Erfindung betrifft auch eine Zusammenstellung von Reagenzien oder einen diagnostischen Kit zum Bestimmen der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, umfassend ein erstes Reagenz (Reagenz 1), welches wenigstens Eisen(III)-Perchlorat, Methansulfonsäure, ein nicht-ionisches Detergens und ein ionisches Detergens in Wasser oder wässrigorganischem Lösungsmittel enthält und bei 25°C einen pH-Wert < 1,5 aufweist, und ein zweites Reagenz (Reagenz 2), welches wenigstens ein wasserlösliches Fluorid, vorzugsweise Kaliumfluorid, in Wasser oder wässrig-organischem Lösungsmittel enthält, wobei die Reagenzien 1 und 2 mit Vorteil die hierin beschriebenen weiteren Merkmale aufweisen können.
Die Erfindungsgemäße Zusammenstellung von Reagenzien oder der diagnostische Kit umfasst vorzugsweise weiterhin mehrere Reagenzien mit Referenz-Standards bekannter Chloridkonzentrationen. Diese werden für die Erstellung einer Kalibrationskurve (Vergleichskurve) eingesetzt. Selbstverständlich kann sich der Anwender entsprechende Referenz-Standards auch durch Verdünnen handelsüblich erhältlicher Stammlösungen mit bekannter Chlorid-Konzentration oder durch genaues Einwiegen von Chloridsalzen und Lösen in geeigneten Lösungsmitteln herstellen.
Weitere Vorteile, Merkmale und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden nun anhand von nicht beschränkenden Beispielen und unter Bezugnahme auf die anhängenden Figuren beschrieben.
Beispiele
Beispiel 1 – Chlorid-Bestimmungen
Es wurden die Chloridkonzentrationen in verschiedenen Patientenproben (Blutserum) sowie in artifiziellen Kontrollproben mit bekannter Chloridkonzentration (TruLabN, Artikelnummer 5 9000 99 10 061, und TruLabP, Artikelnummer 5 9050 99 10 061, der Firma Diasys Diagnostic Systems GmbH, 65558 Holzheim, Deutschland) nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 bestimmt und mit Messungen der Chloridkonzentrationen mit einer ionenselektiven Elektrode (ISE) als Referenz korreliert.
Die Chloridbestimmungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 wurden mit einem automatisierten Analysengerät respons^® 920 der Firma Diasys Diagnostic Systems GmbH, 65558 Holzheim, Deutschland, bei 37°C durchgeführt.
Zur Kalibrierung des Analysengerätes wurden zwei Lösungen mit 0 bzw. 116 mmol/l Chloridionenkonzentration eingesetzt. Die ISE wurde mit der vom Hersteller gelieferten Kalibrierlösung kalibriert (Medica Corporation, Bedford, MA 01730-1413, USA; Reagent Pack ISE Module, Ref.: 5423).
a) Herstellung der Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
Reagenz 1 (R1) wurde durch Lösen von 30,0 g des kationischen Detergens tertiäres Stearylaminpolyethoxylats (Chemeen 18-50; kommerziell erhältlich von PCC Chemax, Inc., Piedmont, SC 29673, USA), 50,0 g des nicht-ionischen Detergens Octylphenoxypolyethoxyethanol (Nonidet P-40; kommerziell erhältlich von Sigma-Aldrich, 89555 Steinheim, Deutschland), 28,8 g (300 mmol) Methansulfonsäure (Reinheit > 98%; kommerziell erhältlich von Sigma-Aldrich, 89555 Steinheim, Deutschland) und 6,04 g (17,05 mmol) Eisen(III)-perchlorat-Hydrat (kommerziell erhältlich von Sigma-Aldrich, 89555 Steinheim, Deutschland) in 1000 ml entionisiertem Wasser hergestellt. Die Lösung wurde anschließend durch einen Sterilfilter mit 0,22 µm Porengröße filtriert. Der pH-Wert der Lösung betrug 0,5 ± 0,05 bei 25 °C. Die Dichte der Lösung betrug D₂₀ = 1,022 g/ml.
Reagenz 2 (R2) wurde durch Lösen von 28,0 g (583 mmol) Kaliumfluorid (kommerziell erhältlich von Merck, 64293 Darmstadt, Deutschland) in 1000 ml entionisiertem Wasser hergestellt. Die Lösung wurde anschließend durch einen Sterilfilter mit 0,22 µm Porengröße filtriert. Die Dichte der Lösung betrug D₂₀ = 1,021 g/ml.
b) Chlorid-Bestimmungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
8 µl Probe wurden mit 180 µl R1 versetzt und gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 300 Sek. zur Erreichung des Temperaturgleichgewichtes wurde eine erste Absorptionsmessung bei 340 nm durchgeführt. Anschließend wurden 45 µl R2 zugesetzt und gemischt. Nach einer weiteren kurzen Inkubationszeit von 60 Sek. wurde eine zweite Absorptionsmessung bei 340 nm durchgeführt. Parallel wurden Messungen der Chloridkonzentrationen der Proben mit einer ionenselektiven Elektrode (ISE) durchgeführt.
c) Herstellung der Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens gemäß EP 0 355 655
Reagenzien S1 und S2 gemäß den in der EP 0 355 655 beschriebenen Zusammensetzungen wurden methodisch im Wesentlichen wie die Reagenzien R1 und R2 der vorliegenden Erfindung hergestellt und anschließend durch einen Sterilfilter mit 0,22 µm Porengröße filtriert. Soweit in den Reagenzien S1 und S2 enthalten, wurden die gleichen Produkte wie zur Herstellung der erfindungsgemäßen Reagenzien R1 und R2 verwendet.
Reagenz S1 enthielt 30,0 g Chemeen 18-50 und 28,8 g Methansulfonsäure in 1000 ml entionisiertem Wasser. Reagenz S2 enthielt die gleichen Bestandteile wie Reagenz S1 und zusätzlich 80 g Eisen(III)-Perchlorat.
d) Chloridbestimmung nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655
8 µl Probe wurden mit 180 µl Reagenz S1 versetzt und gemischt. Nach einer Inkubationszeit von 300 Sek. zur Erreichung des Temperaturgleichgewichtes wurde eine erste Absorptionsmessung bei 340 nm durchgeführt. Anschließend wurden 45 µl Reagenz S2 zugesetzt und gemischt. Nach einer weiteren kurzen Inkubationszeit von nicht mehr als 30 Sek. wurde eine zweite Absorptionsmessung bei 340 nm durchgeführt.
e) Vergleich der Messungen
Die Ergebnisse der Konzentrationsmessungen der Chloridionen in den zu untersuchenden Proben nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 wurden jeweils gegen die Konzentrationsmessungen der Chloridionen mit der ionenselektiven Elektrode (ISE) aufgetragen und eine durch lineare Regression erhaltene Gerade durch die Messpunkte gelegt.
1 zeigt den Auftrag der Konzentrationsmessungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren (Abszissenachse) gegen die Konzentrationsmessungen mittels ISE (Ordinatenachse).
2 zeigt den Auftrag der Konzentrationsmessungen nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 (Abszissenachse) gegen die Konzentrationsmessungen mittels ISE (Ordinatenachse).
Die unterbrochene Linie in den 1 und 2 zeigt die ideale Gerade, die man bei exakter Übereinstimmung der Konzentrationsmessungen mit den mittels ISE erhaltenen Konzentrationsmessungen erhalten würde.
Die Ergebnisse zeigen, dass das erfindungsgemäße Verfahren eine sehr gute Übereinstimmung mit den nach der Referenzmethode mittels ISE bestimmten Chloridionenkonzentrationen liefert. Dem gegenüber weichen die nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 gemessenen Chloridionenkonzentrationen deutlich stärker von den nach der Referenzmethode mittels ISE bestimmten Werten ab.
Beispiel 2 – Untersuchung der Lipidinterferenz
Es wurde eine Serumprobe aus einem Krankenhaus mit einer Chloridkonzentration von 105 mmol/l Chlorid und bekannter Triglyceridkonzentration mit einem delipidierten Humanserum (der Firma PAA Laboratories GmbH, 4061 Pasching, Österreich), welches ebenfalls auf eine Chloridkonzentration von 105 mmol/l Chlorid eingestellt war, verdünnt, um Proben mit gleicher Chloridkonzentration von 105 mmol/l Chlorid, aber unterschiedlichen Triglyceridkonzentrationen für die Messungen zu erhalten.
Für einen Vergleich der Lipidinterferenz in den Messungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 wurden die Bestimmungen der Chloridkonzentrationen mit den Reagenzien und nach den Verfahren durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. 3 zeigt die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten Ergebnisse, und 4 zeigt die nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 erzielten Ergebnisse. Die unterbrochenen Linien in den 3 und 4 zeigen die bekannten Chloridkonzentrationen in den eingesetzten Proben. Die durchgezogenen Linien oberhalb und unterhalb der unterbrochenen Linie geben die Grenzen von ±4,5% um die bekannte Chloridkonzentration der Kontrollprobe an, innerhalb der man in Anlehnung an die Qualitätsrichtlinien der Bundesärztekammer von einer Interferenzfreiheit ausgeht.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Chloridbestimmungen nach dem Verfahren gemäß EP 0 355 655 bereits ab einer Konzentration von etwa 400 mg/dl Triglycerid stark ansteigende Werte der Chloridkonzentration liefern, die erheblich über dem tatsächlichen Chloridgehalt liegen. Die Chloridbestimmungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren liefern hingegen über den gesamten untersuchten Konzentrationsbereich der Triglyceride die tatsächlichen Chloridkonzentrationen innerhalb einer engen Fehlertoleranz. Die Erfinder führen dies unter anderem auf die Gegenwart des nicht-ionischen Detergens im Reagenz R1 zurück.
Beispiel 3 – Untersuchung der Bilirubininterferenz
Eine artifizielle Kontrollprobe mit bekannter Chloridkonzentration (TruLabP, Artikelnummer 5 9050 99 10 061, der Firma Diasys Diagnostic Systems GmbH, 65558 Holzheim, Deutschland) wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen an Bilirubin versetzt (Bilirubin der Firma Sigma-Aldrich Chemie GmbH, 89555 Steinheim, Deutschland, Produktcode: 14370). Die Konzentrationen betrugen 0 mg/dL, 15 mg/dL, 30 mg/dL, 45 mg/dL und 60 mg/dL Bilirubin.
Die Chlorid-Konzentrationen der Proben wurden wie in Beispiel 1 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt, wobei die Absorptionen nach der Zugabe von Reagenz 1 bzw. Reagenz 2 jeweils bei der Hauptwellenlänge von 340 nm und bei Nebenwellenlänge von 660 nm gemessen wurden.
Die 5 und 6 zeigen die Ergebnisse der Konzentrationsmessungen der Chloridionen auf der Abszissenachse und die der jeweiligen Probe zugesetzte Bilirubinkonzentration auf der Ordinatenachse. Die unterbrochenen Linien in den 5 und 6 zeigen die bekannten Chloridkonzentrationen in den eingesetzten artifiziellen Kontrollproben. Die durchgezogenen Linien oberhalb und unterhalb der unterbrochenen Linie geben die Grenzen von ±4,5% um die bekannte Chloridkonzentration der Kontrollprobe an, innerhalb der man in Anlehnung an die Qualitätsrichtlinien der Bundesärztekammer von einer Interferenzfreiheit ausgeht.
Die in 5 wiedergegebenen Werte der Chlorid-Konzentrationen wurden nur unter Berücksichtigung der Messung bei der Hauptwellenlänge von 340 nm bestimmt, wogegen für die Bestimmung der in 6 wiedergegebenen Werte der Chlorid-Konzentrationen die gemessenen Absorptionen bei der Nebenwellenlänge von 660 nm von den Absorptionen bei der Hauptwellenlänge von 340 nm subtrahiert wurden.
Der Vergleich der 5 und 6 zeigt, dass die aufgrund der Bilirubininterferenz insbesondere bei hohen Bilirubinkonzentrationen auftretende Abweichung der gemessenen Chlorid-Konzentration von der tatsächlich eingesetzten Chlorid-Konzentration durch das erfindungsgemäße Korrekturverfahren erheblich reduziert werden kann.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 0355655 A [0007, 0008]
EP 0355655 [0029, 0029, 0034, 0035, 0040, 0043, 0045, 0047, 0049, 0049, 0050]

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, umfassend die folgenden Schritte: (a) Versetzen der Probe mit einem ersten Reagenz (Reagenz 1), welches wenigstens Eisen(III)-Perchlorat, Methansulfonsäure und Detergens, ausgewählt unter nicht-ionischem Detergens, ionischem Detergens oder einem Gemisch davon, in Wasser oder wässrig-organischem Lösungsmittel enthält und bei 25°C einen pH-Wert < 1,5 aufweist, (b) Messen der Absorption des Reaktionsgemisches bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern, (c) Versetzen des Reaktionsgemisches mit einem zweiten Reagenz (Reagenz 2), welches wenigstens ein wasserlösliches Fluorid in Wasser oder wässrigorganischem Lösungsmittel enthält, (d) Messen der Absorption des Reaktionsgemisches bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Flüssigkeit Blutserum, Blutplasma, Urin, Liquor, Speichel oder Tränenflüssigkeit ist, vorzugsweise Blutserum.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht-ionische Detergens in Reagenz 1 ein Octylphenolethoxylat, ein Nonylphenolethoxylat oder ein Derivat davon, vorzugsweise Octylphenoxypolyethoxyethanol, Nonylphenoxypolyethoxyethanol, Octoxinol-9, Nonoxynol-40 oder ein Derivat davon umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das ionische Detergens in Reagenz 1 ein kationisches Fettsäureaminethoxylat, vorzugsweise ein kationisches tertiäres Stearylaminpolyethoxylat umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz 1 Eisen(III)-Perchlorat in einer Konzentration von 5 bis 30 mmol/l, vorzugsweise von 10 bis 25 mmol/l, besonders bevorzugt von 15 bis 20 mmol/l enthält und/oder Methansulfonsäure in einer Konzentration von 150 bis 450 mmol/l, vorzugsweise von 250 bis 350 mmol/l, besonders bevorzugt von 280 bis 320 mmol/l enthält und/oder nicht-ionisches Detergens in einer Konzentration von 1,0 bis 10,0 Gew.-%, vorzugsweise von 3,0 bis 7,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 4,5 bis 5,5 Gew.-% enthält und/oder ionisches Detergens in einer Konzentration von 0,5 bis 8,0 Gew.-%, vorzugsweise von 1,5 bis 5,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 2,5 bis 3,5 Gew.-% enthält.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Fluorid in Reagenz 2 Kaliumfluorid ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz 2 das wasserlösliche Fluorid in einer Konzentration von 0,5 bis 8,0 Gew.-%, vorzugsweise von 1,5 bis 5,0 Gew.-%, besonders bevorzugt von 2,0 bis 3,5 Gew.-% enthält.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Reagenz 1 bei 25°C einen pH-Wert im Bereich von 0 bis 1,0, vorzugsweise von 0,2 bis 0,8, besonders bevorzugt von etwa 0,5 aufweist
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorption des Reaktionsgemisches in den Stufen (b) und (d) bei einer Wellenlänge im Bereich von 330 bis 350 Nanometern, vorzugsweise bei einer Wellenlänge von etwa 340 Nanometern gemessen wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Absorption des Reaktionsgemisches in den Stufen (b) und (d) zusätzlich bei einer zweiten Wellenlänge im Bereich von 650 bis 670 Nanometern, vorzugsweise bei einer zweiten Wellenlänge von etwa 660 Nanometern gemessen wird und die gemessenen Absorptionswerte von den bei einer Wellenlänge im Bereich von 320 bis 380 Nanometern, vorzugsweise 330 bis 350 Nanometern, besonders bevorzugt etwa 340 Nanometern gemessenen Absorptionswerten subtrahiert werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 50°C, vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 10 bis 40°C, besonders bevorzugt bei einer Temperatur von etwa 37°C durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Differenz der in den Stufen (b) und (d) gemessenen Absorptionswerte bildet, vorzugsweise nach Korrektur durch Subtraktion der bei einer zweiten Wellenlänge gemessenen Absorptionswerte, und die Chloridkonzentration in der Probe durch Vergleich mit einer mit Referenzstandards bekannter Chloridkonzentrationen erhaltenen Kalibrationskurve ermittelt.
Zusammenstellung von Reagenzien oder diagnostischer Kit zum Bestimmen der Chlorid-Konzentration in einer Probe einer biologischen Flüssigkeit, umfassend ein erstes Reagenz (Reagenz 1), welches wenigstens Eisen(III)-Perchlorat, Methansulfonsäure, ein nicht-ionisches Detergens und ein ionisches Detergens in Wasser oder wässrig-organischem Lösungsmittel enthält und bei 25°C einen pH-Wert < 1,5 aufweist, und ein zweites Reagenz (Reagenz 2), welches wenigstens ein wasserlösliches Fluorid, vorzugsweise Kaliumfluorid in Wasser oder wässrig-organischem Lösungsmittel enthält, wobei die Reagenzien 1 und 2 die Merkmale eines oder mehrerer der Ansprüche 1 und 3 bis 8 aufweisen.
Zusammenstellung von Reagenzien oder diagnostischer Kit nach Anspruch 12, weiterhin umfassend mehrere Reagenzien mit Referenz-Standards bekannter Chloridkonzentrationen.