DE3040951A1

DE3040951A1 - Verfahren zur herstellung von 6-amino-penicillansaeure oder deren s-oxid

Info

Publication number: DE3040951A1
Application number: DE19803040951
Authority: DE
Inventors: Kenzo Sakai Osaka Koizumi; Eiji Ikeda Osaka Kondo; Takashi Izumiotsu Osaka Mitsugi; Ryonosuke Kyoto Muneyuki; Yoshiharu Takarazuka Hyogo Wakisaka
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1979-10-30
Filing date: 1980-10-30
Publication date: 1981-05-14
Also published as: CA1159783A; FR2468610A1; GB2061943A; GB2061943B; FR2468610B1; US4370414A; JPS5664796A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-Juninopenicillansäure oder 6-Aminopenicillansäure-S-oxid mittels Enzymen, die von Mikroorganismen der Gattung Arthro bacter gebildet werden. Die Erfindung betrifft ferner die Enzyme, die aus diesen Mikroorganismen herstellbar sind

10 bzw. gewonnen werden.

Es sind zahlreiche Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen mittels Enzymen bekannt, die von Bakterien oder Pilzen gebildet werden. Insbesondere sind Verfahren bekannt, bei denen Bakterien der Gattung Escherichia, Bacillus, Pseudomonas, Proteus und Micrococcus eingesetzt werden.

-¹O

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure oder 6-Aminopenicillansäure-S-oxid aus Benzylpenicillin bzw. Benzylpenicillin-S-oxid in hoher Ausbeute zu entwickeln. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß dazu Enzyme in der Lage sind, die von Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter gebildet werden.

Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand. Weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachstehenden Beschreibung.

Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen mittels Mikroorganismen der Gattung Arthrobacter sind bereits in der US-PS 3 116 218 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird der Arthrobacter-Stamm KRRL B-274-3 verwendet.

130020/0810

-*- 30A0951"¹

In den JP-ASen 4-5-950 und 50-2758 sind enzymatisch^ Verfahren unter Verwendung von Ar. viscosus "bzw. Ar. simplex Nr. 3151 beschrieben.

Ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure-S-oxid auf enzymatischem Wege ist bis jetzt noch nicht bekannt geworden.

Die zur Herstellung der Enzyme der Erfindung verwendeten Mikroorganismen haben andere Eigenschaften als die in den vorstehenden Druckschriften beschriebenen Mikroorganismen. Sie werden deshalb als neue Art angesehen. Die Eigenschaften der Stämme M-1376-2 und M-2183-1, die aus Bodenproben isoliert wurden, sind nachstehend aufgeführt. 15

Stamm M-1376-2

A. Morphologie und Anfärbbarkeit

(1) Vegetative Zellen (G-Iy-IM Agarmedium* und Nähragarmedium)

Nach eintägiger Fermentation bei 28°C werden kurze Stäbchen (0,6 bis 0,7 χ 0,8 bis 2,0 ,u) und einige pleomorphe Formen gefunden. Die meisten Zellen werden nach 4- bis 8 Tagen bei 28°C coccoid bzw. gerundet (0,6 bis 0,8 χ 0,8 bis 1,0 /u), und es werden zahlreiche zu Perlen geformte Zellen beobachtet. Nach 2 Tagen bei 37⁰C werden zahlreiche geschwollene Körper, vermutlich Arthrosporen mit den Abmessungen 0,8 bis 1,2 λχ gefunden. Anm.: *) Zusammensetzung von GIy-IM Agar: 0,5% Glycerin, 0,25% Polypepton, 0,25% Hefeextrakt, 0,25% Fleischextrakt, 0,25% Difco-soytone, 0,3% Salz_? 1^25% Agar; pH-Wert 7,0.

(2) Sram-Färbung: Positiv (Nähragarmedium, Züchtung 1 bis 8 Tage bei 28°G)

³⁵ (3) Flagellum: Keine

-,'<■' Beweglichkeit: Nicht beobachtet

130020/08^9

1 (5) Sporen: Keine

B. Wachstumseigenschaften

5 (1) Koloniegestalt (Nähragarmedium, 28°C)

Kreisförmig (1-2 mm; 4- Tage), konvex, die gesamten Kolonien haben eine glänzende glatte Oberfläche. Graustichig weiße Farbe, durchscheinend ; weiche

Struktur.

(2) Wachstum auf Agar-Schrägröhrchen (Nähragarmedium, 1 bis 2 Tage Züchtung bei 28°C)

Mäßiges fadenförmiges Wachstum mit glänzender Oberfläche. Cremig graustichig weiße Farbe, undurchsichtig, weiche Struktur.

(3) Wachstum auf flüssigem Nährboden (Gly-IM-Medium bei 28° C)

Mäßig gleichförmiges Wachstum, auf später Stufe erfolgt etwas Ausfällung. Es bildet sich kein Häutchen, sondern

nach 7 Tagen oder später kann ein Ring beobachtet werden. 20

C. Wachstumsbedingungen

(1) Sauerstoffbedarf: Vollständig aerob

(2) Wachstumstemperatur (G-Iy-IM): Gutes Wachstum bei 20

bis 33,5°C. Wachtumsmaximum bei 27,5 bis 3O,5°C. Auf Agarschrägröhrchen wird nach dem ersten Tag bei 37°C und nach dem dritten Tag bei 10⁰C sichtbares Wachstum beobachtet.

(3) pH-Bereich für das Wachstum: Gutes Wachstum bei pH-Werten von 6,28 bis 10,11. Das pH-Optimum liegt bei 7,42

30 bis 8,10.

D. Stoffwechselleistungen

(1) Katalase-Nachweis : .·. sitiv

(2) Kovac-Oxidasetest: Positiv

³⁵ (3) Voges-Proskauer-Reaktion: Negativ (28°C)

(4) Methylrot-Reaktion: Negativ (28°C)

130020/081Θ

BAD ORfGiiMAL

-⁶- 30Α09δΓ

(5) Eigelb-Reaktion: Negativ

(6) Nitratreduktion: Positiv

(7) Schwefelwasserstoffbildung: Positiv (schwach)

(8) Indolbildung: Negativ

(9) Urease-Nachweise: Positiv

(10) Gelatineverflüssigung: Positiv

(11) Caseinhydrolyse: Positiv"

(12) Stärkehydrolyse: Positiv; Dextrinbildung

(13) Milchreaktion: Peptonisierung positiv 10· Säurebildung negativ

Coagulierung positiv (schwach)

(14-) Säurebildung aus Zuckern: Negativ mit L-Arabinose,
D-Xylose, Rhamnose, D-Ribose, D-Glucose, D-Mannose,
D-Galactose, D-Fructose, Sucrose, Maltose, Lactose,
¹⁵ Trehalose, Raffinose, Melibiose, Dextrin, Stärke, Glycogen, Inulin, Glycerin, Adonit, Mannit, Sorbit, DuIcit, Salicin,
oc-Methylglucosid und m-Inosit.
(15) Celluloseabbau: Negativ

E. Aminosäure- und Zuckerkomponenten der Zellwand

Eine Probe gereinigte Zellwände, hergestellt nach Kotani
et al., Journal of Nara Medical Association, Bd. 10 (1959), S. 45, wird in üblicher Weise hydrolysiert. Die erhaltenen ²⁵ Zucker werden trimethylsilyliert. Die Probe wird der Aminosäuren-Analyse und der Gaschromatographie unterworfen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

130020/0819
L j

Oi

αϊ

co ο

ro

cn ίο ο

Tabelle I

Zellwail· komponente

Stamm Μ-Π76-2 M-2181-1 — ° ff 16biformis

fl-lJ/U-Ä M-iClOJ-J. Arno/"! Qm Π

ATCC 8010

Ar. simplex ATCC k

Diaminopimelinsäure

Lysin G-lyc in Asparaginsäure Serin Glutaminsäure Alanin Leucin Glucosamin Galac t ο s amin Glucose

Galactose -

Mannose +

Arabinose -

Rhainnose nichtidentifizieste Zucker ,0.2*

0 0 + •ίο

Anm. : ο geringe Menge; '+ Hauptkomponente; - nicht gefunden * die Menge entspricht etwa 1/5 der Hauptkomponente

■Ρ-CD CD (Jl

^Γ -8- 30Α0951"¹

Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß Lysin, Alanin und Glutaminsäure die hauptsächlichen Aminosäurekomponenten sind. Glucose und Mannose sind die Zuckerkomponenten; Galactose wurde nicht gefunden, ebenso Arabinose.

F. Nährstoffbedarf: Vitamin B.

Stamm M-2183-1

A. Morphologie und Anfärbbarkeit 10

(1) Vegetative Zellen (GIy-IM Agarmedium und Nähragarme dium)

Nach eintägiger Züchtung bei 28°C werden kurze Stäbchen und Koccen (0,4- bis 0,6 χ 0,8 bis 2,0/u) beobachtet. Die meisten Zellen werden nach zweitägiger Züchtung coccoid (0,5 bis 0,6 χ 0,6 bis 0,8 u) und es werden zahlreiche perlenförmige Zellen beobachtet. Nach viertägiger Züchtung bei 37⁰O werden geschwollene Körper bzw. Arthrosporen (0,8 bis 1,0/u ; Kügelchen) beobachtet.

(2) Gram-Färbung : Positiv (Nähragarmedium; 1 bis 8tägige Züchtung bei 28°C)

(3) Flagellum: Positiv

(4) Beweglichkeit : Positiv

(5) Sporen: Negativ 25

B. Wachstumseigenschaften

(1) Koloniegestalt (Nähragarmedium, 28°C)

Nach 4-tägiger Züchtung kreisförmig (0,3 bis 1,5 mm), konvex, die gesamten Kolonien zeigen eine glänzende glatte Oberfläche von graustichig weißer Farbe, durchscheinend

und von weicher , butterartiger Struktur.

(2) Wachstum auf Agar-Schrägröhrchen (Nähragarmedium, 1 bis 2 Tage Züchtung bei 28°G)

Mäßiges fadenförmiges Wachstum mit glänzender Oberfläche. Graustichig weiße Farbe, durchscheinend,

xtfeiche Struktur.

130020/081Q

L ' -J

^Γ -9-

1 (3) Wachstum auf flüssigem Nährboden (GIy-IM-IIedium bei 28°C)

Mäßig gleichförmiges Wachstum, etwas Ausfällung auf der spaten Stufe des Wachstums. Nach 7tägiger Züchtung bildet

5 sich kein Häutchen, sondern es wird ein Eing beobachtet.

C. Wachstumsbedingungen

(1) Sauerstoffbedarf: Vollständig aerob

10 (2) Wachstumstemperatur (GIy-IM): Gutes Wachstxim. bei 18,5 bis 37°C. Wachstumsmaximum bei 27,5 bis 35,5°C· Auf Agarschrägröhrchen wird bei 10⁰C am zweiten Tag und bei 37°C am ersten Tag Wachstum beobachtet. (3) pH-Bereich für das Wachstum: Gutes Wachstum bei pH-

15 Werten von 6,28 bis 10,1. Das pH-Optimum liegt bei 7,42 bis 8,10.

D. Stoffwechselleistungen

(1) Catalase-iTachweis : Positiv

(2) Kovac-Oxidasetest: Negativ

(3) Voges-Proskauer-Reaktion: Negativ (28°C)

(4) Methylrot-Heaktion: Negativ (28°C)

(5) Eigelb-P_Leaktion: Negativ
(6) Nitratreduktion: Positiv

(7) Schwefelwasserstoffbildung: Positiv (schwach)

(8) Indo!bildung: Negativ

(9) ürease-ITachweise : Positiv

(10) Gelatineverflüssigung: Positiv (11) Caseinhydrolyse: Positiv

(12) Stärkehydrolyse: Negativ

(13) Milchreaktion: Peptonisierung positiv

Säurebildung negativ Coagulierung positiv (schwach)

³⁵ (1^) Säurebildung aus Zuckern: Negativ mit L-Arabinose, D-Xylose, Rhamnose, D-Sibose, D-Glucose, D-Mannose,

130020/0810

BAD ORIGINAL

^Γ -ίο- 30Α0951^Π

D-Galactose, D-Fructose, Sucrose, Maltose, Lactose, Irehalose, Raffinose, Melibiose, Dextrin, Stärke, Glycogen, Inulin, Glycerin, Adonit, Mannit, Sorbit, DuIcit, Salicin, oc-Methylglucosid und m-Inosit.

5 (15) Celluloseabbau: negativ

E. Aminosäure- und Zuckerkomponenten der Zellwand

Die Zusammensetzung der Zellwand wird in gleicher Weise bestimmt wie beim Stamm M-1376-2. Die Ergebnisse sind

ebenfalls in Tabelle I zusammengefaßt. Die hauptsächlichen Aminosäurekomponenten sind Lysin, Alanin und Glutaminsäure, Als Zuckerkomponenten sind Glucose, Mannose und Galactose nachweisbar; Arabinose wurde nicht gefunden. 15

F. Fährstoffbedarf: Vitamin B und Methionin

Die Eigenschaften der beiden Stämme wurden verglichen mit folgenden Stammen der Gattung Arthrobacter: Arthrobacter globiformis

Arthrobacter simplex Arthrobacter tumescens Arthrobacter citreus Arthrobacter terregens,

25 Arthrobacter flavescens

Arthrobacter duodecadis;

die vorstehend aufgeführten sieben Stämme sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., (197Ό> beschrieben.
Arthrobacter luteus

beschrieben in J. Gen. Appln; Microbio.l., Bd. 15, (1969), 317-326;

Arthrobacter marinus

beschrieben in J. Gen. Microbiol., Bd. 62, (1970), 159-169, Arthrobacter viscosus

beschrieben in J. Bact., Bd. 90(1) (1965), 14-7-150

130020/081Ö

L ^J

1 Arthrobacter polychromogenes

beschrieben in J. Microbiol. Serol., Bd. 29 (1963), 1-15,

Arthrobaeter consociatus

beschrieben in Ann. Inst. Pasteur, Bd. 101 (1963), 793-800, Arthrobaeter nicotinoborus beschrieben in Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., Bd. 337 (1964-), 282-283,

Arthrobaeter variabilis

beschrieben in Z. Bakt. Parasit. Infektioskr. Hyg. Abt.II, Bd. 114 (1961), 520-53?.

Die Untersuchungen brachten das Ergebnis, daß die beiden Stämme nicht zur gleichen Art gehören. Ferner wurde die Aminosäuren- und Zuckerzusammensetzung der Zellwände von Ar. globiformis (ATCG Nr. 8010) und Ar. simplex (ATTC Nr. 694-6) untersucht. Es wurde festgestellt, daß diese Zellwände eine andere Zusammensetzung haben als die Zellwände der Stämme JÜ-I376-2 und M-2183-1; vgl. Tabelle I.

Somit sind die "beiden Stämme neue Arten der Gattung Arthrobaeter. Der Stamm M-1376-2 wird mit Arthrobaeter cremorum nov. sp. M-1376-2 bezeichnet. Er ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, Xatabe-machi, Ibaragi Pref., Japan,unter der Hinterlegungsnunmer FERM-P Ur. 514-3 hinterlegt. Der Stamm M-2183-1 wird mit Arthrobaeter flagellum nov. sp. M-2183-1 bezeichnet. Dieser Stamm ist bei der gleichen Hinterlegungsstelle unter der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 514-2 hinterlegt. Die Hinterlegung erfolgte am 16. August 1979·

^⁰ Ferner wurden die Stämme bei der American Type Culture Collection, I23OI Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, V.St.A., unter der Hint er1egungsnummer ATCC Wr. 31567 und 31566 am 13. September 1979 hinterlegt.

Sie Erfindung betrifft auch die Enzyme, die aus den Mikroorganismen der Art Arthrobaeter cremorum bzw. Arthrobaeter

130020/0810

^Γ -ι².- 304095Γ

flagellum sowie ihren Mutanten oder Varianten gewonnen werden, die Benzylpenicillin "bzw. Benzylpenicillin-S-oxid enzymatisch zu 6-Aminopenieillansäure bzw. 6-Aminopenicillansäure-S-oxid spalten.
5

Das erfindungsgemäße Yerfahren wird folgendermaßen durchgeführt : Zunächst wird das Enzym aus den Mikroorganismen gewonnen. Zu diesem Zweck werden die Mikroorganismen gezüchtet und vermehrt. Das Nährmedium enthält Kohlenstoffquellen,Stickstoffquellen und anorganische Salze. Beispiele für geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Inosit, Stärke, Dextrin, Glycerin, Melasse und organische Säuren. Diese Verbindungen können allein oder im Gemisch verwendet werden. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen sind Pepton, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Pleischextrakt, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Weizenkeimlinge, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat. Auch diese Verbindungen können allein oder im Gemisch verwendet werden. Beispiele für geeignete anorganische Salze sind Calciumcarbonat, Matrium-Chlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kobaltchlorid und verschiedene Phosphate. Diese Verbindungen können je nach Bedarf dem Eiährmedium zugesetzt werden.

Die Züchtung kann in üblicher Weise erfolgen. Vorzugsweise wird eine Flüssigkeitskultur verwendet. Zur großtechnischen Herstellung der Enzyme wird die aerobe Züchtung unter submersen Bedingungen bevorzugt. Der pH-Wert des Nährmediums wird auf einen Wert von 6 bis 10,5, insbesondere 7,0 bis 8.5 eingestellt. Sofern der pH-Wert des Nährmediums während der Züchtung sich ändert, wird dem Uährmedium ein Puffer zugesetzt. Die Züchtung wird

etwa
bei Temperaturen von/20 bis 40⁰C, vorzugsweise bei etwa 25 bis 32°G, durchgeführt, und zwar solange, bis die Bildung des gewünschten Enzyms ein Maximum erreicht hat. Gewöhnlich dauert dies etwa 20 bis 100 Stunden.

130020/0810

-^- 30409δΓ

Die erfindungsgemäßen Enzyme werden hauptsächlich in die Kulturflüssigkeit abgegeben. Somit kann die Kulturflüssigkeit unmittelbar oder nach Abtrennung der Zellen, beispielsweise durch Zentrifugieren der Kulturflüssigkeit und Dekantieren des Überstandes zur enzymatischen Spaltung eingesetzt werden. Aus der Kulturflüssigkeit kann auch ein rohes Enzympräparat isoliert werden, beispielsweise durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat. Zur Herstellung eines hochgereinigten Enzyms kann das rohe Enzym weiter gereinigt werden durch Chromatographie an beispielsweise DEAE-Cellulose. Das Enzym kann adsorbiert oder fixiert an wasserunlöslichen Trägern, wie aktiviertem Ton, Celit, DEAE-Sephadex, DEAE-Cellulose, Sepharose 4-B oder Agar, für die enzymatische Spaltung eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Substrat, nämlich Benzylpenicillin und BenzyIpenicillin-S-oxid, umfaßt die Säuren und ihre Salze, wie die Natrium-, Kalium-, Calcium-, Aluminium-, Ammonium- und substituierten Ammoniumsalze.

Bei der enzymatischen Spaltung werden das Benzylpenicillin oder dessen S-oxid mit dem Enzym zusammengebracht. Beispielsweise wird zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure das Benzylpenicillin einer Kulturflüssigkeit zugesetzt, oder die Enzymlösung oder das Enzym wird einer wäßrigen Lösung, vorzugsweise einer Pufferlösung von Benzylpenicillin, zugesetzt. Eine weitere Möglichkeit ist die Behandlung von Benzylpenicillin mit. einem fixierten Enzym. Auf die gleiche Weise kann das 6-Aminopenicillansäure-S-oxid aus Benaylpenicillin-S-oxid hergestellt werden. Die enzysatische Spaltung kann bei Temperaturen von etwa 30 bis 40⁰C, vorzugsweise bei etwa 37°G und bei einem pH-Wert von 6,5 "bis 9>5₅ insbesondere 7,0 bis 8,5> durchgeführt werden.

130020/0810

L · J

-™- 304095Γ

Wenn die gleiche enzymatisch^ Reaktion mit Escherichia coli durchgeführt wird, ist es erforderlich, dem Reaktionsmedium zur Induktion des Enzyms Phenylessigsäure zuzusetzen. Im erfindungsgemäßen Verfahren ist der Zusatz von Phenylessig-

5 säure nicht erforderlich.

6-Penicillansäure bzw. dessen S-Oxid können in üblicher Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, beispielsweise durch Extraktion oder Chromatographie. Die Verbindüngen können auch in Form ihrer Salze gewonnen werden.

6-Aminopenicillansäure bzw. 6-Aminopenicillansäure-S-oxid sind wertvolle Ausgangsverbindungen zur Herstellung von Penicillinen und Cephalosporinen. Dies geht aus dem nachstehenden Reaktionsschema hervor.

130020/0810
L j

CEL

τ ,3

,-CH,

COOH

(a) JSL

COOH

C^H-OCH₀CON ο 5

.N.

_CH,

O COOCH

(c)

OCH₂CONF , ^ N.

_ov j ^GH3

COOCH₀ 4

(d)

COOCH CCl

(CH₃CO)₂O

Zn/H⁺

!H₃

O COOCH-CCl_

2

C,H OCH S /

CONH-^N/ 'CH₂OCOCH₃

0 COOH

130020/0810

Im Reaktionsschema A ist die Stufe a in der JP-OS 49-5991 beschrieben. Die Stufe b ist in J. Am. Chem. Soc., Bd. (1969), S. 1401, beschrieben. Die Stufe c ist in J. Org. Chem., Bd. 37 (1972), S. 793, beschrieben. Die antibakterielle Aktivität der Verbindung 4 ist in J. Am. Ghem. Soc, a.a.O., beschrieben.

Im Reaktionsschema B ist die Stufe d in dem Buch "Cephalosporins and Penicillins", E.H. Flynn, Academic Press, 1972, S. 663,beschrieben. Die Stufen e und f sind in

J. Org. Chem., a.a.O., beschrieben. Die antibakterielle Aktivität der Verbindung 7 ist in der US-PS 3 466 275 beschrieben.

15 Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

200 ml eines Nährmediums mit 0,5% Glucose, 0,5% Pepton und 0,5% Maisquellwasser und mit einem pH-Wert von 7,0 werden sterilisiert und mit Arthrobacter flagellum nov. sp. M-2183-1 (IERM-P Wr. 5142, ATCC Nr. 31566) beimpft. Das Nährmedium wird 3 Tage bei 28°C unter Belüften inkubiert. Sodann wird es mit einer Lösung von 2 g Benzylpenicillin-S-oxid in 5 ml 1/20 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 versetzt. Hierauf wird das Gemisch weitere 18 Stunden bei 28°C unter Belüften inkubiert. Danach enthält die Kulturflüssigkeit 3»66 mg/ml 6-Aminopenicillansäure-S-oxid. Die Ausbeute beträgt 55*2% d.Th. Die quantitative Analyse wird nach G.E. Boxer et al., Anal. Chem.,

30 Bd. 21 (1949), S. 67O, durchgeführt.

200 ml der Kulturflüssigkeit werden zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Sodann wird der Überstand mit 2n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert, um nicht umgesetzte Ausgangsverbindungen und Phenylessigsäure abzutrennen.

130020/0810 L -¹

Die wäßrige Phase wird mit 2n Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und unter Eiskühlung und Rühren mit 3,22 g Natriumbicarbonat versetzt. Hierauf werden 1,6 g Phenoxyacetylchlorid langsam eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird in üblicher Weise aufgearbeitet. Es werden 780 mg Phenoxyρenicillin-S-oxid vom F. 165 bis 168°C (Zers.) erhalten.

IR:y^CHG13 1798, 1696, 1600, 1495 cm"¹ max

Beispiel 2

Das im Beispiel 1 verwendete Nährmedium wird mit Arthrobacter cremorum nov. sp. M-1376-2 (PERM-P Nr. 514-3, ATCC Nr. 31567) beimpft und mit Benzylpenicillin-S-oxid in einer Menge von 15 mg/ml versetzt. Nach 22stündigem Inkubieren bei 28°C enthält die Lösung 3,15 mg/ml 6-AminopenicillansäuO?e-S-oxid. Die Ausbeute beträgt 34·,2% ά.Th.

Beispiel 3

Das im Beispiel 1 verwendete- Nährmedium wird mit Arthrobacter flagellura nov. sp. M-2183-1 beimpft und das Enzym hergestellt. Danach wird die KuItürflüssigkeit zentrifugiert, um die Zellen abzutrennen. 15 ml des Überstandes werden auf einen pH-Wert von 4-,5 eingestellt, mit 15Ο mg Celite 560 versetzt, und das Gemisch wird 3 Stunden bei 4-⁰C gerührt, um das Enzym zu adsorbieren» Danach wird das an Celite 560 adsorbierte Enzym abfiltriert. Das erhaltene immobilisierte Enzym wird in 3 ml einer 3 mg/ml enthaltenden Lösung von Benzylpenicillin-S-oxid in 1/20 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»0 suspendiert. Die erhaltene Suspension wird 2 1/2 Stunden bei 28°G gerührt. Danach enthält die Lösung 1,4-52 mg/ml 6-Aminopenicillansäure-S-oxid. Die Ausbeute beträgt 73% d.Th.

_L 130020/0810 _,

1 Beispiel 4

8 ml eines stark basischen Anxonenaustauscherharζes (Aiaberlite IRA-904) in der Chlorid-Form werden in einen Glaszylinder eingefüllt und mit 1/100 molarem Phosphatpuff er vom pH-Wert 7,0 behandelt. 200 ml des in Beispiel 3 erhaltenen Überstandes werden auf die Austauschersäule gegeben, um das Enzym zu adsorbieren. Danach wird die Säule mit 1/20 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»0 gewaschen. Hierauf wird der Phosphatpuffer, der 3 mg/ml Benzylpenicillin-S-oxid enthält, auf die Säule in einer Menge von 9»5 ml pro Stunde gegeben. Die Innentemperatur der Säule beträgt 28°C. Die Menge des entstandenen 6-Aminopenicillansäure-S-oxids im Eluat schwankt zwischen 1,68 und 1,74-6 mg/ml. Dies entspricht einer Ausbeute von

15 91,2 bis 94,8% d.Th.

Beispiel 5

Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wird Arthrobacter flagellum nov. sp. M-2183-1 gezüchtet und ein zellfreies Medium hergestellt. 2,5 Liter des zellfreien Mediums werden mit AmmoniuBisulfat versetzt. Das Enzym wird bei einer Sättigungskonzentration von 50 bis 70% ausgefällt, abgetrennt und in 20 ml eines 1/100 molarem Phosphatpuffers vom pH-Wert 8,0 gelöst. Die erhaltene rohe Enzymlösung wird gegen den gleichen Puffer während 24- Stunden bei O⁰C dialysiert.

2,4· g DEAE-Sephadex A-25 werden in 1/100 molarem Phosphatpuffer vozi pH-Wert 8,0 suspendiert, und die erhaltene Lösung wird in eine Säule gefüllt. Sodann wird die erhaltene dialysierte rohe Enzyialösung auf die Säule gegeben und an dem Harz fixiert. Hierauf wird die Säule mit 1/100 bis 1/20 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 gewaschen. Sodann wird eine 1/20 molare Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 8,0, die 15 mg/ml Benzylpenicillin-S-oxid enthält, auf die Säule in einer Menge von 10 bis 11 ml pro Stunde

130020/0810

L J

gegeben. Die Innentemperatur der Säule beträgt 28°C. Die Konzentration an 6-Aminopenicillansäure-S-oxid wird >/ährend der gesamten Versmchsdauer bestimmt. Die Umsetzung wird 5 Tage durchgeführt. Das S-Oxid fällt in einer Ausbeute von 90,3 bis 97,5% d.Th. an. Während der Versuchsdauer kann kein signifikanter Abfall der Enzymaktivität beobachtet werden.

Beispiel 6

8,5 g DEAE-Cellulose (Watman DE 52) werden in 1/100 molarem Phosphatpuffer vom pH-wert 8,0 suspendiert. Die Suspension wird mit 43,5 ml einer zellfreien rohen Enzymlösung versetzt, die aus 4-, 5 Liter Kulturflüssigkeit gemäß Beispiel 5 hergestellt worden ist. Das Gemisch wird 3 Stunden

¹^ bei 4°C gerührt. Danach wird das erhaltene immobilisierte Enzym in eine Säule gefüllt, die sodann mit 1/100 bis 1/10 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5 gewaschen wird. Hierauf wird eine Lösung von 1/10 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5» der 30 mg/ml Benzylpenicillin-S-oxid enthält, in einer Menge von 10,2 ml pro Stunde während 30 Stunden auf die Säule gegeben. Die Innentemperatur der Säule wird auf 28°C eingestellt. Das 6-Aminopenicillansäure-S-oxid wird in einer Ausbeute von 95,8 bis 100% d.Th.

erhalten.
25

Beispiel 7

Die gemäß Beispiel 5 hergestellte rohe Enzymlösung wird an DEAE-Ceilulose gereinigt. Die aktive Fraktion wird aufgefangen und durch Ultrafiltration konzentriert. 30

12 ml eines 4-prozentigen perlenf Örmigen Agargels (Peuchtgewicht 8,9 g) werden mit Bromcyan gemäß J.B.C.,* Bd. 245 (197Ο), S. 3Ο59, aktiviert. Sodann wird das aktivierte Material zur Enzymlösung gegeben. Das erhaltene immobilisierte Enzym wird in eine Säule eingefüllt und mit I/IO molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5 gewaschen. Hierauf * Journal of Biological Chemistry

130020/0810 ^

BAD ORIGINAL

wird durch die Säule während 30 Stunden ein 1/10 molarer Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5, der 30 mg/ml Benzylpenicillin-S-oxid enthält, in einer Menge von 10 bis 11 ml
pro Stunde gegeben. Die Innentemperatur der Säule wird

auf 28°C eingestellt. Die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure-S-oxid beträgt 91,2 bis 96,9% d.Th.

Beispiel 8
Beispiel 7 wird wiederholt, jedoch wird die Innentempe-

ratur der mit dem immobilisierten Enzym gefüllten Säule
auf 3O⁰C eingestellt. Hierauf wird die Säule in einer
Menge von 8 ml pro Stunde mit 1/10 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,5 beschickt, der 30 mg/ml Benzylpenicillin enthält. Die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure im Eluat

15 beträgt 80,0 bis 85,5% d.Th.

130020/0810

AD QRlGiHAL

Claims

ρ r. VOSSIUS · VOSSIUS · TAUCH NER · HEUNEMAN N-fiÄU H - ·""■■'" -■■'■ PATENTANWÄLTE,,:.. ; SIEBERTSTRASSE Ά ■ 8OOO MÜNCHEN 86:. PW.ONE: (089)4-7 4O T5 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN · TELEX 5-29 453 VOPAT D 5U.Z, : P 823 .00/E). SHIOIIOGI & CO., LTTJT Osaka, Japan "Verfahren zur Herstellung von 6-Aminppenxcdllansäure oder deren S-oxid" Priorität: 3O. Oktober 1979, Japan, Nr. 140 928/79 15 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 6-Amxnopenxcillansäure-S-oxid, dadurch gekennzeichnet, daß man Benz^lpenicillin-S-oxid mit einem von Mikroorganismen der ,„Gattung Arthr ob act er erzeugten Enzym behandelt.

2. Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure oder 6-Aminopenicillansäure-S-oxid, dadurch gekennzeichnet, daß man Benzylpenicillin bzw. Benzylpenicillin-S-oxid mit einem von Mikroorganismen des Stammes Arthrobacter creiaorum oder Arthrobacter flagellum oder deren Mutanten oder Varianten erzeugten Enzym behandelt,

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzym von Arthrobacter cremorum M-1376-2 (ATCG Nr. 31 567) verwendete
35

130020/0810

L ■■-. j

BAD ORIGINAL

-G£ -^₂-- 304095

Verfahren nach Anspruch 2, dadurch, gekennzeichnet, daß man ein Enzym von Arthrobacter flagellum M-2183-1 (ATCG Nr. 31566) verwendet.

"^c5.fy^
" '" '"'"° eremorum ö der^l Ärtirofeiactelf %lägefflm,¹ "^Μβιοη^ΓΊΡ

• ■.--.■■-:. = -α--./"":.· ,αν/5'ϊί·.'· s^r>;.;ii-3 rxe^lx^I ier-o riex-xjiv; iS ;:"·" ΐ ib

^:;" ··-'■"■■■-■■ ■■- V-^^-Kf-I rr,_fi «·>.λ--^ · ,Γ,,-aicr^

T30 0 2Ό/0 S 1 Q

BAD ORIGhMAL