JP2665533B2 - 寒天分解酵素産生菌及び該菌株により産生された酵素を用いて植物組織培養苗の寒天培地を軟化させる方法 - Google Patents

寒天分解酵素産生菌及び該菌株により産生された酵素を用いて植物組織培養苗の寒天培地を軟化させる方法

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潔 梶原
奈美 麻生
剛 速見
康夫 礒
卓 ▲吉▼原
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Description

【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕 本発明は寒天分解酵素を産生する特定の微生物と、こ
の微生物により産生された酵素を用いて植物の組織培養
の際の寒天培地を軟化させ、苗の植え替えを簡便に行な
う方法に関するものである。 〔従来の技術〕 寒天は植物の組織培養に広く用いられているが、植物
苗の土壌への植え替えの際には、その根から寒天を奇麗
に荒い落とさなければならない。従来は人手によつて寒
天を根から揉みほぐしていたのであるが、この方法は非
常に手間の掛かる作業である。そこで、この様な寒天を
効率的に軟化させる方法の確立が要望されているのが現
状である。 〔発明が解決しようとする課題〕 植物苗の植え替えに於いて、根から寒天を取除く作業
は非常に手間の掛かる作業である。そこで、こうした植
物苗の植え替えを、より効率良く行なうためには容易に
寒天を軟化させる物質(寒天分解酵素)を大量に生産す
る方法が必要である。 〔課題を解決するための手段〕 今迄に寒天分解酵素としてはSIGMA社から市販されて
いる試薬Agaraseや、サイトフアーガ属,シュードモナ
ス属,ビブリオ属の微生物によつて産生される酵素が知
られており、斯かる酵素を用いる事によつて植物苗の寒
天培地を簡単な条件下に軟化出来ることを知見した。 そこで本発明者等は寒天分解酵素を産生する微生物の
検索を行なつた。その結果、キサントモナス属に属する
特定の微生物を培養することにより目的とする寒天分解
酵素が得られることを見い出した。更に斯かる酵素を用
いる事によつて植物苗の寒天培地を極めて簡単な条件下
に軟化出来ることも知見した。本発明は斯かる知見に基
づいて完成したものである。 本発明の内容を以下に詳記する。 (1)キサントモナス属に属し、寒天分解酵素を産生す
る微生物の究明、 (2)キサントモナス属に属する微生物の産生する寒天
分解酵素を用いて植物の組織培養の際の寒天培地を軟化
させ、組織培養苗の植え替えを簡便且つ効率的に行なう
方法。 以下に本発明者等が海水から分離したキサントモナス
属に沿する寒天分解酵素産生菌の菌学的性質を示す。 キサントモナスsp.TK−38の菌学的性質 (a)形態 顕微鏡的観察(0.1%寒天を含むニユートリエントブ
ロスNo.2の培地で48時間培養) 細胞の形及び大きさ 0.5〜0.8μm×1〜2μmの桿菌 細胞の多形性の有無 細胞の多形性を有しない, 運動性の有無 極鞭毛を有し、運動性を有する, (レイフソンの鞭毛染色法に従い、染色後観察) 胞子の有無 無し グラム染色法 陰性 (b)各培地に於ける生育状態 0.1%寒天,2%フアーセランを含むニユートリエント
ブロスNo.2の(Difco)の平板培地, 30℃,48時間で1〜2mmの丸いコロニーを形成,色は淡
黄色を呈し、艶のある、厚みのあるコロニー。 1.5%寒天を含むニユートリエントブロスNo.2の平板
培養, 30℃,48時間で菌体は寒天を凹ませ、培地上にはコロ
ニーに従つて丸い凹みが出来る。 マリンアガー(Difco)平板培養, と同様の状態である。 0.1%寒天を含むマリンブロス(Difco)の液体培養, 30℃,48時間,150rpm(ロータリーシエーカー)で、培
地は黄色に濁り、寒天による澱みが無くなる。 (c)生理学的性質 a.硝酸塩の還元 還元する b.MRテスト 陰性 C.VRテスト 陰性 d.インドールの生成 生成しない e.硫化水素の生成 生成しない f.デンプンの加水分解 加水分解する g.エクスリンの加水分解 加水分解する h.ゼラチンの加水分解 加水分解しない i.ウレアーゼ 陰性 j.オキシダーゼ 陽性 k.カタラーゼ 陽性 l.色素の生成 キサントモナジンを生成 (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology volme
1による) m.ミルク・パープル培地での酸産生 陰性 (ミルクタンパクの分解) n.酵素に対する態度 好気性 o.O−Fテスト 酸化 p.生育の範囲 温度10〜40℃ pH 5〜9 塩濃度0〜3% q.糖類からの酸産生(アンドレイド・ペプトン水培地,p
H7.4) 3週間培養 グルコース + マンノース +(弱) フルクトース − ガラクトース + トレハロース + サツカロース + キシロース + ラクトース + イノシトール 資化せず マルトース + アラビノース + ソルビツト 資化せず マンニツト 資化せず グリセリン 資化せず 以上の菌学的性質から本菌株はキサントモナス属に分
類される。類縁菌としてはキサントモナス・アルビリネ
アンスが挙げられるが、生育可能な塩濃度や糖の分解に
よる酸生成などの結果が異なる。よつて本菌株はキサン
トモナス属に属する新菌種である(Bergey's Manual of
Syatematic Bacteriology volume 1による)。 本発明の新規な寒天分解酵素産生菌を栄養培地に接種
し培養することによつて目的とする寒天分解酵素を製造
することが出来る。ここで培地としては食塩と寒天を含
み、該微生物が利用し得る栄養物を含むものを用いた。
例えば、0.1%程度の寒天を含むマリンブロスなどが挙
げられる。培養法としては振盪培養が好適であり、培養
温度は20〜40℃、好ましくは25〜30℃である。培養日数
は1〜5日,好ましくは1〜2日が適当である。なお微
生物の性質を考慮して目的とする酵素の生産量が最大と
なる様に培養条件を選定すべきである。 上記の如くして得た培養液から遠心分離によつて菌体
を除き上澄から常法により粗酵素を得た。粗酵素はpH6
〜7の状態で凍結乾燥し、低温で保存した。苗の培地を
軟化させる際には粗酵素を蒸留水で溶解し、適量を直接
試験管内の寒天高層培地に注入し、1〜3日間,20〜30
℃で放置した。その結果、培地はゲル状に軟化し、容易
に苗を引抜くことが出来る。苗は軽く水洗いした後、土
壌に植え継いだ。移植後,苗は正常に活着し、酵素作用
による物理的,生理的な障害は全く認められなかつた。 粗酵素は上澄より次の様な方法によつて得られた。即
ち、上澄を硫酸アンモニウムで塩析し、析出した沈殿を
集めて透析による脱塩を行ない(pH6の状態で)、その
後、凍結乾燥に掛けて粗酵素とした。得られた粗酵素の
活性は8U/mg程度であつた。酵素活性の最適温度は45
℃,最適pHは6,pHはリン酸バツフアーにより調節した。
ここで1Uとは定められた条件下で毎分1μgガラクトー
ス相当の還元糖を生成する酵素量とする。 〔実施例〕 実施例1 キサントモナスsp.TK−38をMA液体培地(150ml/三角
フラスコ)1本に接種し、30℃で1日間振盪培養(150r
pm)した後、之を1ml宛NC液体培地(600ml/三角フラス
コ)9本に接種し、MA液体培地と同条件で1日間培養を
行なつた。培養終了後、菌体及び不溶物を遠心分離(80
00rpm,15分)によつて取り除き、上澄から以下の様な方
法で粗酵素を得た。即ち上澄を硫酸アンモニウムで塩析
し(飽和度80%)、析出した沈殿を遠心分離(5000rpm,
15分)で集めて、透析による脱塩を行なつた(pH6の状
態で)。その後凍結乾燥に掛け、粗酵素とした。酵素の
活性及び回収率は、下表の通りである。 酵素活性はソモギー・ネルソン法で測定した。1%の
寒天を含む0.1Mリン酸バツフアー(pH6)0.9mlに酵素液
0.1mlを加え、45℃で10分間反応させた。反応後ソモギ
ー銅液1mlを加えて反応を停止させ、100℃で15分間加熱
した。充分に反応液の温度を下げてからネルソン液2ml
を加え、波長500nmで吸光度を測定し、その値から酵素
活性を算出した。 実施例2 実施例1の様にして得られた粗酵素をリン酸バツフア
ー(pH6)に溶かし、800U/mlの濃度にし、試薬Agarase
(Sigma社製)を同様の方法で800U/mlの濃度にし、次の
様な方法で培養苗(アスパラガス)の寒天溶解試験を行
なつた。用いた苗は5cm程度に生育したもので、培地は1
0mlの高層培地(試験管)であつた。各培養苗1本に対
して酵素液5mlを注入し、25℃で2日間放置した。その
結果、実施例1で得られた粗酵素と試薬Agarase(Sigma
社製)とは全く同様の効果を示し、苗に付着している寒
天は軽く流水を当てることで簡単に除去出来た。また対
照として用いたリン酸バツフアー5mlでは全く寒天は溶
解しなかつた。 実施例3 実施例1と同様にして得られた粗酵素をリン酸バツフ
アー(pH6)に溶かし、760U/mlの濃度にし、5mlを植物
苗の植え付けられている寒天培地に直接注入した。ここ
で使用した苗の培地は試験管の10mlの高層培地で、苗は
5〜8cm前後まで生育したアスパラガスとガーベラであ
る。注入後は、25℃,60rpmで2日間振盪した。2日後、
苗を軟化した寒天から抜取り、軽く水洗いして用土に植
え継いだ。その後、苗の活着,生育の状態を観察した
が、何れも正常な生育が認められた。 実施例4 実施例1と同様にして得られた粗酵素を蒸留水に溶か
し、0U/ml,400U/ml,800U/mlの濃度の酵素液を作り、夫
々を3ml宛実施例2と同様の寒天培地に注入した。注入
後は25℃,静置で2日間放置した。2日後、実施例2と
同じ様にして苗を抜取り、軽く水洗いし、寒天の除去が
充分であるか否かを観察した。その結果、800U/mlの場
合に寒天は充分に軟化しており、簡単に除去出来た。之
に対して400U/mlでは寒天が稍々軟化しているが容易に
は苗を抜き取り難く、0U/mlでは寒天の軟化は認められ
なかつた。 なおキサントモナスsp.TK−38は(FERM P−9763)と
して昭和62年12月18日付で微工研に受託されている。
【受託証添付】
〔発明の効果〕 前述の如く本発明により寒天分解酵素が大量に生産さ
れ、苗の培地の軟化は非常に簡便に行なわれる。アスパ
ラガスなどの苗は非常に根毛が多く寒天を手で揉みほぐ
すことにより先端根毛を痛めたり、また寒天を奇麗に取
除くことが困難であつた。培地寒天の除去が不充分であ
ると病原菌の汚染の原因にもなるため、本発明を利用す
ることによつて苗の大量を植え継ぎが従来に比べ非常に
簡便且つ効率的に行なうことが可能になつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 速見 剛 東京都中央区月島3―2―9 大洋漁業 株式会社大洋研究所内 (72)発明者 礒 康夫 東京都中央区月島3―2―9 大洋漁業 株式会社大洋研究所内 (72)発明者 ▲吉▼原 卓 東京都中央区月島3―2―9 大洋漁業 株式会社大洋研究所内 (56)参考文献 南竹 茂,Bull.Coll.Ag r.& Vet.Med.,Nihon Univ.,No.43,P.84−91 (1986)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】寒天分解酵素を植物の組織培養用寒天培地
    に作用させて、組織培養苗の植え替えを簡便且つ効率的
    に実施するために植物組織培養苗の寒天培地を軟化させ
    る方法。
  2. 【請求項2】寒天分解酵素産生菌としての新規微生物で
    あるキサントモナスsp.TK−38(寄託番号FERMP−9763) 同定項目 (a)形態: 細胞の形及び大きさ 0.5〜0.8μm×1〜2μmの桿菌 細胞の多形性の有無 細胞の多形性を有しない, 運動性の有無 極鞭毛を有し、運動性を有する, 胞子の有無 無し グラム染色法 陰性 (b)各培地に於ける生育状態 0.1%寒天,2%フアーセランを含むニユートリエント
    ブロスNo.2(Difco)の平板培地, 30℃,48時間で1〜2mmの丸いコロニーを形成,色は淡黄
    色を呈し、艶のある、厚みのあるコロニー。 1.5%寒天を含むニユートリエントブロスNo.2の平板
    培養, 30℃,48時間で菌体は寒天を凹ませ、培地上にはコロニ
    ーに従つて丸い凹みが出来る。 マリンアガー(Difco)平板培養, と同様の状態である。 0.1%寒天を含むマリンブロス(Difco)の液体培養, 30℃,48時間,150rpm(ロータリーシエーカー)で、培地
    は黄色に濁り、寒天による澱みが無くなる。
  3. 【請求項3】キサントモナスsp.TK−38(FERM P−976
    3)により産生された寒天分解酵素を植物の組織培養用
    寒天培地に作用させて、組織培養苗の植え替えを簡便且
    つ効率的に実施するために植物組織培養苗の寒天培地を
    軟化させる方法。
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