DE3022527A1 - Verfahren zur durchfuehrung einer elektrophorese sowie vorrichtung dazu - Google Patents
Verfahren zur durchfuehrung einer elektrophorese sowie vorrichtung dazuInfo
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Verfahren zur Durchführung einer Elektrophorese sowie Vorrichtung dazu
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Elektrophorese in einem elektrischen Feld, wobei Moleküle
od. dgl. in einem porösen Stoff, beispielsweise in einem Gel, bewegt und — beispielsweise optisch — erfaßbar gemacht
werden. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung avf eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die als Elektrophorese bezeichnete elektrokinetxsche Erscheinung wird vor allem in der analytischen und in
der klinischen Chemie zur Analyse von Stoffgemischen verwendet, wozu man die verschiedenen Wandergeschwindigkeiten
von Ionen im elektrischen Feld bestimmt. Zu dem hat sich die Elektrophorese in porösen Medien —
beispielsweise in Polyacrylamid - und Agarose- Gelen — zu einer wichtigen analytischen und auch präparativen
Methode in Biochemie und Medizin entwickelt, um beispielsweise komplexe Gemische von Nucleinsäuren oder
Proteinen in einzelne Bestandteile zu trennen.
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P-108 - 2 -
Hierbei wandern nach Anlegen eines elektrischen Feldes
verschiedene Moleküle entsprechend ihrer Beweglichkeit unterschiedlich weit in jenes — hier alle dazu anwendbaren
Stoffe begrifflich umfassende — Gel und werden dadurch räumlich getrennt. Anschließend kann durch
spezifisches Einfärben dieser Moleküle die Verteilung des Gemisches sichtbar gemacht und analysiert werden.
Nachteilig bleibt hierbei, daß das Gelmaterial aus der Elektrophoresevorrichtung entfernt wird und nur einmal
verwendet werden vermag. Um eine befriedigende Auflösung sehr vieler Komponenten — beispielsweise bei
der Sequenzanalyse von DNS bis zu mehrere hundert verschieden lange Moleküle — zu erreichen, v/erden
dabei heute bis zu einem Meter lange Gele verwendet, welche eine sehr hohe Spannung voraussetzen, um einen
genügend großen Spannungsgradienten zur Verfügung zu haben, welcher eine Trennung in annehmbarer Zeit erlaubt
.
Bei präparativen Elektrophoresen wird üblicherweise am Ende des Gels eine stationäre Auffangkammer vorgesehen,
in welche die Moleküle wandern. Diese Kammer wird von Zeit zu Zeit geleert und dann wieder neu gefüllt,
wodurch eine stufenweise Auftrennung des Gemisches in seine Komponenten erreicht werden kann.
Angesichts dieser Gegebenheiten hat sich der Erfinder das Ziel gesetzt, ein Verfahren und eine Vorrichtung
der eingangs erwähnten Art so zu verbessern, daß die Handhabung erleichtert, die Gelgröße .reduziert und
der Vorgang insgesamt gegebenenfalls automatisiert durchgeführt werden kann.
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P-108 1·. - 3 -
Zur Lösung dieser Aufgabe führt, daß an dem porösen Stoff, beispielsweise dem Gel, etwa an dessen in
Wanderrichtung der Moleküle liegendem Ende wenigstens eine bewegte Aufnahmefläche vorbeigeführt wird, welche
bevorzugtermaßen kontinuierlich läuft.jedoch im Rahmen der Erfindung auch schrittweise betrieben werden kann.
Nach einem weiteren Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Moleküle auf der Aufnahmefläche
— kontinuierlich — durch Ionenaustausch angesiedelt oder an reaktive chemische Gruppen gebunden.
Im Rahmen der Erfindung liegt eine Vorrichtung, innerhalb deren jener poröse Stoff, beispielsweise das Gel,
an der Bewegungsbahn zumindest einer etwa bandartig ausgebildeten und von einem Antrieb bewegbaren Aufnahmefläche
angeordnet ist, welche als kontinuierlich laufendes oder umlaufendes Förderband gestaltet sein
sollte.
Vorteilhafterweise ist das Förderband mehrschichtig ausgebildet, wobei die dem Gel od. dgl. zugekehrte
Schicht zur Aufnahme der Moleküle und die andere Schicht als Träger für diese Aufnahmeschicht dient,
was es beispielsweise erlaubt, mechanisch wenig strapazierfähige Aufnahmeschichten zu verwenden,
welche etwa auf einem als Träger dienenden Kunststoffnetz ruhen und über dieses vom Antrieb bewegt
werden.
Als besonders günstig haben sich Aufnahmeschichten
aus Papier, Folie od. dgl. mit einer zur Ladung der Ionenmolekülfc entgegengesetzten Oberflächenladung
erwiesen oder auch Aufnahmeschichten mit reaktiven chemischen Gruppen zur kovalenten oder
nichtkovalenten Bindung der Moleküle
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ff
P- 108 . - A -
In einer relativ kurzen und festen porösen Phase, welche hier als Gel — etwa Polyccrylamidgel, Agarosegel,
Papier, Folie od. dgl. — bezeichnet und.an die eine Gleichspannung angelegt wird, bewegen sich die
geladenen Moleküle oder Teilchen des Gemisches entsprechend ihrer Beweglichkeit zum Ende des Gels und
werden dort an das bewegliche Band gebunden, d.h. an dessen geladene Oberfläche (Ionenaustauscher-Papier)
oder an seine peaktiven chemischen Gruppen. Anschließend kann das Band nach einem v/eiteren Merkmal
der Erfindung durch ein Fixier- oder ein Färbebad geführt werden; die Komponeten werden sichtbar
gemacht und können registriert werden. Auch ist es erfindungsgemäß möglich, unter Bedingungen,bei denen
die Wechselwirkung "Teilchen/Band" aufgehoben ist, die Komponenten einzeln VOIr1 Band zu eluieren und zu
sammeln.
Die Breite einer eluierten Komponente auf dem Band oder Förderband wird um so kleiner, je dünner das
Gel ist, so daß bei analytischen Problemen die Verwendung möglichst dünner Gele angebracht scheint.
Es kann aber nach einem weiteren Merkmal der Erfindung durch die Wahl eines Winkels zwischen der Elutions-
oder Wanderrichtung der .Teilchen und der Bewegungsbahn des Bandes eine Konzentrierung der Komponenten
erreicht werden, da hierbei das Förderband — in Förderrichtung gesehen — das Gel zuerst an einer Berührungslinie
trifft, während die innerhalb des Gels von dieser Berührungslinie weiter weg liegenden Teilchen
etwas später auf das bereits Moleküle tragende Band auftreffen. Dies kann bei Analysen, insbesondere
bei präparativen Vorgängen, von Bedeutung sein.
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P-108 . - 5 -
Andererseits ist es möglich, durch hohe Bandgeschwindigkeiten eine Komponente über eine große Fläche zu verteilen
und damit eine mögliche Begrenzung durch Bindunaskapazität des Bandes zu vermeiden.
Die Verwendung eines beweglichen Bandes, auf dem die Teilchen oder Molekühle beim Verlassen des Gels gebunden
werden, ergibt eine zusätzliche Dimension bei der elektrophoretischen Trennung. So kann der Abstand zwischen Komponenten
auf dem Band durch Änderung der Bandgeschwindigkeit erfindungsgemäß leicht variiert werden. Darüber hinaus
ist die Programmierung der Bandgeschwindigkeit des Spannungsgradienten oder der Temperatur im Hinblick auf die relative
Lage der Komponenten auf dem Band möglich.
Im Rahmen der Erfindung liegt auch die Verwendung verschiedener Werkstoffe und Materialien für das — erfindungsgemäß
gegebenenfalls mehrschichtige — Förderband. So sind Nachweismethoden — etwa durch Färbung,
Radioaktivität od. dgl. — nicht mehr an das Gelmaterial gebunden, wodurch eine größere Flexibilität erreicht
wird.
Von besonderer Bedeutung für die Erfindung ist, daß die Trennung von Elektrophorese und dem Nachweis auf dem Band
es ermöglicht, reaktive Gruppen kurz vorher zu aktivieren bzw. das Färben oder sonstige Analysenvorbereitungen,
aber auch die Elution der gebundenen Moleküle oder Teilchen nach der Elektrophorese in einem kontinuierlichen,
automatischen Arbeitsgang in verschiedenen Bädern oder Vorrichtungen durchzuführen.
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P-108 4V - 6 -
Durch ein Waschen des Bandes nach der Analyse oder EIution
kann dieses wieder verwendet werden, was eine Materialersparnis mit sich bringt.
Nachdem alle Komponenten eines Gemisches aus dem Gel entfernt sind, kann letzteres wieder mit einem neuen Gemisch
beladen und in die Vorrichtung eingebracht werden; Arbeits- und Materialkostenersparnisse bei der Gelherstellung
sind evident, die P.eproduzierbarkeit der Trennung wird erhöht. Die bereits erwähnte Verwendung kurzer Gele
führt ebenfalls zu einer Materialersparnis und bietet darüber hinaus noch den Vorzug, daß die Zeit, welche etwa
schnell wandernde Molekühle im Gel verbringen, entsprechend verkürzt werden kann, wodurch die Diffusion
vermindert und die Trennschärfe erhöht wird. Die Gesamtspannung
bei der Elektrophorese, die zur Erzielung eines bestimmten Spannungsgradienten benötigt wird,
kann bei kurzen Gelen entsprechend verkleinert werden, was die Betriebssicherheit erhöht, die Energiekosten
senkt und ein einfaches Abführen entstehender Wärme erlaubt.
Eine geometrische Konzentrierung am Kontaktbereich zwischen Gel und Band, wie sie in Unteransprüchen beschrieben
ist, ermöglicht es, auf dem Band Moleküle einer Zone zu konzentrieren, deren Breite geringer ist
als die Stärke des Gels. Hierdurch kann eine Erhöhung der Empfindlichkeit bei der Analyse oder eine bessere
Auflösung bei präparativen Trennungen erreicht werden#
Von besonderem Vorteil ist die Anbringung des Gels in
einem etwa vertikalen Schacht mit einer am Förderband vorgesehenen Mündung. Diese Mündung kann so lang gewählt
werden, daß mehrere Förderbänder nebeneinander anzuordnen sind, die auch gegebenenfalls mit unterschiedlichen
Geschwindigkeiten laufen.
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Hierzu kann auch vorteilhaft sein, den Grundriß der Mündung beispielsweise dreieckförmig auszubilden,
so daß über einem der Bänder oder an einer Seite des Bandes die Mündung von geringerer Breite ist
als auf der anderen Seite bzw. dem benachbarten Band,eine Konfiguration, die vor allein bei Verwendung
mehrerer Bänder nebeneinander neue Möglichkeiten erschließt. Darüber hinaus hat sich bei der
Bearbeitung unterschiedlicher Gele nebeneinander eine Auflagefläche für die Gele mit mehreren zueinander
parallel eingeformten Gelnuten als günstig erwiesen.
In der Praxis hat es sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung und das Verfahren sowohl für analytische
Vorgänge als auch für präparative Trennungen eingesetzt werden kann, was das Anwendungsgebiet erheblich
erweitert.
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■ (
Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter
Ausführungsbeispiele sowie anhand der Zeichnung; diese zeigt in
Fig. 1: den schematisierten Querschnitt durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung;
Fig. 2: die Draufsicht auf ein vergrößertes Detail eines anderen Ausführungsbeispiels, geschnitten
etwa nach Linie II - II in Fig. 1;
Fig. 3: den vergrößerten Querschnitt eines Teiles einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 4: ein anderes Detail einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 5: ein anderes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung. Fig. 6: eine Schrägsicht auf öin Detail einer weiteren Ausführung.
In einem Puffergefäß 1 einer Vorrichtung E zur Durchführung der Elektrophorese ist in dessen Achse A eine Elektrode 2 vorgesehen, die mit einer darunter im Abstand h vorhandenen Gegenelektrode 3 ein nicht dargestelltes elektrisches Feld erzeugt. In dessen Bereich liegt ein vertikaler Austragsschacht 4 der Breite b und der Höhe i für ein darin befindliches Gel G.
In einem Puffergefäß 1 einer Vorrichtung E zur Durchführung der Elektrophorese ist in dessen Achse A eine Elektrode 2 vorgesehen, die mit einer darunter im Abstand h vorhandenen Gegenelektrode 3 ein nicht dargestelltes elektrisches Feld erzeugt. In dessen Bereich liegt ein vertikaler Austragsschacht 4 der Breite b und der Höhe i für ein darin befindliches Gel G.
Beidseits des nach oben hin im Gefäßboden 5 endenden Austragsschachtes
4 sind Kammern 6 für thermische Elemente zur Tempera turbeeiriflus sung vorgesehen.
Die Gefäßwände 7 verlaufen in Fig. 1 parallel zu den Schachtwänden 8 und sind mit deren unteren Enden durch die
querschnittlich gekrümmten Kammeraußenwände 9 verbunden.
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P-108 ■ - 9 -
Unterhalb der Schachtmündung 10 ist ein Band 11 angeordnet,
das an Rollen 12 in Pfeilrichtung χ horizontal die Schachtmündung 10 unterfährt. Letztere und das Band
11 sind in eine Flüssigkeit 13 getaucht, welche sich in
einer Wanne 14 befindet.
Das über eine Umlenkrolle 15 aus der Flüssigkeit 13 aufwärtsgeführte
Band 11 wird durch eine Antriebsrolle an einer Druckrolle 17 gesteuert bewegt.
Die aus dem Gel G austretenden Ionen werden von einer Filterschicht 20, beispielsweise einem Filterpapier,
des Bandes 11 aufgenommen und über der Flüssigkeit 13 horizontal ausgetragen. Die Filterschicht 20 ruht auf
einem Traggewebe 21.
Während die Breite b des Austragsschachtes 4 bei der Vorrichtung E der Fig. 1 konstant ist, zeigt Fig. 2 eine
Schachtmündung 10, deren Breite b1 nach einer Gefäßseite
hin zunimmt und welche von mehreren Bändern 11 , 11, ,
abc
unterfahren wird.
Das einschichtige Band 11 nach Fig. 3 ist unter einem Austragsschacht
4 mit sich zur Schachtmündung 10 hin verjüngendem Querschnitt vorgesehen.
Fig. 4 läßt ein zum Gel G in einem Winkel w geneigtes zweischichtiges Band 11 erkennen, welches das Gel G
an einer — in Förderrichtung χ vorderen — Berührungslinie 23 erreicht. Die Ionen des in Abstand b dazu stehenden
Gelbereiches erreichen das Band 11 erkennbar später und zwar in Abhängigkeit von ihrer Austrittsgeschwindigkeit V1 und der
Bandgeschwindigkeit v«.
- 10 -
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P-108 - 10 -
Bei dem Ausführungsbeispiel der Fig. 5 trägt des Band 11 vertikal aus; es durchfährt ein Fixier- oder ein
Waschbad 24 und berührt anschließend das auf einem Tunnel 25 ruhende Gel G entlang einer Vertikalfläche
26. Bei dieser Vorrichtung E1 wird das Gelgemisch
über eine Schurre 27 zugeführt.
Gemäß Fig. 6 können in die Auflagefläche 28 des Tunnels 25 mehrere nutartige Rinnen 29 zur Aufnahme verschiedenartiger
Gele Gw G , G_ eingeformt sein.
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- 4t·
Leerseite
Claims (30)
1. Verfahren zur Durchführung einer Elektrophorese in
einem elektrischen Feld, wobei Moleküle ocL* iUjl in
einem porösem Stoff, beispielsweise einem Gel, bewegt und erfaßbar gemacht werden,
dadurch gekennzeichnet,
daß an dem porösen Stoff etwa an dessen in Wanderrichtung der Moleküle liegendem Ende wenigstens eine
bewegte Aufnahmefläche vorbeigeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche kontinuierlich bewegt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle auf der Aufnahmefläche durch Ionenaustausch
angesiedelt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle an reaktive chemische Gruppen der Aufnahmefläche
gebunden werden.
5. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche nach dem
Gel durch ein Färbebad und/oder ein Fixierbad geführt wird.
6. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß das Gel etwa vertikal zur Aufnahmefläche gerichtet wird.
- A2 -
13ÖÖS1/0363
P-108 - A2 -
7. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahitieflache in einem
Neigungswinkel (w) zur Wanderrichtung der Moleküle am Gel vorbeigeführt wird.
8. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Neigungswinkel (w)
und/oder die Fördergeschwindigkeit (v_) der Aufnahmefläche
verändert wird/werden.
9. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fördergeschwindigkeit der Aufnahmefläche programmiert gesteuert wird.
10. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche durch
ein Reinigungsbad geführt wird.
11. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach wenigstens
einem der Ansprüche 1 bis 10 mit einem porösen Stoff, beispielsweise einem Gel, in einem elektrischen
Feld, dadurch gekennzeichnet, daß der poröse Stoff, beispielsweise ein Gel (G), an der Bewegungsbahn zumindest
einer etwa bandartig ausgebildeten und von einem Antrieb (16) bewegbaren Aufnahmefläche angeordnet
ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche als kontinuierlich um/laufendes
Förderband (11) ausgebildet ist.
- A3 -
130051/0368
P-108 - A3 -
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die als Förderband (11) ausgebildete Aufnahmefläche einen zumindest zweischichtigen
Querschnitt aufweist, wobei die dem Gel (G) od. dgl. zugekehrte Schicht (20) zur Aufnahme
der Moleküle und die andere Schicht (21) als Träger für die Aufnahmeschicht (20) dient.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
daß als Trägerschicht (21) ein begrenzt flexibles Band, beispielsweise ein Kunststoffnetz,
dient, welches vom Antrieb (16) bewegt ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Förderband (11)
aus mehreren einander benachbarten Bandtrumen (11 - 11 ) besteht, wobei gegebenenfalls jedem
ac ~*
der Bandtrume ein gesonderter Antrieb zugeordnet ist.
16. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmeschicht
(20) aus Papier, Folie od. dgl. mit zur MolektL.1 ladung entgegengesetzerOberflächenladung
besteht.
17. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche
11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmeschicht (20) reaktive chemische Gruppen
zur kovalenten oder nichtkovalenten Bindung der Molekü Ie aufweist.
- A4 -
130DS1
P-108 - A4 -
18. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel
(G) od. dgl. an einer Temperatureinrichtung (6, 25) angeordnet ist.
19. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche
11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Förderband
(11) etwa vertikal an einer Fläche (26) des Gels (G) od. dgl. angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis, 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel
(G) od. dgl. in einem etwa vertikal verlaufenden Schacht (4) sowie dessen Mündung (10) über der
Bewegungsbahn des Förderbandes (11) angeordnet
ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
daß der Querschnitt des Schachtes (4) zu seiner Mündung (10) hin verjüngt ist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Mündung (10) des Schachtes
(4) über ihre Länge eine veränderbare Breite (b..) aufweist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mündung (10) des Schachtes (4) einen dreieckartigen
Grundriß aufweist (Fig. 2).
24. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche
11 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das/die Förderband/Förderbänder
(11) zur Austrittsrichtung (v.) der Moleküle in einem Winkel (w) verläuft/verlaufen.
- A5 -
P-108 - A5 -
25. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit
(v„) des Förderbandes "(11) in Abhängigkeit
von der Austrittsgeschwindigkeit (V1)
der Moleküle des Gels (G) und/oder der Gelbreite (b) und/oder des Bandwinkels (w) steuerbar ist.
26. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Bandantrieb (16) mit einem
Rechner verbunden ist.
27. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kontaktbereich
(10,26) zwischen Gel (G) und Förderband (11) wenigstens ein Fixier- und/oder Färbebad
(24 bzw. 13) in der Bewegungsbahn des Förderbandes nachgeschaltet ist.
28. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest
eine der das elektrische Feld erzeugenden Elektroden (2,3) im Fixier- und/oder Färbebad (24 bzw.
13) angeordnet ist.
29. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche
11 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kontaktbereich (10,26) zwischen Gel (G) und Förderband (11)
wenigstens ein Reinigungsbad (24) in der Bewegungsbahn des Förderbandes nachgeschaltet ist.
- A6 -
1300B1/03Sa
P-108 ' - A6 -
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß dem/den Förderband/
-bänden (11) wenigstens eine Aufnahmefläche (28) für mehrere Gele (G1 bis G) zugeordnet ist, wo-'
bei in diese Aufnahmefläche mehrere Rillen oder Nuten (29) für die Gele eingeformt sind.
130051/0368
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Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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