DE3022527A1 - Verfahren zur durchfuehrung einer elektrophorese sowie vorrichtung dazu - Google Patents

Verfahren zur durchfuehrung einer elektrophorese sowie vorrichtung dazu

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DE3022527A1 DE19803022527 DE3022527A DE3022527A1 DE 3022527 A1 DE3022527 A1 DE 3022527A1 DE 19803022527 DE19803022527 DE 19803022527 DE 3022527 A DE3022527 A DE 3022527A DE 3022527 A1 DE3022527 A1 DE 3022527A1
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Description

DIPPING; GEfiHAKD F. KUEBSCH 3022527
PATENTANWALT
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Verfahren zur Durchführung einer Elektrophorese sowie Vorrichtung dazu
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Elektrophorese in einem elektrischen Feld, wobei Moleküle od. dgl. in einem porösen Stoff, beispielsweise in einem Gel, bewegt und — beispielsweise optisch — erfaßbar gemacht werden. Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung avf eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die als Elektrophorese bezeichnete elektrokinetxsche Erscheinung wird vor allem in der analytischen und in der klinischen Chemie zur Analyse von Stoffgemischen verwendet, wozu man die verschiedenen Wandergeschwindigkeiten von Ionen im elektrischen Feld bestimmt. Zu dem hat sich die Elektrophorese in porösen Medien — beispielsweise in Polyacrylamid - und Agarose- Gelen — zu einer wichtigen analytischen und auch präparativen Methode in Biochemie und Medizin entwickelt, um beispielsweise komplexe Gemische von Nucleinsäuren oder Proteinen in einzelne Bestandteile zu trennen.
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Hierbei wandern nach Anlegen eines elektrischen Feldes verschiedene Moleküle entsprechend ihrer Beweglichkeit unterschiedlich weit in jenes — hier alle dazu anwendbaren Stoffe begrifflich umfassende — Gel und werden dadurch räumlich getrennt. Anschließend kann durch spezifisches Einfärben dieser Moleküle die Verteilung des Gemisches sichtbar gemacht und analysiert werden. Nachteilig bleibt hierbei, daß das Gelmaterial aus der Elektrophoresevorrichtung entfernt wird und nur einmal verwendet werden vermag. Um eine befriedigende Auflösung sehr vieler Komponenten — beispielsweise bei der Sequenzanalyse von DNS bis zu mehrere hundert verschieden lange Moleküle — zu erreichen, v/erden dabei heute bis zu einem Meter lange Gele verwendet, welche eine sehr hohe Spannung voraussetzen, um einen genügend großen Spannungsgradienten zur Verfügung zu haben, welcher eine Trennung in annehmbarer Zeit erlaubt .
Bei präparativen Elektrophoresen wird üblicherweise am Ende des Gels eine stationäre Auffangkammer vorgesehen, in welche die Moleküle wandern. Diese Kammer wird von Zeit zu Zeit geleert und dann wieder neu gefüllt, wodurch eine stufenweise Auftrennung des Gemisches in seine Komponenten erreicht werden kann.
Angesichts dieser Gegebenheiten hat sich der Erfinder das Ziel gesetzt, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs erwähnten Art so zu verbessern, daß die Handhabung erleichtert, die Gelgröße .reduziert und der Vorgang insgesamt gegebenenfalls automatisiert durchgeführt werden kann.
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Zur Lösung dieser Aufgabe führt, daß an dem porösen Stoff, beispielsweise dem Gel, etwa an dessen in Wanderrichtung der Moleküle liegendem Ende wenigstens eine bewegte Aufnahmefläche vorbeigeführt wird, welche bevorzugtermaßen kontinuierlich läuft.jedoch im Rahmen der Erfindung auch schrittweise betrieben werden kann. Nach einem weiteren Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Moleküle auf der Aufnahmefläche — kontinuierlich — durch Ionenaustausch angesiedelt oder an reaktive chemische Gruppen gebunden.
Im Rahmen der Erfindung liegt eine Vorrichtung, innerhalb deren jener poröse Stoff, beispielsweise das Gel, an der Bewegungsbahn zumindest einer etwa bandartig ausgebildeten und von einem Antrieb bewegbaren Aufnahmefläche angeordnet ist, welche als kontinuierlich laufendes oder umlaufendes Förderband gestaltet sein sollte.
Vorteilhafterweise ist das Förderband mehrschichtig ausgebildet, wobei die dem Gel od. dgl. zugekehrte Schicht zur Aufnahme der Moleküle und die andere Schicht als Träger für diese Aufnahmeschicht dient, was es beispielsweise erlaubt, mechanisch wenig strapazierfähige Aufnahmeschichten zu verwenden, welche etwa auf einem als Träger dienenden Kunststoffnetz ruhen und über dieses vom Antrieb bewegt werden.
Als besonders günstig haben sich Aufnahmeschichten aus Papier, Folie od. dgl. mit einer zur Ladung der Ionenmolekülfc entgegengesetzten Oberflächenladung erwiesen oder auch Aufnahmeschichten mit reaktiven chemischen Gruppen zur kovalenten oder nichtkovalenten Bindung der Moleküle
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ff
P- 108 . - A -
In einer relativ kurzen und festen porösen Phase, welche hier als Gel — etwa Polyccrylamidgel, Agarosegel, Papier, Folie od. dgl. — bezeichnet und.an die eine Gleichspannung angelegt wird, bewegen sich die geladenen Moleküle oder Teilchen des Gemisches entsprechend ihrer Beweglichkeit zum Ende des Gels und werden dort an das bewegliche Band gebunden, d.h. an dessen geladene Oberfläche (Ionenaustauscher-Papier) oder an seine peaktiven chemischen Gruppen. Anschließend kann das Band nach einem v/eiteren Merkmal der Erfindung durch ein Fixier- oder ein Färbebad geführt werden; die Komponeten werden sichtbar gemacht und können registriert werden. Auch ist es erfindungsgemäß möglich, unter Bedingungen,bei denen die Wechselwirkung "Teilchen/Band" aufgehoben ist, die Komponenten einzeln VOIr1 Band zu eluieren und zu sammeln.
Die Breite einer eluierten Komponente auf dem Band oder Förderband wird um so kleiner, je dünner das Gel ist, so daß bei analytischen Problemen die Verwendung möglichst dünner Gele angebracht scheint. Es kann aber nach einem weiteren Merkmal der Erfindung durch die Wahl eines Winkels zwischen der Elutions- oder Wanderrichtung der .Teilchen und der Bewegungsbahn des Bandes eine Konzentrierung der Komponenten erreicht werden, da hierbei das Förderband — in Förderrichtung gesehen — das Gel zuerst an einer Berührungslinie trifft, während die innerhalb des Gels von dieser Berührungslinie weiter weg liegenden Teilchen etwas später auf das bereits Moleküle tragende Band auftreffen. Dies kann bei Analysen, insbesondere bei präparativen Vorgängen, von Bedeutung sein.
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Andererseits ist es möglich, durch hohe Bandgeschwindigkeiten eine Komponente über eine große Fläche zu verteilen und damit eine mögliche Begrenzung durch Bindunaskapazität des Bandes zu vermeiden.
Die Verwendung eines beweglichen Bandes, auf dem die Teilchen oder Molekühle beim Verlassen des Gels gebunden werden, ergibt eine zusätzliche Dimension bei der elektrophoretischen Trennung. So kann der Abstand zwischen Komponenten auf dem Band durch Änderung der Bandgeschwindigkeit erfindungsgemäß leicht variiert werden. Darüber hinaus ist die Programmierung der Bandgeschwindigkeit des Spannungsgradienten oder der Temperatur im Hinblick auf die relative Lage der Komponenten auf dem Band möglich.
Im Rahmen der Erfindung liegt auch die Verwendung verschiedener Werkstoffe und Materialien für das — erfindungsgemäß gegebenenfalls mehrschichtige — Förderband. So sind Nachweismethoden — etwa durch Färbung, Radioaktivität od. dgl. — nicht mehr an das Gelmaterial gebunden, wodurch eine größere Flexibilität erreicht wird.
Von besonderer Bedeutung für die Erfindung ist, daß die Trennung von Elektrophorese und dem Nachweis auf dem Band es ermöglicht, reaktive Gruppen kurz vorher zu aktivieren bzw. das Färben oder sonstige Analysenvorbereitungen, aber auch die Elution der gebundenen Moleküle oder Teilchen nach der Elektrophorese in einem kontinuierlichen, automatischen Arbeitsgang in verschiedenen Bädern oder Vorrichtungen durchzuführen.
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Durch ein Waschen des Bandes nach der Analyse oder EIution kann dieses wieder verwendet werden, was eine Materialersparnis mit sich bringt.
Nachdem alle Komponenten eines Gemisches aus dem Gel entfernt sind, kann letzteres wieder mit einem neuen Gemisch beladen und in die Vorrichtung eingebracht werden; Arbeits- und Materialkostenersparnisse bei der Gelherstellung sind evident, die P.eproduzierbarkeit der Trennung wird erhöht. Die bereits erwähnte Verwendung kurzer Gele führt ebenfalls zu einer Materialersparnis und bietet darüber hinaus noch den Vorzug, daß die Zeit, welche etwa schnell wandernde Molekühle im Gel verbringen, entsprechend verkürzt werden kann, wodurch die Diffusion vermindert und die Trennschärfe erhöht wird. Die Gesamtspannung bei der Elektrophorese, die zur Erzielung eines bestimmten Spannungsgradienten benötigt wird, kann bei kurzen Gelen entsprechend verkleinert werden, was die Betriebssicherheit erhöht, die Energiekosten senkt und ein einfaches Abführen entstehender Wärme erlaubt.
Eine geometrische Konzentrierung am Kontaktbereich zwischen Gel und Band, wie sie in Unteransprüchen beschrieben ist, ermöglicht es, auf dem Band Moleküle einer Zone zu konzentrieren, deren Breite geringer ist als die Stärke des Gels. Hierdurch kann eine Erhöhung der Empfindlichkeit bei der Analyse oder eine bessere Auflösung bei präparativen Trennungen erreicht werden#
Von besonderem Vorteil ist die Anbringung des Gels in einem etwa vertikalen Schacht mit einer am Förderband vorgesehenen Mündung. Diese Mündung kann so lang gewählt werden, daß mehrere Förderbänder nebeneinander anzuordnen sind, die auch gegebenenfalls mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten laufen.
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Hierzu kann auch vorteilhaft sein, den Grundriß der Mündung beispielsweise dreieckförmig auszubilden, so daß über einem der Bänder oder an einer Seite des Bandes die Mündung von geringerer Breite ist als auf der anderen Seite bzw. dem benachbarten Band,eine Konfiguration, die vor allein bei Verwendung mehrerer Bänder nebeneinander neue Möglichkeiten erschließt. Darüber hinaus hat sich bei der Bearbeitung unterschiedlicher Gele nebeneinander eine Auflagefläche für die Gele mit mehreren zueinander parallel eingeformten Gelnuten als günstig erwiesen.
In der Praxis hat es sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung und das Verfahren sowohl für analytische Vorgänge als auch für präparative Trennungen eingesetzt werden kann, was das Anwendungsgebiet erheblich erweitert.
130051/Ώ368
■ (
Weitere Vorteile, Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele sowie anhand der Zeichnung; diese zeigt in
Fig. 1: den schematisierten Querschnitt durch eine erfindungsgemäße Vorrichtung;
Fig. 2: die Draufsicht auf ein vergrößertes Detail eines anderen Ausführungsbeispiels, geschnitten etwa nach Linie II - II in Fig. 1;
Fig. 3: den vergrößerten Querschnitt eines Teiles einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 4: ein anderes Detail einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 5: ein anderes Ausführungsbeispiel der Vorrichtung. Fig. 6: eine Schrägsicht auf öin Detail einer weiteren Ausführung.
In einem Puffergefäß 1 einer Vorrichtung E zur Durchführung der Elektrophorese ist in dessen Achse A eine Elektrode 2 vorgesehen, die mit einer darunter im Abstand h vorhandenen Gegenelektrode 3 ein nicht dargestelltes elektrisches Feld erzeugt. In dessen Bereich liegt ein vertikaler Austragsschacht 4 der Breite b und der Höhe i für ein darin befindliches Gel G.
Beidseits des nach oben hin im Gefäßboden 5 endenden Austragsschachtes 4 sind Kammern 6 für thermische Elemente zur Tempera turbeeiriflus sung vorgesehen. Die Gefäßwände 7 verlaufen in Fig. 1 parallel zu den Schachtwänden 8 und sind mit deren unteren Enden durch die querschnittlich gekrümmten Kammeraußenwände 9 verbunden.
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P-108 ■ - 9 -
Unterhalb der Schachtmündung 10 ist ein Band 11 angeordnet, das an Rollen 12 in Pfeilrichtung χ horizontal die Schachtmündung 10 unterfährt. Letztere und das Band 11 sind in eine Flüssigkeit 13 getaucht, welche sich in einer Wanne 14 befindet.
Das über eine Umlenkrolle 15 aus der Flüssigkeit 13 aufwärtsgeführte Band 11 wird durch eine Antriebsrolle an einer Druckrolle 17 gesteuert bewegt.
Die aus dem Gel G austretenden Ionen werden von einer Filterschicht 20, beispielsweise einem Filterpapier, des Bandes 11 aufgenommen und über der Flüssigkeit 13 horizontal ausgetragen. Die Filterschicht 20 ruht auf einem Traggewebe 21.
Während die Breite b des Austragsschachtes 4 bei der Vorrichtung E der Fig. 1 konstant ist, zeigt Fig. 2 eine Schachtmündung 10, deren Breite b1 nach einer Gefäßseite hin zunimmt und welche von mehreren Bändern 11 , 11, ,
abc
unterfahren wird.
Das einschichtige Band 11 nach Fig. 3 ist unter einem Austragsschacht 4 mit sich zur Schachtmündung 10 hin verjüngendem Querschnitt vorgesehen.
Fig. 4 läßt ein zum Gel G in einem Winkel w geneigtes zweischichtiges Band 11 erkennen, welches das Gel G an einer — in Förderrichtung χ vorderen — Berührungslinie 23 erreicht. Die Ionen des in Abstand b dazu stehenden Gelbereiches erreichen das Band 11 erkennbar später und zwar in Abhängigkeit von ihrer Austrittsgeschwindigkeit V1 und der Bandgeschwindigkeit v«.
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P-108 - 10 -
Bei dem Ausführungsbeispiel der Fig. 5 trägt des Band 11 vertikal aus; es durchfährt ein Fixier- oder ein Waschbad 24 und berührt anschließend das auf einem Tunnel 25 ruhende Gel G entlang einer Vertikalfläche 26. Bei dieser Vorrichtung E1 wird das Gelgemisch über eine Schurre 27 zugeführt.
Gemäß Fig. 6 können in die Auflagefläche 28 des Tunnels 25 mehrere nutartige Rinnen 29 zur Aufnahme verschiedenartiger Gele Gw G , G_ eingeformt sein.
130051/0368
- 4t·
Leerseite

Claims (30)

PATENTANWALT DIPL.-ING. HlEBSCH · D - 77 SIN GEN, den 10.06.1980 A.Z. P-108 Blatt - &-| - PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Durchführung einer Elektrophorese in einem elektrischen Feld, wobei Moleküle ocL* iUjl in einem porösem Stoff, beispielsweise einem Gel, bewegt und erfaßbar gemacht werden,
dadurch gekennzeichnet,
daß an dem porösen Stoff etwa an dessen in Wanderrichtung der Moleküle liegendem Ende wenigstens eine bewegte Aufnahmefläche vorbeigeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche kontinuierlich bewegt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle auf der Aufnahmefläche durch Ionenaustausch angesiedelt werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle an reaktive chemische Gruppen der Aufnahmefläche gebunden werden.
5. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche nach dem Gel durch ein Färbebad und/oder ein Fixierbad geführt wird.
6. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel etwa vertikal zur Aufnahmefläche gerichtet wird.
- A2 -
13ÖÖS1/0363
P-108 - A2 -
7. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahitieflache in einem Neigungswinkel (w) zur Wanderrichtung der Moleküle am Gel vorbeigeführt wird.
8. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Neigungswinkel (w) und/oder die Fördergeschwindigkeit (v_) der Aufnahmefläche verändert wird/werden.
9. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fördergeschwindigkeit der Aufnahmefläche programmiert gesteuert wird.
10. Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche durch ein Reinigungsbad geführt wird.
11. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 10 mit einem porösen Stoff, beispielsweise einem Gel, in einem elektrischen Feld, dadurch gekennzeichnet, daß der poröse Stoff, beispielsweise ein Gel (G), an der Bewegungsbahn zumindest einer etwa bandartig ausgebildeten und von einem Antrieb (16) bewegbaren Aufnahmefläche angeordnet ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmefläche als kontinuierlich um/laufendes Förderband (11) ausgebildet ist.
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130051/0368
P-108 - A3 -
13. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die als Förderband (11) ausgebildete Aufnahmefläche einen zumindest zweischichtigen Querschnitt aufweist, wobei die dem Gel (G) od. dgl. zugekehrte Schicht (20) zur Aufnahme der Moleküle und die andere Schicht (21) als Träger für die Aufnahmeschicht (20) dient.
14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerschicht (21) ein begrenzt flexibles Band, beispielsweise ein Kunststoffnetz, dient, welches vom Antrieb (16) bewegt ist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Förderband (11) aus mehreren einander benachbarten Bandtrumen (11 - 11 ) besteht, wobei gegebenenfalls jedem
ac ~*
der Bandtrume ein gesonderter Antrieb zugeordnet ist.
16. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmeschicht (20) aus Papier, Folie od. dgl. mit zur MolektL.1 ladung entgegengesetzerOberflächenladung besteht.
17. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmeschicht (20) reaktive chemische Gruppen zur kovalenten oder nichtkovalenten Bindung der Molekü Ie aufweist.
- A4 -
130DS1
P-108 - A4 -
18. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel (G) od. dgl. an einer Temperatureinrichtung (6, 25) angeordnet ist.
19. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche
11 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Förderband (11) etwa vertikal an einer Fläche (26) des Gels (G) od. dgl. angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis, 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel (G) od. dgl. in einem etwa vertikal verlaufenden Schacht (4) sowie dessen Mündung (10) über der Bewegungsbahn des Förderbandes (11) angeordnet ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Querschnitt des Schachtes (4) zu seiner Mündung (10) hin verjüngt ist.
22. Vorrichtung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Mündung (10) des Schachtes (4) über ihre Länge eine veränderbare Breite (b..) aufweist.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mündung (10) des Schachtes (4) einen dreieckartigen Grundriß aufweist (Fig. 2).
24. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche
11 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß das/die Förderband/Förderbänder (11) zur Austrittsrichtung (v.) der Moleküle in einem Winkel (w) verläuft/verlaufen.
- A5 -
P-108 - A5 -
25. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Geschwindigkeit (v„) des Förderbandes "(11) in Abhängigkeit von der Austrittsgeschwindigkeit (V1) der Moleküle des Gels (G) und/oder der Gelbreite (b) und/oder des Bandwinkels (w) steuerbar ist.
26. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Bandantrieb (16) mit einem Rechner verbunden ist.
27. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kontaktbereich (10,26) zwischen Gel (G) und Förderband (11) wenigstens ein Fixier- und/oder Färbebad (24 bzw. 13) in der Bewegungsbahn des Förderbandes nachgeschaltet ist.
28. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 11 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine der das elektrische Feld erzeugenden Elektroden (2,3) im Fixier- und/oder Färbebad (24 bzw. 13) angeordnet ist.
29. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche
11 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß dem Kontaktbereich (10,26) zwischen Gel (G) und Förderband (11) wenigstens ein Reinigungsbad (24) in der Bewegungsbahn des Förderbandes nachgeschaltet ist.
- A6 -
1300B1/03Sa
P-108 ' - A6 -
30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß dem/den Förderband/ -bänden (11) wenigstens eine Aufnahmefläche (28) für mehrere Gele (G1 bis G) zugeordnet ist, wo-' bei in diese Aufnahmefläche mehrere Rillen oder Nuten (29) für die Gele eingeformt sind.
130051/0368
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