DE4230837A1

DE4230837A1 - Mehrpunkt-nachweisverfahren zur elektrophorese und chromatographie in kapillaren

Info

Publication number: DE4230837A1
Application number: DE4230837A
Authority: DE
Inventors: Stellan Hjerten; Tasanee Srichaiyo
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1991-09-30
Filing date: 1992-09-15
Publication date: 1993-04-01
Also published as: ITRM920713A0; JPH05203622A; US5114551A; GB9220057D0; ITRM920713A1; IT1263263B; GB2259980A; GB2259980B; FR2681944B1; JPH0820415B2; FR2681944A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Kapillarelektrophorese und eine Kapillarchromatographie und insbesondere Verfahren zum on-line- Nachweis.

Die Kapillarelektrophorese und die Kapillarchromatographie weisen eine Anzahl von verschiedenen Vorteilen auf, wenn sie als Verfahren zur Auftrennung von biochemischen Mischungen ein gesetzt werden. Einer der Vorteile ist das kleine Volumen des Kapillarinneren. Dies ermöglicht Auftrennungen von extrem klei nen Proben, und die Auftrennungen können mit hoher Geschwindig keit durchgeführt werden. Ein anderer Vorteil, der spezifisch die Elektrophorese in Kapillaren betrifft, ist die schnelle Geschwindigkeit, mit welcher Wärme aus der Kapillare aufgrund der engen Bohrung der Kapillare nach außen geleitet wird. Hier durch ist es möglich, zur Durchführung der Elektrophorese eine hohe Spannung anzulegen, wodurch Auftrennungen mit hoher Ge schwindigkeit und mit hoher Leistungsfähigkeit möglich sind. Jeder dieser Vorteile ermöglicht es, daß Kapillaren insbesonde re bevorzugt zur Analyse von Proben von biologischem Interesse, insbesondere von Mischungen von Peptiden, Proteinen und Nu kleinsäuren, einsetzbar sind.

Ein insbesondere bevorzugtes Verfahren zum Nachweis von gelö sten Stoffen in Kapillarauftrennungen ist der on-line-Nachweis. Einer der vielen Vorteile, welche der on-line-Nachweis bietet, ist die Möglichkeit, eine Vielzahl an Chromatogramm- und Elek tropherogrammspuren während des Verlaufs einer einzigen konti nuierlichen Elektrophoreseauftrennung zu erhalten. Das herkömm licherweise bevorzugt verwendete Verfahren, um dies zu errei chen, ist daß mehrfache Scanning der Kapillare, während die Auftrennung erfolgt. Dies ermöglicht dem Betreiber, dem Gang der Auftrennung zu folgen, die Mobilitäten und die Peak-Berei che der gelösten Stoffe auf der Basis verschiedener Messungen anstelle von nur einer Messung zu bestimmen, und ein Chromato gramm und ein Elektropherogramm auszuwählen, welches die größte Peak-Auftrennung mit der geringsten Verbreiterung aufweist.

Eine Schwierigkeit beim Scanning ist die Notwendigkeit, daß entweder ein beweglicher Detektor oder eine bewegliche Kapilla re vorliegt, und die Notwendigkeit, die relativen Positionen des Detektors und der Kapillare mit den beobachteten Peaks ge nau zu korrelieren. Eine andere Schwierigkeit ist die Notwen digkeit, eine aus Quarz hergestellte Kapillare zu verwenden, die sowohl nach innen als auch nach außen geschliffen und po liert ist, um die Unterschiede im Innendurchmesser und in der Wanddicke zu minimieren, die ansonsten Schwankungen in der Ba sislinie ergeben könnten. Eine dritte Schwierigkeit ist die Notwendigkeit, daß sowohl die Kapillare als auch das Medium im Inneren der Kapillare für einen Nachweisstrahl wie z. B. ein ultraviolettes Licht (UV-Licht) durchlässig sein müssen, und zwar entlang der gesamten Länge der Kapillare, an der das Scan ning durchgeführt wird. In manchen Fällen werden an die Außen seiten der Kapillaren Beschichtungen angebracht, um die Kapil lare flexibler und gegen Bruch weniger anfällig zu machen. Vie le dieser Beschichtungen sind für UV-Licht undurchlässig und ermöglichen deshalb kein Scanning.

In Beckers, J.L., et al., "Use of a Double-Detector System for the Measurement of Mobilities in Zone Electrophoresis", J. Chromatog. 452 : 591-600 (1988) wird die Verwendung von zwei De tektoren beschrieben, die in einer bestimmten Entfernung von einander befestigt sind. Ein derartiges System jedoch ist mehr als unbefriedigend. Die Kosten für die Apparatur eines Zwei- Detektor-Systems beinhalten natürlich die Kosten für zwei De tektoren, die einen Hauptteil der Kosten des gesamten Systems bilden. Weiterhin weisen zwei Detektoren selten die gleiche Sensitivität auf, und Unterschiede in der Sensitivität ergeben für einen spezifischen gelösten Stoff verschiedene Peak-Berei che. Die Verwendung von zwei Detektoren erfordert weiterhin Beschränkungen hinsichtlich der relativen Positionen der Detek toren zueinander, d. h. es besteht eine Beschränkung, wie nahe diese Detektoren angeordnet werden können, außer wenn eine Fa seroptik verwendet wird.

Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, diese und andere Probleme zu lösen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Ver fahren zum Bestimmen von Werten, die für die Mobilitäten und die relativen Mengen von gelösten Stoffen, die einer elektro phoretischen Auftrennung über ein Trennmedium in einer Kapilla re unterzogen werden, repräsentativ sind, bereitgestellt wird, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Nachweis von Unterschieden im Lichtabsorptionsvermögen durch das Trennmedium als Funktion der Zeit an einer Viel zahl von entlang der Kapillarlänge angeordneten Nachweis punkten mit einem einzelnen Detektor;
b) Identifizieren von Peaks in derart nachgewiesenen Unter schieden im Lichtabsorptionsvermögen und einer Sequenz, in welcher die Peaks auftreten, die im wesentlichen an allen Nachweispunkten gleich ist, und zwar an jedem Nachweis punkt;
c) Bilden des Mittelwertes unter allen Nachweispunkten von der vom Peak zum Nachweispunkt zurückgelegten Entfernung, dividiert durch die Zeit, die von jedem Punkt benötigt wird, um den Nachweispunkt zu erreichen und zwar für jeden Punkt der Sequenz; und
d) Bilden des Mittelwertes unter allen Nachweispunkten für die von den Peaks an der gleichen Position in der Sequenz definierten Bereiche, und zwar für jeden Punkt in der Se quenz.

Erfindungsgemäß wurde ein Verfahren entwickelt, in welchem meh rere Chromatogramme und Elektropherogramme, die successive Schritte bei der chromatographischen oder elektrophoretischen Auftrennung in einer Kapillare darstellen, ohne longitudinales Scanning der Kapillare und ohne mehrere Detektoren erhalten werden können. Erfindungsgemäß werden Unterschiede in der Lichtabsorptionsfähigkeit als eine Funktion der Zeit an einer Vielzahl von Stellen nachgewiesen, die voneinander entfernt entlang der Länge der Kapillare angeordnet sind, jedoch unter Verwendung eines einzelnen Detektors. Um dies zu erreichen, werden zwei verschiedene Ausführungsformen der Erfindung be reitgestellt.

In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wird ein Nach weisfenster in der Kapillare mit dem Nachweisstrahl eines De tektors ausgerichtet, wobei das Fenster eines von verschiedenen Nachweisfenstern darstellt, die in Abständen entlang der Länge der Kapillare angeordnet sind. Wenn alle Peaks des gelösten Stoffes das Nachweisfenster passiert haben und demnach vom De tektor nachgewiesen wurden, wird die Kapillare nach rückwärts bewegt, und zwar in der Richtung, die entgegengesetzt zur Wan derungsrichtung der gelösten Stoffe liegt, um das nächste Nach weisfenster mit dem Nachweisstrahl auszurichten. Dies wird aus reichend lange wiederholt, bis alle derartigen Nachweisfenster in den Detektorstrahl gelangt sind und die Peaks der gelösten Stoffe, die durch die Kapillare laufen, an der Stelle jedes Fensters nachgewiesen wurden.

In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung enthält die Ka pillare eine Vielzahl von Nachweisfenstern, die in Abständen entlang der Länge der Kapillare angeordnet sind, wie dies be reits im vorstehenden Absatz beschrieben wurde. In dieser Aus führungsform der Erfindung ist die Kapillare jedoch zwischen diesen Nachweisfenstern in Schleifen gelegt, wobei jedes be nachbarte Nachweisfensterpaar durch wenigstens eine Schleife getrennt ist. Die Schleifen sind derart angeordnet, daß die Nachweisfenster alle ausreichend nahe zueinander lokalisiert sind, um in den Weg eines einzelnen Detektorstrahls zu fallen. Die Schleifen können alle in der gleichen Richtung ausgerichtet sein, wodurch die gelösten Stoffe den Strahl zu jeder Zeit in der gleichen Richtung passieren oder die Schleifen können auch in ihrer Richtung alternieren, wodurch die gelösten Stoffe den Strahl von einer Schleife zur nächsten in wechselnden Richtun gen durchlaufen, oder die Schleifen können eine Kombination dieser beiden Ausführungsformen darstellen. In jedem Fall wer den durch den kontinuierlichen Nachweis alle Peaks, die alle Nachweisfenster passieren, nachgewiesen, und die Reihenfolge, in welcher die Peaks nachgewiesen werden, dient als ein Mittel, um das Nachweisfenster, durch welches ein bestimmter Peak nach gewiesen wurde, zu identifizieren.

Gleichgültig welches Verfahren verwendet wird, können Durch schnitts-Peak-Bereiche für jeden Bestandteil der Probenmischung in einfacher Weise dadurch erhalten werden, daß die Flächenbe reiche der entsprechenden Peaks unter den verschiedenen Chroma togrammen oder Elektropherogrammen gemittelt werden, und die Mobilität eines jeden Bestandteils kann mit einem hohen Grad an Genauigkeit dadurch bestimmt werden, daß die Entfernungen vom Injektionsende der Kapillare zu jedem Fenster gegen die Zeiten aufgetragen werden, an welchen die Peaks im Fenster nachgewie sen werden.

Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung in Zusammenhang mit den Ausführungsbei spielen und den Zeichungen offenbart.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für eine erste Auführungsform des erfindungsgemäßen Elektrophoresesystems.

Fig. 2 zeigt eine schematische Zeichnung eines zweiten Aus führungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Elektropho resesystems.

Fig. 3 zeigt eine schematische Zeichnung eines Ausführungs beispiels für ein erfindungsgemäßes Chromatographie system.

Fig. 4 zeigt eine Kurve eines Bandschreibers während eines experimentellen Laufs unter Verwendung des erfin dungsgemäßen Systems gemäß Fig. 1.

Fig. 5 zeigt eine Kurve eines Bandschreibers während eines experimentellen Laufs unter Verwendung des erfin dungsgemäßen Systems gemäß Fig. 2.

Fig. 6 zeigt die Wanderungsstrecke gegen die Zeit für vier Peptide aus der Kurve von Fig. 5 aufgetragen.

Die Kapillarröhrchen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, kön nen aus einem beliebigen Material bestehen, mit dem Elektropho rese und Chromatographie ohne Beeinflussung durch das Material selbst durchführbar sind, und in welche Nachweisfenster einge baut werden können, oder in die kurze Segmente als Nachweisfen ster an festgelegten Stellen entlang der Kapillarlänge bestimmt werden können. Die Nachweisfenster können von beliebiger Zusam mensetzung oder von beliebiger Bauweise sein, die es ermög licht, daß ein Nachweisstrahl durchtreten kann, und die Nach weisfenster werden dementsprechend in Übereinstimmung mit dem verwendeten Strahl und Nachweissystem ausgewählt oder angepaßt, was wiederum abhängig ist von der Natur der aufzutrennenden löslichen Stoffe. Auf der Absorption von UV-Licht basierende Nachweissysteme sind allgemein bekannt, und sie sind insbeson dere bei der Verwendung der Kapillarelektrophorese biologischer Mischungen wie kleiner Peptide, Proteine und Nukleinsäuren be vorzugt verwendbar. Die Nachweisfenster für derartige Systeme sind deshalb für UV-Licht durchlässig.

Da in derartigen Systemen nur die Nachweisfenster für UV-Licht durchlässig sein müssen, können erfindungsgemäß Kapillarröhr chen aus anderen Materialien als Quarz verwendet werden. Die Segmente des Kapillarröhrchens zwischen den Nachweisfenstern können tatsächlich aus einem beliebigen Material bestehen, wel ches inert ist und mit der Auftrennung nicht interferiert. Bei spielsweise gehören zu diesen Materialien Glas und andere sili ziumdioxid-enthaltende Materialien, Kunststoffe und Metalle wie rostfreier Stahl. Zu denjenigen Kapillaren, die am einfachsten und mit den geringsten Kosten herstellbar sind, gehören natür lich diejenigen Kapillaren, bei welchen die gesamte Kapillare aus einem Material hergestellt ist. Als Beispiel für ein ins besondere geeignetes Kapillarmaterial sei Quarzglas genannt.

Kapillaren aus Quarzglas sind im allgemeinen an der Außenseite der Kapillaroberfläche mit einer Polyimidbeschichtung versehen, um sie gegen Bruch widerstandsfähiger zu machen. Da die Poly imidbeschichtung für UV-Licht nicht durchlässig ist, kann ein Nachweisfenster dadurch ausgebildet werden, daß die Beschich tung entfernt wird, um einen schmalen Streifen der Quarzglas oberfläche freizusetzen, der ausreichend breit ist, um einen Durchtritt des Nachweisstrahles zu ermöglichen, welcher aus reicht, um eine Ablesung zu ermöglichen. Bei einer Kapillare von einem Innendurchmesser von etwa 0,1 mm oder geringer kann der Streifen eine Breite von etwa 0,01 mm bis etwa 1,0 mm auf weisen. Die Entfernung der Beschichtung kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden, beispielsweise durch Oxidation mit tels einer erhitzten Sonde, wie beispielsweise eines unter Strom gesetzten Drahtes. Für UV-Licht durchlässige Beschichtun gen erfordern kein Entfernen der Beschichtung. Röhrchen aus Quarzglas mit einer derartigen Beschichtung sind beispielsweise von der Firma Polymicro Technologies Inc., Phoenix, Arizona, USA, erhältlich.

Wenn es notwendig ist, die Oberfläche der Innenwandung der Ka pillare zu behandeln, um die Adsorption zu unterdrücken, und, im Fall der Elektrophorese, die Elektroendosmose, können Be handlungsmittel verwendet werden, die mit dem Nachweisstrahl nicht interferieren. Ein derartiges Behandlungsmittel kann aus verschiedenen, für den Fachmann bekannten Materialien zur Un terdrückung der Adsorption und der Elektroendosmose ausgewählt werden; im allgemeinen handelt es sich um einen Monolayer einer Verbindung oder eines Polymers von niedrigem Molekulargewicht, z. B. um lineares Polyacrylamid, Dextran und Methylzellulose. Das Behandlungsmittel kann durch herkömmliche Verfahren auf den Kapillaren abgelagert werden. Die Verwendung eines derartigen Behandlungsmittels ist jedoch wahlweise. Die Erfindung ist so wohl auf Kapillaren gerichtet, die auf der Innenseite unbe schichtet sind als auch auf Kapillaren, die eine derartige Be schichtung tragen.

Die Zahl an Nachweisfenstern, die in einer einzigen Kapillare verwendet werden, ist unkritisch und kann in einem weiten Be reich variiert werden. Die Zahl an Nachweisfenstern beträgt mindestens zwei, und für die meisten Anwendungen sind nicht mehr als 6 Nachweisfenster erforderlich. Bevorzugt werden Ka pillaren mit 3 bis 5 Nachweisfenstern. In einigen Fällen wird die Zahl an Nachweisfenstern durch die Länge der Kapillare und durch die Notwendigkeit, die Fenster in einem ausreichenden Abstand anzuordnen, so daß alle gelösten Stoffe ein Fenster passieren können, bevor sie das nächste erreichen, beschränkt, wie weiter unten näher ausgeführt werden wird.

Die Anordnung, die Zahl und der Abstand zwischen den Nachweis fenstern ist unkritisch und kann in einem weiten Bereich vari iert werden. Die brauchbarsten und am leichtesten zu interpre tierenden Ergebnisse werden jedoch dann erzielt, wenn die Peaks der gelösten Stoffe in diskreten, sich nicht-überlappenden Gruppen nachgewiesen werden, d. h. Chromatogramme oder Elektro pherogramme, wobei jede Gruppe einem einzelnen Nachweisfenster entspricht. Bevorzugt werden deshalb die Nachweisfenster aus reichend weit voneinander entfernt angeordnet, so daß eine Bandschreiberkurve eines Detektors alle Chromatogramme oder Elektropherogramme nacheinander ohne Überlappung zeigt. Falls tatsächlich zwischen den letzten zwei oder drei Chromatogrammen oder Elektropherogrammen eine Überlappung auftritt, können die Peaks und die Sequenz, in welcher sie nachgewiesen werden, den noch identifiziert werden, vorausgesetzt, daß den überlappenden Peak-Sequenzen wenigstens eine und bevorzugt zwei nicht-über lappende Peak-Sequenzen vorangehen. Die aus diesen frühen nicht-überlappenden Peak-Sequenzen bestimmten relativen Reten tionszeiten können dann dazu verwendet werden, um die letzteren Peak-Sequenzen auszusortieren und die entsprechenden Peaks zu identifizieren.

Die Nachweisfenster können in gleichen Abständen oder in nach einander zunehmenden Abständen angeordnet sein, wobei dies vom Bereich der Mobilitäten der gelösten Stoffe abhängt. Bei Mi schungen gelöster Stoffe, in welcher die Zeit, die benötigt wird, daß alle gelösten Stoffe jedes einzelne Nachweisfenster passieren, gering ist im Vergleich zu der Zeit, die benötigt wird, daß ein gegebener gelöster Stoff von einem Nachweisfen ster zum nächsten wandert, sind die Nachweisfenster bevorzugt in gleichen Abständen voneinander angeordnet. Für Mischungen von gelösten Stoffen, in welchen die Verbreiterung der Peaks mit der Wanderung der Peaks vom einen Ende der Kapillare zum anderen stark zunimmt, nimmt der Abstand zwischen den Nachweis fenstern bevorzugt in Richtung der Migration zu, so daß jedes nachfolgende Nachweisfenster die immer zunehmendere Breite der Peak Ausbreitung unterbringen kann, bevor die Peak-Ausbreitung das nächste Fenster erreicht.

Das Auftreten von Schwankungen oder eines Drifts in der Grund linie des Aufzeichnungsgerätes, welches zum Nachweis der jedes Nachweisfenster passierenden gelösten Stoffe verwendet wird, kann durch die Verwendung einer Temperaturkontrolle bei System elementen wie der Kapillare (in den Bereichen der Nachweisfen ster) und dem Detektor minimiert werden. Dies wird leicht da durch erreicht, daß zirkulierende Kühlflüssigkeiten, Ventilato ren, Heizmäntel oder Heizhauben oder ähnliche Maßnahmen, die dem Fachmann ohne weiteres bekannt sind, in Verbindung mit Thermostaten unter äquivalenten Temperaturkontrollvorrichtungen verwendet werden. Hierdurch werden kleine Abweichungen in den relativen Positionen des Lichtstrahls der Nachweisfenster und der Fotodiode vermieden.

Die Größe der Kapillare, und zwar sowohl hinsichtlich ihrer Länge als auch ihres Innendurchmessers, ist unkritisch, und erfindungsgemäß kann ein breiter Bereich an Kapillargrößen ein schließlich Mikrokapillaren verwendet werden. Im allgemeinen weisen die Kapillaren einen Innendurchmesser von etwa 5 bis etwa 100 µm auf, wobei ein Bereich von etwa 20 bis etwa 100 µm bevorzugt wird. Die Länge der Kapillare liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 100 mm bis etwa 3000 mm, wobei ein Bereich von etwa 300 mm bis etwa 1000 mm bevorzugt wird.

Für elektrophoretische Auftrennungen ist die verwendete Span nung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens unkri tisch, und sie kann in einem weiten Bereich variieren. Ein ty pischer Spannungsbereich liegt bei etwa 500 Volt bis etwa 30000 Volt, wobei ein Bereich von etwa 1000 Volt bis etwa 10000 Volt bevorzugt wird.

Das Trennmedium ist in ähnlicher Weise für die Ausführung der Erfindung unkritisch, und es kann sich hierbei entweder um eine Flüssigkeit, ein Gel oder um ein Granulat, beispielsweise um Kügelchen, handeln, und zwar in Abhängigkeit von der Art der durchzuführenden Auftrennung. Beim Trennmedium kann es sich um ein solches Medium handeln, welches den Durchtritt eines Nach weisstrahls ermöglicht, und es kann deshalb kontinuierlich so wohl durch die Nachweisfenster als auch durch die Segmente der Kapillare zwischen den Nachweisfenstern gehen. Alternativ hier zu kann es sich beim Trennmedium um ein solches Medium handeln, welches den Durchtritt des Strahls nicht ermöglicht, und das Trennmedium kann demgemäß an den Nachweisfenstern für den Durchtritt des Strahls Lücken aufweisen. Dies wird häufig bei chromatographischen Auftrennungen der Fall sein, insbesondere dann, wenn ein Granulat als Trennmedium verwendet wird. Bei elektrophorethischen Auftrennungen werden im allgemeinen her kömmliche flüssige Pufferlösungen verwendet, obwohl die optima le Wahl für einen beliebigen Lauf von der Natur der aufzutren nenden gelösten Stoffe abhängt.

Im allgemeinen wird die Auftrennung, bei der es sich entweder um eine Chromatographie oder eine Elektrophorese handeln kann, gemaß den herkömmlichen bekannten Techniken durchgeführt, wobei Materialien und Verfahren verwendet werden, die bekannterweise für Kapillarauftrennungen nützlich sind oder für derartige An wendungen angepaßt werden können. Dies reicht von den Verfahren zum Einbringen der Probe in die Kapillare vor der Auftrennung, vom Trennungslauf selbst, von der Aufrechterhaltung der Tempe raturkontrolle, von der Durchführung des on-line-Nachweises bis zur Verarbeitung und Interpretation der Ergebnisse.

Wie oben ausgeführt wurde, wird der Nachweis bevorzugt auf der Basis der UV-Licht-Absorption durchgeführt; hier kann jedoch wiederum jede Art des on-line-Nachweises durch ein Kapillar röhrchen verwendet werden. Die Lichtabsorption wird aus Gründen der Bequemlichkeit und Einfachheit bevorzugt, jedoch kann die Wellenlänge, bei der die Absorption gemessen wird, über einen weiten Bereich variieren. Die Auswahl der optimalen Wellenlänge hängt wiederum vom Absorptionsvermögen der gelösten Stoffe in Bezug auf das Trennmedium ab. Eine herkömmliche Nachweisvor richtung, wie sie im allgemeinen bei Kapillarchromatographie oder Elektrophoresesystemen verwendet wird, kann hierbei be nutzt werden.

Die Größe des Nachweisstrahls (Fläche des Strahlquerschnittes) relativ zum Durchmesser des Trennmediums (d. h. des Innendurch messers der Kapillare) wird in vielen Fällen den Grad des Drifts, der auf der Grundlinie der nachgewiesenen Signale be obachtet wird, beeinflussen. Wenn als Detektor eine Photodiode verwendet wird, können geringe Veränderungen oder Abwandlungen in der Position der Kapillare relativ zur Photodiode oder zum Lichtstrahl einen signifikanten Effekt auf die Sensitivität des Nachweises ausüben. Dieser Effekt kann durch Temperaturkontrol le unter Verwendung eines Thermostaten minimiert oder elimi niert werden, da die Photodiode, die Kapillare und der Licht strahl ihre Positionen bei Änderung der Temperatur verändern können. Der Effekt kann auch durch Verwendung eines Licht strahls minimiert oder eliminiert werden, der größer ist als der Innendurchmesser der Kapillare, d. h. eine größere Abmessung in Richtung quer zur Längsachse der Kapillare aufweist. In be vorzugten Ausführungsformen der Erfindung wird deshalb die Querabmessung des Nachweisstrahls das etwa 1,1 fache bis etwa 3,0 fache des Innendurchmessers der Kapillare betragen, bevor zugt das etwa 1,3 fache bis etwa das 1,8 fache.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen repräsentative Darstellungen der oben beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung, welche die Durchführung der Erfindung veranschaulichen.

Fig. 1 zeigt eine Elektrophoresesystem 11 mit einer linearen Kapillare 12. Die Bestandteile des Systems sind die Kapillare 12, die Elektrodenvorratsbehälter 13, 14, die Elektroden 15, 16, eine Stromquelle 17, eine UV-Lichtquelle 18, ein Fotodio dendetektor 19, ein Integrator 20 und ein Aufzeichnungsgerät 21. Die Kapillare 12 in diesem Beispiel besteht aus Quarzglas, und die Außenoberfläche der Kapillare ist mit Polyimid 22 be schichtet, was durch die Schrägschrafur angedeutet wird. Die Polyimidbeschichtung ist diskontinuierlich, wobei vier kurze unbeschichtete Segmente 23, 24, 25, 26 offengelassen werden, die für UV-Licht durchlässig sind und als Nachweisfenster die nen. Die Migration der gelösten Stoffe erfolgt in Richtung des Pfeils 27. In der in der Zeichnung gezeigten Anordnung sind die Systembestandteile zum Nachweis der gelösten Stoffe am ersten Nachweisfenster 23 positioniert. Sobald alle gelösten Stoffe das Fenster passiert haben, wird die Kapillare 12 in Richtung des Pfeils 28 relativ zur UV-Lichtquelle 18 und zum Fotodioden detektor 19 bewegt, bis das zweite Nachweisfenster 24 mit der Lichtquelle und der Fotodiode ausgerichtet ist. Wenn alle das zweite Nachweisfenster passierenden Peaks aufgezeichnet wurden, wird die Kapillare 12 wiederum in gleicher Richtung bewegt, um die dritten und vierten Fenster nacheinander mit der Lichtquel le und dem Detektor auszurichten. Die Bewegung der Kapillare kann entweder manuell oder durch einen Bewegungsmechanismus herkömmlicher Bauart ausgeführt werden, wobei das Timing entwe der in vorher festgelegter Weise erfolgt oder in Übereinstim mung mit dem aus dem Aufzeichnungsgerät kommenden Signalen, die anzeigen, daß eine vorher bestimmte Zahl an Peaks nachgewiesen wurde.

Fig. 2 zeigt ein Elektrophoresesystem 41 mit einer in Schleifen gelegten Kapillare 42, die stationär gehalten wird. Die Kapil lare ist wie die obige Kapillare aus Quarzglas, wobei die Au ßenoberfläche mit Ausnahme der drei Nachweisfenster 43, 44, 45 mit Polyimid beschichtet ist. Alle drei Fenster sind jedoch mit der UV-Lichtquelle 46 und dem Fotodiodendetektor 47 ausgerich tet, so daß es nicht notwendig ist, irgendeine Systemkomponente zu bewegen, um von allen drei Fenstern eine Ablesunng zu erhal ten. Die Segmente des Rohraufbaus, die die Nachweisfenster ein schließen, können in Form eines Bündels oder einer planaren An ordnung angeordnet sein, und die planare Anordnung kann quer zum Nachweisstrahl sein, so daß der Strahl gleichzeitig durch alle Fenster tritt, oder die Anordnung kann parallel zum Nach weisstrahl sein, so daß der Strahl hintereinander durch die Fenster tritt. Alle übrigen Teile des Systems sind identisch zu den entsprechenden Teilen des Systems der Fig. 1. Die Migra tionsrichtung der gelösten Stoffe während der Elektrophorse wird durch den Pfeil 48 angezeigt.

Eine Temperaturkontrolle zur Vermeidung eines Grundliniendrifts und zur Vermeidung von Schwankungen wird durch ein System von Temperaturkontrolleinheiten und Thermostaten erreicht. Diese sind durch die gestrichelten Linien 49 in der Fig. 2 angedeu tet.

Die Erfindung stellt auch eine Verbesserung bei der elektropho retischen Auftrennung von Proben dar, bei welchen verschiedene Probenbestandteile relativ zu den anderen Probenbestandteilen sehr langsam migrieren. Bei den aus dem Stand der Technik be kannten Verfahren benötigen Auftrennungen dieser Art im allge meinen zwei Experimente, wobei das eine Experiment unter sol chen Bedingungen durchgeführt wird, die eine langsame Migra tionsgeschwindigkeit fördern und die für die beweglicheren Kom ponenten geeignet ist, und das andere Experiment unter solchen Bedingungen durchgeführt wird, die eine schnelle Migrationsge schwindigkeit fördern, was für die weniger beweglichen Kompo nenten geeignet ist. Erfindungsgemäß können jedoch zwei Nach weisfenster verwendet werden, wobei das eine nahe am Einsprit zende der Kapillare angeordnet ist und das andere relativ weit vom Einspritzende. Mit einer derartigen Anordnung wird die Zeitdauer, die benötigt wird, um alle Bestandteile nachzuwei sen, beträchtlich verringert, da der Nachweis der schneller wandernden Komponenten nur dann aufgezeichnet wird, wenn diese Komponenten das vom Einspritzende am weitesten entfernte Nach weisfenster passieren, während der Nachweis der langsamer wan dernden Komponenten dann aufgezeichnet wird, wenn diese das am Einspritzende am nächsten angeordnete Nachweisfenster passie ren. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung ist es für jedes Nachweisfenster nicht notwendig, ein volles Elektropherogramm zu erstellen.

Fig. 3 zeigt weniger ein Chromatographiesystem als ein Elektro phoresesystem. Dieses System ist identisch mit der Anordnung des Systems aus Fig. 2, mit der Ausnahme, daß die Kapillare 51 in diesem System mit einem chromatographischen Trennmedium wie einem Gel oder einem gefüllten Bett gefüllt ist. Das darge stellte System entspricht einem System, welches einen flüssigen Träger verwendet, der mittels einer herkömmlichen Chromatogra phiepumpe 52 durch die Kapillare gepumpt wird. Im übrigen ar beitet dieses System in gleicher Weise wie das oben in Fig. 2 beschriebene System und es wird auch in gleicher Weise betrie ben. Ein Chromatographiesystem-Gegenstück zur in Fig. 1 gezeig ten Anordnung kann in ähnlicher Weise hergestellt und in analo ger Weise betrieben wird. In jedem Fall kann die Art der Chro matographie in einem weiten Bereich variieren. Beispiele hier für sind die Adsorptionschromatographie, die Gelfiltrations chromatographie, die Ionenaustauschchromatographie und die Säu lenchromatographie.

Die folgenden Beispiele dienen zur weitern Veranschaulichung der Erfindung, wobei die Erfindung jedoch nicht auf diese Bei spiele beschränkt ist.

Beispiel 1

Eine gerade Rohrleitung aus Quarzglas mit einer Länge von 540 mm und einem Innendurchmesser von 0,075 mm, dessen Außenober fläche mit einem nicht-UV-durchlässigen Polyimid beschichtet war, wurde als Kapillare verwendet. Teile der Polyimidbeschich tung wurden an vier Stellen entlang der Kapillarlänge mit einem elektrisch erhitzten Wolframdraht weggebrannt. Diese derart hergestellten UV-durchlässigen Fenster in der Kapillare waren 12 cm, 17 cm, 27 cm bzw. 37 cm vom Kapillarende entfernt, in welches die Probe eingeführt wurde. Jedes dieser Fenster wies eine Länge von etwa 2 mm auf. Das Rohrinnere wurde anschließend entlang der gesamten Länge, und zwar einschließlich der UV- durchlässigen Fenster, mit einem Monolayer aus einem linearen Polyacrylamid beschichtet, um die Adsorption und die Elektronen dosmose zu elliminieren. Die Wirksamkeit dieser Beschichtung wurde durch die Beobachtung verifiziert, daß über vier Wochen keine Veränderungen in den Migrationsgeschwindigkeiten auftra ten, während die Kapillare bei einem pH-Wert von 11 gelagert wurde.

Die Kapillare aus Quarzglas wurde in einer V-förmigen Vertie fung befestigt, so daß die Kapillare in einer fixierten Posi tion relativ zum Strahl eines Lichtabsorptionsdetektors fixiert war, jedoch weiterhin in Längsrichtung bewegt werden konnte. Die V-förmige Vertiefung wurde mit fließendem Wasser gekühlt. Ein Schlitz (Queröffnung) in der V-förmigen Vertiefung wurde mit dem Detektorstrahl ausgerichtet, wobei der Schlitz eine Höhe aufwies, die in etwa gleich war zum Außendurchmesser der Kapillare und eine Breite von 0,15 mm (in Längsrichtung der Kapillare, quer zum Weg des Detektorstrahls) aufwies. Der Nach weis wurde mit einem LKB/Pharmacia (Uppsala, Schweden) HPLC 2141 Monitor mit variablen Wellenlängen, modifiziert für einen Nachweis von gelösten Stoffen, direkt an der Rohrleitung bei einer Wellenlänge von 260 nm, durchgeführt. Das Elektrophero gramm wurde mit einem REC 61 Servograph Aufzeichnungsgerät der Firma Radiometer, Kopenhagen, Dänemark, durchgeführt.

Eine Elektrophoreseauftrennung von λ DNA wurde in der Kapillare durchgeführt. Das Trennmedium in der Kapillare war TBE Puffer (0,09M Tris, 0,09M Borsäure und 0,002M Ethylendiamintetraessig säure), pH 8,2. Die λ DNA wurde in die Kapillare durch elektro phoresische Mittel bei 2000 Volt 30 sek. lang injiziert, und, nachdem sie injiziert war, bei gleicher Spannung der elektro phoretischen Auftrennung unterworfen. Die Betriebsbedingungen und die Anordnung der UV-durchlässigen Fenster wurden auf der Basis einer voher durchgeführten Bestimmung vorgenommen, so daß alle die λ DNA in der Probe repräsentierenden Peaks ein Fenster passieren, bevor sie das nächste Fenster erreichen.

Die Aufzeichnung der Auftrennung begann mit der Ausrichtung des ersten UV-durchlässigen Fensters der Kapillare mit der Öffnung der V-förmigen Vertiefung, wobei dies dem 12 cm vom Injektions ende der Kapillare angeordneten Fenster entspricht. Wenn alle Peaks den Detektor passiert hatten, wurde die Kapillare nach rückwärts in der V-förmigen Vertiefung bewegt, um das zweite UV-durchlässige Fenster mit der Öffnung in der V-förmigen Ver tiefung auszurichten. Dies wurde so lange wiederholt, bis alle Peaks, die jedes der vier UV-durchlässigen Fenster passierten, nachgewiesen, integriert und aufgezeichnet waren.

Teile der Aufzeichnungskurve sind in Fig. 4 aufgezeichnet, wel che zeigt, daß die Reihenfolge und die Identität der Peaks kom plexer ist als dies jedes einfache Elektropherogramm zeigen würde.

Beispiel 2

Eine der Länge nach ausgerichtete Rohrleitung aus Quarzglas mit einer Länge von 580 mm und einem Innendurchmesser von 0,05 mm, an ihrer Außenoberfläche mit einem nicht-UV-durchlässigen Po lyimid beschichtet, wurde als Kapillare verwendet. Teile der Polyimidbeschichtung wurden auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise ausgebrannt, wodurch UV-durchlässige Fenster 4,0 cm, 14,0 cm und 44,0 cm vom Injektionsende entfernt und je mit einer Länge von etwa 2 mm erzeugt wurden, und die Innenseite des Roh res entlang seiner gesamten Länge, einschl. der UV-durchlässi gen Fenster, wie in Beispiel 1 mit einem Monolayer aus linearem Polyacrylamid beschichtet war.

In der Kapillare wurden zwei Schleifen gebildet, wobei eine Schleife zwischen den ersten und zweiten UV-durchlässigen Fen stern und die andere Schleife zwischen den zweiten und dritten UV-durchlässigen Fenstern angeordnet war, so daß die die Fen ster enthaltenden Kapillarabschnitte parallel in einer V-förmi gen Vertiefung in der in Fig. 2 gezeigten Anordnung mit neben einanderliegenden Fenstern zu liegen kamen. Die Schleifen wur den durch einen Ventilator gekühlt, und die V-förmige Vertie fung durch fließendes Wasser. Die V-förmige Vertiefung enthielt einen Schlitz, der ähnlich dem Schlitz der V-förmigen Vertie fung des Beispiels 1 ausgebildet war, mit der Ausnahme, daß seine Höhe etwas größer war als die Summe der Außendurchmesser der drei Segmente der Kapillare. Die Breite des Schlitzes be trug wie vorher 0,15 mm.

Der gleiche Detektor wurde verwendet, zusammen mit einem Spec tra Physics SP 4270 Integrator, und der Nachweis wurde bei 200 nm durchgeführt. Der Detektorstrahl trat durch alle drei UV- durchlässigen Fenster gleichzeitig.

Unter Verwendung der folgenden Standardpeptidmischung, erhalten von den Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USA (im folgenden in der Reihenfolge der Elution angegeben), wurde eine elektrophoretische Auftrennung durchgeführt:

1. Bradykinin,
2. Angiotensin,
3. α-Melanocyten-stimulierendes Hormon,
4. Thyrotropin-freisetzendes Hormon,
5. Luteinisierendes Hormon-freisetzendes Hormon,
6. (2-5) Leucin-Enkephalin,
7. Bombesin,
8. Methionin-Enkephalin,
9. Oxytocin.

Das in der Kapillare verwendete Trennmedium war 0,1M Natrium phosphatpuffer, pH 2,5. Die Probeninjektion wurde elektrophore tisch bei 8000 Volt für 10 sek. durchgeführt, und die Laufspan nung betrug ebenso 8000 Volt.

Die Aufzeichnungskurve ist in Fig. 5 gezeigt, und drei Wieder holungen der Elutionssequenz sind angegeben. Die erste Wieder holung wird durch den Buchstaben "a" in der Kurve angegeben, und zeigt die Detektorantwort auf die gelösten Stoffe, die das Fenster bei der Position 4,0 cm passieren; die zweite Repeti tion ist durch "b" gekennzeichnet, und sie repräsentiert das Fenster bei der Position 14,0 cm; die dritte Repetition ist durch "c" gekennzeichnet, und sie repräsentiert das Fenster bei der Position 44,0. Die Nummer der Bestandteile ist über jeden Peak in der dritten Repetition angegeben. Die Elutionssequenz in jeder dieser Repetitionen, Bradykinin, luteinisierendes Hor mon-freisetzendes Hormon, (2-5) Leucin Enkephalin und Oxytocin werden durch die Peaks 1,5,6 bzw. 9 veranschaulicht, basierend auf dem bekannten Elutionsverhalten der Standardmischung.

Integrierte Peakbereiche sind in Tabelle 1 angegeben. Um Unter schiede in Veränderungen in der Lichtintensität über den Quer schnitt des Nachweis-UV-Strahls und von anderen Faktoren wie Veränderungen im Durchmesser der Kapillare von einem Fenster zum nächsten zu kompensieren, sind die Peakbereiche relativ zu Bradykinin normalisiert.

Tabelle 1

Relative Peakbereiche bei verschiedenen Nachweispunkten

In Fig. 6 ist die Migrationsentfernung in cm (d. h. die Entfer nung des Fensters vom Injektionsende der Kapillare) gegen die Zeit in sek., bei welcher jeder Peak am Detektor erschien, auf getragen. Die gefüllten Kreise in der Zeichnung stehen für Bra dikinin, die X′s für das luteinisierende Hormon-freisetzende Hormon, die offenen Kreise für Leucin-Enkephalin und die Drei ecke für Oxitocin. Die Punkte liegen auf geraden Linien, wodurch gezeigt wird, daß die Mobilitätswerte (Migrationsgeschwindig keit in cm/sek. dividiert durch die Feldstärke in Volt/cm) mit einem hohen Genauigkeitsgrad bestimmt werden. Diese Werte sind in der unten stehenden Tabelle 2 angegeben.

Mobilitätswerte für vier Peptide
Peptide
Mobilität × 10^-4 (cm²s^-1V^-1
Bradykinin
1,61
luteinisierendes Hormon-freisetzendes Hormon	1,17
[2-5] Leucin Enkephalin	0,96
Oxytocin	0,69

Claims

1. Verfahren zum Bestimmen von Werten, die für die Mobilitä ten und die relativen Mengen von gelösten Stoffen, die einer elektrophoretischen Auftrennung über ein Trennmedium in einer Kapillare unterzogen werden, repräsentativ sind, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

2. Verfahren, um eine Vielzahl von Peakmustern löslicher Stoffe zu erhalten, wobei die Muster die aufeinanderfol gende Schritte einer kontinuierlichen Trennung von gelö sten Stoffen durch ein Trennverfahren repräsentieren, wo bei die Trennverfahren ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus chromatographischen und elektrophoretischen Trennungen, die in einem in einer Kapillare enthaltenen- Trennmedium durchgeführt werden, während die gelösten Stoffe in einer Migrationsrichtung in der Kapillare mi grieren und wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

a) Ausrichten einer ersten Stelle einer Kapillare mit einem Lichtabsorptionsdetektor, und Erhalten eines ersten Peak musters der löslichen Stoffe durch den Nachweis von Unter schieden im Lichtabsorptionsvermögen durch das Trennmedium als Funktion der Zeit an der ersten Stelle;
b) Verändern des Ortes der Kapillare relativ zum Detektor, um sie mit einer zweiten Stelle entlang der Kapillarlänge in Richtung der Migration auszurichten, und Erhalten eines zweiten Peakmusters der löslichen Stoffe durch Nachweis von Unterschieden im Lichtabsorptionsvermögen als Funktion der Zeit an der zweiten Stelle; und
c) Wiederholen des Schrittes (b) an einer ausreichenden Zahl von Stellen, um eine Vielzahl von Peakmustern der lösli chen Stoffe zu erhalten.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Trennverfahren eine Elektrophorese ist und die Peakmuster der löslichen Stoffe Elektropherogramme darstellen und wobei das Verfahren die weiteren folgenden Schritte umfaßt:

d) Identifizieren von darin auftretenden Peaks und einer Se quenz, in welcher die Peaks auftreten, wobei die Sequenz im wesentlichen in jeder der Elektropherogramme die glei che ist, und zwar für jedes Elektropherogramm,;
e) Bilden des Mittelwertes unter allen Elektropherogrammen für die vom Peak zur Stelle, bei welcher das Elektrophero gramm erhalten wird, zurückgelegte Entfernung, dividiert durch die vom Peak benötigte Zeit, um die Stelle zu errei chen, und zwar für jeden Peak in der Sequenz; und
f) Bilden des Mittelwertes unter allen Elektropherogrammen für die von den Peaks an der gleichen Position in der Se quenz definierten Bereiche, und zwar für jeden Peak in der Sequenz.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Kapillare aus Quarz glas besteht, deren Außenoberfläche mit Polyimid in einer im wesentlichen ununterbrochenen Weise beschichtet ist, mit der Ausnahme von Unterbrechungen an jeder der Stellen, die mit dem Lichtabsorptionsdetektor in den Schritten (a) und (b) ausgerichtet sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Innenseite der Kapil lare mit einer Substanz beschichtet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus linearem Polyacrylamid, Dextran und Methylzellulose.

6. Verfahren zum Erhalten einer Vielzahl von Peakmustern von löslichen Stoffen, die aufeinanderfolgende Schritte einer kontinuierlichen Trennung von gelösten Stoffen durch ein Trennverfahren repräsentieren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus chromatographischen und elektrophoretischen Verfahren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte um faßt:

a) die gelösten Stoffe werden Bedingungen unterworfen, die das Trennverfahren in einem in einer Kapillare enthaltenen Trennmedium fördern, wobei die Kapillare wenigstens einmal in Schleifen gelegt ist, um eine Vielzahl von Stellen ent lang der Länge der Kapillare, die als Nachweispunkte defi niert sind, in ausreichender Nähe zueinander zu bringen, so daß alle derartigen Nachweispunkte einen einzigen Nach weisstrahl eines Lichtabsorptionsdetektors auffangen, wo bei jedes Paar an Nachweispunkten durch wenigstens eine Schleife der Kapillare getrennt ist; und
b) Nachweis von Unterschieden in der Lichtabsorption durch das Trennmedium mit Hilfe des Nachweisstrahls als eine Funktion der Zeit, verursacht durch die Migration der ge lösten Stoffe durch das Trennmedium nach den Nachweispunk ten.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Trennverfahren eine Elektrophorese ist, und wobei die Peakmuster der gelösten Stoffe Elektropherogramme darstellen und wobei das Verfah ren weiterhin folgende Schritte umfaßt:

c) Identifizieren von Peaks in den derart nachgewiesenen Ver änderungen und Gruppieren der Peaks zu Elektropherogram men, wobei ein Pherogramm einem jedem Nachweispunkt ent spricht;
d) Identifizieren einer Sequenz, in welcher Peaks in jeder der Elektropherogramme auftreten, wobei die Sequenz im wesentlichen in jedem der Elektropherogramme die gleiche ist;
e) Bilden des Mittelwertes unter allen Elektropherogrammen für die vom Peak zum Nachweispunkt, bei welcher das Elek tropherogramm erhalten wird, zurückgelegte Entfernung di vidiert durch die vom Peak benötigte Zeit, um den Nach weispunkt zu erreichen, und zwar für jeden Peak in der Sequenz; und
f) Bilden des Mittelwertes unter allen Elektropherogrammen für die von den Peaks an der gleichen Position in der Se quenz definierten Bereiche, und zwar für jeden Peak in der Sequenz.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kapillare aus Quarz glas besteht, dessen Außenoberfläche mit Polyimid in einer im wesentlichen ununterbrochenen Weise mit der Ausnahme von Unterbrechungen an jedem der Nachweispunkte beschich tet ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Innenseite der Kapil lare mit einer Substanz beschichtet ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus linearem Polyacrylamid, Dextran und Methylzellulose.