CH633370A5 - Verfahren zur bestimmung von antigenen und antikoerpern. - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von C) Immunochemistry, Vol. 12 (1975) 349 bis 351 ist es

Antigenen und Antikörpern durch Fixieren eines Antikörpers bereits bekannt, Antikörper oder Antigene quantitativ dadurch oder eines Antigens an unlöslichen Trägerteilchen mit einem zu bestimmen, dass man die oben erwähnten agglutinierten La-

durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 [im, um 60 texteilchen mit einem Laserstrahl und die Änderung der Breite die unlöslichen Trägerteilchen zu sensibilisieren, Umsetzen des der Spektrallinien des gebeugten Lichts des Laserstrahls misst,

auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörpers und/oder um die mittlere Diffusionskonstante (D) zu bestimmen, die

Antigens mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper einen Hinweis auf die Brown'sche Bewegung der agglutinierten oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium, Be- Teilchen gibt, die ihrerseits umgekehrt proportional ist der strahlen der Reaktionsmischung mit Licht und Messung der Ex- 65 Grösse der agglutinierten Teilchen.

tinktion der Reaktionsmischung. Da bei dieser Methode der den Antikörper oder das Anti-

Es besteht ein ständiges Bedürfnis für ein Verfahren zur gen tragende Latex in extrem geringer Konzentration verwen-

schnellen und genauen qualitativen und quantitativen Bestim- det wird, beispielsweise in einer Konzentration von lediglich

3 633 370

0,001 %, wird die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper- reich des nahen Infrarots oder in einem Teil des sichtbaren BeReaktion vermindert, so dass sowohl die Präzision als auch die reiches, der sich an das nahe Infrarot anschliesst. Vorzugsweise Reproduzierbarkeit dieser Methode zu wünschen übrig lassen. verwendet man erfindungsgemäss ein Licht, dessen Wellenlänge Weiterhin besitzt diese Methode den Nachteil, dass komplizier- im nahen Infrarot liegt und 0,8 bis 1,8 [xm und vorzugsweise 1 te Berechnungen unter Anwendung von Spektrumanalysenme- 5 bis 1,4 fxm beträgt. Zur Untersuchung von Molekülstrukturen thoden erforderlich sind, was komplizierte Massnahmen not- oder Eigenschaften der Moleküle ist es bereits bekannt, Spek-wendig macht, und dass irgendwelche in der Probe vorhandenen tralanalysen durchzuführen, bei denen man Licht mit einer im Verunreinigungen vor der Messung entfernt werden müssen. infraroten Bereich liegenden Wellenlänge von mindestens Demzufolge hat sich auch diese Methode in der Praxis nicht 2,5 |xm oder Licht mit einer im ultravioletten Bereich liegen durchsetzen können. io den Wellenlänge von nicht mehr als 0,4 (im verwendet. Das

Die obige Literaturstelle C beschreibt ferner, dass die Be- Licht des nahen Infrarots oder des sich daran anschliessenden Stimmung mit Hilfe der in der Literaturstelle A angegebenen sichtbaren Bereichs, das erfindungsgemäss angewandt wird, und Trübungsmessmethode extrem ungenaue Ergebnisse liefert das der Vereinfachung halber im folgenden als «Licht des nahen

(siehe die Fig. 2 auf Seite 350 dieser Veröffentlichung). Infrarotbereiches» bezeichnet wird, ist bislang nur begrenzt an-

Aus der DE-OS 22 04 684 ist weiterhin ein Verfahren zum 15 gewandt worden und hat nur geringes Interesse gefunden. Nachweis von Antikörpern bzw. Antigenen in einer Körperflüs- Es wurde nunmehr gefunden, dass das Licht des nahen In-sigkeit bekannt, bei dem in einem Testgemisch, das neben ande- frarotbereiches sehr gut durch wässrige Medien, die im allge-ren Stoffen die Körperflüssigkeit, einen Träger und serologisch meinen die Grundmedien von Antigene oder Antikörper entbestimmende Materialien enthält, Agglutinationskomplexe be- haltenden Proben darstellen, wie Wasser, Sera, Urin, Salzlösun-obachtet werden, wobei als serologisch bestimmende Materia- 20 gen etc., sowie die Grundmedien der oben erwähnten Latices, lien Antikörper bzw. Antigene verwendet werden, welche an hindurchdringt, wobei insbesondere das Licht des nahen Infra-einem serologisch inerten Latexträger mit einer Teilchengrösse rotbereiches mit einer Wellenlänge von 0,8 bis 1,4 |im und von von 0,05 bis 0,9 |xm gebunden sind, und die Lichtabsorption 1,53 bis 1,88 |xm von den wässrigen Medien nur in geringem des Testgemisches nach dessen Aufteilung durch Lufteinschlüs- Ausmass absorbiert wird. Es hat sich ferner gezeigt, dass, wenn se in Teilströmen automatisch gemessen wird. Dieses Verfahren ^ man die durch Umsetzen der mit dem Antikörper oder dem vermag jedoch in seiner Präzision der Messung nicht vollständig Antigen sensibilisierten unlöslichen Trägerteilchen, die einen zu befriedigen. durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 um,

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit vorzugsweise von 0,1 bis 1 um, aufweisen, mit dem Antigen darin, ein Verfahren der eingangs genannten Gattung anzuge- und/oder dem Antikörper in der Probe unter Bildung der Ag-ben, mit dem die Antikörper- bzw. Antigene in der zu untersu- 3« glutination erhaltene Reaktionsmischung mit Licht aus dem chenden Probe mit hoher Präzision und mit guter Reproduzier- oben erwähnten nahen Infrarotbereich mit einer Wellenlänge, barkeit schnell bestimmt werden können und ferner schnell die um einen Faktor von mindestens 1,5 und vorzugsweise von nachgewiesen werden kann, ob die Konzentration eines Anti- mindestens 2 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser körpers oder eines Antigens in einer Probe oberhalb oder unter- der Trägerteilchen, bestrahlt, die Intensität des durch die Reak-halb eines bestimmten Wertes liegt. Dabei soll eine extrem ge- 35 tionsmischung hindurchgeführten Lichtes sehr genau dem bei ringe Menge der Probe ausreichend sein und auch extrem gerin- der Antigen-Antikörper-Reaktion erreichten Agglutinations-ge Mengen des Antigens und/oder Antikörpers mit einer Präzi- grad entspricht. Die Durchlässigkeit für das oben erwähnte und sion gemessen werden können, die der bei dem Radioimmuntest erfindungsgemäss verwendete Licht entspricht der Extinktion erreichten entspricht, jedoch wesentlich schneller und sicherer. A, die man mit Hilfe von Spektrophotometern bestimmen kann, Das Verfahren soll ferner nicht nur zur Bestimmung von multi- 40 beispielsweise jenen Vorrichtungen, wie sie im allgemeinen für valenten oder polyfunktionellen Antigenen sondern auch von die Infrarotspektrometrie verwendet werden, so dass diese unvollständigen Antigenen, beispielsweise Haptenen geeignet Durchlässigkeit im folgenden der Einfachheit halber als Extink-sein und nicht nur die Agglutination der Antikörper und/oder tion bezeichnet wird.

Antigene ausnützen, sondern auch sie inhibierende Wirkungen. Die mit Hilfe des Infrarotspektrometers bestimmte Extink-

Gelöst wird diese Aufgabe ausgehend von einem Verfahren 45 tion A entspricht der folgenden Formel:

der eingangs genannten Art dadurch, dass man die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 A = log —

bis 2,4 |xm, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist I

als der Durchmesser der Trägerteilchen, bestrahlt. in der

Der Grund hierfür ist darin zu sehen, dass das Ausmass der 50 I0 für die Intensität des durch die lediglich das Lösungsmittel Antigen-Antikörper-Reaktion in Gegenwart der sensibilisierten enthaltende Absorptionszelle hindurchgeführten Lichtes und unlöslichen Trägerteilchen sehr genau proportional ist der In- I für die Intensität des durch die eine Lösung einer bestimm-

tensität des durch die Mischung geführten Lichtes. Es ist ersieht- ten Konzentration enthaltende Zelle hindurchgeführten Lichtes lieh, dass das Ausmass der Antigen-Antikörper-Reaktion auch stehen.

proportional ist der Menge (oder der Konzentration) des Anti- 55 Demzufolge wird die oben angesprochene Durchlässsigkeit körpers und/oder des Antigens in der Probe, vorausgesetzt, dass im folgenden der Einfachheit halber als «Extinktion (A)» be-die Reaktion unter spezifischen Bedingungen durchgeführt zeichnet.

wird. Erfindungsgemäss kann die Bestimmung der Extinktion A

Besonders bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfin- mit Hilfe eines Spektrophotometers erfolgen, das ähnlich den dungsgegenstands sind in den Unteransprüchen beschrieben. 60 Spektrophotometern ist, die man für den nahen Infrarotbereich Das obige erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht eine verwendet, wobei man erfindungsgemäss Licht des oben angeschnelle Bestimmung eines Antikörpers und/oder eines Anti- sprochenen nahen Infrarotbereiches verwendet und die obige gens in einer Probe mit extrem grosser Präzision unter Anwen- Formel benützt.

dung einer Technik, die sich von den herkömmlichen Methoden Wenn das Grundmedium der Probe ein transparentes flüssi-erheblich unterscheidet, bei denen die Trübung oder die mittle- 65 ges Medium ist, kann man die Bestimmung des Wertes von I0 re Diffusionskonstante bestimmt werden. bequem in der Weise durchführen, dass man die Suspension, die

Das Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis die mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten un-

2,4 |xm, das erfindungsgemäss angewandt wird, liegt im Be- löslichen Trägerteilchen enthält, verwendet, welche Suspension

633 370

4

man beispielsweise mit Wasser auf die gleiche Konzentration wie die Mischung verdünnt hat.

Die Erfindung wird im Folgenden näher erläutert. Dabei ist auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 das Absorptionsspektrum von Wasser unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 jtm, das in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 1 mm aufgenommen wurde;

Fig. 2 anhand einer Kurve die Änderung der Extinktion mit dem Durchmesser der Teilchen eines Polystyrollatex ;

Fig. 3 anhand einer Kurve die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Reaktionszeit einer Antigen-Antikörper-Reaktion;

Fig. 4 ein schematisches Diagramm, das den Grundaufbau einer zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeigneten Vorrichtung wiedergibt ;

Fig. 5 eine perspektivische Ansicht einer Absorptionszelle, die sowohl für die Proben als auch für die Kontrollproben oder Blindproben geeeignet ist;

Fig. 6 eine schematische Darstellung einer Rühreinrichtung, die verwendet werden kann ;

Fig. 7 eine Fibrinogen(Fg)-Eichkurve bei einer Wellenlänge von 1,2 [im, die unter Verwendung von Standard-Fibrinogen-Lösungen und Antifibrinogen-Polystyrollatexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,481 (im ermittelt wurde ;

Fig. 8 eine Extinktionseichkurve, die bei einer Wellenlänge von 1,2 jxm unter Verwendung von Antifibrinogen-Silicium-dioxidteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,32 [im und einer Reihe von Standard-Fibrinogenlösungen ermittelt wurde;

Fig. 9 eine Eichkurve für die Zeit, die erforderlich ist, dass die Extinktion bei einer Wellenlänge von 1,2 |im den Wert 0,5 erreicht, wenn man ein mit Antifibrinogen sensibilisiertes Latexreagens mit jeder der Standard-Fibrinogenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen umsetzt;

Fig. 10 eine Extinktionseichkurve, die bei einer Wellenlänge von 1,2 Jim aufgenommen wurde, indem man Oxytocin-Anti-serum mit jeder der unterschiedliche Konzentrationen aufweisenden Standard-Oxytocinlösungen umgesetzt hat und dann die Reaktionsmischung mit Latexteilchen versetzt hat, die mit Oxytocin sensibilisiert worden sind ;

Fig. 11 eine bei 1,0 [im bestimmte Extinktions-Eichkurve, die dadurch erhalten wurde, dass man Anti-human-choriongo-nadotropin-Serum mit Standardlösungen von Humanchorion-gonadotropin (hCG) mit unterschiedlichen Konzentrationen umgesetzt hat und die erhaltene Reaktionsmischung mit Hu-manchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexteilchen versetzt hat; und

Fig. 12 anhand einer Kurve die Änderung der Nachweisempfindlichkeit mit der Konzentration des mit Antifibrinogen sensibilisierten Polystyrollatex.

In der Fig. 1 ist durch Auftragen der Wellenlänge des Lichtes auf der Abszisse und der prozentualen Transmission des Lichtes auf der Ordinate das prozentuale Transmissionsspektrum einer Wasserschicht mit einer Dicke von 1 mm in einem Wellenlängenbereich von 0,6 bis 2,4 (im dargestellt. Aus der Fig. 1 ist zu ersehen, dass Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 1,4 um Wasser, das das für Latices und Proben weitestgehend verwendete Grundmedium darstellt, praktisch ohne merkliche Absorption durchdringt und dass Licht mit einer Wellenlänge von 1,53 bis 1,88 (im Wasser ebenfalls im wesentlichen durchdringt, so dass man Licht mit einer Wellenlänge in diesem Bereich bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwenden kann. Es ist ferner aus der Fig. 1 ersichtlich, dass Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 2,1 bis 2,35 (im für Wasser eine Transmission im Bereich von 20% zeigt, so dass man Licht einer solchen Wellenlänge auch in Kombination mit einem hochempfindlichen Photometer anwenden kann, wenngleich dies nicht bevorzugt ist.

Die Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Extinktion eines Polystyrollatex (mit einem Feststoffgehalt von 1 Gew.-%), die 5 auf der Ordinate aufgetragen ist, und der Wellenlänge des Lichts, die in (im auf der Abszisse aufgetragen ist, wenn man die Bestimmung in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm durchführt. In der Fig. 2 gibt die Kurve A die Änderung der Extinktion eines Polystyrollatex wieder, dessen Teilchen io einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,481 (im aufweisen, während die Kurve B für einen Polystyrollatex steht, dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser 0,804 (im beträgt. Zur Bestimmung der Extinktion wird der Latex vorzugsweise verdünnt, wonach der durch Multiplizieren des beobachteten Ex-15 tinktionswertes mit dem Verdünnungsfaktor ermittelte Wert als Extinktion des Latex bezeichnet wird.

Aus der Fig. 2 ist zu ersehen, dass die Extinktion des Latex bei einer Wellenlänge von weniger als 0,6 (im stark zunimmt, so dass es schwierig ist, die Änderungen der Lichttransmission 20 einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung unter Anwendung von Licht einer solchen Wellenlänge zu bestimmen. Wenn man jedoch Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 (im und insbesondere von mindestens 1 (im verwendet, so ist die Extinktion des Latex als solchem relativ gering, so dass 25 Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 (im und vorzugsweise mindestens 1 (im für die oben erwähnte Messung der Lichttransmission geeignet ist.

Vergleicht man in Fig. 2 die Kurve A mit der dort dargestellten Kurve B, so ist festzustellen, dass die Extinktion des 30 Latex mit zunehmendem durchschnittlichen Durchmesser der Polystyrollatexteilchen zunimmt. Demzufolge ist ersichtlich, dass Latexteilchen mit einem extrem grossen durchschnittlichen Durchmesser erfindungsgemäss nicht geeignet sind. Bei Untersuchungen hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäss geeigne-35 ten unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen oder mittleren Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1,6 (im aufweisen müssen und dass Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis 1 (im bevorzugter und mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,8 (im am bevorzugtesten sind. 40 Die Fig. 3 gibt die Beziehung zwischen der Änderung der Extinktion einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung, die auf der Ordinate aufgetragen ist, mit der Wellenlänge des Lichtes, die in (im auf der Abszisse aufgetragen ist, bei verschiedenen Reaktionszeiten wieder, wenn die Antigen-Antikörper-Re-45 aktion genau in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt wird, mit dem Unterschied, dass man einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 (im einsetzt. Die in der Fig. 3 dargestellten Kurven C, D und E stehen für die Extinktion der Reaktionsmischung nach-50 dem die Antigen-Antikörper-Reaktion während 3,10 bzw. 20 Minuten durchgeführt worden ist.

Die Fig. 3 lässt erkennen, dass wenn man die Extinktion der Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung mit Licht einer Wellenlänge von weniger als 0,6 (im im Wellenlängenbereich von 55 etwa 0,6 bis 0,4 (im bestimmt, das Ausmass der Reaktion (das heisst die Reaktionszeit) der Extinktion nicht entspricht und dass bei Anwendung einer Wellenlänge im Bereich von nicht mehr als etwa 0,4 (im die Extinktion sich in Abhängigkeit von dem Reaktionsfortschritt nicht merklich ändert. Andererseits 60 zeigt bei Anwendung von Licht mit einer Wellenlänge von mindestens etwa 0,75 (im die Extinktion der Reaktionsmischung eine sehr gute Korrelation zwischen der Reaktionszeit oder dem Reaktionsablauf oder Reaktionsgrad. Die in den Kurven C, D und E der Fig. 3 gestrichelt angegebenen Bereiche deuten 65 darauf hin, dass die Extinktion in diesen Wellenlängenbereichen selbst bei erhöhter Schlitzbreite nicht genau bestimmt werden kann, da die Absorption von Wasser in diesen Bereichen sehr hoch ist.

5 633 370

Wie aus dem weiter unten angegebenen Beispiel 4 zu erse- ciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid und feinpul-

hen ist, erzielt man bei Verwendung eines Polystyrollatex mit verisierte Mineralien, Metalle und dergleichen, verwendet einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 jxm werden.

eine gute Korrelation zwischen der Extinktion der Antigen-An- Zur Sensibilisierung der Trägerteilchen kann der Antikör-

tikörper-Reaktionsmischung und der Konzentration des Anti- 5 per oder das Antigen physikalisch und/oder chemisch an dem gens, wenn man Licht mit einer Wellenlänge verwendet, die um Träger adsorbiert werden. Bei den Antikörpern handelt es sich einen Faktor von mindestens etwa 1,5 grösser ist, als der durch- um Proteine, während die Antigene einer Gruppe von verschie-

schnittliche Durchmesser der Teilchen, beispielsweise wenn denartigen Substanzen angehören, beispielsweise Proteine, Po-

man Licht mit einer Wellenlänge von etwa 1,2 |xm verwendet, lypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und vorausgesetzt, dass die Konzentration des Antigens in der Probe io dergleichen. Es wurde bereits eine Reihe von Verfahren be-

nicht grösser ist als 0,6 [ig/ml. In diesem Fall kann daher die schrieben, um diese Antikörper oder Antigene, insbesondere erfindungsgemässe quantitative Bestimmung durch Bestrahlen Antikörper auf unlösliche Trägerteilchen, zu fixieren. Um ein mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 (im oder mehr durch- unvollständiges Antigen, insbesondere ein Hapten, an unlösli-

geführt werden. chen Trägermaterialien zu fixieren, ist es vorteilhaft, die Träger-

Wenn man Latexteilchen mit einem relativ geringen durch- is materialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe schnittlichen Durchmesser verwendet, ist es vorteilhaft, wie es eines Kupplungsmittels, und anschliessend das Antigen che-

aus der Fig. 3 zu ersehen ist, Licht des nahen Infrarotbereiches misch an das modifizierte Trägermaterial zu binden.

mit einer Wellenlänge im Bereich von etwa 0,8 bis 1,4 (im und Die unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise Latexteil-vorzugsweise 1 bis 1,4 |xm und mehr, welche Wellenlänge min- chen, die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensibili-destens um den Faktor 2 grösser ist als der durchschnittliche 20 siert sind (und die im folgenden als «sensibilisierte Trägerteil-Durchmesser der Trägerteilchen, zu verwenden. chen» bezeichnet werden) werden in Form einer Suspension Gemäss einer Ausführungsform der Erfindung ist es er- verwendet, die eine Konzentration von nicht weniger als 0,05 wünscht, eine Reaktionsmischung aus einem Trägermaterial Gew.-% und vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von spezifischer Teilchengrösse, auf dem ein bestimmter Antikörper 0,1 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis oder ein bestimmtes Antigen vorliegt und einem bestimmten 25 0,6 Gew.-% aufweist. Wenn die Konzentration der sensibilisier-Antigen oder Antikörper oder einer Mischung davon in einer zu ten Trägerteilchen zu hoch ist, wie es aus der Fig. 2 zu ersehen untersuchenden Flüssigkeit mit Licht mit einer geeigneten Wel- ist, wird die Durchlässigkeit der Suspension derart vermindert, lenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 |xm zu bestrahlen, um zu- dass die Messung der Extinktion erschwert wird. Innerhalb des nächst einen Wellenlängenbereich zu ermitteln, in dem eine Konzentrationsbereiches, in dem die Messung der Extinktion quantitative Beziehung zwischen der Änderung der Konzentra- 30 möglich ist, sind jedoch höhere Konzentrationen der sensibili-tion des besonderen Antigens, des Antikörpers oder der Mi- sierten Trägerteilchen in der Suspension bevorzugt, da es hier-schung davon (einschliesslich des Reaktionsproduktes) in der zu durch möglich wird, die Empfindlichkeit der quantitativen Beuntersuchenden Flüssigkeit und der Extinktion der Reaktions- Stimmung der Antigene und der Antikörper zu steigern, mischung besteht, und anschliessend Licht mit einer innerhalb Die Reaktion kann mit Vorteil unter Bewegung der Reak-dieses Wellenlängenbereiches liegenden spezifischen Wellen- 35 tionsmischung durchgeführt werden. Da die Reaktion im allgelänge zur Bestimmung der Extinktion zu verwenden. meinen in einer dünnen Zelle durchgeführt wird, erreicht man Somit ist es erfindungsgemäss möglich, die Menge oder die das Bewegen der Reaktionsmischung bequemerweise zum BeiKonzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in spiel dadurch, dass man einen Stab vertikal oder transversal einer Probe zu bestimmen, indem man unlösliche Trägerteil- durch die Zelle bewegt. Natürlich kann man die sensibilisierten chen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr 40 Trägerteilchen und die Probe ausserhalb der Zelle während als 1,6 ^m, der vorteilhafterweise im Bereich von 0,1 bis einer bestimmten Zeitdauer unter genau bestimmten Bedingun-1,0 um, noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 [im und gen umsetzen und dann die Reaktionsmischung zur Messung am bevorzugtesten im Bereich von 0,3 bis 0,6 [im liegt, ver- der Extinktion in die Zelle einbringen. Um die Reaktionsbedin-wendet, einen Antikörper oder ein Antigen auf dem Trägerma- gungen jedoch bei sämtlichen Messungen reproduzierbar zu terial fixiert (das heisst das Trägermaterial mit dem Antikörper « halten, insbesondere hinsichtlich der Reaktionszeit, kann man oder dem Antigen sensibilisiert), das sensibilisierte Trägermate- die sensibilisierten Trägerteilchen unter speziellen Bedingungen rial mit dem in der Probe vorliegenden Antigen und/oder Anti- direkt in einer Zelle umsetzen, die in ein Spektrophotometer körper umsetzt und die Extinktion der Reaktionsmischung un- eingebracht ist, wodurch eine genauere Bestimmung möglich ter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge im Bereich wird, indem man die Extinktion unmittelbar nach Ablauf einer von 0,6 bis 2,4 [im, vorzugsweise im Bereich von 0,6 bis so vorbestimmten Reaktionszeit bestimmt oder indem man die 1,8 [im, noch bevorzugter im Bereich von 0,8 bis 1,4 [im und Zeit bestimmt, die notwendig ist, bis die Extinktion einen vor-am bevorzugtesten im Bereich von 1 bis 1,4 [im misst. Wie herbestimmten Wert erreicht, wenn man die Reaktion unter bereits erwähnt sollte das verwendete Licht eine Wellenlänge genau bestimmten Bedingungen durchführt.

besitzen, die mindestens um den Faktor 1,5, vorzugsweise min- Zur Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikör-

destens um den Faktor 2 und noch bevorzugter mindestens um 55 pers in einer Probe, die eine unbekannte Menge des Antigens den Faktor 2,5 grösser ist als der durchschnittliche Durchmesser und/oder Antikörpers enthält, bereitet man bevorzugt eine Rei-

der unlöslichen Trägerteilchen. he von verdünnten Eichproben unter Verwendung einer Stan-

Als unlöslicheTrägerteilchen werden bevorzugt Mikroteil- dardprobe, die eine definierte Menge des entsprechenden Anti-

chen aus organischen Polymeren verwendet, die im wesentli- gens und/oder Antikörpers enthält, indem man sie unter An-

chen in dem für die Bestimmung verwendeten flüssigen Medium 6° wendung verschiedener Faktoren verdünnt. Dann kann man je-

unlöslich sind und die einen durchschnittlichen Durchmesser de der verdünnten und unverdünnten Eichproben oder Stan-

innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, bei- dardproben unter vorbestimmten Bedingungen mit unlöslichen spielsweise Latices von organischen Polymeren, wie Polystyrol Trägerteilchen umsetzen, die mit einer definierten Menge eines und Styrol-Butadien-Copolymere, die man durch Emulsionspo- entsprechenden Antikörpers oder Antigens sensibilisiert sind,

lymerisation erhält. Es können aber auch dispergierte Kokken- 65 worauf man die Extinktion einer jeden Reaktionsmischung be-

bakterien, wie Staphylokokken und Streptokokken, Bacillus stimmt und eine Eichkurve für die besondere Kombination aus prodigiosus, Rickettsia, Zellmembranfragmente etc., sowie Mi- dem Antigen und/oder Antikörper mit den sensibilisierten Trä-

kroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Sili- gerteilchen ermittelt, die die Beziehung zwischen der Menge

633 370

6

(Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers und der Extinktion wiedergibt (wobei diese Art von Eichkurve im folgenden der Einfachheit halber als «Eichkurve A» bezeichnet wird). Anschliessend wird eine zu bestimmende unbekannte Probe mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen, die zur Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden, unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen wie den bei der Ermittlung der Eichkurve angewandten umgesetzt, worauf man die Extinktion der Reaktionsmischung misst. Die Menge (oder Konzentration) des betreffenden Antigens und/oder Antikörpers in der unbekannten Probe kann dann dadurch ermittelt werden, dass man den in dieser Weise gemessenen Extinktionswert mit der Eichkurve A vergleicht. Alternativ kann man bei der oben beschriebenen Ermittlung der Eichkurve eine Eichkurve erstellen, die die Beziehung zwischen der Menge (oder Konzentration) des Antigens oder des Antikörpers in der verwendeten Eichprobe und der Reaktionszeit wiedergibt, die erforderlich ist, bis ein vorbestimmter Extinktionswert erreicht ist (wobei diese Art von Eichkurve im folgenden der Bequemlichkeit halber als «Eichkurve B» bezeichnet wird). Auch in diesem Fall kann man durch Umsetzen einer unbekannten Probe mit den gleichen sensibilisierten Trägerteilchen unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen, wie sie für die Herstellung der Eichkurve A angewandt wurden, die Menge (oder Konzentration) des Antigens und/oder Antikörpers in der unbekannten Probe bestimmen, indem man die Zeit misst, die bis zum Erreichen des vorbestimmten Extinktionswertes abläuft.

Somit kann man die Menge oder die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe dadurch bestimmen, dass man entweder

A) die Extinktion der unbekannten Probe misst (wobei man zu Eichzwecken die Eichkurve A verwendet) oder

B) die Reaktionsgeschwindigkeit oder die bis zum Erreichen eines vorgeschriebenen Extinktionswertes erforderliche Reaktionszeit bestimmt (wobei man zum Eichen die Eichkurve B verwendet).

Wie bereits beschrieben, ist die obige Methode A als Bestimmungssystem mit sehr grosser Präzision nicht nur dann geeignet, wenn die Konzentration eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe relativ hoch ist, sondern selbst dann, wenn sie so gering ist, dass sie bislang nur mit Hilfe eines Radioimmuntests (RIA) bestimmt werden konnte. Andererseits ist die obige Methode B, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit gemessen wird, dazu geeignet, eine relativ grosse Menge (oder Konzentration) eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer unbekannten Probe zu bestimmen und ist dadurch besonders vorteilhaft, dass die Messung ziemlich einfach ist. Wie sich gezeigt hat, besitzt die oben angesprochene Eichkurve A eine schwache S-Form statt einer geraden Linie, was jedoch auf die Präzision der Bestimmung keinen nachteiligen Einfluss hat. Der Grund dafür, dass die Eichkurve eine S-Form hat, wie es oben beschrieben wurde, scheint offenbar der zu sein, dass die Reaktionsgeschwindigkeit die Form der Kurve bei niedrigeren Konzentrationen des Antigens und/oder des Antikörpers beeinflusst, während bei höheren Konzentrationen eine Sättigung der aktiven Stellen des Trägermaterials eintritt. Es ist natürlich möglich, den linearen Abschnitt der S-förmigen Kurve zu vergrössern, indem man die Bedingungen der Ermittlung der Eichkurve besonders auswählt, und bei der Bestimmung unbekannter Proben im wesentlichen innerhalb dieses Bereiches arbeitet.

Da man wie bereits ausgeführt wurde, die sensibilisierten Trägerteilchen in einer möglichst hohen Konzentration mit der Probe in Kontakt bringt und mit ihr umsetzt, sollte die zur Bestimmung der Extinktion der Reaktionsmischung verwendete Zelle eine Dicke besitzen, die geringer ist als die einer Zelle, wi< sie für die Analyse eines Spektrums im sichtbaren Bereich angewandt wird, so dass Zellen mit einer Dicke im Bereich von 0,5

bis 4 mm und insbesondere von 1 bis 2,5 mm bevorzugt sind. Wenn man Spurenmengen eines Antigens oder eines Antikörpers mit möglichst grosser Genauigkeit bestimmen will, was bislang durch den Radioimmuntest (RIA) erreicht wurde, ist es s besonders vorteilhaft:

a) ein Antigen oder einen Antikörper mit einer möglichst hohen Gleichgewichtskonstanten einzusetzen,

b) Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,3 bis 0,6 |xm zu verwenden, deren Teilchengrössenvertei-

lo lung möglichst eng ist,

c) die Extinktion mit Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 bis 1,4 (xm zu bestimmen,

d) eine relativ lange Reaktionszeit anzuwenden, die beispielsweise im Bereich von 1 bis 3 Stunden liegt, und

15 e) die Konzentration des sensibilisierten Latexträgermaterials zu erhöhen, vorausgesetzt, dass die Extinktion sich messen lässt.

Wenn man auf der anderen Seite durch Messen der Reaktionsgeschwindigkeit (unter Verwendung der Eichkurve B) eine 20 unbekannte Probe in relativ kurzer Zeit bestimmen will, ist es von Vorteil:

f) Latexteilchen mit einem relativ grossen durchschnittlichen Durchmesser zu verwenden,

g) die Konzentration der Trägerteilchen in dem Latex zu 25 erhöhen, vorausgesetzt, dass die Messung der Extinktion möglich ist, und h) die Reaktionszeit möglichst kurz zu halten und beispielsweise eine Reaktionszeit im Bereich von 5 Sekunden bis 10 Minuten und vorzugsweise im Bereich von 10 Sekunden bis 3

30 Minuten anzuwenden.

Wenn man in diesem Fall die Zeit, die zum Erreichen eines vorbestimmten Extinktionswertes erforderlich ist, auf der Ordinate und die Konzentration auf der Abszisse aufträgt, und zwar jeweils in logarithmischem Massstab, erhält man die Eichkurve 35 B in Form einer vorteilhaften geraden Linie.

Die Erfindung wurde im Vorstehenden erläutert anhand der Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe, die darauf beruht, dass man das in der Probe enthaltene Antigen und/oder den in der Probe enthaltenen Anti-40 körper mit sensibilisierten Trägerteilchen agglutiniert (das heisst ein LA-System anwendet). Das erfindungsgemässe Verfahren ist jedoch auch für eine Bestimmung geeignet, bei der die inhibierende Wirkung gegen die oben erwähnte Agglutination angewendet wird (Ll-System).

45 Z.B. kann man unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, dadurch bestimmen, dass man das Ll-System anwendet. In diesem Fall kann man beispielsweise ein Antigen auf den unlöslichen Trägerteilchen fixieren, die in dieser Weise sensibilisierten Trägerteilchen nach einer kompetitiven Reaktion mit 50 einer gegebenen Menge eines Antikörpers, der mit einem Antigen einer vorbestimmten Konzentration (beispielsweise einer Standard-Antigenlösung) umgesetzt worden ist, reagieren lassen, und dann die Extinktion der erhaltenen Reaktionsmischung bestimmen. Diese Massnahmen werden bei verschiedenen Kon-55 zentrationen der Standard-Antigenlösung wiederholt, wodurch man schliesslich die Eichkurve C erhält. Anschliessend setzt man eine unbekannte Probe mit dem gleichen Antikörper einer bestimmten Konzentration um, wonach man die erhaltene Reaktionsmischung mit dem sensibilisierten Trägermaterial zur 60 Reaktion bringt. Diese Reaktionen sollten unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie zur Ermittlung der Eichkurve C angewandt wurden. Die Extinktion der letztendlich mit den sensibilisierten Trägerteilchen erhaltenen Reaktionsmischung wird dann bestimmt und mit der 65 Eichkurve C verglichen, wodurch man die Menge (oder Konzentration) des Antikörpers in der unbekannten Probe bestimmen kann.

Nach der Verfahrensweise gemäss dem oben erwähnten LI-

7

633 370

System kann man auch einen Antikörper in einer unbekannten Bei der Lichtquelle 1 kann es sich um eine übliche Wolfram-Probe bestimmen, indem man einen bestimmten Antikörper auf lampe handeln, deren Licht mit Hilfe des Filters oder Prismas 2

den unlöslichen Trägerteilchen fixiert. Weiterhin ist es ge- monochromatisiert wird, um einen Lichtstrahl mit einer be-

wünschtenfalls möglich, gleichzeitig ein Antigen und einen An- stimmten Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 |xm und ins-

tikörper unterschiedlicher Art auf den unlöslichen Trägerteil- 5 besondere von 0,8 bis 1,4 [xm und noch bevorzugter im Bereich chen zu fixieren und dann ein Antigen und einen Antikörper in von 1,0 bis 1,4 um zu bilden, der durch die Zellen 4 und 5

einer unbekannten Probe zu bestimmen. geführt wird. Das Filter oder Prisma 2 kann man daher unter

Somit gelingt es erfindungsgemäss, quantitativ eine grosse jenen Produkten auswählen, die dazu geeignet sind, das Licht Vielzahl von Antigenen und/oder Antikörpern zu bestimmen, unter Bildung einer innerhalb der oben angegebenen Wellenbeispielsweise io längenbereiche liegenden Wellenlänge zu monochromatisieren.

1. bei der Blutuntersuchung von Patienten oder Blutspen- Beispielsweise kann man ein Interferenzfilter, das eine Wellendem, was für Notmassnahmen unerlässlich ist; beispielsweise länge von 1200± 50 mjxm ergibt, als Filter oder man kann kann man die Blutgruppensubstanzen, das Au- oder HB-Anti- Quarzprismen oder Glasprismen verwenden.

gen oder andere Verunreinigungen im Blut oder Fibrin/Fibrino- Das in dieser Weise monochromatisierte Licht wird mit Hilgen-Abbauprodukte (FDP) bestimmen, was sich in jüngster is fe eines Spalts oder einer Linse gebündelt, bevor es durch die Zeit als nützlich erwiesen hat bei der Überwachung der Gene- Probenzelle 3 und die Vergleichszelle 4 geführt wird. Die Pro-sung von Patienten mit Nierentransplantation oder mit Nieren- benzelle 3 und die Vergleichszelle 4 können aus durchsichtigem versagen ; Glas oder einem durchsichtigen synthetischen Harz (beispiels-

2. zur Bestimmung von Humanchoriongonadotropin weise einem Acrylharz) bestehen und können einen schachtel-(hCG), das eine wichtige Rolle spielt bei der Schwangerschafts- 20 artigen Aufbau mit rechteckigem oder länglichem Querschnitt diagnose oder bei der Überwachung der Genesung von Chorio- besitzen (wie es in der Fig. 5 gezeigt ist). Die Dicke der Zelle, nepitheliomen ; das heisst der Abstand 1 zwischen den Wänden a und b (durch

3. zur Bestimmung von Humanchoriongonadotropin oder die das Licht geführt wird) bzw. zwischen der dem Licht zuge-von Östriolglucuronid, das ein Stoffwechselprodukt des Folli- wandten Wand und der ihr gegenüberliegenden Wand kann im kelhormons darstellt, im Urin, welche Bestimmung für die 25 Bereich von 0,5 bis 4 mm und vorzugsweise im Bereich von 1 Überwachung der Schwangerschaft von Bedeutung ist ; bis 2,5 mm liegen. Die lichtdurchlässigen Wände besitzen vor-

4. zur Bestimmung von Oxytocin im Blut, von welcher Sub- teilhafterweise einen Transmissionsgrad von mindestens 30 % stanz man annimmt, dass sie Uteruskontraktionen verursacht ; und vorzugsweise von 80 % oder mehr für Licht mit einer Wel-

5. zur Bestimmung bestimmter Nebennierenrindenhormo- lenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 |xm.

ne, wie Corticoiden und Aldosteron oder adrenocorticotropen 30 In die Probenzelle 3 bringt man eine Reaktionsmischung

Hormonen (ACTH) ; ein, die man dadurch erhalten hat, dass man ein Antigen und/

6. zur Bestimmung des Insulins bei Diabetikern oder zur oder einen Antikörper oder eine Mischung davon mit einem Bestimmung des Follikel-anregenden Hormons, des luteinisie- entsprechenden Antikörper oder Antigen, das auf unlöslichen renden Hormons, von Östrogenen, des Gelbkörperhormons Trägerteilchen vorliegt, in einem flüssigen Medium in der oben (corpus luteum hormon) etc; 35 beschriebenen Weise umsetzt. In die Vergleichszelle 4 bringt

7. zur Bestimmung von Gastrin oder Sekretin, bei dem es man eine Vergleichsprobe ein, die lediglich eine Dispersion des sich um ein Magen-Darm-Hormon handelt ; und Antikörpers oder des Antigens, der bzw. das auf den unlösli-

8. zum Nachweis und zur Bestimmung eines Antikörpers in chen Trägerteilchen fixiert ist, in dem flüssigen Medium ein. Die Körperflüssigkeiten von Patienten, die an Allergien, Syphilis, durch die Zellen 3 bzw. 4 geführten Lichtstrahlen werden von hämolytischer Streptokokzidiose, Röteln, Autoimmunkrank- 40 den Photozellen 5 bzw 6 aufgenommen und in elektrische Si-heiten, wie Kollagenose, und anderen Infektionskrankheiten gnale umgewandelt, deren Stärke proportional ist der Intensität und dergleichen leiden. des von der entsprechenden Photozelle aufgenommenen Lichts.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann natürlich auch zur Man kann irgendwelche Photozellen 5 und 6 verwenden, vorqualitativen oder halbquantitativen Bestimmung dieser Antige- ausgesetzt, dass sie dazu geeignet sind, das aufgefangene Licht ne und/oder Antikörper angewandt werden. 45 in ein elektrisches Signal umzuwandeln, dessen Stärke propor-

Die Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens tional der Lichtintensität ist. Beispielsweise kann man mit Vorkann in einer Vorrichtung erfolgen, die eine Absorptionszelle teil Bleisulfid-Photoleiterelemente verwenden. Die in dieser mit einer Dicke von 0,5 bis 4 mm zur Aufnahme der durch Weise durch die Photozellen gebildeten elektrischen Signale Umsetzen des auf dem unlöslichen Träger fixierten Antikörpers können mit Hilfe des Verstärkers 7 in üblicher Weise verstärkt oder Antigens mit dem entsprechenden Antigen oder Antikör- 50 und in einer Anzeigevorrichtung bzw. Aufzeichnungsvorrich-per oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium er- tung 8 aufgezeichnet oder visuell angezeigt werden.

hältlichen Reaktionsmischung und ein Photometer mit einer Wenn man einen Zeitmechanismus in das Anzeigegerät

Bestrahlungseinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer im oder Aufzeichnungsgerät 8 einbaut, ist es möglich, die Extink-

Bereich von 0,6 bis 2,4 [xm liegenden Wellenlänge aufweist. tion automatisch nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktions-

Diese Messvorrichtung kann neben den obigen Vorrich- 55 Zeit zu messen oder die Zeit zu bestimmen, die erforderlich ist,

tungsmerkmalen ähnliche Merkmale aufweisen wie herkömmli- dass die Extinktion einen vorherbestimmten Wert erreicht,

che Photometervorrichtungen. Vorzugsweise ist die verwendete Probenzelle 3 mit einer

Wie aus der Fig. 4 zu erkennen ist, umfasst der Grundauf- Bewegungseinrichtung versehen, beispielsweise einem in der bau der Vorrichtung eine Bestrahlungseinrichtung mit einer Zelle bewegbaren Mischstab.

Lichtquelle 1 und einem Filter oder Prisma 2 ; eine Probenzelle 60 Die Fig. 6 gibt eine besonders geeignete Form des Bewe-

3 zur Aufnahme der Probe zur Messung der Antigen-Antikör- gungsmechanismus zur Bewegung der Mischung 9 aus einer per-Reaktion und eine Vergleichszelle 4 zur Aufnahme einer Probe und sensibilisierten Trägerteilchen (beispielsweise einem zur Kompensation dienenden Blindprobe ; Photozelle 5 und 6 sensibilisierten Latex) wieder, die in der Probenzelle 3 der erfin-

zur Messung des durch die entsprechenden Zellen hindurchge- dungsgemässen Vorrichtung vorliegt.

tretenen Lichtes unter Bildung von elektrischen Signalen; einen 65 Wie aus der Fig. 6 zu erkennen ist, kann man zur Bewegung

Verstärker 7 zur Verstärkung der elektrischen Signale und eine der Mischung 9 in der Zelle 3 den L-förmigen Mischstab 11 auf-

Anzeige oder Aufzeichnungseinrichtung 8 zur Anzeige oder zur und abwärts bewegen, indem man die T-f örmige Verbindungs-

Aufzeichnung der verstärkten elektrischen Signale. Stange 14 auf- und abbewegt, wobei die Verbindungsstange 14

633 370

8

über ihre obere flache Platte 14' mit einer sich drehenden Scheibe 12 im Eingriff steht, die von einer Exzenterwelle 13 angetrieben wird. Mit der Bezugsziffer 17 ist ein Lichtabschirmungsdek-kel bezeichnet, durch den die Verbindungsstange 14 über ein Rohr 15 geführt ist, das an und in dem Deckel 17 befestigt ist. Die Verbindungsstange 14 wird durch die Drehung der Exzenterscheibe 12 nach unten gedrückt und dann durch die Ausdehnungskraft der Feder 16, die zwischen dem Deckel 17 und der oberen flachen Platte 14' der Verbindungsstange 14 angeordnet ist, wieder nach oben bewegt.

Wenn die in der in der Fig. 4 dargestellten Vorrichtung dargestellte Probenzelle 3 den Aufbau besitzt, wie er beispielsweise in der Fig. 6 dargestellt ist, kann man die Zelle 3 ins Dunkle, das von dem Sonnenlicht abgeschirmt ist, einbringen und eine Mischung aus einer zu bestimmenden Probe und sensibilisierten Trägerteilchen (einem sensibilisierten Latex) in der Zelle 3 mit Hilfe des L-förmigen Mischstabes 11 durchmischen, währenddem die Zelle mit Licht einer ausgewählten Wellenlänge innerhalb des nahen Infrarotbereichs bestrahlt wird, so dass es möglich ist, die Mischung zu bewegen, ohne den Lichtstrahl zu unterbrechen. Somit kann man durch die Anwendung der oben beschriebenen Vorrichtung die Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen der Probe und den sensibilisierten Trägerteilchen beschleunigen, wobei es weiterhin möglich ist, die Reaktion unmittelbar nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit zu unterbrechen und die Reaktionszeit genau zu bestimmen, nach der der Extinktionswert einen vorbestimmten Wert erreicht hat, und dergleichen mehr.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

1. Herstellung eines mit Antifibrinogen-Antikörper sensibilisierten Latexreagens (Antifibrinogen-Latexreagens, Anti-Fg-Latexreagens)

Zu 10 ml einer Lösung von Anti-Humanfibrinogen (Fg)-Antikörper (mit einer Konzentration von 2 mg/ml) in einem Glycinpuffer gibt man 1 ml eines Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 |xm (der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist), rührt die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur, erwärmt auf 40 °C und rührt während weiterer 30 Minuten bei dieser Temperatur und zentrifugiert schliesslich unter Kühlen auf 2 bis 4 °C während 50 Minuten (bei 12 000 min"x). Den Niederschlag trennt man durch Dekantieren ab und suspendiert die erhaltenen Latexteilchen, die mit dem Antifibrinogen-Antikörper sensibilisiert sind, in einer Rinderserumalbuminlösung (mit einer Konzentration von 0,2 Gew.-%) unter Bildung eines Antifibri-nogen-sensibilisierten Latexreagens, das die sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält.

2. Aufnahme einer Eichkurve

Man beschickt ein Kunststoffreagensglas (mit einem Innendurchmesser von 7 mm und einer Länge von 70 ml) mit einem aliquoten Anteil von 0,1 ml des gemäss Abschnitt 1 hergestellten Antifibrinogen-Latexreagens und 0,3 ml einer Standard-Fi-brinogenlösung (in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält), die Fibrinogen

Tabelle!!

in der in der folgenden Tabelle I angegebenen Konzentration enthält und schüttelt die Mischung während 20 Minuten auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung mit 200 Schüttelvorgängen pro Minute, um die Antigen-Antikörper-Reaktion s ablaufen zu lassen. Unmittelbar darauf wird die in dem Reagensglas enthaltene Reaktionsflüssigkeit in eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm überführt und es wird die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 um mit Hilfe eines automatischen Spektrophotographen io bestimmt (wozu man als Vergleichslösung eine Suspension von 0,1 ml des Antifibrinogen-Latexreagens verwendet, das mit 0,3 ml der isotonischen Natriumchloridlösung verdünnt ist, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält). Die Messung wird mit jeder Standard-Fibrinogenlösung zweimal durchgeführt. 15 Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

Tabelle I

Konzentration der Stan- Extinktion bei 1,2 |xm 20 dard-Fibrinogenlösung ((Ag/ml)

1. Mes

2. Mes

Mittel

sung sung wert

25 0,1

0,336

0,363

0,350

0,2

0,836

0,778

0,807

0,3

1,083

1,167

1,125

0,4

1,330

1,333

1,332

0,5

1,403

1,430

1,417

30

Wenn man die obigen Werte graphisch aufträgt, und zwar die Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung auf der Abszisse und die Extinktion (Mittelwert) bei 1,2 [im (der Wellenlänge des angewandten Lichts) auf der Ordinate, so erhält man 35 die in der Fig. 7 dargestellte Eichkurve.

3. Quantitative Bestimmung von Fibrinogen in unbekannten Proben.

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut, Urin oder der Flüssigkeit aus dem Brustkorb (aus dem Brustfellraum) und 40 trennt Serum oderPlasma davon ab, wenn es sich bei der Probe um eine Blutprobe handelt. Dann verdünnt man einen aliquoten Anteil von 0,3 ml der Probe oder der verdünnten Probe mit 0,1 ml des gemäss Abschnitt 1 bereiteten Antifibrinogen-Latexreagens genau nach der in dem Abschnitt 2 beschriebenen Wei-45 se und bestimmt die Extinktion in der Weise, die in dem Abschnitt 2 angegeben ist. Unter Verwendung der nach der in Abschnitt 2 angegebenen Methode ermittelten Eichkurve liest man die Fibrinogen-Konzentration entsprechend dem ermittelten Extinktionswert ab. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind so in der folgenden Tabelle II angegeben.

Zu Vergleichszwecken sind in der folgenden Tabelle II auch die Werte aufgeführt, die man mit Hilfe des üblichen Radioimmuntests (RIA-Methode) (S.M.Ratkey et al., Brit. J. Haematol. 30 (1975) 145 bis 149) und der üblichen Objektträgermethode 55 (Fujimaki, Tamura und Takahashi, Rinsho Kagaku (Clinical Science), Vol. 12 (1976) 507 ; und Fujimaki, Ikematsu, Takeu-chi und Kato, Rinsho Byori (Japanese Journal of Clinical Patho-logy) 21 (1973) 973) ermittelt hat.

Patient Unbekannte Probe Fibrinogenkonzentration in der unbekannten

Nr. Probe ([ig/ml)

Material Verdünnungs- Ermittelter Erfindungs- RIA-Methode Objektträgerfaktor - ExtinktionswertgemässeMe- Methode thode

1 Urin x2 0,764 ' 0,402 0,359 0,5

2 do. x 16 1,162 5,178 5,117 8,0

9

633 370

Patient Nr.

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Unbekannte Probe

Material do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

Serum do.

do.

do.

Fibrino-

genfreies

Plasma

Verdünnungs- Ermittelter faktor xl do.

do.

do.

do.

do.

do.

do.

x 10

do.

do.

do.

do.

Extinktionswert gemässe Methode

Fibrinogenkonzentration in der unbekannten Probe (|xg/ml)

Erfindungs- RIA-Methode Objektträger-

1,233 0,090 0,011 0,175 0,066 0,171 0,020 0,199 0,310 0,330 0,520 0,348 0,550

0,347 0,021 0,003 0,042 0,016 0,041 0,005 0,048 0,760 0,812 1,317 0,858 1,400

0,368 0,024 0,006 0,037 0,011 0,008 0,007 0,072 0,800 0,863 1,335 0,892 1,520

Methode

0,5

weniger als 0,5

do.

do.

do.

do.

do.

do.

1,0

0,9 1,25 1,0 2,0

16

Cancerose x 640 Brustfellraumflüssigkeit

1,210

217,12

197,4

320

Aus den obigen Ergebnissen ist zu ersehen, dass die mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens ermittelten Werte der Fibrinogen-Konzentration im wesentlichen gut übereinstimmen mit den Werten, die man nach der Radioimmuntestmethode erzielt, die als die genaueste der herkömmlichen Bestimmungsmethoden gilt. Der Korrelationskoeffizient zwischen der erfindungsgemässen Methode und der Radioimmuntestmethode beträgt 0,999.

Beispiel 2

Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise bereitet man ein Antifibrinogen-sensibilisiertes Latexreagens (das 1 Gew.-% Latexteilchen enthält) mit dem Unterschied, dass man einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 [im verwendet (der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist).

Dann vermischt man einen aliquoten Anteil von 0,1 ml des in dieser Weise erhaltenen Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens mit 0,3 ml einer Standard-Fibrinogenlösung (die 0,5 [ig Fibrinogen pro Liter enthält) und schüttelt während 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 250 Schüttelbewegungen pro Minute, um die Antigen-Antikörper-Reaktion ablaufen zu lassen. Anschliessend bestimmt man die Extinktion der Reaktionsmischung unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 [im in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Zur Bestätigung der Reproduzierbarkeit der Messung wiederholt man die Massnahmen drei weitere Male. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Weiterhin wiederholt man die obige Bestimmungsmethode, mit dem Unterschied, dass man anstelle der Standard-Fibrino-genlösungen Seren verwendet, die man aus von Patienten gewonnenen Blutproben isoliert hat. Man wiederholt dabei die gleiche Bestimmungsmethode viermal an verschiedenen Tagen, um die Reproduzierbarkeit der Bestimmung der Körperflüssigkeit zu bestätigen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind ebenfalls in der Tabelle III angegeben.

30 Tabelle III

Messung Nr.

35 i

2

3

4

Durchschnitts-40 wert

Varianz-Koeffizient

Extinktion

Standard-Fibrinogenlösung

0,582

0,565

0,562

0,545

0,564 ± 0,010

1,8%

Serum

0,294

0,280

0,306

0,287

0,292±0,010

3,4%

45 Wie aus den in der obigen Tabelle III angegebenen Werten zu ersehen ist, ist das erfindungsgemässe Verfahren hervorragend reproduzierbar sowohl bei der Bestimmung der Standard-Fibrinogenproben als auch bei der Bestimmung von tatsächlichen Proben von Körperflüssigkeiten (Serum).

50

Beispiel 3

Zu 5 ml einer Glycinpufferlösung gibt man 100 mg Silicium-dioxid in Form von Mikroteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,32 (im (obwohl 15 % dieser Teilchen einen 55 Durchmesser von 0,5 [im oder mehr aufweisen) und unterzieht die Mischung Ultraschallschwingungen mit einer Frequenz von 28 kHz während 1 Stunde, um eine Suspension der Siliciumdi-oxid-Mikroteilchen zu erreichen. Dann bereitet man nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise ein Reagens in 60 Form einer Suspension von mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisiertem Siliciumdioxid, mit dem Unterschied, dass man anstelle des in Beispiel 1, Abschnitt 1, verwendeten Polystyrollatex mit einer Teilchengrösse von 0,481 [im die in dieser Weise hergestellte Suspension der Siliciumdioxid-Mikroteilchen 65 verwendet und mit dem Unterschied, dass man eine Rinderserumalbumin-Lösung mit einer anderen Konzentration (0,05 Gew.-%) verwendet. Dann bestimmt man unter Verwendung des Antifibrinogen-sensibilisierten Siliciumdioxid-Suspensions-

633 370

10

reagens die Extinktion von Standard-Fibrinogenlösungen in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben.

Tabelle IV Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung (ug/ml)

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Tabelle V

Extinktion bei 1,2 [im

0,028 0,126 0,287 0,460 0,631

Wie in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschrieben, bildet man durch Auftragen der obigen Werte eine Eichkurve, die in der Fig. 8 dargestellt ist. Aus der Fig. 8 ist zu ersehen, dass eine deutliche geradlinige Beziehung zwischen der Fibrinogen-Kon-5 zentration und der Extinktion dann besteht, wenn die Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung 0,4 jxg/ml oder mehr beträgt.

Dann unterwirft man unbekannte Proben (Urin, Serum und 10 Brustfellraumflüssigkeit), die man von Patienten gewonnen hat, der in Beispiel 1, Abschnitt 3, angegebenen Bestimmungsme-thode, um den Fibrinogengehalt der unbekannten Proben zu ermitteln. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusammengestellt.

Patient Nr.

Unbekannte Probe

Material

Verdünnungsfaktor

Gemessene Extinktion

Fibrinogen-Konzentration in der unbekannten Probe (ug/ml)

Erfindungs-

gemässes

Verfahren

RIA-Methode

1

2

3

4

5

6

Urin do.

do.

Serum do.

Cancerose Brustfellraumflüssigkeit

X 1 X 10 X 1 X 1 X 1 X 400

Beispiel 4

Man bestimmt die Extinktion bei Wellenlängen des angewandten Lichts von 1,2 und 1,7 (xm nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1 und 2, beschriebenen Weise, mit dem Unterschied, dass man anstelle des Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 [im einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 |xm mit einem Feststoffgehalt von 10 Gew.-% und eine andere Konzentration des Rinderserumalbumins (0,1 Gew.-%) anwendet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung

0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Extinktion bei 1,2 [xm 1,7 um

0,127 0,258 0,418 0,388 0,258

0,083 0,198 0,452 0,592 0,622

0,125 0,210 0,110 0,440 0,490 0,211

0,400 5,000 0,380 0,770 0,830 200

0,359 5,117 0,368 0,800 0,892 197,4

35

des Antihumanfibrinogen-Antikörpers Antihumanchoriongo-nadotropin-Antikörper (Anti-hCG) verwendet und den Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 jim durch einen anderen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,234 um ersetzt.

Unter Verwendung des in dieser Weise erhaltenen, mit An-4o tihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens bestimmt man die Extinktion nach der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge von 1,2 (im, mit dem Unterschied, dass man anstelle der Standard-Fibrinogenlösung eine Standard-Human-choriongonadotropinlösung einsetzt. Die erhaltenen Ergebnisse

45

sind in der folgenden Tabelle VII angegeben.

Tabelle VII

50

55

Aus den in der obigen Tabelle VI angegebenen Zahlenwerten ist zu ersehen, dass eine deutliche Korrelation zwischen der Fibrinogen-Konzentration und der Extinktion besteht, wenn die Wellenlänge des angewandten Lichtes um einen Faktor von mehr als 2 grösser ist als der durchschnittliche Durchmesser des festen teilchenförmigen Trägermaterials (Polystyrollatexteilchen).

Beispiel 5

Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, angegebenen Weise bereitet man ein mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied, dass man anstelle

60

Konzentration der Standard- Extinktion

Humanchoriongonadotropin- bei 1,2 |xm lösung (IE/ml)

0,1 0,048

0,2 0,130

0,3 0,168

0,4 0,261

0,5 0,360

0,7 0,630

1,0 0,972

Unter Anwendung der obigen Zahlenwerte bereitet man in der oben beschriebenen Weise eine Eichkurve. Andererseits gewinnt man von verschiedenen Patienten Urinproben, die man 65 zur Bestimmung des im Urin vorhandenen Humanchoriongona-dotropins verwendet, wozu man nach der in Beispiel 1, Abschnitt 3, beschriebenen Weise vorgeht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VIII angegeben.

11

633 370

Tabelle Vili

Patient Nr.

Unbekannte Probe

Material

Verdünnungsfaktor

Gemessene Extinktion

Humanchoriongonadotropin-Konzen-tration in den unbekannten Proben (IE/ml)

Erfindungs-

gemässes

Verfahren

RIA-Methode

1

2

3

4

Urin do. do. do.

X 1 do. do. do.

0,400 1,122 0,955 0,990

0,564 0,966 0,944 0,952

0,482 1,120 0,857 0,925

Beispiel 6

Man beschickt eine gläserne Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm, die mit einem L-förmigen Rührstab ausgerüstet ist, mit 0,1 ml des gemäss Beispiel 2 bereiteten, mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens und 0,3 ml einer der Standard-Fibrinogenlösungen mit der in der folgenden Tabelle IX angegebenen Fibrinogen-Konzentration und überwacht die Extinktion der Reaktionsmischung kontinuierlich bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 [Am nach der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise, um die Zeit zu ermitteln, die erforderlich ist, dass die Extinktion einen Wert von 0,5 erreicht, wobei man den Rührstab mit einer definierten Geschwindigkeit von 200 Vibrationen pro Minute vertikal auf-und abbewegt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX angegeben.

Tabelle IX

Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung (mg/ml)

2 4 6 8

10

Zeit bis zum Erreichen eines Extinktionswertes von 0,5 (s)

26,9 11,3 6,4 4,7 2,9

15

Die obigen Werte trägt man auf doppelt logarithmischem Papier auf, wobei man die Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung auf der Abszisse und die Zeit bis zum Erreichen eines 20 Extinktionswertes von 0,5 auf der Ordinate aufträgt, und erhält eine Eichkurve. Die Eichkurve ist, wie es aus der Fig. 9 zu ersehen ist, eine gerade Linie.

25

Dann beschickt man eine Glasabsorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm, die mit einem L-förmigen Rührstab ausgerü-30 stet ist, mit 0,3 ml irgendeiner unbekannten Probe (Urin, Serum und Brustfellraumflüssigkeit), die man von verschiedenen Patienten gewonnen hat, und dann mit 0,1 ml des oben erwähnten Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens und misst in der oben beschriebenen Weise unter Verwendung von Licht mit 35 einer Wellenlänge von 1,2 (Am die Zeit, die erforderlich ist,

dass die Extinktion einen Wert von 0,5 erreicht, worauf man den Wert der Fibrinogen-Konzentration, der dieser Zeit entspricht, von der in der obigen Weise ermittelten Eichkurve abliest. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle X 40 angegeben.

Tabelle X

Unbekannte Proben

Fibrinogen-Konzentration in der unbekannten Probe (|Ag/ml)

Patient Nr.

3

4

5

6

Material

Urin

Cancerose Brustfellraumflüssigkeit

Serum do.

do.

do.

Verdünnungsfaktor

X 1 X 50

X 1 X 1 X 1 X 1

Zeit bis zum Erfindungs-

Erreichen eines gemässes Extinktionswertes Verfahren von 0,5 (s)

9,2 11

25 20 3,8 12

4,5 195

2,1

2.5

8.6

3.7

RIA-Methode

5,117 197,4

2,210 2,302 9,020 3,723

Beispiel 7

1. Herstellung eines mit Oxytocin sensibilisierten Latexreagens.

Man vermischt 1,0 ml einer Oxytocinlösung mit einer Konzentration von 220 IE/ml in einer wässrigen 0,ln Essigsäurelösung mit 0,5 ml eines Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 (Am (Dow-Chemical Company, der einen Feststoffgehalt von 10 Gew.-% aufweist) 65 und rührt die Mischung bei Raumtemperatur während 2 Stunden, wonach man sie während 20 Minuten unter Kühlen auf 2 bis 4 °C (bei 12 000 min- !) zentrifugiert. Die Niederschläge trennt man durch Dekantieren ab und dispergiert die erhaltenen

633 370

12

Oxytocin-sensibilisierten Latexteilchen in 4 ml einer Äthylen-diamintetraessigsäure-Glycin-Pufferlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, unter Bildung eines Oxytocinsensibilisierten Latexreagens, das die Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält.

2. Bestimmung der optimalen Konzentration von Oxytocin-Antiserum

Man vermischt einen aliquoten Anteil von 0,1 ml des gemäss Abschnitt 1 bereiteten Oxytocin-sensibilisierten Latexreagens mit 0,1 ml einer istotonischen Natriumchloridlösung und 0,2 ml Oxytocin-Antiserum, das man mit einer isotonischen Natriumchloridlösung um den in der folgenden Tabelle XI angegebenen Faktor verdünnt hat. Dann schüttelt man die Mischung auf einer sich hin- und herbewegenden Schütteleinrichtung, die bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute betrieben wird, während 12 Minuten und bestimmt dann die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 [im in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XI angegeben.

Tabelle XI

Verdünnungsfaktor des Oxytocin-Antiserums

X 20 X 30 X 40 X 50 X 80 X 100

Extinktion bei 1,2 [im

1,175 0,618 0,393 0,327 0,220 0,162

tocinlösung von Null)minus(Extinktion bei der angegebenen Konzentration)

Wenn man die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlen-s werte graphisch aufträgt, und zwar die Konzentration der Stan-dard-Oxytocinlösung auf der Abszisse und den AD-Wert auf der Ordinate, so erhält man eine geradlinige Beziehung wie aus der Fig. 10 zu ersehen ist. Unter Anwendung der in dieser Weise ermittelten Eichkurve ist es möglich, die Bestimmung von io Oxytocin in dem Serum von schwangeren Frauen zu erreichen.

Aus den obigen Zahlenwerten ist ersichtlich, dass die optimale Konzentration des Oxytocin-Antiserums bei einem Verdünnungsfaktor von etwa 30 liegt.

3. Erstellung einer Eichkurve

Man beschickt ein Kunststoffreagensglas mit 0,2 ml einer Lösung, die man durch Verdünnen des in Abschnitt 2 verwendeten Oxytocin-Antiserums um einen Faktor von 30 erhalten hat, und 0,1 ml einer Standard-Oxytocinlösung (in wässriger 0,ln Essigsäure) mit der in der folgenden Tabelle XII angegebenen Konzentration und mischt gut durch. Nachdem man die Mischung während 30 Minuten bei Raumtemperatur hat stehenlassen, gibt man 0,1 ml des gemäss Abschnitt 1 bereiteten Oxytocin-sensibilisierten Latexreagens in das Reagensglas und schüttelt die erhaltene Mischung während 12 Minuten auf einer hin- und herbewegten Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Die in dieser Weise erhaltene Flüssigkeit überführt man in eine gläserne Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm und bestimmt die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,2 [im in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XII zusammengestellt.

Tabelle XII

Konzentration der

Standard-Oxytocinlösung

([iIE/ml)

Extinktion bei 1,2 [im

AD*

Beispiel 8

15 1. Bereitung eines Humanchoriongonadotropin-sensibili-sierten Latexreagens

In 5 ml 0,05n Chlorwasserstoffsäure löst man 7 900 IE/ml Humanchoriongonadotropin (hCG) und hydrolysiert das Material während 1 Stunde bei 80 °C. Nachdem man die Lösung 20 dialysiert und durch Absaugen filtriert hat, löst man das hydro-lysierte Humanchoriongonadotropin in 2 ml einer 0,05m Boratpufferlösung (mit einem pH-Wert von 8,7) und verdünnt auf ein Gesamtvolumen von 10 ml. Dann gibt man nach und nach unter Rühren einen aliquoten Anteil von 5 ml einer 2%igen Lösung 25 eines Polystyrollatex mit einem Feststoffgehalt von 10 Gew.-% und einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,481 zu der Lösung des hydrolysierten Humanchoriongonadotropins. Die erhaltenen Humanchoriongonadotropin-sensibilisierten Latexteilchen werden während 20 Minuten bei 13 000 min-1 30 zentrifugiert, wonach die abzentrifugierten sensibilisierten Latexteilchen abgetrennt und in 10 ml einer 0,2 %igen Lösung von Rinderserumalbumin in der Boratpufferlösung suspendiert werden. Die Suspension wird dann zentrifugiert. worauf der Niederschlag durch Zentrifugieren mit der Boratpufferlösung ge-35 waschen und schliesslich in 10 ml der Pufferlösung suspendiert wird, so dass man ein Humanchoriongonadotropin-sensibilisier-tes Latexreagens erhält, das 1 Gew.-% Latexteilchen enthält.

2. Ermittlung einer Eichkurve

Die optimale Konzentration des Antihumanchoriongonado-40 tropinserums wird in der in Beispiel 7, Abschnitt 2, beschriebenen Weise ermittelt (die in diesem Fall einer Verdünnung um den Faktor 300 entspricht). Dann beschickt man ein Kunststoffreagenzglas mit 0,2 ml einer Antihumanchoriongonadotropin-Serumlösung, die man durch Verdünnen des Serums mit einer 45 isotonischen Natriumchloridlösung um einen Faktor von 300 erhalten hat, und mit 0,1 ml einer Standard-Humanchoriongo-nadotropin-Lösung in der in der folgenden Tabelle XIII angegebenen Konzentration und schüttelt während 10 Minuten. Anschliessend gibt man 0,1 ml des entsprechend dem obigen Ab-50 schnitt 1 bereiteten Humanchoriongonadotropin-sensibilisier-ten Latexreagens zu und schüttelt die Mischung während 10 Minuten auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Die erhaltene Flüssigkeit wird in eine gläserne Absorptionszelle mit einer Dicke von 55 2 mm überführt, worauf man die Extinktion bei einer Wellenlänge des angewandten Lichtes von 1,0 [im in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle XIII angegeben.

so Tabelle XIII

2 000

0,395

0,183

1 500

0,450

0,128

Konzentration der Standard-

Extinktion bei

1 000

0,483

0,095

Humanchoriongonadotropin-

1,0 [im

500

0,525

0,053

Lösung (IE/ml)

300

0,550

0,028

65

0

0,578

—

10

0,140

1

0,208

*AD =

(Extinktion bei einer Konzentration der Standard-Oxy-

0,1

0,271

13

633 370

Wenn man die obigen Zahlenwerte graphisch aufträgt, und Tabelle XIV zwar den Logarithmus der Konzentration der Standard-Human-

choriongona dotropin-Lösung auf der Abszisse und die Extink- Konzentration der Standard-

tion auf der Ordinate, so erhält man eine Eichkurve, die, wie in Fibrinogenlösung (ng/ml)

der Fig. 11 dargestellt ist, in den Konzentrationsbereichen, in 5

denen die Messung tatsächlich ausgeführt wird, einen geradlini- 20

gen Verlauf zeigt. 40

Somit ist es möglich, unter Verwendung dieser Eichkurve ^

Humanchoriongonadotropin im Serum von schwangeren Frau- m .

en zu bestimmen. "

Wenn man auf der Grundlage der obigen Zahlenwerte eine Eichkurve erstellt, so findet man eine eindeutige Korrelation zwischen der Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung 15 und der Extinktion. Somit ist es erfindungsgemäss möglich, extrem geringe Fibrinogenmengen im Bereich von Nanogram/ Milliliter zu bestimmen und dies mit einer Empfindlichkeit, die vergleichbar ist der Radioimmuntestmethode (RIA-Methode).

Beispiel 9 20 Beispiel 10 In einem Kunststoffreagenzglas vermischt man 0,1 ml des Nach der in Beispiel 1, Abschnitt 1, beschriebenen Weise gemäss Beispiel 1, Abschnitt 1, bereiteten Antifibrinogen-sensi- bereitet man Antif ibrinogen-sensibilisierte Latexreagenzien, die bilisierten Latexreagens (wobei der durchschnittliche Durch- die Antifibrinogen-sensibilisierten Latexteilchen in Konzentramesser der Polystyrollatexteilchen 0,481 (im beträgt und die tionen von 0,75 Gew.-%, 1,0 Gew.-% bzw. 2,0 Gew.-% enthal-sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 2sten, mit dem Unterschied, dass man einen anderen Polystyrolla-Gew.-% vorliegen) und 0,3 ml einer Standard-Fibrinogenlö- tex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,35 sung (die in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,5 (im verwendet. Für jedes in dieser Weise bereitete Antifibrino-Gew.-% Rinderserumalbumin enthält) in der in der folgenden gen-sensibilisierte Latexreagens nimmt man nach der in Beispiel Tabelle XIV angegebenen Konzentration und schüttelt dann 1, Abschnitt 2, beschriebenen Weise eine Eichkurve auf (bei während 3 Stunden auf einer hin- und hergehenden Schüttelein- 30 einer Wellenlänge des angewandten Lichts von 1,2 (tm und bei richtung bei 200 Schüttelvorgängen pro Minute. Anschliessend einer Schüttelzeit von 10 Minuten). Diese Eichkurven sind in bestimmt man die Extinktion bei einer Wellenlänge des ange- der Fig. 12 dargestellt. Wie aus der Fig. 12 zu ersehen ist, nimmt wandten Lichts von 1,2 (im in der in Beispiel 1, Abschnitt 2, die Nachweisempfindlichkeit für Fibrinogen mit der Konzentra-beschriebenen Weise. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der tion der sensibilisierten Latexteilchen in dem Antifibrinogen-folgenden Tabelle XIV zusammengestellt. 35 sensibilisierten Latexreagens zu.

Extinktion bei 1,2 (im

0,048 0,125 0,324 0.540 0,718 0,802

C

4 Blatt Zeichnungen

Claims (10)

633 370 2 PATENTANSPRÜCHE mung von biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise Antige-

1. Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikör- nen und Antikörpern, die in extrem geringen Konzentrationen pern durch Fixieren eines Antikörpers oder eines Antigens an vorliegen. Es besteht ausserdem ein starkes Bedürfnis dafür, die unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durch- Anwesenheit von Drogen oder Arzneimitteln in Körperflüssigmesser von nicht mehr als 1,6 [im, um die unlöslichen Träger- 5 keiten festzustellen. Weiterhin ist es für die medizinische Diateilchen zu sensibilisieren, Umsetzen des auf dem Trägermate- gnose häufig wichtig, über die Anwesenheit von verschiedenen rial vorliegenden Antikörpers und/oder Antigens mit einem Substanzen Bescheid zu wissen, die auf natürlichem Wege von entsprechenden Antigen oder Antikörper oder einer Mischung dem Körper synthetisiert werden oder in den Körper eingeführt davon in einem flüssigen Medium, Bestrahlen der Reaktionsmi- worden sind.

schung mit Licht und Messung der Extinktion der Reaktionsmi- io Bislang ist es bereits bekannt, Antikörper oder Antigene schung, dadurch gekennzeichnet, dass man die Reaktionsmi- halbquantitativ dadurch nachzuweisen, dass man Latexteilchen,

schung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis an die man einen Antikörper oder ein Antigen fixiert hat, mit

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, Aus den folgenden Veröffentlichungen ist es bekannt, Anti-dass die verwendeten unlöslichen Trägerteilchen einen durch- gene und Antikörper unter Verwendung der oben erwähnten schnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 [im, vor- Latexteilchen quantitativ zu bestimmen, indem man einen Anti-zugsweise von 0,2 bis 0,8 [im, aufweisen. körper oder ein Antigen an den Latexteilchen fixiert, den auf

2,4 [Am, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als einem entsprechenden Antigen oder Antikörper auf einer Glas-

der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, be- platte umsetzt und visuell den Agglutinationszustand beob-

strahlt. i5 achtet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn- 20 dem Trägermaterial vorliegenden Antikörper oder das auf dem zeichnet, dass man als Trägerteilchen ein feines Pulver aus Trägermaterial vorliegende Antigen mit einem entsprechenden hochmolekularem Polystyrollatex verwendet. Antigen oder Antikörper umsetzt, um die Latexteilchen zu ag-

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich- glutinieren oder zusammenzuballen, und die Geschwindigkeit net, dass man die Umsetzung während einer vorherbestimmten der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Zeitdauer unter spezifischen Bedingungen durchführt und an- 2s Latex mit Hilfe von sichtbarem Licht zu messen, um das Anti-schliessend die Extinktion der Reaktionsmischung misst. gen oder den Antikörper unter Ausnützung des Agglutinations-

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich- phänomens des als Reagens verwendeten Latex zu bestimmen: net, dass man die Zeitdauer bestimmt, die erforderlich ist, dass A) Croatica Chemica Acta, 42 (1970) 457—466 ; und die Extinktion der Reaktionsmischung einen vorbestimmten B) European Journal of Biochemistry, Vol. 20, Nr. 4 (1971)

Wert erreicht. 30 558-560.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeich- Da die Methode gemäss dem obigen Vorschlag die Messung net, dass man Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von der Geschwindigkeit der Trübungsabnahme dazu benützt, das 0,8 [im bis 1,8 [im, vorzugsweise von 1 bis 1,4 [xm, anwendet. Antigen oder den Antikörper zu bestimmen, ist es erforderlich,

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeich- einen mit dem Antikörper oder dem Antigen sensibilisierten net, dass man Licht mit einer Wellenlänge anwendet, die um 35 Latex mit extrem geringer Konzentration, die beispielsweise im einen Faktor von mindestens 2 länger ist als der durchschnittli- Bereich von 0,007 bis 0,028 % liegt, zu verwenden, die Reak-che Durchmesser der Trägerteilchen. tion des Latex und des Antigens und des Antikörpers in einem

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeich- stationären Zustand durchzuführen, irgendwelche Verunreini-net, dass man die Trägerteilchen in einer solchen Menge ver- gungen, die die Trübung der Probe beeinträchtigen könnten, zu wendet, dass die Konzentration des Trägermaterials in der Re- 40 entfernen und ähnliche Massnahmen zu ergreifen. Als Ergebnis aktionsmischung 0,1 bis 1 Gew.-% beträgt. davon ist die oben erwähnte Methode nachteilig dadurch, dass

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeich- die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion unver-net, dass man als flüssiges Medium Wasser oder eine Mischung meidbar vermindert wird, dass sowohl die Präzision als auch die aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lö- Reproduzierbarkeit für die Bestimmung von Antigenen oder sungsmittel verwendet. 45 Antikörpern ungenügend sind und dass die Abtrennung von

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeich- Verunreinigungen häufig extrem komplizierte Massnahmen er-net, dass man zunächst ein Antigen oder einen Antikörper zu forderlich macht. Demzufolge ist es schwierig, die obige Metho-einer zu untersuchenden Flüssigkeit, die den zu bestimmenden de zur Bestimmung von Antigenen, wie Fibrinogen (Fg), Hu-Antikörper oder das zu bestimmende Antigen enthält, zusetzt manchoriongonadotropin (hCG) oder ähnliche Materialien zu und damit umsetzt und anschliessend eine Suspension der unlös-50 verwenden, bei denen komplizierte Massnahmen zur Herstel-lichen Trägerteilchen, an die ein besonderes Antigen oder ein lung des notwendigen Reagens erforderlich sind und bei denen besonderer Antikörper fixiert ist, zugibt und mit der bei der es schwierig ist, eine reproduzierbare Agglutinationsreaktion ersten Reaktion gebildeten Reaktionsmischung umsetzt. der Substanz zu errreichen, die in Blut oder Urin enthalten ist,

das bzw. der verschiedene andere Substanzen enthält, die die 55 Reaktion beeinträchtigen können.

Aus