DE3016831C2

DE3016831C2 -

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Publication number: DE3016831C2
Application number: DE3016831A
Authority: DE
Inventors: Haruo Matsudo Chiba Jp Ogura; Kazuyoshi Yokohama Kanagawa Jp Takeda
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-05-02
Filing date: 1980-05-02
Publication date: 1989-12-07
Also published as: US4341707A; FR2455586B1; GB2049686A; GB2049686B; JPS55145665A; IT8009417A0; JPH0112751B2; DE3016831A1; DE3051115C2; FR2455586A1; IT1175395B

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von N,N′-Disuccinimidyl-, N,N'-Diphthalmidyl- oder N,N'-Bis-(5-norbornen-2,3-dicarboximidyl)-carbonat zur Herstellung von Aminosäureaktivestern und in der Peptidsynthese.

Die übliche Peptidsynthese schließt die Methode über den aktiven Ester ein, gemäß welcher die Aminosäure zunächst in einen aktiven Ester umgewandelt und mit einer zweiten Aminosäure kondensiert wird. Bei der Aktivierung einer Aminosäure wird diese im allgemeinen in ihren aktiven Ester, ihr aktives Säureanhydrid oder ihr aktives Säureazid umgewandelt, welches dann mit einer zweiten Aminosäure umgesetzt wird. Die Methode über den aktiven Ester ebenso wie die Methoden über das Säureanhydrid und das Säureazid sind jedoch kaum ohne unerwünschte Racemisierung der eingesetzten Aminosäure durchführbar. Wird die Peptidsynthese nach der Methode über den aktiven Ester durchgeführt, so umfaßt die Verfahrensstufe der Kondensation der ersten Aminosäure mit der zweiten Aminosäure im allgemeinen zwei Stufen; in der ersten Stufe wird der aktive Ester der Aminosäure hergestellt und in der zweiten Stufe wird der so gewonnene aktive Aminosäureester mit einer Aminkomponente (nämlich der zweiten Aminosäure, die eine freie Aminogruppe aufweisen muß, welche mit der aktivierten Carboxylgruppe des aktiven Aminosäureesters kondensiert wird, so daß die Amidbindung zwischen den beiden Aminosäuren gebildet wird) "gekuppelt", d. h. verbunden. Es ist aus der Literatur bekannt, daß bei Durchführung der Kupplungsstufe nach der bekannten "backing off"-Methode die unerwünschte Racemisierung im allgemeinen schwer eintritt. Wenn infolgedessen die Stufe der Aktivierung der Aminosäure im wesentlichen ohne Eintritt einer Racemisierung durchgeführt werden kann, ist es günstig, auch die Fragmentkondensation der beiden Aminosäure-Reaktanten in einer günstigen Weise ohne eine Racemisierung der Aminosäuren während des gesamten Verfahrens der Peptidsynthese aus Aminosäuren durchzuführen.

Zu den aktiven Estergruppen, mit denen eine Aminosäure in ihre aktive Form umgewandelt werden kann, gehören die p-Nitrophenylgruppe, die N-Hydroxysuccinimidogruppe und die N-Hydroxyphthalimidogruppe. Eine der gebräuchlichen Methoden zur Herstellung der aktiven Ester von Aminosäuren ist die Methode, bei welcher die Aminosäure mit N-Hydroxysuccinimid (im Folgenden mit der Abkürzung HOSu bezeichnet) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid (im Folgenden mit der Abkürzung DCC bezeichnet) als Dehydratisierungsmittel umgesetzt wird, so daß sich der N-Hydroxysuccinimidester der betreffenden Aminosäure bildet (Anderson et al "Journal of American Chemical Society" 85, 3039 (1963)). Diese DCC-Methode besitzt verschiedene Vorteile, beispielsweise daß der entstehende Aminosäure-N-hydroxysuccinimidester gut kristallisiert (und folglich leicht zu reinigen ist), daß der Ester hoch-reaktiv ist und daß in der Kupplungsstufe freigesetzte N-Hydroxysuccinimid in Wasser löslich ist, so daß es auch dem Reaktionsgemisch durch einfaches Auswaschen mit Wasser nach Beendigung der Kupplungsreaktion entfernt werden kann. Es ist jedoch auch bekannt, daß die DCC-Methode verschiedene Nachteile aufweist, so unter anderem den, daß das als Dehydratisierungsmittel eingesetzte DCC und der hergestellte Aminosäure-N-hydroxysuccinimidester beide eine oleophile Natur aufweisen, wodurch die Entfernung von DCC aus dem Reaktionsgemisch, welches den gebildeten aktiven Aminosäureester enthält, nicht durch einfaches Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel vorgenommen werden kann, sondern daß schwierige und mühsame Operationen zur Isolierung des gewünschten aktiven Aminosäureesters durchgeführt werden müssen. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß durch eine Lossen-Umlagerung aus der Aminosäure unter der Wirkung von DCC und HOSu β-Alaninderivate als Nebenprodukte gebildet werden können. Wird die DCC-Methode auf Asparagin, Glutamin oder entsprechende andere Aminosäuren, die eine Säureamidgruppe im Molekül enthalten, angewandt, so ist es nachteilig, daß durch Wasserabspaltung unter der Wirkung des DCC ein Nitrilderivat als unerwünschtes Nebenprodukt gebildet werden kann.

Zu den weiteren bekannten Methoden der Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters von Aminosäuren gehört auch die Methode, bei welcher Trifluoressigsäureanhydrid verwendet und mit N-Hydroxysuccinimid umgesetzt wird, so daß sich der N-Hydroxysuccinimidester von Trichloressigsäure bildet, welcher dann mit einer Aminosäure zu dem gewünschten aktiven Ester der Aminosäure durch eine Umesterungsreaktion gebildet wird (Stepanoya et al, "J. Gen. Chem." (USSR) 45, 2451 (1976)). Wird diese bekannte Methode auf N-t-Butoxycarbonylglycin (Boc-Gly) angewandt, so laufen die Reaktionen nach folgendem Schema ab:

Bei dieser bekannten Methode muß jedoch der als Zwischenprodukt zu verwendende Trichloressigsäure-N- hydroxysuccinimidester unmittelbar vor seiner Verwendung hergestellt werden und kann weder isoliert noch gereinigt werden, was bedingt, daß der aktive Ester der Aminosäure, der unter Verwendung von Trichloressigsäure- N-hydroxysuccinimidester hergestellt worden ist, mehrfachen Reinigungsoperationen unterworfen werden muß. Darüberhinaus muß die Herstellung von Trichloressigsäure- N-hydroxysuccinimidester unter absolut wasserfreien Bedingungen erfolgen, was als ein weiterer Nachteil angesehen werden muß. Bei dem Verfahren von Groos et al (Angew. Chem. Internt. Edit. 6, 570 (1967)) wird das Kaliumsalz des N-Hydroxysuccinimid mit Phosgen umgesetzt, wobei N-Hydroxysuccinimid-chloroformiat gebildet wird, welches anschließend mit einer N-geschützten Aminosäure in Gegenwart von Triäthylamin zu einem gemischten Säureanhydrid umgesetzt wird. Das so hergestellte gemischte Säureanhydrid wird anschließend erhitzt, wobei sich der aktive N-Hydroxysuccinimidester der N-geschützten Aminosäure bildet. Wird diese Methode von Groos et al auf N-Benzyloxycarbonylphenylalanin (Z-Phe) angewandt, so laufen folgende Reaktionen ab:

Die Methode von Groos et al hat jedoch den Nachteil, daß die erforderlichen Operationen kompliziert sind und das Risiko einschließen, daß die eingesetzten Aminosäuren infolge der Wirkung der Chloridionen, die während der Reaktionen gebildet werden, einer unerwünschten Racemisierung unterliegen.

G. W. Anderson et al beschreiben die Synthese von N- Hydroxysuccinimid-Estern von Acyl-Peptiden nach der gemischten Anhydrid-Methode (J. Am. Chem. Soc. 89 (1967) 178). Danach wird eine N-geschützte Aminosäure oder ein N-Peptid unter wasserfreien Bedingungen mit Isobutylformiat umgesetzt, so daß sich ein gemischtes Anhydrid bildet, welches anschließend mit N-Hydroxysuccinimid unter Erwärmen zum aktiven N-Hydroxysuccinimid-Ester der N-geschützten Aminosäure oder des N-geschützten Peptids reagiert.

Die Nachteile dieser Methode liegen vorwiegend in dem relativ hohen Arbeitsaufwand, den "wasserfreies Arbeiten" sowie das aggressive Reagenz "Isobutylformiat" erfordern. Außerdem ist die Bildung von Nebenprodukten ungünstig zu beurteilen.

Von Ito ("Bull. Chem. Soc. Jpn." 47, 471 (1974)) ist eine Methode vorgeschlagen worden, gemäß welcher eine organische Säure wie Benzoesäure durch Umsetzung mit einem asymmetrischen Carbonat, insbesondere Äthyl- 2-äthoxycarbonyloxyimino-2-cyanoacetat in Gegenwart von Diäthylamin aktiviert wird. Die Reaktion läuft nach folgendem Schema ab:

Dabei ist zu beachten, daß mit der Methode von Ito zwei verschiedene Ester gleichzeitig gebildet werden, und zwar infolge der Asymmetrie des als Aktivierungsmittel eingesetzten Carbonat-Derivates, wovon einer der beiden gebildeten Ester der gewünschte aktivierte Ester ist, der andere jedoch ein nicht-aktivierter Ester ist. Nach der Methode von Ito ist es auch möglich, Äthyl-2- (p-nitrophenyloxy)-carbonyloxyimino-2-cyanoacetat als aktivierendes asymmetrisches Carbonat-Derivat zu verwenden. Wird dieses besondere Carbonat verwendet, so läßt sich eine Aminosäure in einer Ausbeute von 50 bis 60% in ihren aktiven Ester umwandeln. Wird die Methode von Ito auf N-Benzyloxycarbonylphenylalanin (Z-Phe) angewandt, so läuft folgende Reaktion ab:

Mit diesem Verfahren erhält man jedoch nicht den gewünschten aktiven Ester der Aminosäure, von dem angenommen werden kann, daß er nur schwer der Racemisierung der Aminosäure ausgesetzt ist.

Von Glatthard et al ("Helv. Chem. Acta." 46, 795 (1963)) wurde eine Methode zur Herstellung eines aktiven Esters einer Aminosäure in guter Ausbeute vorgeschlagen, gemäß welcher eine Aminosäure mit einem Diphenylcarbonat umgesetzt wird, welches durch Umsetzung eines bestimmten Phenolderivates mit Phosgen gewonnen wird. Wird dieses Diphenylcarbonat als Aktivierungsreagenz für die Aminosäure verwendet, so schließt diese Umsetzung das Risiko ein, daß die Aminosäure in der Stufe der Aminolyse der Racemisierung unterliegt; die Aminolyse ist die Stufe, in der der aktivierte Aminosäureester mit der Aminkomponente (d. h. der zweiten Aminosäure) unter Bildung der Amidobindung gekuppelt wird.

Auf der Basis der vorstehend erwähnten verschiedenen bekannten Methoden und unter Berücksichtigung der Vor- und Nachteile ist jetzt überlegt worden, daß eine Verbindung, die sowohl in Form eines N-Hydroxyderivates als auch in Form versprechender Weise als Reagenz für die Umwandlung einer Aminosäure in ihren aktiven Ester, der einerseits in der Peptidsynthese verwendet wird, einsetzbar sein müßte und daß, wenn eine solche Verbindung mit einer Aminosäure umgesetzt wird, die Herstellung des aktiven Esters aus der Aminosäure in einfacher Weise und mit verhältnismäßig hohem Wirkungsgrad unter mäßigen Reaktionsbedingungen zu erreichen wäre.

Die erfindungsgemäß verwendeten Carbonatderivate haben die allgemeine Formel I:

in welcher R eine Succinimidogruppe, eine Phthalimidogruppe oder eine 5-Norbornen-2,3-dicarboxyimidogruppe bedeutet. Wird ein Carbonat der Formel I mit einer Aminosäure umgesetzt, so läßt sich der aktive Aminosäureester tatsächlich bei Umgebungstemperatur in einfacher Weise und in hoher Ausbeute gewinnen und eine Racemisierung der eingesetzten Aminosäure während der Herstellung des aktiven Esters tritt nicht ein, ebensowenig wie eine Racemisierung der Aminosäure, wenn der aktive Aminosäureester in der folgenden Stufe bei der Peptidsynthese mit einer zweiten Aminosäure kondensiert wird.

Das erfindungsgemäß verwendete Carbonat-Derivat ist auch dadurch vorteilhaft, daß es bei der Umsetzung mit der Aminosäure unter Bildung des aktiven Esters gasförmiges Kohlendioxid freisetzt, so daß der Endpunkt der Umsetzung des Carbonates mit der Aminosäure visuell feststellbar ist, indem man die Entwicklung von gasförmigem Kohlendioxid bis zum Aufhören beobachtet. Das Carbonat-Derivat ist leicht zu handhaben und hat keine irritierende Wirkung auf die menschliche Haut. Das Cyclohexylcarbodimid (DCC), welches bei der bisher bekannten DCC- Methode verwendet wurde, weist dagegen eine stark irritierende Wirkung auf die menschliche Haut auf. Das erfindungsgemäß verwendete Carbonat setzt N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxy-5-norbornen- 2,3-dicarboxyimid frei, wenn es mit der Aminosäure zu dem aktiven Aminosäureester umgesetzt wird und das so freigesetzte N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid oder N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid ist in Wasser löslich und folglich leicht aus dem Reaktionsgemisch durch einfaches Waschen mit Wasser entfernbar. DCC ist dagegen nicht in Wasser löslich. Bei der DCC-Methode läßt sich das DCC also nicht durch einfaches Waschen aus dem Reaktionsgemisch entfernen.

Die Reaktion von erfindungsgemäß verwendeten Carbonatderivat der Formel

in welchem die Reste R der allgemeinen Formel I jeweils eine 5-Norbornen-2,3-dicarboxyimidogruppe sind, kann in einfacher Weise mit einer N-geschützten Aminosäure bei Umgebungstemperatur in neutralem oder in im wesentlichen neutralem Milieu umgesetzt werden, wobei man den entsprechenden N-geschützten, aktiven Aminosäureester in hoher Ausbeute erhält. Der gewünschte aktive Aminosäureester, der in der vorstehend beschriebenen Weise gebildet wird, kann als gereinigte Lösung gewonnen werden, indem man das Reaktionsgemisch einfach mit Wasser wäscht;
dies ist möglich, weil die bei der Umsetzung des Carbonates der Formel I mit der Aminosäure freigesetzte N-Hydroxyverbindung der Formel II ebenso wie nicht umgesetztes Carbonat der Formel I aus dem Reaktionsgemisch durch einfaches Waschen mit Wasser entfernt werden können. Der in der beschriebenen Weise hergestellte aktive Aminosäureester kann aber auch als solcher, d. h. ohne Isolierung und Reinigung weiterverwendet und mit einer zweiten Aminosäure umgesetzt werden, so daß die Aminolyse, d. h. die Bildung der Amidobindung in der Peptidsynthese eintritt. Das Carbonat der Formel I läßt sich auch als Kondensationsmittel verwenden, welches direkt in der Synthese von Peptiden aus zwei oder mehr Aminosäuren eingesetzt werden kann. Die Verbindungen der Formel I sind daher wertvolle Reagentien für die Peptidsynthese.

Zum Beweis der vielen vorteilhaften Verwendungsmöglichkeiten der Carbonatderivate wurden verschiedene Versuche zur Synthese von Peptiden durchgeführt, wobei N,N′-Disuccinimidylcarbonat (DSC) als repräsentatives Beispiel eines Carbonates gemäß vorliegender Erfindung benutzt wurde. DSC wurde mit folgenden N-geschützten Aminosäuren zu deren aktiven Estern umgesetzt: N-Benzyloxycarbonylvalin (Z-Val); N-Benzyloxycarbonylphenylalanin (Z-Phe); N-Benzyloxycarbonylmethionin (Z-Met); N-t-Butoxycarbonylglycin (Boc-Gly); N-t-Butoxycarbonylvalin (Boc-Val); N-t- Butoxycarbonylphenylalanin (Boc-Phe). Die so gewonnenen aktiven Ester der entsprechenden N-geschützten Aminosäuren wurden ohne Isolierung aus dem Reaktionsgemisch in Pyridin mit einem Aminosäureester kondensiert, der als Aminkomponente, d. h. als zweite Aminosäure verwendet wurde. Folgende Verbindungen wurden beispielsweise als zweite Aminosäure dienende Aminkomponente eingesetzt:
Glycinäthylester (Gly-OEt); Leucinäthylester (Leu-OEt); Methioninäthylester (Met-OEt). Bei der Durchführung der Versuche wurden jeweils die Ausbeute und die spezifische optische Drehung (a)_D der synthestisierten Dipeptide festgestellt und in die folgende Tabelle 1 mit aufgenommen. Zu Vergleichszwecken wurden auch die aus der Literatur bekannten Werte für die Ausbeute und die spezifische optische Drehung von solchen entsprechenden Dipeptiden mit aufgenommen, die nach der bekannten DCC-Methode hergestellt worden waren, gemäß welcher freies N-Hydroxysuccinimid (HOSu) mit einer N-geschützten Aminosäure in Gegenwart von DCC zu dem aktiven Aminosäureester umgesetzt worden war, der dann ohne Isolierung aus der Reaktionsmischung mit einem als Aminkomponente verwendeten Aminosäureäthyl- oder -methylester kondensiert worden war. Die mit Bezug auf die Ergebnisse der DCC-Methode geprüfte Literatur war die "Rec. Trav. Pay-Bas" 92, 92 (1973). Weiterhin wurde das "Bull. Chem. Soc. Jpn." 46, 1489 (1973) geprüft, in welchem die Ergebnisse der Synthese von Dipeptiden nach der bekannten Methode, die mit N-acyliertem Aziridinon als Dehydratisierungsmittel arbeitet, beschrieben ist. Die Ergebnisse, die mit diesen bekannten Methoden erzielt werden, sind ebenfalls in Tabelle 1 enthalten.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen die folgenden Beispiele.

Beispiel 1 Herstellung von N,N′-Disuccinimidylcarbonat (DSC)

(1) 11,5 g (0,1 Mol) N-Hydroxysuccinimid wurden mit 14,5 g (0,1 Mol) Trimethylsilyldiäthylamin (TMS-DEA) als Silylierungsmittel vermischt; die entstandene Mischung wurde 2 Stunden zum Rückfluß erhitzt. Anschließend wurde nicht umgesetztes TMS-DEA aus dem Reaktionsgemisch abdestilliert. Die zurückbleibende Mischung wurde mit Tetrahydrofuran (THF) sowie weiterhin mit 100 ml einer Lösung von 30% Phosgen in Toluol (Gewicht/ Volumen) unter Eiskühlung vermischt. Die entstandene Mischung wurde 5 Stunden gerührt. Das überschüssige Phosgen und THF wurden aus der Reaktionslösung abdestilliert. Der verbleibende feste Rückstand wurde mit Aceton gewaschen, wobei eine kristalline Substanz zurückblieb. Durch Umkristallisieren aus Acetonitril erhielt man 10,1 g der Titelverbindung in Form von farblosen Kristallen. Ausbeute 80%; F. 211∼215°C. IR-Spektrum (cm^-1): ν 1750; n ^KBr 1840, 1780.NMR-Spektrum (DMSO-α₆, ppm.): 2,61 (8 H. s -CH₂CH₂- × 2).Gewichtsanalyse für C₉H₈O₇N₂:berechnet:
H 3,14, C 42,20, N 10,93%;
gefunden:
H 3,13, C 42,15, N 10,74%.
(2) 11,5 g (0,1 Mol) N-Hydroxysuccinimid wurden mit 8,1 g Hexamethyldisilazan als Silylierungsmittel vermischt; die entstandene Mischung wurde zum Rückfluß erhitzt. Nachdem sich die Reaktionsteilnehmer gelöst hatten, wurde die entstandene Lösung mit THF und Phosgen vermischt und anschließend in derselben Weise behandelt wie vorstehend bei Verfahrensstufe (1) angegeben. Man erhielt auf diese Weise 8,5 g der Titelverbindung in Form von farblosen Kristallen. Ausbeute 65,9%.
(3) 11,5 g (0,1 Mol) N-Hydroxysuccinimid wurden mit 6 ml (0,05 Mol) Trichlormethylchloroformiat (TCF) vermischt und die entstandene Mischung wurde durch Erhitzen aufgeschmolzen. Das Erhitzen wurde noch weitere 10 Minuten fortgesetzt. Danach ließ man die Schmelze abkühlen, wobei sich ein farbloses kristallines Material absetzte. Dieses kristalline Material wurde von der flüssigen Phase abfiltriert und aus Acetonitril umkristallisiert. Man erhielt auf diese Weise 6,5 g der Titelverbindung in Form von farblosen Kristallen. Ausbeute 50%.
(4)11,5 g (0,1 Mol) N-Hydroxysuccinimid und 12 ml (0,1 Mol) TCF wurden mit Xylol vermischt. Die Mischung wurde zum Rückfluß erhitzt. Während des Siedens unter Rückfluß setzte sich ein farbloses kristallines Material ab. 6 Stunden später wurde dieses kristalline Material abfiltriert und aus Acetonitril umkristallisiert. Man erhielt auf diese Weise 8,0 g der Titelverbindung in Form von farblosen Kristallen in einer Ausbeute von 80%.

Beispiel 2

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 (1) wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß 0,1 Mol N-Hydroxyphthalimid anstelle von N-Hydroxysuccinimid verwendet wurden. Man erhielt auf diese Weise N,N′-Diphthalimidylcarbonat in Form von farblosen Kristallen. F. 208∼210°C.

IR-Spektrum (cm^-1): ν 1850, 1790;
νKn 1600.

Gewichtsanalyse für C₁₇H₈O₇N₂:

berechnet:
C 59,38, H 4,20, N 7,29%;
gefunden:
C 59,11, H 4,14, N 7,29%.

Beispiel 3

Die Arbeitsweise von Beispiel 1 (1) wurde wiederholt, jedoch mit 0,1 Mol N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid anstelle von N-Hydroxysuccinimid verwendet. Man erhielt auf diese Weise N,N′-Bis(5-norbornen-2,3-dicarboximidyl)- carbonat in Form von farblosen Kristallen. F. 242∼245°C (unter Zersetzung).

IR-Spektrum (cm^-1): ν 1850, 1790;
ν 1750.

Gewichtsanalyse für C₁₉H₁₆O₇N₂:

berechnet:
C 57,97, H 2,29, N 7,95%;
gefunden:
C 57,97, H 2,35, N 8,10%.

Beispiel 4

In diesem Beispiel soll die Herstellung des aktiven Esters verschiedener Aminosäuren unter Verwendung von DSC erläutert werden.

Eine Lösung von 0,251 g (0,001 Mol) N-Benzyloxycarbonylvalin (Z-Val), 0,08 g (0,001 Mol) Pyridin und 0,256 g (0,001 Mol) DSC in 10 ml Acetonitril wurde bei Umgebungstemperatur 2 Stunden gerührt; nach dieser Zeit hörte die Entwicklung von gasförmigem Kohlendioxid auf. Anschließend wurde die Reaktionslösung auf ein kleines Volumen eingeengt und dann mit Äthylacetat vermischt. Die Mischung, d h. die Lösung, die so erhalten worden war, wurde mit wäßrigem 4%igem NaHCO₃, wäßriger 1n HCl und gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen, um das freigesetzte N-Hydroxysuccinimid zu entfernen. Anschließend wurde die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das benutzte Lösungsmittel wurde abdestilliert, so daß eine farblose kristalline Substanz zurückblieb. Durch Umkristallisieren dieser kristallinen Substanz aus Äthanol-Petroläther erhielt man 0,348 g N-Benzyloxycarbonylvalin-N-succinimidester (Z-Val-OSu) in Form von farblosen Kristallen. Ausbeute 100%.

In der vorstehend beschriebenen Weise wurde eine größere Zahl von aktiven Aminosäureestern hergestellt und deren physikalische Eigenschaften gemessen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 zusammengestellt. Die Ergebnisse der Gewichtsanalyse der aktiven Ester, die gemäß diesem Beispiel hergestellt worden sind, jedoch bereits aus der Literatur bekannt, sind nicht in Tabelle 2 mit aufgenommen worden.

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die Synthese von Dipeptiden unter Verwendung von DSC.

Eine Lösung aus 0,265 g (0,001 Mol) N-t-Butoxycarbonylphenylalanin (Boc-Phe), 0,08 g (0,001 Mol) Pyridin und 0,256 g (0,001 Mol) DSC in 10 ml Acetonitril wurde bei Umgebungstemperatur gerührt. Nachdem die Dünnschichtchromatographie (TLC) an Silikagel gezeigt hatte, daß Boc-Phe (in Form der freien Säure) aus der Lösung verschwunden war, wurde die Reaktionslösung mit einer Lösung aus 0,139 g (0,001 Mol) Glycinäthylester-Hydrochlorid (Gly-OEt · HCl) und 0,101 g (0,001 Mol) Triäthylamin in 10 ml Acetonitril vermischt. 24 Stunden später wurde das Reaktionsgemisch auf ein kleines Volumen eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde mit Äthylacetat vermischt und dann nacheinander mit wäßriger 4%iger NaHCO₃-Lösung, wäßriger 10%iger Zitronensäure (oder 1n Chlorwasserstoffsäure) und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, um freigesetztes N- Hydroxysuccinimid zu entfernen; anschließend wurde die Lösung über Natriumsulfat getrocknet. Die eingesetzten Lösungsmittel wurden abdestilliert, so daß das Dipeptid als farbloses kristallines Material zurückblieb. Durch Umkristallisieren des kristallinen Materials aus Äther- Petroläther erhielt man 0,342 g des Dipeptids (Boc-Phe- Gly-OEt) in Form einer farblosen kristallinen Substanz. Ausbeute 97,7%.

In derselben Weise wie vorstehend beschrieben wurde eine Reihe weiterer Dipeptide hergestellt, deren physikalische Konstanten in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt sind.

Die Gewichtsanalysen der Dipeptide, die gemäß diesem Beispiel hergestellt worden sind, deren Werte jedoch aus der Literatur bekannt sind, sind weggelassen worden.

Beispiel 6

Dieses Beispiel erläutert die Synthese einer Reihe von Dipeptiden.

(A) Eine Lösung aus 0,223 g (0,001 Mol) N-Benzyloxycarbonylalanin (Z-Ala), 0,08 g (0,001 Mol) Pyridin und 0,256 g (0,001 Mol) DSC in 10 ml Acetonitril wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem die TLC an Silikagel gezeigt hatte, daß Z-Ala (in Form der freien Säure) aus der Lösung verschwunden war, wurde die Lösung auf ein kleines Volumen eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde mit Äthylacetat vermischt und nacheinander mit wäßriger 4%iger NaHCO₃, 1n HCl und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, um das freigesetzte N-Hydroxysuccinimid zu entfernen. Aus der so behandelten Lösung wurde anschließend das Äthylacetat abdestilliert. Der verbleibende feste Rückstand wurde mit einer Lösung aus 0,165 g (0,001 Mol) Phenylalanin (Phe-OH) und 0,101 g (0,001 Mol) Triäthylamin in 20 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Acetonitril und Wasser (Volumenverhältnis 4 : 6) vermischt. 24 Stunden später wurde die Reaktionslösung auf ein kleines Volumen eingeengt. Die konzentrierte Lösung wurde mit Äthylacetat vermischt, mit wäßriger 4%iger NaHCO₃, 1n HCl und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wurde die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde destilliert, wobei man eine farblose kristalline Substanz gewann. Durch Umkristallisieren dieser kristallinen Substanz aus Methylenchlorid-Äthyläther erhielt man 0,34 g N-Benzyloxycarbonylalanyl-phenylalanin (Z-Ala-Phe-OH) als farblose kristalline Substanz. Ausbeute 90%.
(B) Eine Lösung aus 0,223 g (0,001 Mol) N-Benzyloxycarbonylalanin (Z-Ala), 0,08 g (0,001 Mol) Pyridin und 0,256 g (0,001 Mol) DSC in 10 ml Dimethylformamid (DMF) wurde bei Umgebungstemperatur gerührt. Nachdem die TLC an Silikagel gezeigt hatte, daß Z-Ala (in Form der freien Säure) aus der Lösung verschwunden war, wurde die Reaktionslösung mit Äthylacetat vermischt und nacheinander mit 4%iger NaHCO₃, 1n HCl und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die so behandelte Lösung wurde destilliert, um das Äthylacetat zu entfernen; dabei verblieb ein fester Rückstand. Dieser Rückstand wurde mit einer Lösung aus 0,165 g (0,001 Mol) Phenylalanin (Phe-OH) und 0,101 g (0,001 Mol) Triäthylamin in 20 ml DMF vermischt und die entstandene Mischung wurde 24 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat vermischt und mit wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen, um freigesetztes N-Hydroxysuccinimid zu entfernen. Anschließend wurde die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wobei man eine farblose kristalline Substanz zurückbehielt. Durch Umkristallisieren dieser kristallinen Substanz aus Äthylenchlorid-Äthyläther erhielt man 0,321 g N-Benzyloxycarbonylalanyl-phenylalanin (Z-Ala-Phe-OH) als farbloses kristalline Substanz in einer Ausbeute von 86%.
(C) Eine Lösung aus 0,223 g (0,001 Mol) Z-Ala, 0,08 g (0,001 Mol) Pyridin und 0,256 g (0,001 Mol) DSC in 10 ml DMF wurde bei Umgebungstemperatur gerührt. Nachdem die TLC an Silikagel gezeigt hatte, daß Z-Ala aus der Lösung verschwunden war, wurde die Lösung mit einer weiteren Lösung aus 0,165 g (0,001 Mol) Phenylalanin (Phe-OH) und 0,101 g (0,001 Mol) Triäthylamin in 20 ml DMF vermischt. Nach 24 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit Äthylacetat vermischt und mit wäßriger 4%iger NaHCO₃, 1n HCl und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wurde die Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde durch Destillieren vom Lösungsmittel befreit, wobei eine farblosse kristalline Substanz zurückblieb. Durch Umkristallisieren dieser kristallinen Substanz aus Methylenchlorid-Äthyläther erhielt man 0,27 g Z-Ala-Phe-OH als farblose kristalline Substanz. Ausbeute 72%.
(D) Eine Lösung aus 0,299 g (0,001 Mol) N-Benzyloxycarbonylphenylalanin (Z-Phe), 0,08 g (0,001 Mol) Pyridin und 0,256 g (0,001 Mol) DSC in 10 ml Acetonitril wurde bei Umgebungstemperatur gerührt. Nachdem die Dünnschichtchromatographie an Silikagel gezeigt hatte, daß Z-Phe (in Form der freien Säure) aus der Lösung verschwunden war, wurde die Reaktionslösung mit 0,075 g (0,001 Mol) Glycin (Gly-OH) und 0,101 g (0,001 Mol) Triäthylamin vermischt und anschließend 24 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Das danach vorliegende Reaktionsgemisch wurde auf ein kleines Volumen eingeengt und danach mit Äthylacetat vermischt und nacheinander mit wässriger 4%iger NaHCO₃, 1n HCl und gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Anschließend wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die getrocknete Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde destilliert, um das Lösungsmittel zu entfernen, wobei man eine farblose kristalline Substanz gewann. Durch Umkristallisieren dieser festen Substanz aus Äthylacetat-Petroläther gewann man 0,30 g N-Benzyloxycarbonylphenylalanylglycin (Z-Phe-Gly-OH) als farblose kristalline Substanz. Ausbeute 83,4%.

Eine Zahl weiterer Dipeptide wurden in derselben Weise wie vorstehend beschrieben hergestellt. Die physikalischen Konstanten dieser Dipeptide sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt.

Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von N,N′-Disuccinimidylcarbonat (Verbindung A), N,N′-Diphthalimidylcarbonat (Verbindung B), und N,N′-Bis-(5-norbornen-2,3- dicarboximidyl)-carbonat (Verbindung C) als Reagenz zur Bildung des aktiven Esters einer Aminosäure. Die Verbindung A, B oder C (0,001 Mol) wurde mit 0,001 Mol einer entsprechenden N-geschützten Aminosäure gemäß nachfolgender Tabelle 5 umgesetzt, und zwar in entsprechender Weise wie in Beispiel 4 angegeben; auf diese Weise wurde der aktive Ester der eingesetzten Aminosäure gebildet. Die Ausbeuten an aktivem Ester (in %) sind in der folgenden Tabelle 5 angegeben.

Tabelle 5

Alle aktiven Ester, die so durch Umsetzung von Z-Val, Z-Pro, Z-Met, Z-Phe oder Boc-Phe mit dem Carbonat A, B oder C gebildet wurden, waren vollständig mit denen identisch, die in der Literatur beschrieben sind, und zwar hinsichtlich ihres Schmelzpunktes, der Gewichtsanalyse und des NMR-Spektrums.

Claims

Verwendung von N,N′-Disuccinimidyl-, N,N′-Diphthalimidyl- oder N,N′-Bis-(5-norbornen-2,3-dicarboximidyl)-carbonat zur Herstellung von Aminosäureaktivestern und in der Peptidsynthese.