DE2857828C2

DE2857828C2 -

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Publication number: DE2857828C2
Application number: DE2857828A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Isowa; Muneki Tokio/Tokyo Jp Ohmori; Kaoru Mori; Tetsuya Sagamihara Kanagawa Jp Ichikawa; Yuji Nonaka; Keiichi Kihara; Kiyotaka Oyama; Heijiro Satoh; Shigeaki Shin-Nanyo Yamaguchi Jp Nishimura
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute; Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute; Tosoh Corp
Priority date: 1977-01-27
Filing date: 1978-01-12
Publication date: 1990-06-07
Anticipated expiration: 1998-01-13
Also published as: DE2801238C2; US4436925A; US4165311A; NL190413C; DD136737A5; DE2801238A1; FR2378747A1; NL7800767A; FR2378747B1; US4256836A; GB1548553A; UA8373A1; CH637914A5; NL190413B; CA1101845A; CH643532A5; IT7819706A0; IT1091982B

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L,L-Dipeptidestern der allgemeinen Formel VI

in der
R₁ Wasserstoff oder eine gegebenenfalls mit dem Methoxyrest substituierte Benzyloxycarbonylgruppe,
R₂ Methoxy oder Äthoxy, und
n 1 oder 2 bedeuten, gemäß dem nachstehenden Anspruch.

Es ist bekannt, daß Peptidderivate verschiedene physiologische Aktivitäten besitzen, und diese Peptidderivate können nach verschiedenen Methoden hergestellt werden. Die Peptide mit einem sauren Aminosäurerest, wie α-L-Asparaginylphenylalanin- niederalkylester, die sich als Süßmittel eignen, können aus einer Vorstufe mit einer Benzyloxycarbonylgruppe als N-ständige Schutzgruppe durch Abspaltung der Schutzgruppe erhalten werden.

Die Peptide mit N-ständiger Schutzgruppe, wie N-Benzyloxycarbonyl- L-α-glutamylphenylalanin-niederalkylester, können leicht zu Peptiden mit freier C-ständiger Carboxylgruppe hydrolysiert werden. Diese hydrolysierten Peptide werden als Substrate zur Messung der enzymatischen Aktivität von Carboxypeptidasen verwendet.

Die N-geschützten oder -ungeschützten Dipeptidester können durch Umsetzung von sauren Aminosäureanhydriden mit einer geschützten oder ungeschützten Aminogruppe mit Aminosäurealkylestern erhalten werden (JA-PS 14 217/74, JA-OS 61 451/73, 76 8835/73, 58 025/75 und 71 642/75).

Aus Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, 4. Aufl. (1974), Band XV/1, Seiten 334, 405-407 und 639, ist es allgemein bekannt, Dipeptidester mit freier ω-Carboxygruppe aus den entsprechenden Salzen durch Versetzen mit Säure freizusetzen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von L,L- Dipeptidestern der oben angegebenen Formel VI zur Verfügung zu stellen, mittels dem die erwünschten Dipeptidester in hoher Ausbeute und Reinheit erhalten werden können.

Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des Patentanspruchs aufgeführten Maßnahmen gelöst.

Die erfindungsgemäß erhältlichen α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin- methyl- oder äthylester besitzen einen süßen Geschmack wie Zucker. α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester besitzt eine Süßkraft, die das 200fache derjenigen von Zucker beträgt.

Die Salze der Formel (I) werden in einem flüssigen Medium gelöst und dann mit einer Säure umgesetzt. Das Lösen und Umsetzen kann hierbei in einer wäßrig-sauren Lösung erfolgen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wendet man als wäßrig-saure Lösung eine Lösung aus Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Citronensäure oder Toluolsulfonsäure, jeweils in einer Menge von 1 bis 100 Äquiv., vorzugsweise von etwa 1 bis etwa 20 Äquiv., insbesondere 1 bis 10 Äquiv., bezogen auf die Molmenge des verwendeten Salzes der Formel (I), an.

Als flüssiges Medium wird vorzugsweise ein Keton, ein Sauerstoff enthaltendes organisches Lösungsmittel, ein chlorierter niederer Kohlenwasserstoff, ein nicht-protonisches, polares organisches Lösungsmittel, eine flüssige organische Carbonsäure oder ein Gemisch hiervon und als Säure eine Brønstedtsäure verwendet.

Vorzugsweise verwendet man das flüssige Medium und die Säure in einer Menge von 20 bis 100 Gew.-Teilen, pro 1 Gew.-Teil des Salzes der Formel (I), bzw. mindestens 2 Äquiv., bezogen auf die Molmenge des Salzes der Formel (I), wobei man die Umsetzung bei Temperaturen von etwa 20 bis etwa 100°C und für eine Dauer von 10 Minuten bis 6 Stunden durchführt.

Als Brønstedtsäure eignen sich insbesondere Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Perchlorsäure, Trifluoressigsäure oder p-Toluolsulfonsäure.

Bevorzugt sind weiterhin als Ausgangsverbindungen Salze der allgemeinen Formel (I), in der n den Wert 1 hat.

Die Salze, in denen R₁ eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe ist, werden in einem flüssigen Medium gelöst und mit einer Säure umgesetzt unter Bildung von Dipeptidestern mit freier Aminogruppe der allgemeinen Formel (VII)

in der R₂ und n die gleiche Bedeutung wie in Formel (VI) haben.

In der allgemeinen Formel (I) liegt das Aparaginsäuregerüst vor im Falle von n = 1, und das Glutaminsäuregerüst liegt vor im Falle von n = 2.

Ein typisches, als Ausgangsverbindung verwendetes Salz, erhalten durch Umsetzung von N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginsäure und L-Phenylalaninmethylester, zeigt die nachfolgend wiedergegebenen IR- und NMR-Spektren.

IR-Spektrum

3260 cm^-1 (N-H-Streckschwingung); 3000 bis 3200 cm^-1 (C-H- Streckschwingung); 1740 cm^-1 (C=O-Ester); 1720 cm^-1 (C=O Urethan); 1660 cm^-1 (erste Amidabsorption); 1630 cm^-1 (Carboxylat); 1540 cm^-1 (zweite Amidabsorption); 1430 und 1450 cm^-1 (C-H-Deformationsschwingung); 1390 cm^-1 (Carboxylat); 1220 bis 1290 cm^-1 (C-O-C-Streckschwingung und dritte Amidabsorption); 1050 cm^-1 (Phenylschwingung in der Ebene); sowie 740 und 695 cm^-1 (Schwingung des monosubstituierten Benzolrings außerhalb der Ebene).

NMR-Spektrum
(1) δ = 2,75 ppm (2 H)
(2) δ = 3,02 ppm (4 H)
(3) w = 3,61 ppm (3 H), 3,7 ppm (3 H)
(4) δ = 4,4 bis 4,8 ppm (3 H)
(5) δ = 5,05 ppm (2 H)
(6) δ = 5,82 ppm (5 H)
(7) δ = 7,3 ppm (15 H).

Wenn dieses als Ausgangsverbindung verwendete Salz der Behandlung mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, unterworfen und das Produkt mit einem organischen Lösungsmittel, wie Äthylacetat, extrahiert wird, erhält man aus der organischen Schicht den entsprechenden L,L-Dipeptidester.

Wenn der erhaltene L,L-Dipeptidester der katalytischen Hydrierung mit Wasserstoff unterworfen wird, erhält man den bekannten L,L-Asparaginyl- phenylalanin-methylester.

Alle Daten, einschließlich der IR- und NMR-Spektren, sowie die für die Verbindungen erhaltenen Elementaranalysen in irgendeiner der vorgenannten Stufen, bestätigen die in den Formeln gezeigten Strukturen.

Unterwirft man die als Ausgangsverbindung verwendeten Salze in wäßrigem Medium der Behandlung mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, und extrahiert das Produkt mit einem organischen Lösungsmittel, so kann man die L,L-Dipeptidester der allgemeinen Formel (VI) erhalten. Andererseits lassen sich aus der wäßrigen Phase L-, D- oder hauptsächlich D-Phenylalaninester isolieren, wobei die optische Isometrie der isolierten Ester von derjenigen der in den Salzen enthaltenen Grundbausteine abhängt.

Hierbei ist die Menge des L,L-Didpeptidesters der Formel (VI) dem erhaltenen Phenylalaninester äquivalent, wobei es klar ist, daß es sich bei der Ausgangsverbindung um das Salz aus dem L,L- Dipeptidester und dem Phenylalaninester (1 : 1) handelt, das die Formel (I) besitzt.

Wie vorstehend dargelegt, läßt sich durch Umsetzung des Salzes der Formel (I) mit einer starken Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, und anschließende Extraktion des Produkts mit einem organischen Lösungsmittel der L,L-Dipeptidester mit einer Schutzgruppe für die Aminogruppe erhalten.

Wird die Schutzgruppe für die Aminogruppe, d. h. R₁, nach einer bekannten Methode abgespalten, z. B. durch katalytische Hydrierung, so läßt sich der L,L-Dipeptidester mit einer Aminogruppe und einer Carboxylgruppe erhalten.

L,L-Dipeptide mit einer N-ständigen Schutzgruppe und einer freien C-ständigen Carboxylgruppe, die aus dem L,L-Dipeptidester mit einer Schutzgruppe für die Aminogruppe durch übliche Hydrolyse erhalten werden können, besitzen ebenfalls wertvolle Eigenschaften. So findet z. B. N-Benzyloxycarbonyl-α-L-glutamyl-phenylalanin als Substrat zur Messung der enzymatischen Aktivität von Carboxypeptidasen Verwendung.

Das Verhältnis der wäßrig-sauren Lösung zu den Ausgangsverbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich, in dem der L,L-Dipeptidester (VI) in festem Zustand vorliegen kann, da der erhaltene Dipeptidester (VI) als Feststoff abgetrennt wird. Die Dipeptidester (VI) besitzen eine geringe Löslichkeit in Wasser oder in der wäßrig-sauren Lösung. Beispielsweise beträgt die Löslichkeit des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters 0,028 g/100 g Wasser und 0,017 g/100 g verdünnter Salzsäure (10^-2-molar) bei 25°C. Demgemäß kann der Anteil der wäßrig-sauren Lösung relativ hoch sein. Andererseits wird bei dem Verfahren der Erfindung das Salz (I) mit der wäßrig-sauren Lösung so in Berührung gebracht, daß man Bedingungen zur Feststoff-Flüssigkeits-Trennung vorliegen hat. Es ist somit nicht zweckmäßig, ein zu niedriges Verhältnis anzuwenden. Geeignete Mengen der wäßrig-sauren Lösung liegen im Bereich von 1,5 bis 50 Gew.-Teile, vorzugsweise 2 bis 10 Gew.-Teile, jeweils pro 1 Gew.-Teil des Salzes (I).

Die Temperatur zur Umsetzung des Salzes (I) mit der wäßrig-sauren Lösung liegt im allgemeinen im Bereich von 0 bis 100°C, vorzugsweise 5 bis 80°C. Wenn man das Gemisch ausreichend rührt, ist die Zersetzung des Salzes (I) in etwa 10 Minuten beendet.

Handelt es sich bei R₁ um eine Schutzgruppe, die leicht hydrolysiert werden kann, z. B. um eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, so ist es gegebenenfalls erforderlich, Reaktionszeit und -temperatur sorgfältig zu überwachen, um eine Abspaltung der Schutzgruppe, falls unerwünscht, zu verhindern.

Ein erheblicher Teil des L,L-Dipeptidesters (VI) liegt nach der Umsetzung in festem Zustand vor, da er, wie vorstehend dargelegt, in der wäßrigen Säurelösung nur eine geringe Löslichkeit besitzt.

Der erhaltene, feste L,L-Dipeptidester kann in üblicher Weise, z. B. durch Filtration oder Zentrifugieren, abgetrennt werden. Aus der abgetrennten Salzlösung kann der Phenylalaninester in üblicher Weise isoliert werden, z. B. durch Auskristallisieren oder durch Lösungsmittelextraktion.

Erfindungsgemäß kann der L,L-Dipeptidester (VI) in einfacher Weise hergestellt und abgetrennt werden und zwar ohne komplizierte Stufen, wie Extraktion und Ionenaustauscherharzbehandlung. Ausbeute und Reinheit des L,L-Dipeptidesters (VI) sind bemerkenswert hoch.

Nachfolgend ist die Herstellung von α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin- alkylestern, die als Süßmittel Verwendung finden, beschrieben.

Das Verfahren der Umsetzung des Salzes (I) in einem speziellen Fall besteht darin, daß man das Salz (I), wobei R₁ eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe darstellt, nämlich das Salz aus einem N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-α-asparaginylphenylalaninalkylester und einem Phenylalaninalkylester (1 : 1) in einem flüssigen Medium auflöst und mit einer Säure in dem flüssigen Medium unter Bildung des L,L-Dipeptidesters mit einer freien Aminogruppe der Formel (VII) umsetzt.

Geeignete flüssige Medien zur Auflösung des Salzes (I) sind die bereits erwähnten organischen Lösungsmittel, insbesondere Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Chloroform, Methylendichlorid, Äthylendichlorid, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, und flüssige Carbonsäuren, wie Essigsäure und Ameisensäure. Auch Gemische aus zwei oder mehr der vorgenannten Lösungsmittel können verwendet werden.

Des weiteren kann man auch Ester, wie Äthylacetat, und Alkohole, wie Methanol, Äthanol oder Propanol, verwenden. Bei Verwendung solcher Lösungsmittel ist die Produktausbeute normalerweise erniedrigt, und zwar wegen unerwünschter Nebenreaktionen, z. B. Umesterungsreaktionen oder Veresterung der Carboxylgruppe.

Das Salz (I) besitzt eine geringe Löslichkeit in Wasser. Demgemäß ist Wasser selbst in diesem Fall nicht als flüssiges Medium geeignet, obwohl es möglich ist, Wasser zu dem flüssigen Medium in solchem Umfang hinzuzusetzen, daß eine ausreichende Löslichkeit des Salzes in dem flüssigen Medium gewährleistet bleibt.

Die Menge des flüssigen Mediums richtet sich nach der Art des flüssigen Mediums und dem Lösevermögen für das Salz. Die Menge ist im allgemeinen größer als 10 Gewichtsteile und beträgt vorzugsweise etwa 20 bis 100 Gewichtsteile, pro 1 Gewichtsteil des Salzes.

Die Konzentration der Säure in dem flüssigen Medium liegt im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 10 N, vorzugsweise 1 bis 5 N. Vorzugsweise wird die genaue Konzentration nach Maßgabe der anderen Reaktionsbedingungen festgelegt, da die Reaktion unter anderem von der Reaktionszeit, der Reaktionstemperatur und der Art der Säure abhängt. Hohe Konzentrationen, die den vorgenannten Bereich übersteigen und zu unerwünschten Nebenreaktionen, z. B. der Hydrolyse der Ester führen könnten, sollten jedoch vermieden werden.

Bei der Säure kann es sich um wäßrige oder wasserfreie Säure handeln. Wenn es sich bei dem flüssigen Medium um ein mit Wasser nicht mischbares Medium, z. B. einen chlorierten Kohlenwasserstoff handelt, wird die Verwendung wasserfreier Säuren bevorzugt, da die Verwendung wäßriger Säuren zur Ausbildung von zwei Phasen führen würde, was eine sehr langsame Reaktion zur Folge hätte.

Bei Anwendung der Säure in geringerer Konzentration dauert die Reaktionszeit länger oder die Reaktionstemperatur ist höher. Bei höherer Säurekonzentration ist es von Vorteil, eine kürzere Reaktionszeit und eine niedrigere Reaktionstemperatur zu wählen.

Nach der Umsetzung des Salzes (I) können der erhaltene L,L-Dipeptidester mit der freien Aminogruppe (VII), Anisalkohol und der Phenylalaninester nach nachfolgend beschriebenen Methoden getrennt werden. So kann man z. B. nach der Reaktion den Anisalkohol in eine Lösungsmittelphase extrahieren. Hierbei geht man so vor, daß man geeignete Mengen Wasser und Lösungsmittel, das eine separate Phase mit Wasser zu bilden vermag, wie Chloroform oder Diäthyläther, der Reaktionslösung zusetzt, anschließend schüttelt und dann absitzen läßt, wobei eine Phasentrennung in eine Lösungsmittelphase und eine wäßrige Phase erfolgt. Andererseits wird der pH-Wert der wäßrigen Phase durch Zugabe einer Base, wie NaOH, NaHCO₃, Na₂CO₃, Ammoniak oder Triäthylamin, auf einen Wert von 5 bis 6 eingestellt, worauf der abgeschiedene L,L-Dipeptidester mit der freien Aminogruppe (VII) durch Filtration abgetrennt wird. Der pH-Wert des Filtrats wird dann mit der Base auf einen pH-Wert von 8 bis 10 eingestellt, worauf der freie Phenylalaninalkylester mit einem Lösungsmittel, wie Chloroform, Diäthyläther oder Äthylacetat, extrahiert wird. Der L,L-Dipeptidester mit der freien Aminogruppe und der Phenylalaninester können auch in einfacher Weise durch die übliche Methode unter Anwendung eines Kationenaustauscherharzes isoliert werden.

Dieses Verfahren ist höchst vorteilhaft anwendbar auf die Herstellung von α-L-Asparaginylphenylalanin-methyl(äthyl)- estern aus dem Salz von N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- α-L-asparaginyl-L-phenylalanin-methyl(äthyl)-estern mit Phenylalanin-niederalkylestern, wobei R₁, eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, R₂ eine Methyl- oder Äthylgruppe und n den Wert 1 bedeuten.

Erfindungsgemäß können die Abspaltung des Phenylalaninester- Bausteins und der N-ständigen Schutzgruppe, wie der p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, von dem Dipeptidester-Salz gleichzeitig erfolgen. Der abgetrennte Anisalkohol kann wiedergewonnen und durch Umsetzung mit Phosgen in ein p-Methoxybenzyloxycarbonylierungsmittel überführt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

1145 mg des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) in Form feiner, nadelförmiger Kristalle, Fp. 117 bis 120°C, werden in 40 ml 1 N HCl gelöst und dann dreimal mit 30 ml Äthylacetat extrahiert. Hierauf werden die Extrakte vermischt, mit jeweils 20 ml Wasser (dreimal) gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Einengen der Lösung führt man durch Zugabe von n-Hexan Kristallisation herbei. Hierbei erhält man 640 mg eines kristallinen Produktes. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind wie folgt:

Fp. 115-125°C
: -15,3 (C = 1, Methanol)

Elementaranalyse: C₂₂H₂₄N₂O₇
berechnet:
C 61,67%, H 5,65%, N 6,54%;
gefunden:
C 61,52%, H 5,65%, N 6,57.

Die IR- und NMR-Spektren zeigen die für N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylester erwartenden Eigenschaften.

Die Ergebnisse stimmen mit denjenigen überein, die man bei Benzyloxycarbonylierung der Aminogruppe des L-Asparaginyl-L- phenylalaninmethylesters erhält.

Der L-Phenylalaninmethylester wird aus einem Gemisch der Salzsäurephase und der Waschwasserfraktion, die von der Äthylacetatextraktion herrühren, gewonnen.

Beispiel 2

Nachdem man 580 mg eines rohen, kristallinen Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- methylester und L-Phenylalanin-methylester (1 : 1), Fp. 123 bis 125°C, in 40 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Dimethylformamid und Wasser (1 : 1) gelöst hat, wird die Lösung unter gründlichem Rühren mit einem stark sauren Kationenaustauscherharz in der H-Form versetzt. Nach Abtrennung des Harzes wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt. Nachdem man den Rückstand in Dimethylformamid gelöst hat, wird die Lösung mit Wasser versetzt. Hierbei erhält man einen Niederschlag aus 330 mg N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginyl-L-phenylalanin-methylester, Fp. 123 bis 125°C, Ausbeute 77,0%, bezogen auf N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure.

Beispiel 3

120 mg eines rohen, kristallinen Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin-methylester (1 : 1), Fp. 119 bis 123°C, werden gemäß dem vorstehenden Beispiel der Behandlung mit dem stark sauren Kationenaustauscherharz in H-Form unterworfen. Hierbei erhält man 50 mg N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl- L-phenylalanin-methylester, Fp. 95 bis 105°C, Ausbeute 11,7%.

Beispiel 4

800 mg des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und D-Phenylalanin- methylester (1 : 1) werden in 40 ml 1 N HCl gelöst und dann mit 30 ml Methylendichlorid dreimal extrahiert. Hierauf wird die Methylendichloridphase mit Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nachdem man das Methylendichlorid abdestilliert hat, wird der feste Rückstand aus einem Lösungsmittelgemisch aus Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Hierbei erhält man 450 mg Kristalle mit den nachfolgend angegebenen Eigenschaften.

Fp. 124-132°C
= -15,3 (C = 1, Methanol)

Elementaranalyse: C₂₂H₂₄N₂O₇
berechnet:
C 61,67%, H 6,65%, N 6,54%;
gefunden:
C 61,38%, H 5,58%, N 6,29.

Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester.

Die rückständige, wäßrige Phase aus der Extraktion mit Methylenchlorid wird zur Einstellung des pH auf einen Wert von 8,7 mit Natriumhydrogencarbonat vermischt. Hierauf wird das Produkt mit 30 ml Methylenchlorid dreimal extrahiert. Nachdem man den Extrakt mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet hat, wird Chlorwasserstoffgas in den Extrakt für eine Dauer von etwa 10 min eingeleitet. Nach dem Einengen wird die Methylenchloridlösung mit Äthyläther versetzt. Hierbei rekristallisiert das Produkt, und man erhält 29,0 mg D-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid, Fp. 149 bis 151°C; = -15,1 (C = 1, Methanol). Das IR- und NMR- Spektrum stimmen mit denjenigen der L-Form überein.

Beispiel 5

1,00 g (1,65 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin-methylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 2,0 ml 1 N HCl unter Rühren bei Raumtemperatur während 10 min versetzt. Nachdem man die erhaltene Aufschlämmung filtriert hat, wird der Niederschlag mit 4 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,72 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl- L-phenylalanin-methylesters mit einer Ausbeute von 98,8%.

Nachdem man die erhaltenen Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man mit n-Hexan zur Rekristallisation des Produkts. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse des Endproduktes sind im folgenden angegeben.

Fp. 121-124°C
= -15,4 (C = 1, Methanol)

Elementaranalyse: C₂₂H₂₄N₂O₇
berechnet:
C 61,67%, H 5,65%, N 6,54%;
gefunden:
C 61,58%, H 5,64%, N 6,56.

Das IR-Spektrum des Produkts stimmt mit demjenigen der Standardverbindung überein.

Darüber hinaus wird die Identität des Produktes durch Vergleich mit einer wäßrigen Lösung des Produktes mit derjenigen der Standardverbindung mittels Hochgeschwindigkeits- Flüssigchromatographie bestätigt. Die mit dieser Methode gemessene Reinheit beträgt 100%. Das Gerät und die Bedingungen für die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie- Analyse sind nachfolgend angegeben. Die Methode dient zur Bestimmung der Reinheit der Zersetzungsprodukte der Salze in den folgenden Beispielen, falls nicht anders angegeben. Soweit diese Methode betroffen ist, finden in den Beispielen das gleiche Gerät und die gleichen Bedingungen Anwendung.

Gerät für die Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie:

TSK-HLC 801 (Handelsbezeichnung, Hersteller Toyo Soda K. K.)
Säule: lichte Weite 7,5 mm, Länge 30 cm;
Packung: Stärkegel, Teilchengröße 5 µm (TSK-Gel LS 170);
Eluiermittel: 0,5%iges wäßriges Natriumacetat;
Fließgeschwindigkeit: 0,8 ml/min;
Druckverlust: 19,7 bar;
Meßtemperatur: Raumtemperatur;
Detektor: Differentialrefraktometer.

Beispiel 6

1,00 g (1,65 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin- methylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 1,32 ml 1 N HCl versetzt. Nachdem man das Gemisch 10 min bei Raumtemperatur gerührt hat, wird gemäß Beispiel 5 aufgearbeitet. Hierbei erhält man 0,70 g feine, prismatische Kristalle, Fp. 100 bis 126°C, mit einem Gehalt an N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginyl-L-phenylalanin-methylester von 96,8%.

Beispiel 7

0,50 g (0,82 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und D-Phenylalanin- methylester (1 : 1) werden mit 4 ml Wasser und 0,26 g Citronensäure vermischt. Nachdem man das Gemisch bei Raumtemperatur 10 min gerührt hat, erfolgt die Aufarbeitung gemäß Beispiel 5. Hierbei erhält man 0,35 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- methylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 99,3%.

Beispiel 8

0,50 g (0,82 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin- methylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 4 ml Wasser und 0,24 g (1,2 mMol) p-Toluolsulfonsäure-monohydrat versetzt. Bei der Aufarbeitung gemäß Beispiel 5 erhält man 0,33 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- methylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 93,6%.

Beispiel 9

0,45 g (8,2 mMol) 85%ige Ameisensäure und 8 ml Wasser werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 0,50 g (0,82 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl- L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin-methylester. versetzt. Nachdem man das Gemisch 20 min bei Raumtemperatur gerührt hat, wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,312 g weiße Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 88,6%.

Beispiel 10

0,47 g (8,2 mMol) Eisessig und 8 ml Wasser werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 0,50 g (0,82 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- methylester und L-Phenylalanin-methylester versetzt. Nachdem man das Gemisch 30 min bei Raumtemperatur gerührt hat, wird das Reaktionsprodukt abfiltriert, mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,308 g weiße Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- methylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 87,2%.

Beispiel 11

1,00 g (1,65 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin- methylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 1,0 ml 1 N HCl versetzt. Nachdem man das Gemisch 3 min bei 60°C gerührt hat, erfolgt die Aufarbeitung gemäß Beispiel 5. Hierbei erhält man 0,35 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl-L- asparaginyl-L-phenylalanin-methylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 100%.

Beispiel 12

0,500 g (0,78 mMol) des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin-methylester werden in einem 30 ml fassenden Kolben mit 2 ml Wasser und 0,94 ml (0,94 mMol) 1 N HCl versetzt. Hierauf wird das Reaktionsgemisch 3 min bei 60°C gerührt.

Nach Filtrieren der erhaltenen Aufschlämmung, Waschen mit 6 ml Wasser und Trocknen erhält man 0,32 g Kristalle.

Die nachfolgenden Ergebnisse zeigen, daß es sich bei dem Reaktionsprodukt um N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl- L-phenylalaninmethylester (Reinheit 100%, Ausbeute 89,1%) handelt.

Nachdem man die Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man mit n-Hexan zur Rekristallisation des Produkts. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.

Fp. 128-130°C
: -15,1 (C = 1, Methanol)

Elementaranalyse: C₂₃H₂₆N₂O₈
berechnet:
C 60,25%, H 5,72%, N 6,11%;
gefunden:
C 60,30%, H 5,74%, N 5,99.

IR-Spektrum

3280 cm^-1 (N-H Streckschwingung); 2930 und 3020 cm^-1 (C-H Streckschwingung); 1735 cm^-1 (C=O Ester); 1700 cm^-1 (C=O Urethan); 1650 cm^-1 (erste Amidabsorption); 1510 bis 1540 cm^-1 (zweite Amidabsorption); 1440 cm^-1 (C-H Deformationsschwingung); 1220 bis 1270 cm^-1 (C-O-C Streckschwingung, dritte Amidabsorption) 1030 bis 1050 cm^-1 (Phenylschwingung in der Ebene); 690 und 810 cm^-1 (Phenylschwingung außerhalb der Ebene).

NMR-Spektrum δ
(1) 2,8 ppm (2 H);  (2) 3,0 ppm (2 H);
(3) 3,6 ppm (3 H);  (4) 3,8 ppm (3 H);
(5) 4,5 ppm (1 H);  (6) 4,8 ppm (1 H);
(7) 5,0 ppm (2 H);  (8) 6,0 ppm (1 H);
(9) 6,6 ppm (1 H); (10) 6,6 ppm (1 H);
(11) 6,8 bis 7,3 ppm (9 H).

Diese Ergebnisse zeigen, daß es sich um einen L,L-Dipeptidester der Formel (VI) handelt, in der R₁ eine p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, R₂ eine Methoxygruppe und n den Wert 1 bedeuten.

0,2 Gewichtsteile des erhaltenen N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalaninmethylesters werden in 2 Gewichtsteilen Aceton gelöst. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 1 Gewichtsteil 4 N HCl versetzt hat, wird das Gemisch auf dem Wasserbad 1,5 Stunden unter schwachem Rückfluß erhitzt. Hierbei findet vollständige Zersetzung unter Bildung einer Lösung statt, die als Hauptkomponenten L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester, L-Phenylalaninmethylester und Anisalkohol enthält. Aus dieser Lösung erhält man den L-Asparaginyl-L-phenylalaninmethylester.

Beispiel 13

0,001 g des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L- glutamyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester werden in einem 15 ml fassenden Reagenzglas unter Rühren zu 2,3 ml (0,32 mMol) 0,14 N HCl zugefügt. Hierauf wird das Gemisch 15 min bei Raumtemperatur gerührt.

Der erhaltene weiße Niederschlag wird abfiltriert, mit 3 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,683 g Kristalle.

Die nachfolgend angegebenen Ergebnisse bestätigen, daß es sich beim dem Reaktionsprodukt um den N-Benzyloxycarbonyl- L-glutamyl-L-phenylalaninmethylester (Reinheit 100%, Ausbeute 95,8%) handelt.

Nachdem man die Kristalle in Äthylacetat gelöst hat, versetzt man zur Rekristallisation mit n-Hexan.

Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse sind nachfolgend angegeben.

Fp. 97-99°C
: -11,0 (C = 1, Methanol)

Elementaranalyse: C₂₃H₂₆N₂O₇
berechnet:
C 62,43%, H 5,92%, N 6,33%;
gefunden:
C 62,63%, H 5,94%, N 6,24.

IR-Spektrum

3300 cm^-1 (N-H Streckschwingung); 2930 und 3030 cm^-1 (C-H Streckschwingung); 1735 cm^-1 (C=O Ester); 1690 cm^-1 (C=O Urethan); 1650 cm^-1 (erste Amidabsorption); 1530 cm^-1 (zweite Amidabsorption); 1440 cm^-1 (C-H Deformationsschwingung); 1220 bis 1280 cm^-1 (C-O-C Streckschwingung und dritte Amidabsorption); 1050 cm^-1 (Phenylschwingung in der Ebene); 695 und 735 cm^-1 (Phenylschwingung außerhalb der Ebene).

NMR-Spektrum: δ
(1) 2,0 ppm (2 H);  (2) 2,4 ppm (2 H);
(3) 3,1 ppm (2 H);  (4) 3,7 ppm (3 H);
(5) 4,3 ppm (1 H);  (6) 4,8 ppm (1 H);
(7) 5,1 ppm (2 H);  (8) 5,9 ppm (1 H);
(9) 7,2 ppm (1 H); (10) 7,2 ppm (5 H);
(11) 7,3 ppm (5 H); (12) 8,1 ppm (1 H).

Diese Ergebnisse zeigen, daß es sich bei dem Endprodukt um die Verbindung der Formel VI handelt, in der R₁ eine Benzyloxycarbonylgruppe, R₂ eine Methoxygruppe und n den Wert 2 bedeuten.

Der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalaninmethylester kann durch Reduktion bzw. Hydrierung mit Wasserstoff in den L-Glutamyl-L-phenylalaninmethylester, und durch Hydrolyse bzw. Verseifung in das N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl- L-phenylalanin überführt werden.

Beispiel 14

In einem 30 ml fassenden Kolben werden 0,125 g (0,197 mMol) des Salzes aus N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl- L-phenylalanin-äthylester und L-Phenylalanin-äthylester (1 : 1) mit 2 ml Wasser und 0,24 ml 1 N HCl (0,24 mMol) vermischt. Das erhaltene Gemisch wird 30 min bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtrieren der erhaltenen Aufschlämmung wird das Produkt mit 5 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,0807 g Kristalle des N-Benzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-äthylesters mit einer Reinheit von 100% und einer Ausbeute von 92,6%. Diese Kristalle werden aus Äthylacetat/n-Hexan umkristallisiert. Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse des erhaltenen Produktes sind nachfolgend angegeben.

Fp. 128 bis 135°C
= -17,3 (C = 1, Methanol)

Elementaranalyse: C₂₃H₂₆N₂O₇
berechnet:
C 62,43%, H 5,92%, N 6,33%;
gefunden:
C 62,82%, H 5,96%, N 6,40.

IR-Spektrum

3300 cm^-1; 2900 bis 3100 cm^-1; 1730 cm^-1; 1690 cm^-1; 1655 cm^-1; 1530 cm^-1; 1440 cm^-1; 1200 bis 1280 cm^-1; 1030 cm^-1; 690 cm^-1; 740 cm^-1.

NMR-Spektrum
1,1 ppm; 2,8 ppm; 3,0 ppm; 4,1 ppm; 4,6 ppm; 4,8 ppm; 5,1 ppm; 6,0 ppm; 7,1 ppm; 7,3 ppm; 9,6 ppm.

Beispiel 15

0,3 g des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin-methylester werden in einem 20 ml fassenden Kolben in 3 ml Aceton gelöst. Nach Zugabe von 2 ml 2,4 N HCl läßt man 1 h bei 60°C reagieren. Ein Teil des Reaktionsgemisches wird mit Wasser, wäßrigem 1,2 N HaHCO₃ und Cyclohexanon als innerem Standard zu einer Probe vermischt. Die Umwandlung zu α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester wird durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie bestätigt. Die Ausbeute beträgt 72,7%.

Beispiel 16

0,3 g des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin- methylester und L-Phenylalanin-methylester werden in einem 20 ml fassenden Kolben vorgelegt. Gemäß Beispiel 15 jedoch unter Verwendung von Dioxan anstelle von Aceton, werden die Zersetzung des Salzes und die Analyse des Produktes durchgeführt. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl- L-phenylalanin-methylester beträgt 73,0%.

Beispiel 17

Beispiel 16 wird unter Verwendung von Methanol anstelle von Dioxan wiederholt. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin- methylester beträgt 63,3%.

Beispiel 18

Beispiel 16 wird unter Verwendung von N,N-Dimethylformamid anstelle von Dioxan wiederholt. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl- L-phenylalanin-methylester beträgt 28,1%.

Beispiel 19

Beispiel 16 wird wiederholt, wobei jedoch 4 ml Dioxan, 1 ml einer HCl-Dioxan-Lösung (5,3 N) und Triäthylamin als Neutralisationsmittel anstelle von 3 ml Dioxan, 2 ml 2,4 N HCl bzw. wäßrigem 1,2 N NaHCO₃ Verwendung finden. Die Ausbeute an α-L- Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 98,6%.

Beispiel 20

Beispiel 19 wird wiederholt, wobei jedoch die Reaktionsbedingungen 20 min bei 90°C anstelle von 1 h bei 60°C betragen. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 88,5%.

Beispiel 21

Beispiel 19 wird wiederholt, wobei jedoch 4,5 ml Dioxan und 0,5 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 N) anstelle von 4 ml bzw. 1 ml verwendet werden und wobei man die Umsetzung bei 90°C anstelle von 60°C durchführt. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl- L-phenylalanin-methylester beträgt 84,4%.

Beispiel 22

Beispiel 19 wird wiederholt, wobei jedoch 3 ml Dioxan und 2 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 N) anstelle von 4 ml bzw. 1 ml verwendet werden und wobei die Reaktionsbedingungen 120 min bei 30°C anstelle von 1 h bei 60°C betragen. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 98,6%.

Beispiel 23

Das Verfahren von Beispiel 19 wird wiederholt, wobei jedoch 4,5 ml Dioxan und 0,5 ml 60%ige Perchlorsäure anstelle von 4 ml Dioxan bzw. 1 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 N) Verwendung finden. Die Ausbeute an a-L-Asparaginyl-L-phenylalanin- methylester beträgt 65,5%.

Beispiel 24

Beispiel 19 wird wiederholt, wobei jedoch 4,85 ml Dioxan und 0,15 ml konzentrierte Schwefelsäure anstelle von 4 ml Dioxan und 1 ml der HCl-Dioxan-Lösung (5,3 N) verwendet werden. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester beträgt 89,9%.

Beispiel 25

0,3 g des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin- methylester (1 : 1) werden in 2 ml Dioxan gelöst. Nachdem man mit 3 ml Trifluoressigsäure versetzt hat, läßt man 1 h bei 60°C reagieren.

Nach Eindampfen des Reaktionsgemisches unter vermindertem Druck versetzt man einen Teil hiervon mit Wasser, Triäthylamin und Cyclohexanon als innerem Standard. Die erhaltene Probe wird der Analyse mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie unterworfen. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl- L-phenylalanin-methylester beträgt 96,4%.

Beispiel 26

1,000 g des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin-methylester (1 : 1), 14 ml Dioxan und 4 ml HCl-Dioxan-Lösung (5,3 N) werden in einem 50 ml fassenden Kolben 1 h bei 60°C gerührt. Nachdem man das Dioxan aus dem Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck abdestilliert hat, versetzt man den öligen Rückstand mit 6 ml Wasser und 20 ml Diäthyläther unter Rühren. Anschließend werden die beiden Phasen getrennt. Die wäßrige Phase wird zusätzlich mit 10 ml Diäthyläther versetzt, um das Produkt in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, zu extrahieren. Die letzte Extraktion wird dreimal wiederholt.

Die Diäthyläther-Phasen werden gesammelt, hierauf zweimal mit 5 ml einer 5%igen wäßrigen Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Abdestillieren des Diäthyläthers unter vermindertem Druck erhält man 0,176 g (Ausbeute 81,2%) an rohem Anisalkohol.

Die wäßrige Phase wird mit 7%igem wäßrigem Natriumhydroxid bis pH 6 neutralisiert und dann bei etwa 5°C über Nacht gehalten. Die erhaltenen, ausgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit 2 ml Wasser gewaschen und getrocknet. Hierbei erhält man 0,316 g (Ausbeute 68,5%) rohen L-Asparaginyl- L-phenylalanin-methylester.

Das Filtrat mit der Waschwasserfraktion wird mit 7%igem wäßrigen NaOH bis zum pH 9 versetzt; das Produkt wird hierauf mit 15 ml Dichlormethan dreimal extrahiert. Die Dichlormethan- Phasen werden gesammelt, mit 5 ml Wasser gewaschen und dann mit wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Abdestillieren des Dichloräthans unter vermindertem Druck erhält man 0,234 g (Ausbeute 83,4%) rohen L-Phenylalanin- methylester.

Beispiel 27

Beispiel 19 wird wiederholt, wobei jedoch das Salz aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-L- phenylalanin-äthylester und L-Phenylalanin-äthylester (1 : 1) anstelle des Salzes aus N-p-Methoxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester mit L-Phenylalanin- methylester verwendet wird. Hierbei erhält man den L-Asparaginyl- L-phenylalanin-äthylester. Die Ausbeute an α-L- Asparaginyl-L-phenylalanin-äthylester beträgt 95,5%.

Beispiel 28

1,0 g des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und D-Phenylalanin- methylester (1 : 1) werden mit 4 ml Wasser und 2 ml 1 N HCl vermischt. Das erhaltene Gemisch wird hierauf 3 min bei 60°C gemischt. Nach der Fest-Flüssig-Trennung der erhaltenen Aufschlämmung isoliert man den N-p-Methoxycarbonyl-L- phenylalanin-methylester und den D-Phenylalanin-methylester im Molverhältnis 1 : 1 aus der festen bzw. flüssigen Phase.

Beispiel 19 wird wiederholt, wobei jedoch 0,3 g des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl-L- asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und D-Phenylalanin- methylester (1 : 1) in Form des Halbhydrats anstelle der in Beispiel 18 eingesetzten Verbindung verwendet werden. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und D-Phenylalanin-methylester beträgt 95,9%.

Beispiel 29

0,3 g des Salzes aus N-p-Methoxybenzyloxycarbonyl- L-asparaginyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin- methylester (1 : 1) werden in 10 ml HCl-Chloroform-Lösung (0,31 N) gelöst. Hierauf läßt man 2 h bei 60°C reagieren. Nach Abdestillieren der flüssigen Bestandteile unter vermindertem Druck versetzt man den Rückstand mit Wasser, Triäthylamin und Cyclohexanon als innerem Standard. Die erhaltene Probe wird der Analyse mittels Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatographie unterworfen. Die Ausbeute an α-L-Asparaginyl-L-phenylalanin- methylester beträgt 94,3%.

Claims

Verfahren zur Herstellung von L,L-Dipeptidestern der allgemeinen Formel (VI) in der
R₁ Wasserstoff, eine Benzyloxycarbonylgruppe oder eine p-Methoxy-, 3,5-Dimethoxy- oder 2,4,6-Trimethoxybenzyloxycarbonylgruppe,
R₂ Methoxy oder Äthoxy, und
n 1 oder 2 bedeuten,
dadurch gekennzeichnet, daß man Salze aus L,L-Dipeptidestern und Phenylalaninestern der allgemeinen Formel (I) in der R₁, R₂ und n die vorgenannten Bedeutungen haben, mit Ausnahme R₁ = H, in einem flüssigen Medium mit einer Säure in einer Menge von etwa 1 bis 100 Äquivalenten, bezogen auf die Molmenge der Verbindung der Formel I, umsetzt und den gebildeten L,L-Dipeptidester der Formel VI isoliert.