DE2943116A1

DE2943116A1 - Einrichtung zur durchflusscytometrischen reaktions- und/oder diffusionsmessung

Info

Publication number: DE2943116A1
Application number: DE19792943116
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Dr. 3000 Hannover Eisert
Original assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Current assignee: STRAHLEN UMWELTFORSCH GmbH
Priority date: 1979-10-25
Filing date: 1979-10-25
Publication date: 1981-06-11
Also published as: DE2943116C2; US4352558A

Description

Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung mbH, München

Neuherberg, lo.lo.1979 PIA 7939 Ga/he

Einrichtung zur durchflußcytometrischen Reaktions- und/oder Diffusionsmessung

1 30024/0030

OOPY

Beschreibung: L

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur durchflu£cytrometrischen Reaktions- und/oder Diffusionsmessung von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen mit einem von der Suspension und einer ersten Mantelflüssigkeit durchflossenen, sich verjüngenden Rohr zum hydrodynamischen Fokussieren der Suspension zu einem Suspensionsfaden, der nach Verlassen des Rohres zusammen mit der ersten Mantelflüssigkeit zu einem Auslaß geführt wird, mit einem den Suspensionsfaden kreuzenden Beleuchtungs- und/oder Beobachtungsstrahl und mit mindestens einem an eine Impulsauswerteschaltung angeschlossenen Detektor für die von den vereinzelten Teilchen ausgehende Strahlung.

Eine ähnliche Einrichtung ist in der DT-CS 25 43 31o beschrieben. Mit ihr können jedoch u.a. nur Teilchen einzeln gezählt und klassifiziert werden. Die Messung des Transportes von Stoffen in und aus den Teilchen (Zellen oder Partikeln) sowie chemische Reaktionen an den Teilchen können mit ihr nicht durchgeführt werden, denn einerseits erzeugte die Reaktionsflüssigkeit Absorption und/oder Streuung des Beleuchtungs- und/oder Beobachtungsstrahles und andererseits müßte ein Minimaldurchmesser der ersten Mantelflüssigkeit aufgrund der Stabilisierung der hydrodynamischen Fokussierung eingehalten werden,so daß bei dieser bekannten Einrichtung nicht einfach diese Mantelflüssigkeit als Reaktionsflüssigkeit verwendet werden könnte.

Solche Messungen gelangen bisher nur an Einzelteilchen mit direkter mikroskopischer Beobachtung (ElIi Kohen et al,"Quantitative aspects of rapid microfluoremetry for the study of enzyme reactions and transport mechanismus in single living cells" ,Fluorescence technignes

in cell biology, Springer Verlag 1973, Heidelberg- New-York,

5.27o7-218).

,τ 4 -

130024/003Q

S-

Hierbei finden Farbstoffreaktionen, radioaktive oder immunologische Techniken Anwendung.

Diese Techniken bzw. Messungen sind nur an einzelnen Teilchen möglich, welche nicht repräsentativ für die Gesamtmenge der Teilchen zu sein brauchen, oder es können, bei Messungen an Teilchen in Suspension, über die einzelnen Teilchen keine weiteren Informationen erhalten werden.

Die der Erfindung gestellte Aufgabe besteht nunmehr darin, die eingangs genannte' Einrichtung derart zu verändern-bzw. zu verbessern _f da£ solche Messungen durchgeführt werden können, wobei auch die Möglichkeit gegeben sein soll, daß zuerst zwischen den beiden Mantelflüssigkeiten ein Reaktionsprodukt erhalten wird, welches dann erst mit den Teilchen wechselwirkt.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mittels der Merkmale des Anspruches 1 gelöst. Die Merkmale des Anspruches 2 geben eine Weiterbildung der Erfindung an, die besonders zu Messungen geeignet ist, bei denen keine Fluoreszenz bzw. Streustrahlung nachzuweisen bzw. benötigt wird. Die übrigen Ansprüche geben weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung wieder.

Bei der Erfindung wird demnach das Verfahren der hochauflösenden Durchflußcytrcanetrie durch einen zusätzlichen Mantelstrom erweitert, der die Reaktionslösung enthält. Damit wird eine schnell aufeinanderfolgende Messung einzelner Zellen und Partikel möglich, wobei gleichzeitig weitere Parameter der jeweiligen Zelle erfaßbar sind. Das mikroskopische Auflösungsvermögen bleibt dabei auch bei hohen Meßraten erhalten. Nach dem Austritt aus dem Probenzuführungsrohr wird die Suspension von einem konzentrischen Flüssigkeits- bzw. Reaktionsstrahl, der die Reaktions- oder Farbstofflösung enthält, ummantelt. Beide werden in der an sich bekannten Weise hydrodynamisch fokussiert und ein weiterer Mantelstrom gestattet in speziellen Anwendungsfällen die optische Anpassung an ebene Beobachtungsfenster. Das Durchmesserverhältnis des Suspen-

130024/0030

sions- zum Reaktionsflüssigkeitskanal kann an Hand der Versuchsbedingungen gewählt werden. Bei hoher Eigenabsorption der Reaktionslösung z.B. wird der Enddurchmesser des Flüssigkeitszylinders der Reaktionslösung nur wenig größer als die Zelle gewählt. Ohne wesentliche Einbußen an Genauigkeit der räumlichen Positionierung bei der hydrodynamischen Fokussierung lassen sich durch Verlegung der Mündung des Suspensionszuführungsrohres entlang der Strömungsachse unterschiedliche Reaktionszeiten bis zum Meßpunkt einstellen. Durch Wahl der Stoffkonzentration im Reaktionsmantel können unterschiedliche Diffusionsgradienten eingestellt werden. Bei fluorochromierten Stoffen ist dabei die Größe des abtastenden Strahles nur durch die räumliche Trennung der Einzelzellen begrenzt, d.h. er kann sowohl kleiner als auch größer als der ZeIldurchmesser sein.

Das System gestattet es aber, erstmals Diffusionen und Reaktionen an einzelnen Zellen ur>^ Partikeln in Suspensionen mit einstellbaren Reaktionszeiten und/oder Diffusionsgradienten bei hoher Meßrate durchzuführen. Neben den Reaktionsdaten lassen sich weitere Parameter der Zellen und Partikel erfassen und zur genaueren Charakterisierung heranziehen. Weiterhin sind hochauflösende Untersuchungen an Systemen im Diffusionsgleichgewicht als auch vor Erreichen des Gleichgewichtszustandes möglich. Die Messung einzelner Partikel in großer Anzahl erlaubt Aussagen mit hoher statistischer Sicherheit.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen mittels der Fig. 1, 2 und 3a - c näher erläutert.

Die Fig. 1 stellt eine Einrichtung mit Beleuchtungs- und Aufnahmeeinrichtung schematisch dar. Die Probensuspension 1 (Teilchen 2 mit Flüssigkeit) strömt über ein Zuführungsrohr 3 in das sich verjüngende Rohr 4 zur hydrodynamischen Fokussierung, über dieses Rohr 4 wird eine erste Mantelflüssigkeit 5 zur Ausbildung des Suspensionsfadens zugeführt (ähnlich wie in der DT-OS 25 43 31o) ·

Um das Zuführungsrohr 3 herum ist konzentrisch zum Rohr 4 (und

130024/0030

Rohr 3) ein weiteres Rohr 6 angeordnet, über welches die Reaktionsflüssigkeit 7 zugeführt wird. Die Teilchen 2, die Suspensionsflüssigkeit 1 und die Reaktionsflüssigkeit 7 werden sodann mittels des äußeren, sich verjüngenden Rohres 4 derart hydrodynamisch fokussiert, wie es z.B. in den Fig. 3a - c dargestellt ist. Mittels Doppelpfeilen ist angedeutet, daß sowohl das Zuführungs-. rohr 3 relativ zu dem weiteren Rohr 6 als auch beide Rohre 3 und relativ zum äußeren (ersten) Rohr 4 in Strömungsrichtung bewegbar sein sollen. Mit diesen Verschiebemöglichkeiten sind sowohl der Durchmesser des Suspensionsfadens 1 als auch der der Reaktionsflüssigkeit 7 veränderbar.

Der gemeinsam gebildete Flüssigkeitsstrahl 8 tritt dann aus dem Düsenende 9 des äußeren Rohres 4 entweder frei aus oder es wird von einer weiteren Mantelflüssigkeit Io bis zum AuslaC 27 umgeben, welche im Mantelrohr 11 zugeführt wird. Diese weitere Flüssigkeit kann beispielsweise zur Stabilisierung des Flüssigkeitsstrahls 8 oder zur optischen Anpassung dienen. Er kann jedoch auch entfallen, wenn nur von den Teilchen 2 ausgehendes Streu-oder Fluoreszenzlicht betrachtet werden soll.

Die Beleuchtung, Beobachtung und Auswertung erfolgt mittels eines Laserstrahls 12, der über einen Polarisaticnsrotator 13 (kann entfallen}einem dichroitischen Spiegel 14 (Epi Illumination) und ein Objektiv 15 auf die Teilchen 2 bzw. den gemeinsamen Flüssigkeitsstrahl 8 gerichtet ist. Beobachtet (gemessen) wird im Durchlicht 17 mit Linse 16 oder im Auflicht(Streu- oder Fluoreszenzlicht) 18 über das Interferenzfilter 19, den Calcite Crystial 2o und die zwei Photomultiplier 23, 24,auf die die polarisierten Teilstrahlen 21, 22 gerichtet sind. Diese beiden Strahlen 21 und 22 dienen z.B. der Messung der Emissionsanisotropie. Die Impulsauswerteschaltung ist nicht dargestellt, da sie im wesentlichen der in der genannten DT-OS gleicht. An Stelle einer Trennung nach unterschiedlichen Polarisations-Richtungen kann auch eine Aufspaltung des Beobachtungsstrahls in mehrere unterschiedliche Wellenlängenbereiche mit Hilfe von Prismen oder halbdurchlässigen Spiegeln erfolgen.

~1 3 00 24/0030

Die Fig. 2 zeigt ein Detail der Einrichtung zur Ausbildung des Flüssigkeitsstrahles 1 und 7. In einer einseitig offenen Metallkanuner 25 ist sowohl das Zuführungsrohr 3 als auch das Rohr 6 befestigt. Die Verschiebemöglichkeit der beiden Rohre 3 und 6 zueinander bzw. gegenüber dem äußeren Rohr 4 (s. Fig. 1) ist nicht näher dargestellt. Sie läßt sich jedoch durch bekannte Verschiebetechniken verifizieren. Die Zuführung der Reaktionsflüssigkeit 7 erfolgt über einen seitlich angeordneten Stutzen 26.

In den Fig. 3a - c sind jeweils 2 Teilchen 2 dargestellt, die entlang des Suspensionsfadens 1 hintereinander aufgereiht sind. Die Suspensionsflüssigkeit 1 umgibt die Teilchen 2 im gezeigten Beispiel als dünner Film. Die Teilchen 2 mit Supension 1 bewegen sich gemeinsam mit der Reaktionsflüssigkeit 5 in horizontaler Pfeilrichtung. ,

Seitlich der Fig. 3a - c sind scwohl zwei kleine Pfeile P.. und P_, die zwei der möglichen Polarisationsrichtungen der beiden parallelen Anregungsstrahlen widergeben, als auch die Querschnitte zweier paralleler Beleuchtungs- bzw. Beobachtungsstrahlen 12, 17, oder 18 dargestellt. Mit kreisförmigen Strahlungsquerschnitten (Fig. 3a) kann entweder die Ze Hänge (v/obei der zweite Strahl 18 der Korrektur der Absolutwerte dient) oder, wenn mit zwei Polarisationsrichtungen angeregt wird, z.B. die Mobilität von Fluorochromen bestimmt werden.

Mit einem schlitz- und einem kreisförmigen Strahlquerschnitt (s. Fig. 3b) läßt sich die Länge und Breite (Extinktion) der Teilchen 2 bestimmen.

Zwei schlitzförmige Strahlquerschnitte (s.Fig. 3c) erlauben die Bestimmung von Ze Hängen, wobei die Teilchen nicht unbedingt gut ausgerichtet sind oder Klumpen gebildet haben. Dabei wird mit einem Strahl die Länge entsprechend der o.g. DT- OS relativ zu der Strömungsgeschwindigkeit und mit Hilfe der Passagezeit vom ersten bis zum zweiten Strahl die Strömungsgeschwindigkeit selbst bestimmt. Damit ist eine Eichung der Auswerteelektronik zur Darstellung der absoluten Größenwerte möglich.

1 3t)02%/OO3O

Claims

Patentansprüche;

/1.J Einrichtung zur durchflußcytometrischen Reaktions- und/oder Diffusionsmessung von in einer Flüssigkeit suspendierten Teilchen mit einem von der Suspension und einer ersten Mantelflüssigkeit durchflossenen, sich verjüngenden Rohr zum hydrodynamischen Fokussieren der Suspension zu einem Suspensionsfaden, der nach Verlassen des Rohres zusammen mit der ersten Mantelflüssigkeit zu einem Auslaß geführt wird, mit einem den Suspensionsfaden kreuzenden Beleuchtungs- und/oder Beobachtungsstrahl und mit mindestens einem an eine Impulsauswerteschaltung angeschlossenen Detektor für die von den vereinzelten Teilchen ausgehende Strahlung, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem Suspensionsfaden (1, 2) und der ersten Mantelflüssigkeit (5) eine weitere Mantelflüssigkeit (7) konzentrisch zu beiden ausgebildet ist, die mit den Teilchen (2) in Wechselwirkung tritt, und daß diese weitere Mantelflüssigkeit (7) innerhalb des Rohres (4) zum hydrodynamischen Fokussieren mittels einem weiteren Rohr (6), welches ein Zuführungsrohr (3) der Flüssigkeit (1) mit den Teilchen (2) umgibt, der ersten Mantelflüssigkeit (5) zuführbar ist.
2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Suspensionsfaden (1, 2) nach dem Verlassen des sich verjüngenden Rohres (4) zusammen mit der ersten und zweiten Mantelflüssigkeit (5, 7) in einem Mantelrohr (11) zu dem Auslaß (27) führbar ist.
3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das weitere Rohr (6) relativ zum Zuführungsrohr (3) und beide relativ zum fokussierenden Rohr (4) in achsialer Richtung bewegbar sind, wodurch der Durchmesser der weiteren Mantelflüssigkeit (7) und des Suspensionsfadens (1) veränderbar ist.
4. Einrichtung nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die von den Teilchen (2) ausgehende Strahlung (17, 18) der Messung der Extinktion, der Fluoreszenz, des Streulichts oder des Beugungslichtes dient.

1 30024/0030

COPY