DE60218649T2 - IR-Analysesystem - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Analyse von kleinen biologischen oder chemischen Proben und insbesondere Vergleiche der Transmissions- oder Emissions-Spektren im nahen Infraroten, um die Degradation von Lösungen der in Mikroröhrchen gelagerten Verbindungen zu messen.
  • In einem System, wo eine sehr grosse Anzahl von sehr kleinen Proben über verlängerte Zeitdauern gelagert werden, besteht ein Risiko, dass einige der Proben sich über die Zeit durch den Zufluss von ungewünschten Unreinheiten wie Wasser verschlechtern können,. Es ist vorteilhaft, in einer nicht-intrusiven Art und Weise fähig zu sein, zu überprüfen, ob eine Probe kontaminiert worden ist.
  • US-A-4,675,390 beschreibt ein universelles Spektrometersystem mit einer modularen Probenkammer, die in getrennter Weise konstruiert worden ist, eingeschlossen in eine modulare Einheit, die in einfacher Weise an eine Gehäusewand befestigbar und lösbar ist, welche die Basiseinheit des Spektrometers ausmacht, und welche ein Interferometer enthält, einen oder mehr Detektoren und andere Anteile des Systems.
  • Die US-A-3,748,044 beschreibt eine digitale chemische Analysevorrichtung zum Evaluieren von Reaktionsraten und Endpunktbestimmungen, die innerhalb einer Vielzahl von individuellen Mustern stattfinden.
  • WO 99/12017 beschreibt ein Verfahren einer Vorrichtung zum Identifizieren von Wirkstoffen, um die Formation von Komplexen zwischen Reaktanten zu bestimmen.
  • Gemäss der vorliegenden Erfindung ist ein Infrarot-Analysesystem zur Analyse von Proben vorgesehen, um eine Degradation während des Speicherns zu erfassen, wobei die Proben in transparenten oder durchscheinenden Behältern angeordnet sind, wobei das System umfasst: eine infrarote Lichtquelle, eine behälterlokalisierende Vorrichtung zum Lokalisieren eines Behälters in einer bekannten Position relativ zur infraroten Lichtquelle, ein Spektrometer, das ausgestaltet ist, um infrarotes Licht von den Behältern zu empfangen, Mittel zum Lesen der Identität eines Behälters, Mittel, die ausgestaltet sind, um von dem Spektrometer aufgezeichnete Spektren an eine Datenbank zu übermitteln, Mittel, die ausgestaltet sind, um die Spektren und die Identität des Behälters in der Datenbank in einem Datensatz aufzuzeichnen; und Mittel, die ausgestaltet sind, um von dem Spektrometer aufgezeichnete Spektren mit einem zuvor aufgezeichnetem Spektrum zu vergleichen, welches in der Datenbank für denselben Behälter abgespeichert ist.
  • Vorzugsweise bewirkt die behälterlokalisierende Vorrichtung, dass die Röhre gedreht wird, während sie ihre Position relativ zur infraroten Lichtquelle beibehält.
  • Die behälterlokalisierende Vorrichtung kann ausgestaltet sein, um eine Mikroröhre oder eine Kulturplatte zu halten.
  • Das Spektrometer kann so angeordnet sein, um Licht aufzunehmen, welches von dem Behälter durchgelassen oder reflektiert worden ist.
  • 1 ist eine schematische Ansicht der Vorrichtung, um Spektren zu erhalten,
  • 2 ist ein Bildschirmausdruck, der Spektren verschiedener Komponenten zeigt, die in der Mikroröhre 14 gefunden werden,
  • 3 ist ein Bildschirmausdruck, der ein Spektrum zeigt, welches von einer unbekannten Substanz erhalten wird, welche Dimethylsulfoxid (DMSO) ist,
  • 4 ist ein Bildschirmausdruck, der ein Spektrum zeigt, welches aus DMSO mit einer Unreinheit erhalten worden ist, die dadurch imitiert wurde, das Licht durch eine Plastikfolie geleitet wurde.
  • Die schematische Darstellung der 1 zeigt eine Lichtquelle 10 im nahen Infraroten (NIR), innerhalb einer Lampenfassung. Das Licht verlässt die Fassung durch eine Öffnung und wird durch eine Linse 12 auf einer zu analysierenden Probe fokussiert, die von einer transparenten oder durchscheinenden Mikroröhre 14 gehalten wird, an ihrer Position durch einen Röhrenhalter 15 gehalten, welcher eine optische Faserschnittstelle 16 zu einem Spektrometer 17 aufweist. Die Faseroptik 16 reduziert die Wirkungen der Beugung und Brechung auf die an das Spektrometer 17 gesandten Daten.
  • Die Mikroröhre 14 kann an Ort und Stelle durch einen Roboter gehalten werden, der auch die Mikroröhre 14 drehen kann, während er sie an ihrer Position relativ zur Lichtquelle 10 hält. Dies vermindert Fehler, die als Ergebnis von Mängeln der Ausgestaltung der Mikroröhre 14 auftreten können. Alternativ kann die Probe 13 auch in einer Kulturplatte gehalten werden, eher als in einer Mikroröhre 14. Dies ist insbesondere geeignet, wenn die Probe 13 lebende Zellen umfasst, die daher in situ auf den Platten getestet werden können, auf welchen sie wachsen. Falls das Spektrum einer biologischen Probe auf einer Kulturplatte erhal ten wird, ist es dann möglich, das Spektrum zu einer späteren Zeit zu vergleichen, um zu sehen, ob die Platte durch Produkte kontaminiert worden ist, die annehmen lassen, dass unprogrammierter Zelltot, oder Nekrose, stattgefunden hat. Falls dies der Fall ist, können die Zellen lysieren und Produkte abgeben, von denen das Spektrum erfassbar ist.
  • Die Lichtquelle 10 ist eine 12V-Hallogenlampe mit einem Aluminiumreflektor. Solch eine Lampe hat eine gleichmässige Lichtabgabe über die Wellenlänge des nahen Infraroten, die im Spektrometer 17 eingesetzt werden, und hat auch den Vorteil, dass das Meiste des Lichts nach vorne abgegeben wird. Das Projizieren des Lichts des nahen Infraroten durch die Blende liefert eine gleichmässige Punktlichtquelle und gestattet die Bündelung des Strahls. Der Einsatz einer Linse 12, um das Licht zu fokussieren, gewährleistet, dass das Licht in die Mikroröhre 14 im wesentlichen senkrecht zu den Wänden eintritt, um den optischen Weg durch die Wände der Mikroröhre zu minimieren und den Weg durch die Inhalte zu maximieren, was also unerwünschte Linseneffekte vermindert, die durch die gekrümmten Wände der Mikroröhre bewirkt werden. Der Röhrenhalter 15 in Gestalt einer V-förmigen Öffnung mit der Faseroptik 16 an seiner Spitze, gestattet ein einfaches und wiederholbares Positionieren der Mikroröhre 14 relativ zur Lichtquelle 10 und der faseroptischen Schnittstelle 16. Die Mikroröhrenprobe 13 enthält eine Verwendung, die im Allgemeinen in DMSO aufgelöst ist und die Lösung wird einen Anteil der nahinfraroten Strahlung absorbieren. Die Menge an Strahlung, die bei jeder Wellenlänge absorbiert wird, ist abhängig von der jeweiligen Substanz, die in der Mikroröhre 14 ist, und abhängig von der chemischen Zusammensetzung der Mikroröhre 14 und dem Lösungsmittel und der Strahlung, die durch die Röhre 14 hindurchgelassen wird, und der Inhalte, die vom Spektrometer 17 festgestellt werden. Das Spektrometer 17 gestattet es, die Menge an Strahlung, die an einer Anzahl von verschiedenen zu messenden Wellenlängen absorbiert worden sind, zu messen, um eine chemische Signatur der Mikroröhre 14 und der Probe 13 abzugeben. Die Signatur wird in einer Datenbank gespeichert und kann zu einem späteren Zeitpunkt abgefragt werden, um mit einer neuen Lesung verglichen zu werden, die durch das erneute Vorlegen der selben Mikroröhre 14 und der Probe 13 in dem Röhrenhalter 15 erhalten worden ist. Jegliche Änderungen in den Messungen sind Änderungen in entweder der Mikroröhre 14 oder der Probe 13 zuzuschreiben. Diese Änderungen können analysiert werden, um die Quelle der Degradation zu bestimmen.
  • Eine bestimmte Quelle der Degradation einer Probe 13 kann der Zufluss von Wasser in die Mikroröhre 14 sein.
  • Ein Beispiel eines Spektrometers, welches hier geeignet ist, ist das Zeiss MMS Near-InfraRed-Spectrometer. Das Spektrometer benutzt eine 128-elementige Matrix, die Wellenlängen zwischen 0.9 und 1.7μm abdeckt.
  • Das System wird durch das Erhalten von weissen Spektren über 20 Integrationswerte zwischen 0.8 und 51ms für alle Werte, die nicht saturiert sind, kalibriert. Die Matrizen werden dann gegen den tatsächlichen Zählwert gegen die Integrationszeit für 128 Wellenlängen aufgebaut. Ausgleichswerte werden dann auf allen dieser Matrizen berechnet, um Gleichungen zu erhalten, die sich für jede Wellenlänge auf den Signalwert zur Integrationsdauer beziehen. Diese Gleichungen können eingesetzt werden, um vorherzusagen, was das weisse Spektrum bei einer gegebenen Integrationszeit sein würde, falls der Detektor gegenüber Sättigung immun wäre. Sobald das weisse Referenzspektrum berechnet worden ist, wird die zu messende Substanz in das System eingelassen und ein Satz von Spektren wird über die gesamte Breite der erlaubten Integrationszeiten aufgenommen. Das Spektrometer 17 erzeugt einen Vektor von 128 Integern, die die Intensität zu verschiedenen Wellenlängen in ungefähren Inkrementen von 6 Nanometer darstellen. Um diese Integerzahlen in Transmissionswerte zu wandeln, ist es zuerst notwenig, die Spektren zu erkennen, die für null und volle Transmission erzeugt werden. Es wird dann angenommen, dass das Spektrometer eine lineare Antwort über den betreffenden Bereich aufweist und Werte so skaliert werden können, dass schwarze Werte 0 und ungehinderte Werte 1 werden.
  • Die Datenaufnahme wird durch zwei speziell ausgestaltete Karten erreicht. Die Ausgabe des Spektrometers 17 ist in Gestalt einer Abfolge von analogen Differenzspannungen, die proportional zur Intensität des Lichtes sind, welches auf die innere CCD-Matrix während einer vordefinierten Integrationszeit fällt. Die Ausgangsspannungen werden in eine 14-bit Digitalzahl auf einer Front End Electronics-Karte gewandelt, die lokal an dem Spektrometer vorgesehen ist, um Rauschinterferenz auf empfindlichen analogen Leitungen zu vermindern. Diese digitalen Daten werden dann seriell an die Spektrometersteuerkarte übermittelt, die in einem entfernt stehenden PC angeordnet ist, welcher wiederum die Daten direkt in den RAM-Speicher des PC's über DMA übermittelt. Diese Karten steuern auch die digitale Steuerung und Taktsignale, die vom Spektrometer 17 angefordert sind. Die Integrationszeit des Spektrometers 17 kann auch von dem PC aus gesteuert werden durch Beschreiben eines Registers innerhalb der Karte.
  • Sobald die Daten gesammelt worden sind, kann eine Anzahl von Operationen durchgeführt werden, um die Inhalte der Mikroröhre 14 zu bestimmen. Die Transmission von Licht durch eine Substanz wird einer exponentiellen Abschwächung der Form: T = eklog (t) unterworfen, wobei T die Transmission von k Einheiten der Substanz mit einer einzelnen Einheitstransmission von t ist. Der Algorithmus arbeitet von einem betrachteten Spektrum ausgehend und versucht, es als eine Kombination von Referenzspektren auszudrücken. Das Spektrometer nimmt Licht in 128 verschiedenen Wellenlängenintervallen auf und daher müssen 128 Gleichungen gleichzeitig gelöst werden. Dies wird getan durch das Levenberg-Marquardt-Verfahren. Dies kann eingesetzt werden, um die Menge von jedem Referenzspektrum zu finden, welches die nächste Approximierung an das betrachtete Spektrum bietet. Es ist möglich, den Wechsel in der Menge einer bekannten Substanz selbst dann zu messen, falls die Identität der zuvor in dem Behälter vorhandenen Substanzen nicht bekannt ist. Dies erfordert, dass sich die Substanzen in dem Behälter nicht verändern, sondern Wissen, was genau sie sind, nicht notwendig ist. Beispielsweise seien zwei Spektren der selben Probe gegeben, von denen beide einen bestimmten Anteil von Absorption einer unbekannten Substanz Tc enthalten, ist es möglich, den Wechsel in der Menge einer Substanz festzustellen, welche ein bekanntes Spektrum Tb hat, durch Analyse des Verhältnisses der Spektren. Das ursprüngliche Spektrum, welches von einem Behälter erhalten wird Tl = tc. Ein nachfolgendes Spektrum von dem Behälter ist T2 = tb·tc. Das Verhältnis T1/T2 ist tb.
  • Zu jeder Stufe innerhalb des Verfahrens können die Daten in grafischer Form entweder als rohe Signalzahl oder als Transmission auf der Ordinate dargestellt werden und die Kanalnummer des Spektrometers 17 auf der Abszisse. Die Kanalnummer bezieht sich auf die Wellenlänge des Lichtes und kleinere Kanalnummern entsprechen längeren Wellenlängen.
  • Die Begrenzungen der Matrix der internen CCD des Spektrometers und die Optiken können eine Verschlechterung an jedem Ende des Spektrums in dem Masse bewirken, dass das Signalrauschverhältnis die Daten unzuverlässig macht. Um diesen Nachteil auszugleichen, können die ersten und letzten wenigen Datenpunkte für jedes Spektrum weggelassen werden.
  • Um systematische Fehler innerhalb des Systems zu entfernen, ist es wichtig, Änderungen aufgrund der Drift des Dunkelreferenzpunktes über die Zeit zu entfernen. Dies wird durch eine flache Faltungsoperation durchgeführt, wobei ein Algorithmus eingesetzt wird, um ein dunkles und ein helles Spektrum zu kombinieren, um die Wirkungen von Nichtlinearitäten des Spektrometers zu vermindern.
  • Die Wirkungen der Selbstlinseneigenschaften um die Mikroröhre 14 kann auch ohne Einführung von spezifischer Software durch Einführung eines spezifischen Spektrums behandelt werden, welches "grey.nir" genannt wird. Dies ist ein simuliertes Spektrum, welches 0% Absorption enthält. Die Linsenwirkung führt dazu, dass das gesamte Signal mit einem unbekannten Wert zu multiplizieren ist, welcher tatsächlich das Weissniveau nach oben bzw. unten verschiebt. Das Liefern eines gleichförmigen Absorptionsspektrums gestattet es dem Algorithmus, das Weissniveau zurück auf 1.0 zu bringen durch Multiplizieren des gesamten Spektrums durch eine geeignete Zahl.
  • Sobald diese Wirkungen in Betracht gezogen sind, können die Daten weiter analysiert werden. Das aus einer Mikroröhre erhaltene Spektrum wird aus einer Anzahl von Komponenten hergestellt, wie diejenigen, die in 2 dargestellt sind. Das nahe Infrarote wird in verschiedenen Mengen durch jede der Komponenten absorbiert werden, durch welche es hindurch geht. Das so erhaltene Spektrum aus der Mikroröhre wird so um verschiedene Mengen von jeder der in der Mischung vorhandenen Substanzen reduziert, auch umfassend den Kunststoff, aus dem die Mikroröhre ausgebildet ist. Das Spektrum wird analysiert, um festzustellen, welche Substanzen in der Mischung vorhanden sind. Zuerst wird das Absorptionsspektrum aus dem Transmissionsspektrum berechnet. Jegliche bekannten Komponenten der Mischungen können getrennt gemessen werden und die Daten ihrer Spektren können in der Datenbank gespeichert werden, so dass geeignete Vergleiche durchgeführt werden können. Ein Algorithmus kann eingesetzt werden, um eine Ausgleichsanpassung für die unbekannten Bestandteile der Mikroröhre zu erhalten, unter Betrachtung der Referenzabsorptionsspektren.
  • Die Ausgleichsspektren werden erhalten durch Multiplikation der Absorptionsspektren der Referenzproben durch eine Variable, welche den Anteil des gesehenen Referenzspektrums darstellt. Bspw., falls das Referenzspektrum von DMSO durch eine 3mm Probe aufgenommen worden ist, sollte der Algorithmus eine "Menge an vorhandenem DMSO"-Wert von 1.0 für 3mm und von 0.1 für 0.3mm erzeugen. Wo Vielfachabsorptionsspektren vorhanden sind, sollten die berechneten Werte das Verhältnis der in der Probe vorhandenen Substanz multipliziert mit der Dicke der Probe und geteilt durch die Dicke der Referenzprobe sein. Falls alle Referenzproben auf die Dicke der einzusetzenden Behälter normalisiert sind, werden die Ergebnisse das Verhältnis von jeder Substanz im Behälter ergeben.
  • Die 3 zeigt ein von der Mikroröhre 14 erhaltenes Spektrum. Es wird angenommen, dass sie DMSO enthält, und daher wird das erhaltene Spektrum mit dem Referenzspektrum für DMSO verglichen. Der ChiQuadrat-Wert ist klein (1.649), was eine gute Korrelation zwischen der Substanz in der Mikroröhre und dem Referenzspektrum für DMSO bedeutet. Es ist daher möglich, abzuleiten, dass die Mikroröhre DMSO enthält.
  • Die 4 zeigt ein scheinbar ähnliches Spektrum, welches aus einer Mikroröhre erhalten worden ist. In diesem Falle ist eine Unreinheit imitiert worden, indem das Licht durch eine Plastikfolie hindurchgeleitet worden ist. Obwohl die Mikroröhre immer noch DMSO enthält, ist der ChiQuadrat-Wert, der erhalten wird, wenn das Spektrum der Mikroröhre mit dem Referenzspektrum für DMSO verglichen wird, sehr hoch, was vermuten lässt, dass neben DMSO auch etwas anderes vorhanden ist.
  • Falls beispielsweise vermutet wird, dass die Probe durch Wasser verunreinigt worden ist, ist es möglich, die Referenzdaten für Wasser und für die vorgängig gemessenen Inhalte der Mikroröhre zu vergleichen und die besten Ausgleichsgrade mit Fehlerstatistiken zu betrachten. Falls der ChiQuadrat-Wert klein ist; dann ist die Identifikation der Verunreinigung als Wasser wahrscheinlich richtig. Falls der ChiQuadrat-Wert hoch ist; dann ist die Identifikation nicht richtig oder unvollständig gemacht worden. Der ChiQuadrat-Wert wird mit den individuellen Werten kombiniert, um ein Ausgabewert zu erzeugen, der zwischen 1 und 10 liegt, wobei 1 darauf hinweist, dass eine exzellente Anpassung vorliegt, werte um 5 eine schlechte Anpassung bedeuten und Werte um 10 keinerlei Anpassung anzeigen.
  • Obwohl das System in Bezug auf Transmissionsspektren ausgestaltet worden ist, können, falls die Substanzen opak sind, wie es häufig im Fall von Emulsionen der Fall ist, anstelle dessen Reflektionsspektra eingesetzt werden können.

Claims (6)

  1. Infrarot-Analysesystem zum Analysieren von Proben, um eine Degradation während der Lagerung festzustellen, wobei die Proben in transparenten oder durchscheinenden Behältern angeordnet sind, umfassend: – eine infrarote Lichtquelle (10) – eine Behälter lokalisierende Vorrichtung (15) zum Lokalisieren eines Behälters (14) in einer bekannten Position relativ zur infraroten Lichtquelle (10), – ein Spektrometer (17), das ausgestaltet ist, um infrarotes Licht von den Behältern (14) zu empfangen, gekennzeichnet durch – Mittel zum Lesen der Identität eines Behälters, – Mittel, die ausgestaltet sind, um von dem Spektrometer aufgezeichnete Spektren an eine Datenbank zu übermitteln, – Mittel, die ausgestaltet sind, um die Spektren und die Identität des Behälters in der Datenbank in einem Datensatz aufzuzeichnen, und – Mittel, die ausgestaltet sind, um von dem Spektrometer aufgezeichnete Spektren mit einem zuvor aufgezeichneten Spektrum zu vergleichen, welches in der Datenbank für denselben Behälter gespeichert ist.
  2. Infrarot-Analysesystem nach Anspruch 1, bei dem die Behälter lokalisierende Vorrichtung (15) bewirkt, dass der Behälter (14) gedreht wird, während seine Position relativ zu der infraroten Lichtquelle (10) beibehalten wird.
  3. Infrarot-Analysesystem nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Behälter lokalisierende Vorrichtung (15) ausgestaltet ist, um eine Mikroröhre (14) zu halten.
  4. Infrarot-System nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Behälter lokalisierende Vorrichtung (15) ausgestaltet ist, um eine Kulturplatte (14) zu halten.
  5. Infrarot-System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Spektrometer (17) so angeordnet ist, um Licht aufzunehmen, welches durch den Behälter (14) hindurchgegangen ist.
  6. Infrarot-System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Spektrometer (17) so angeordnet ist, um Licht aufzunehmen, welches von dem Behälter (14) reflektiert ist.
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