DE69123957T2

DE69123957T2 - Ein hplc-lichtstreuungsdetektor für biopolymere

Info

Publication number: DE69123957T2
Application number: DE69123957T
Authority: DE
Inventors: Robert L. Hercules Ca 94547 Cunico; Gavin D. San Francisco Ca 94114 Dollinger; Michael G. San Rafael Ca 94903 Kunitani
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems Inc
Priority date: 1990-10-23
Filing date: 1991-10-23
Publication date: 1997-04-30
Anticipated expiration: 2011-10-24
Also published as: DE69123957D1; GR930300025T1; CA2072004C; EP0505564A1; US5269937A; EP0505564B1; ES2038572T1; JP3253614B2; ATE147161T1; WO1992007244A1; JPH05505882A; DE505564T1; CA2072004A1

Description

Die Erfindung betrifft die Charakterisierung und den Nachweis jedes Materials zwischen 2 und 10.000 Kilodalton (kD) Molekulargewicht, besonders Biopolymere oder andere Polymere, unter Verwendung der klassischen Lichtstreuung. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verbesserung von klassischen Flachwinkel-Lichtstreuungsdetektoren und klassischen Mehrfachwinkel-Lichtstreuungsdetektoren, entwickelt zur Bestimmung des Molekulargewichts von Teilchen, die aus einer Trennvorrichtung wie einer Flüssigchromatographiesäule austreten.
Es ist wichtig, das Molekulargewicht eines Teilchens zu bestimmen, das aus einer Flüssigchromatograpiesäule austritt oder bei anderen Trennverfahren anfällt, sowohl zur Charakterisierung des Teilchens als auch zur Analyse des Chromatogramms und zur Verfahrensüberwachung und Kontrolle. Angenommen, ein biologisches Verfahren erzeugt eine Probe mit unterschiedlichen biologischen Proteinen von Interesse und Forscher wollen diese aufgrund des Molekulargewichts trennen und identifizieren, um in weiteren Experimenten ihre Nützlichkeit bei der Behandlung von Krankheiten oder diagnostischen Zwecken zu prüfen. Es gibt keine Flüssigchromatographiesäulen, die Proteine aufgrund ihres Molekulargewichts trennen, aber es gibt Säulen, die Teilchen nach ihrer Größe trennen. Jedoch ist die Größe ein schlechter Indikator des Molekulargewichts, da ein biologisches Protein in der natürlichen globulären Form und das gleiche Protein im denaturierten Zustand stark unterschiedliche Größen, aber das gleiche Molekulargewicht besitzen. Es wäre nützlich zur Trennung der zahlreichen Proteine, wie sie von einer Flüssigchromatographiesäule, basierend z.B. auf der Größe, eluieren, das Molekulargewicht der Proteine zu kennen, die jeden Peak in der Chromatographie erzeugen. Das Molekulargewichtssignal kann dann zur Kontrolle eines Sammelsystems verwendet werden, in das der Proteinstrom fließt, so daß die verschiedenen Proteine in verschiedenen Behältern gesammelt werden.
Es sind einige Detektoren bekannt, die den Unterschied im Brechungsindex des Ausgangsstrahls einer Flüzsigchromatographiesäule erkennen. Der Brechungsindex ist jedoch kein geeigneter Indikator des Molekulargewichts.
Eine andere Anwendung zur Kenntnis des Molekulargewichts von Teilchen, die von einer Flüssigchromatographie (LC) Säule eluieren, ist die Analyse von Chromatogrammen. In einigen Situationen können die Peaks in einem Chromatogramm, erzeugt unter Verwendung eines Ultraviolett-Detektors (UV), nicht den Zustand der Teuchenarten entschlüsseln, die die Peaks hervorrufen. Wenn ein klassischer Lichtstreuungsdetektor zur Erzeugung eines anderen Chromatogramms verwendet wird, können die beiden Chromatogramme verglichen und die Unterschiede zwischen der Teilchenmasse, die die unterschiedlichen Peaks in dem UV-Chromatogramm hervorrufen, leicht bestimmt werden.
Bisher waren Molekulargewichtsbestimmungen schwierig und basierten auf Instrumenten, die 1970 entworfen wurden, basierend auf der Mathematik der klassischen Lichtstreuung, die für kleine Teilchen mit Größen weniger als λ/4 optimiert wurden, wie für Biopolymere, wobei λ die einfallende Lichtwellenlänge ist. Insbesondere gibt es eine Beziehung, die mathematisch Molekulargewicht, Raleigh-Streuung, Gewichtskonzentration der die Streuung hervorrufenden Teilchen, einen Größenfaktor, genannt P und eine andere physikalische Eigenschaft, genannt den zweiten Virialkoeffizienten, der sich auf das Volumen, ausgeschlossen von einem bestimmten biologischen Protein, basierend auf seinen Eigenschaften, miteinander in Beziehung bringt. Dieser zweite Virialkoeffizient, A, bedeutet, wenn er groß ist, daß ein bestimmtes biologischen Protein andere Proteine von einem sehr großen Volumen um es herum ausschließt. Wenn A negativ ist, bedeutet das, daß dieses biologische Protein dazu neigt, andere Proteine anzuziehen und Agglomerate zu bilden. Insbesondere gilt die Gleichung (1)
wobei
K = eine optische Konstante, die unter anderem die Wellenlänge, den Brechungsindex der Lösung und die Veränderung des Brechungsindex der Lösung mit der Zeit in Beziehung zueinander setzt und die empirisch für jedes ausgewählte System gemessen werden kann;
R = die "spezifische Rayleigh-Konstante" oder das "spezifische Rayleigh-Verhältnis";
Mw = das Gewichtsmittel des Molekulargewichts der streuenden Teilchen;
P(Θ) = ein Größenparameter, der die Gleichung (1) dür die Effekte der mehrfach Intrateilchenstreuung korrigiert;
A&sub2; und A&sub3; = der zweite bzw. dritte Virialkoeffizient, und
C = die Gewichtskonzentration der streuenden Teilchen.
Eine der Schwierigkeiten, denen die Fachleute ausgesetzt sind, liegt im P-Faktor in Gleichung (1). Speziell ist P gegeben durch die Gleichung
wobei
P(Θ)&supmin;¹ = der inverse Größenfaktor;
n = der Brechungsindex;
Rg = der Trägheitsradius der streuenden Teilchen;
Θ = der Streuwinkel, d.h. der Winkel zwischen dem einfallenden und dem gestreuten Licht;
λ. = die Wellenlänge des einfallenden Lichts.
Fachleute der Instrumentenentwicklung für ein Instrument, das das Molekulargewicht bestimmen kann, sorgten sich, da der Trägheitsradius der streuenden Teilchen nicht einfach gemessen werden konnte und nicht im Voraus bekannt ist, daß der Größenfaktor P nicht bekannt sein würde und nicht ohne die Erzeugung eines Fehlers ignoriert werden könnte, sofern der Streuwinkel sehr klein war, was den Größenfaktor etwa 1 in Gleichungen (1) und (2) machen würde. Als Ergebnis erschien etwa 1970 eine Entwicklung für ein Instrument zur Messung des Molekulargewichts, das aufflachen Lichtstreuwinkeln basierte, so daß P ignoriert werden konnte. Tatsächlich kann Rg gemessen werden, aber das erfordert die Messung von R (Rayleigh-Streuung) bei jedem einer Vielzahl von Winkeln Θ. Mw (das Gewichtsmittel des Molekulargewichts) und Rg können von diesen Messungen hergeleitet werden. Eine andere bekannte Instrumentenentwicklung verwendet diesen Ansatz. Für Flachwinkel Θ muß Rg nicht bekannt sein.
Figur 1 veranschaulicht diese bekannte Entwicklung für einen Flachwinkeistreulicht- Detektor (nachstehend mit LAL bezeichnet), in dem Rg nicht bekannt sein muß. Eine Lichtquelle 10, die ein Lichtbogen oder ein Laser sein kann, erzeugt einfallendes Licht, das durch Optiken 12 auf dem Einlaßfenster 14 einer Strömungszelle 16 fokussiert wird. Die Strömungszelle umfaßt ein langes Stück eines Einlaßglases 18, ein Streuvolumen 20, durch das die von einer Flüssigchromatographiesäule 22 eluierenden streuenden Teilchen in einer Lösung fließen, ein langes Stück eines Ausgangsglases 24, ein Ausgangsfenster 26, eine Maske 28 und einen Streulichtdetektor 30.
Der LAL-Detektor von Figur 1 hat viele Bereiche, die verbessert werden können. Erstens ist Verhältnis von Signal zu Hintergrund in dieser Entwicklung aus verschiedenen Gründen nicht optimal. Sofern die Lichtquelle 10 ein Lichtbogen ist, erzeugt Licht, das nicht ausreichend parallel ist und das durch die Optiken 12 fokussiert werden muß. Beim Durchgang des Lichts durch die Optiken und beim Eintritt in das Einlaßfenster 14 führen die Fehler in den Objektiven und dem Fenster zu einiger Streuung des einfallenden Lichts, das, falls es in den Detektor 30 eintritt, einen Hintergrund erzeugt, da es kein Licht ist, gestreut durch die streuenden Teilchen, sondern Licht, gestreut durch die Maschine selbst. Wenn das Licht das Einlaßglas 18 verläßt und in das Streuvolumen 20 eintritt und dann erneut in das Ausgangsglas 24 eintritt, erfolgt eine erneute Streuung an den Flüssigkeits-Glas-Zwischenflächen 32 und 34, hervorgerufen durch Fehler im Glas. Weiteres Streuen tritt am Ausgangsfenster 26 auf, hervorgerufen durch Fehler im dortigen Glas. All dieses Streulicht ist Hintergrund und keine Daten, und es müssen Schritte unternommen werden, um es auszuschließen. Einer dieser Schritte besteht darin, die Gläser 18 und 24 sehr lang zu machen, so daß Streulicht am Einlaßfenster 14 und den Zwischenflächen 32 und 34 soweit vom Detektor 30 entfernt ist, daß Streulicht an diesen Stellen den Detektor verfehlt. Streulicht am Ausgangsfenster 26 wird vom Detektor 30 durch die Maske 28 etwas abgedeckt. Figur 2 zeigt die bekannte Maskenkonfiguration für die Maske 28. Diese Maske umfaßt einen lichtundurchlässigen zentralen Bereich 36, der nicht gestreutes einfallendes Licht abhält, das direkt durch die Strömungszelle und Streuvolumen strahlt, ohne gestreut zu sein vom Eintreten in den Detektor 30. Die Maske besitzt auch einen konzentrischen lichtundurchlässigen äußeren Bereich 38, der Streulicht mit großem Winkel vom Eintreten in den Detektor 30 abhält. Die Region 40, die nicht schraffiert ist, ist transparent und erlaubt dem Flachwinkelstreulicht, in den Detektor einzutreten, unabhängig davon, ob es von den streuenden Teilchen oder durch andere Ursachen, wie Fehler im Glas, gestreut wurde.
Es ist beschwerlich, die Struktur von Figur 1 zu verwenden, da die Strömungszelle auseinandergenommen und mit Ultraschall oder auf andere Weise fast jeden Tag gereinigt werden muß, um die Ansammlung von Schmutz auf den verschiedenen Oberflächen in den optischen Wegen zu verhindern, die weiteres Streuen hervorrufen könnte.
Weiterhin ist der Aufbau der Optiken 12 zur Fokussierung des Bogenlichts etwas kompliziert und teuer, falls das Streulicht minimiert werden soll. Mit dem Auftreten von Lasern sind die Probleme der Entwicklung von optischen Systemen verringert, da Laser paralleles Licht abgeben. Jedoch müssen einige Optiken vorhanden sein, um den Laserstrahl "zu reinigen", so daß etwas Streulicht eliminiert wird. Die Probleme, die Fenster 14 und 26 und die Zwischenflächen 32 und 34 so perfekt wie möglich zu gestalten, sind ebenfalls ziemlich schwierig.
Ein anderes Problem mit der Struktur von Figur list, daß die Ausgangsfrequenz der Laser, die relativ preiswert sind (Hehum-Neon-Laser), zu weit in den roten Bereich des Spektrums hineinreichen, um eine gute Übereinstimmung für die Bande der höchsten Empfindlichkeit des Detektors 30 zu erreichen. Üblicherweise ist der Detektor 30 ein Photomultiplier (nachstehend mit PMT bezeichnet), der eine Empfindlichkeit besitzt, die dreimal so effizient im blau-griinen Bereich des Spektrums wie im roten Bereich ist. Für den blau-grünen Bereich des Spektrums optimierte PMTs besitzen auch geringere Dunkeldichten, d.h. ungewollte Signale, wenn kein Streulicht erkannt wird, was zu weniger Hintergrund führt. Da die Menge des Streulichts, verglichen mit der einfallenden Lichtintensität sehr klein ist, sind Hintergrundberücksichtigungen äußerst wichtig für die Entwicklung von Streulichtdetektoren, und eine hohe Intensität des einfallenden Lichts ist wichtig, um die Intensität von gestreutem Licht in meßbaren Werten zu halten. Weiterhin ist die Menge des Streulichts proportional zu 1/λ&sup4;. Daher streut blaues Licht, das eine kürzere Wellenlänge λ besitzt, viel mehr als rotes Licht. Ein üblicher Helium-Neon- Laser-Ausgang beträgt 633 nm. Eine typische Linie von einer Bogenlampe, die verwendet werden kann, beträgt 467 nm. 633&sup4; geteilt durch 467&sup4; beträgt 3,4, was bedeutet, daß blaueres Licht von einer Lichtbogenlampe 3,4 mal besser streut, als He-Ne-Laser-Licht. Daher ist es äußerst wünschenswert, einen PMT, optimiert für blau-grün zu verwenden. Laser mit einem Ausgangslicht im blau-grünen Bereich des Spektrums und einer hohen Ausgangsstärke sind sehr teuer und sehr groß. Das macht das Instrument voluminös, schwer und teuer.
Weiterhin besitzen Laser wellenartigen Hintergrund, d.h. Hintergrund, angepaßt auf ihre Ausgangslichtintensität, die im Bereich von 0 bis 30 Hz liegt. Abweichungen in der Intensität des einfallenden Lichts, hervorgerufen durch die Quelle, übertragen sich auf den Hintergrund in Form von Abweichungen in der Intensität des Streulichts, das nicht durch die Konzentration oder das Molekulargewicht der streuenden Teilchen hervorgerufen ist. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie dauert im allgemeinen mindestens 30 bis 90 Minuten und die Ausgangssignale von den Detektoren werden im allgemeinen einmal pro Sekunde gesammelt. Daher liegt die Sarnrnelfrequenz nahe oder innerhalb der Frequenzbande des wellenförmigen Hintergrunds, so daß weiterer Hintergrund in den Daten erzeugt wird.
Schließlich besteht ein anderes Hintergrundproblem aufgrund des unvermeidlichen Auftretens von sehr großen Teilchen im Ausgangsstrahl der Flüssigchromatographiesäule. Diese großen Teilchen, möglicherweise feine Teilchen der Säulenpackung, sind daher keine Teilchen von Interesse, aber aufgrund ihrer großen Größe fuhren sie auf jeden Fall zu einer großen Menge an Streulicht. Figur 3 beschreibt das übliche Streulichtmuster eines kleinen Teilchens als eine Winkelfünktion, und Figur 4 beschreibt das übliche Streulichtmuster dieser großen Teilchen. In Figur 3 kommt der einfallende Lichtvektor I&sub0; von links und die Streulichtvektoren für Streulicht mit flachen Winkeln und bei etwa 90º sind dargestellt durch die Vektoren Is0 und Is90 Die Intensität von Streulicht bei 90º von kleinen Teilchen ist etwa die Hälfte der Intensität von Streulicht bei flachen Winkeln. Wie in Figur 4 zu sehen, hat die Intensität von Streulicht von großen Teilchen leider eine sehr unterschiedliche Gestalt. Figur 4 zeigt, daß sehr wenig Licht von großen Teilchen bei 90º gestreut wird und das meiste Streulicht bei kleinen Winkeln weitergegeben wird. Das bedeutet, daß diese großen Teilchen trotz ihres relativ geringen Auftretens große Hintergrundspitzen in Flachwinkelstreulicht-Detektoren hervorrufen.
Ein Beispiel eines Flachwinkellaserlichtphotometers verwendet mit einem Konzentrationsdetektor für biologisches Material ist beschrieben von Stuting et al., 1989, LG-GB, 7(5):402-417.
Eine weitere Veröffentlichung, in der Flachwinkelstreuung von Laserlicht für Molekulargewichtsbestimmung von Biopolymeren vorgeschlagen ist, stammt von I.S. Krull et al., T.R.A.C., Band 8, Nr.7, 1. August 1989, Seiten 260-268.
Die Verwendung von Laserlicht in Kombination mit Vielfachwinkellichtstreuung zur Bestimmung von Molekulargewichten von Biopolymeren ist beschrieben von C. Jackson et al., J.A.P.S., Applied Polymer Symposium 43, 99 (1989), Seiten 99-114.
Jede dieser Methoden besitzt den zuvor beschriebenen, mit Laserlicht verbundenen Nachteil.
Folglich besteht ein Bedarf für eine neue Entwicklung für einen klassischen Lichtdetektor und ein System zur Bestimmung des Molekulargewichts von biologischen Proteinen oder anderen kleinen Teilchen, die in das Streuvolumen einer Strömungszelle eindringen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt eine Vorrichtung zur Erzeugung von Signalen, von denen das Durchschnittsmolekulargewicht von Teilchen in Lösung berechnet werden kann. Diese Vorrichtung umfaßt:
Einrichtungen zur Erzeugung von Licht zum Anstrahlen der Teilchen in Lösung mit monochromatischem Licht und umfassend eine Lichtquelle aus einer Lichtbogenlampe oder einer Wolframlampe;
Einrichtungen zur Messung der Intensität des Lichts, das von den Teilchen gestreut wurde bei einem ausgewählten Winkel zwischen 35º und 145º, wahlweise etwa 90º, wobei die Streulichtintensität gemessen wird relativ zu der auf die Teilchen einfallende Lichtintensität und zur Ausgabe eines Signals, das die relative Streulichtintensität angibt; und
Einrichtungen zur Messung der Gewichtskonzentration der Teilchen in Lösung und zur Ausgabe eines Signals, das diese anzeigt.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Durch schnittsmolekulargewichts von Teilchen in Lösung, umfassend
die Verwendung einer ersten Lichtquelle aus einer Lichtbogenlampe oder einer Wolframlampe, um einfallendes Licht zu erzeugen mit einer ersten Wellenlänge, ausgewählt, um bei einem Streulichtdetektor ein maximales Ausgangssignal zu erzeugen;
das Führen des einfallenden Lichts auf eine Lösung mit den Teilchen;
Verwenden der ersten Lichtquelle oder einer zweiten Lichtquelle, um einfallende Strahlung mit einer zweiten Wellenlänge zu erzeugen, die geeignet ist, um UV-Absorption zu messen;
Führen dieser einfallenden Strahlung bei dieser zweiten Wellenlänge zu einer Lösung, die die Teilchen enthält;
Messen der Streulichtintensität bei einem ausgewählten Winkel zwischen 35º und 145º bei der ersten Wellenlänge und der Lichtintensität des einfallenden Lichts auf die Lösung bei der ersten Wellenlänge;
Messen der Intensität des Durchlichts bei der zweiten Wellenlänge, das durch die Lösung durchgelassen wurde und der Intensität des einfallenden Lichts bei der zweiten Wellenlänge, das auf die Lösung fällt;
Berechnen der Gewichtskonzentration der Teilchen unter Verwendung der Werte für die Intensität des einfallenden Lichts und des Durchlichts bei der zweiten Wellenlänge unter Verwendung einer vorbestimmten Beziehung;
Berechnen des Gewichtsmittels des Molekulargewichts der Teilchen in Lösung unter Verwendung der Werte für die Intensität des einfallenden Lichts und der Streulichtintensität bei der ersten Wellenlänge und des Wertes der berechneten Gewichtskonzentration der Teilchen unter Verwendung einer vorbestimmten Beziehung, die das Gewichtsmittel des Molekulargewichts und die Streulichtintensität in Beziehung zueinander setzt.
Die Erfindung umfaßt eine Lichtbogenquelle, vorzugsweise eine Quecksilberdampflampe, einen Filter, eine Strömungszelle, eine LC-Säule, einen UV-Detektor, einen Großwinkelstreulicht-Detektor, einen einfallenden Lichtdetektor und einen Computer zur Berrechnung des Molekulargewichts bezogen auf Signale vom UV-Detektor und vom Streulichtdetektor. Licht von der Lichtbogenquelle wird gefiltert zum Durchlassen einer Frequenz, vorzugsweise einer Frequenz mit keiner Analytenabsorbierung oder Fluoreszenz, und in der Bande, in der das Produkt der Intensität gegen die Kurve der Wellenlängeneigenschaften der Lichtquelle und die Wirksamkeit gegen die Kurve der Wellen längeneigenschaften des Detektors bei oder nahe am Maximum liegt. Dieses monochromatische Licht ist gegebenenfalls polarisiert, um alle außer der vertikalen Polarisation auszuschließen. Ein optisches System fokussiert dann vorzugsweise das gefilterte, polarisierte Licht, um die Lichtbogenlampe innerhalb der Grenzen des Einlaßfensters der Strömungszelle widerzuspiegeln. Der einfallende Lichtdetektor erkennt vorzugsweise die Intensität des auf das Strömungszellen-Einlaßfenster einfallenden Lichts.
Der Ausgangsstrom der LC-Säule mit biologischen Proteinen aus der Probe wird durch das Streuvolumen der Strömungszelle, verbunden mit dem Streulichtdetektor, durchgeführt. Die Intensität des Lichts wird dann von dem Streulichtdetektor gemessen, wobei eine Streuung in jedem Winkel zwischen 35º und 145º, vorzugsweise 90º, verwendet werden kann zur Vereinfachung der Konstruktion.
Der UV-Detektor hat seine eigene Strömungszelle, durch die der Austrittsstrom von der LC-Säule austritt. Der UV-Detektor erkennt den Grad der Absorption der UV-Strahlung durch die aus der LC-Säule austretenden biologischen Teilchen (oder andere Moleküle), wenn sie durch die Strömungszelle des UV-Detektors hindurchtreten. Diese UV-Absorptionsmessung wird üblicherweise bei einer Wellenlänge von 280 nm durchgeführt. Sie kann aber ebenso bei kürzeren Wellenlängen, wie etwa 200 bis 214 nm durchgeführt werden, da nicht alle Proteine bei 280 nm absorbieren, aber im wesentlichen alle Proteine von Interesse bei 200 bis 214 nm absorbieren. Die Absorption bei 280 nm ist charakteristisch für die Proteinkonzentration und kann zur Berechnung der Gewichtskonzentration der streuenden Teilchen im LC-Austrittsstrom verwendet werden. Jeder Detektor, der ein Signal oder Daten proportional zur Gewichtskonzentration bereitstellt, kann für diesen Zweck verwendet werden, z.B. ein Brechungsindexdetektor. Diese Konzentrationserkennung kann oberhalb der Strömungszelle für den Streumeßlichtdetektor oder unterhalb davon durchgeführt werden, aber die Daten des UV-Detektors müssen zeitlich mit den Daten vom Streulichtdetektor in Übereinstimmung gebracht werden aufgrund der physikalischen Verzögerung, hervorgerufen durch die Durchlaufzeit zwischen den beiden Detektoren. Das erlaubt die Anpassung der Gewichtskonzentrationsdaten, stammend von den UV-Detektordaten mit den Streulichtintensitätsdaten, wobei dem Computer gestattet wird, das Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw der Streuung erzeugenden Teilchen, wie sie aus der LC-Säule eluieren, korrekt zu berechnen. Diese Berechnung wird mittels der nachstehenden Gleichung (3) durchgeführt, die eine vereinfachte, von der Gleichung (1) abgeleitete Version ist.
wobei
Is/I&sub0; = die Intensität des mit einem großen Winkel gestreuten Lichts bei einigen Winkeln zwischen 35º und 145º relativ zur Intensität I&sub0; des Lichts, einfallend auf die Strömungszelle (dieses Verhältnis schließt Hintergrund, hervorgerufen durch Variationen in der Ausgangsintensität der Lichtquelle aus);
C = die Gewichtskonzentration;
Mw = das Gewichtsmittel des Molekulargewichts der streuenden Teilchen in dem Bereich des Ausgangsstrahls, für den die Gewichtskonzentration C berechnet wurde; und
B = eine optische Konstante, die für jedes System unterschiedlich ist und die entweder empirisch mittels verschiedener unterschiedlicher Arten von Teilchen mit bekanntem Gewichtsmittel des Molekulargewichts gemessen wird oder absolut mittels einer Lösung bekannter Streufähigkeit, wie Toluol.
Eine alternative Vorrichtung gemäß der Erfindung verwendet eine Einzelströmungszelle mit zwei Ausgangsfenstern. Es wird eine einzelne Lichtquelle verwendet. Die fokussierenden Optiken und Streulichtdetektoren können wie in der vorstehend beschriebenen Ausführungsform strukturiert sein. Die Gewichtskonzentrationsdaten werden unter Verwendung eines UV-Detektors, eines Monochromators und eines zweiten Ausgangsfensters in der Strömungszelle und zwei unterschiedlicher Filter vor den zwei Detektoren bestimmt. Der Monochromator, d.h. ein einstellbarer Filter, der auch Oberwellen durchläßt, wird abgestimmt zur Filterung von Licht von der Lichtbogenquelle, um eine Wellenlänge, geeignet zur Messung der UV-Absorption, im allgemeinen bei 280 nm (oder 200 bis 214 nm, abhängig vom Protein) und eine zweite Wellenlänge bei etwa 560 nm durchzulassen, von denen eine die fundamentale und die andere die Oberwelle zweiter Ordung ist. Die 280 nm Wellenlänge wird bei einer geringeren Intensität durchgelas sen. Nicht alle Proteine absorbieren bei 280 nm, so daß es notwendig sein kann, daß der Monochromator so eingestellt werden muß, daß er 200-214 nm durchläßt, wo praktisch alle Proteine absorbieren. Die Wellenlängen 400-428 nm streuen ebenfalls gut. Ein anderer Vorteil der Verwendung einer Lichtbogenlampe im Gegensatz zu einem Laser besteht darin, daß die einfallenden Lichtfrequenzen leichter eingestellt werden können. Diese Wellenlängen treten in die Strömungszelle ein und die Mehrzahl der einfallenden Energie fließt durch die Strömungszelle hindurch, ohne gestreut zu werden. Die direkte Durchflußenergie tritt aus einem Fenster genau gegenüber dem Einlaßfenster aus und wird von einem Filter gefiltert, der alles bis auf das 280 nm Licht filtert. Dieses Licht wird dann von einem UV-PMT erkannt, und das erhaltene Signal wird digitalisiert, von der Intensität des einfallenden Lichts abgezogen und zur Berechnung der Gewichtskonzentration verwendet.
Eine kleine Fraktion des einfallenden Lichts wird bei großen Winkeln zwischen 35º und 145º gestreut. In der bevorzugten Ausführungsform wird das bei etwa 90º gestreute Licht über einen Lichtweg geführt, beinhaltend einen Filter, der nur das 560 nm Licht durchläßt. Dieses Licht wird von einem Streulichtdetektor erkannt. Die einfallende Lichtintensität wird auch an der Eingangsstelle der Strömungszelle erkannt. Diese einfallende Lichtintensität wird zur Verhältnisbestimmung mit der Streulichtintensität verwendet, um Hintergrund auszuschließen, hervorgerufen durch Veränderungen in der Intensität des in die Strömungszelle eintretenden Lichts. Es wird ebenfalls verwendet, um die durchfließende Lichtintensität zu normieren, um jeden Hintergrund auszuschließen, der darin durch Variationen in der Ausgangsintensität der Lichtquelle erzeugt wurde. Die normierte Streulichtintensität und die Gewichtskonzentration werden dann verwendet, um das Durchschnittsmolekulargewicht zu berechnen. Diese Vorrichtung eliminiert eine Hintergrundquelle, hervorgerufen durch die Verwendung von zwei Strömungszellen und zwei Lichtquellen, deren Ausgangsintensität in einer anderen als einer synchronisierten Form variieren kann.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren umfaßt das Filtern von starkem einfallenden Licht, um nur eine erste Wellenlänge, geeignet zur Messung der Gewichtskonzentration, und eine zweite Wellenlänge in der Bande der größten Empfindlichkeit eines Streulichtdetektors zu belassen. Üblicherweise gibt es eine Funktion der erzeugten Lichtintensität bei verschiedenen Wellenlängen fur die Quelle und eine Ausgangssignalgröße gegen die Wellenlänge für den Detektor. Vorzugsweise wird die einfallende Wellenlänge in einem Bereich des Spektrums ausgewählt, in dem das Produkt dieser beiden Funktionen maximal ist. Eine Probe von biologischen Proteinen oder anderen sehr kleinen Teilchen wird dann durch eine Trennvorrichtung geführt, und der Strom der getrennten Teilchen wird durch einen transparenten Bereich, vorzugsweise eine Strömungszelle geführt. Die Intensität des Lichts, durchgeleitet durch den transparenten Bereich oder eine Strömungszelle ohne Streuung bei einer geeigneten Wellenlänge zur Messung der Gewichtskonzentration, wird dann mittels einer bekannten Beziehung erkannt und die Gewichtskonzentration berechnet. Ebenfalls wird die Intensität von Licht bei einer zweiten Wellenlänge mit großen Winkeln im Bereich von 35º bis 145º, vorzugsweise nahe 90º für die Vereinfachung der Konstruktion, gemessen. Die Intensität des Lichts, das auf die Strömungszelle einfällt, wird ebenfalls an der Einlaßlichtstelle der Strömungszelle für Hintergrund- Streichungszwecke gemessen, d.h. um die Intensitäten des Streulichts und des durchfließenden Lichts zu normieren. Die Streulichtintensität und die Gewichtskonzentrationen werden dann verwendet, um das Durchschnittsmolekulargewicht der Teilchen zu berechnen, die das Streulicht hervorrufen, mittels einer zuvor bestimmten Beziehung, wie der vorstehenden Gleichung (3).
Eine anderes erfindungsgemäßes Verfahren umfaßt die Trennung der kleinen Teilchen von Interesse (kleiner als λ/4) nach bekannten Methoden, wie Flüssigchromatographie oder Kapillarelektrophorese, Durchlassen eines Stroms der getrennten Teilchen durch eine transparente Zone, vorzugsweise eine Strömungszelle, und Messen jeder optischen Eigenschaft, die verwendet werden kann, um die Gewichtskonzentration der Teilchen zu berechnen und die Berechnung der Gewichtskonzentration, das Durchführen des Stroms durch eine zweite Strömungszelle und Anstrahlen des Stroms mit starkem Licht bei einer bekannten Wellenlänge λ, Messen der Intensität des Lichts, einfallend auf den Strom und Messen des Lichts, gestreut bei irgendeinem Winkel zwischen 35º und 145º, und Berechnen des Gewichtsmittels des Molekulargewichts in einem Computer mittels der vorstehenden Gleichung (3) und der Gewichtskonzentration und der Streulichtintensität, normiert zur einfallenden Lichtintensität oder einfach Auslassen der Streulicht- und einfallenden Lichtintensitäten, als verschiedene Signale oder einem Verhältnis, so daß die Berechnung manuell durchgeführt werden kann. In einer alternativen Ausführungsform dieses Verfahrens kann eine einzelne Strömungszelle und eine einzelne Lichtquelle, gefiltert zum Durchlassen von zwei Wellenlängen, verwendet werden. Eine Wellenlänge wäre geeignet zum Messen der UV-Absorption von Licht, durchgelassen durch den Strom zur Berechnung der Gewichtskonzentration. Die andere Wellenlänge wäre geeignet zur Messung von Streulicht, so daß das Gewichtsmittel des Molekulargewichts berechnet werden könnte mittels der relativen Streulichtintensität (normiert zur einfallen den Lichtintensität) und der berechneten Gewichtskonzentration. Dieses Verfahren schließt eine Extraquelle für Hintergrund aus, die sich ergibt, wenn zwei Hintergrunderzeugende Lichtquellen verwendet werden, in denen die Variationen der Ausgangslichtintensität der zwei verschiedenen Quellen nicht zusammengeführt wurden.
Ein anderes Verfahren und eine andere Vorrichtung zur Durchführung der Erfindung für große Teilchen, von denen einige Eigenschaften zuvor bekannt waren, besteht darin, alle zuvor beschriebenen Messungen auszuführen. Danach wird die Beziehung zwischen dem Durchschnittsmolekulargewicht und dem Trägheitsradius in einem Handbuch bekannter Eigenschaften nachgesehen. Es existieren viele solcher Tabellen. Natürlich muß man von den Teilchen verschiedene Dinge wissen und speziell die Kriterien, auf denen die Tabellen aufbauen, wie ihre Größe, Gestalt, das Lösungsmittel, usw. Die Tabellen geben Mw im allgemeinen als dRgx, wobei x eine Potenz ist und ein Dichtefaktor d in der Tabelle gegeben ist. Die Gleichung, in der Rg auf Mw bezogen ist, wird dann umgeschrieben, um Mw als Rg² auszudrücken, und das Ergebnis wird für Rg² in nachstehende Gleichung (15) eingesetzt. Diese umgeschriebene Gleichung (15) wird dann in nachste hende Gleichung (11) eingesetzt für P(Θ), um eine quadratische Gleichung, definierend eine Beziehung zwischen dem Lichtstreuungspotential R und dem Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw zu definieren. Diese Beziehung (Gleichung (11) wie umgeschrieben) wird dann für Mw gelöst, unter Verwendung des gemessenen Wertes für normierte Streulichtintensität Is/I&sub0; und entweder Weglassen der Virialkoeffizienten, falls möglich, oder unter Verwendung der gemessenen Werte für diese Koeffizienten. Das geht mit jeder Größe von Partikeln, von denen eine ausreichende Menge an Informationen bekannt ist, so daß die richtige Tabelle und die richtigen Kriterien a priori ausgesucht werden. Natürlich, wenn die Virialkoeffizienten in Gleichung (11) nicht vernachläßigbar sind für große Teilchen, müssen diese zur Lösung für Mw gemessen und in Gleichung (11) verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist ein Blockdiagramm eines üblichen bekannten Flachwinkelstreulicht-Detek tors.
Figur 2 ist eine Draufsicht der Maske 28 in Figur 1.
Figur 3 ist ein Diagramm der Streulichintensität gegen Winkel für kleine Teilchen.
Figur 4 ist ein Diagramm der Streulichtintensität gegen Winkel für große Teilchen.
Figur 5 ist ein Blockdiagramm einer erfindungsgemäßen Ausführungsform eines Großwinkelstreulicht-Detektors mit der Fähigkeit der Berechnung des Durchschnittsmolekulargewichts.
Figur 6 ist eine Draufsicht eines Strömungseinlaßfensters.
Figur 7 ist ein Fließschema eines üblichen Programms zur Kontrolle des Computers in Figur 5 zur Berechnung des Durchschnittsmolekulargewichts der streuenden Teilchen.
Figur 8 ist ein Schaubild eines üblichen experimentellen Ergebnisses, das darstellt, wie die optische Konstante B in Gleichung (3) experimentell für einen bestimmten Großwinkelstreulicht-Detektor bestimmt wird.
Figur 9 ist ein Blockdiagramm einer anderen Ausführung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, die zeigt, wie die Gewichtskonzentration und Streulichtdetektoren eine Strömungszelle teilen können.
Figur 10 ist ein Diagramm für eine Ausführungsform, die zur Trennung von Teilchen die Kapillarzonenelektrophorese verwendet.
Figur 11 ist ein Diagramm einer Ausführungsform, die eine einzelne Lichtquelle, eine einzelne Strömungszelle und einen einzelnen Monochromator verwendet.
Figur 12 ist ein Diagramm einer Ausführungsform, die eine einzelne Lichtquelle und Strömungszelle, aber zwei Monochromatoren verwendet.
Figur 13 ist ein Diagramm eines Verfahrens zur Bestimmung des Gewichtsmittels des Molekulargewichts unter Verwendung von zwei Strömungszellen und zwei Lichtquellen.
Figur 14 ist ein Diagramm des Verfahrens zur Bestimmung des Gewichtsmittels des Molekulargewichts unter Verwendung einer einzelnen Lichtquelle und einer einzelnen Strömungszelle.

Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Figur 5 zeigt ein Blockdiagramm einer erfindungsgemäßen Ausführungsform Figur 5 beschreibt nur eine mögliche Art einer Klasse von Systemen, die das Durchschnittsmolekulargewicht von biologischen Proteinen und anderen kleinen Teilchen berechnen, die eine Größe, sehr viel kleiner als die Wellenlänge des Streulichts besitzen. Eine übliche Anwendung besteht darin, LC-Chromatogramme zu analysieren oder Sammlungsausrüstung (nicht gezeigt) zu kontrollieren, die an den Stromausgang 50 von einer LC- Trennsäule 52 gekoppelt sind, so daß Teilchen in dem Strom von bestimmten Molekulargewichten in verschiedenen Behältern gesammelt werden. Das System eignet sich auch für weitere Anwendungen neben der Anwendung bei der Flüssigchromatographie. Zum Beispiel kann das System von Figur 5 und allen anderen hier beschriebenen Ausführungsformen das Molekulargewicht von kleinen Teilchen in einer statischen Lösung bestimmen.
In Figur 5 pumpt eine Pumpe 54 eine Probe, enthaltend eine Mischung von biologischen Proteinen oder anderen ähnlich großen Teilchen, von einem Behälter oder einer anderen Quelle 56. Die Probe wird durch die Flüssigchromatographiesäule 52 gepumpt und aufgrund einiger Kriterien, wie der Größe, getrennt. Die verschieden großen Teilchen eluieren dann zu verschiedenen Zeiten von der LC-Säule, aufgenommen in einem Lösungsmittelstrom am Ausgang 50.
Um das Durchschnittsmolekulargewicht der Proteine zu berechnen, die zu einer bestimmten Zeit eluieren, ist es notwendig, die Gewichtskonzentration von diesen Proteinen in dem Lösungsmittlestrom zu kennen. Das kann durch eine Studie der vorstehenden Gleichung (1) überprüft werden. Dazu wird ein Standard-Ultraviolett-Absorptions detektor 58 an den Ausgangsstrom 58 gekoppelt. Es kann jedoch auch jede andere Art von Detektor verwendet werden zur Erzeugung eines Ausgangssignals, von dem die Gewichtskonzentration hergeleitet werden kann. Beispiele für solche andere Arten von Detektoren sind Brechungsindexdetektoren.
Üblicherweise wird der UV-Detektor 58 eine Strömungszelle enthalten, durch die die Proteine enthaltenden Lösung fließt, ferner eine UV-Quelle, einen einfallenden UV- Intensitätsdetektor, einen durchfließenden UV-Intensitätsdetektor und andere filternde und/oder drosselnde und optische Strukturen, um das Verhältnis von Signal zu Hintergrund zu erhöhen. Eine Strömungszelle umfaßt im wesentlichen einen Kanal durch einen Glas- oder Quarzblock mit einem Einlaßfenster, um der Strahlung zu erlauben, eine durch den Kanal strömende Flüssigkeit anzustrahlen, und mindestens ein Ausgangsfenster, das erlaubt, gestreutes oder durchgeleitetes Licht zu verlassen. Die Art und Weise, in der die Gewichtskonzentration bestimmt wird, ist nicht kritisch für die Erfindung. Es kann jedes Verfahren oder jede Vorrichtung, die diese Bestimmung durchführen kann, ist ausreichend für die Ausführung dieser Erfindung verwendet werden.
Der UV-Detektor 58 gibt ein analoges Signal auf die Linie 60, das entweder gleich oder proportional zur Gewichtskonzentration ist. Dieses Signal wird zu einem digitalen Signal durch einen Analog-zu-Digital-Umwandler 62 umgewandelt und wird in eine zentrale Prozessoreinheit (CPU) 64 eingegeben.
Der Lösungsstrom, der den UV-Detektor 58 verläßt, durchquert dann einen Kanal 66 und tritt in eine Strömungszelle 68 ein (gezeigt in Draufsicht), verbunden mit einem klassischen Großwinkelstreulichtdetektor 70, ähnlich der Struktur von Lichtdetektoren in Fluorometern. Der Detektor 70 umfaßt die Strömungszelle 68, die optisch mit einer Lichtquelle 72, um einfallendes Licht I&sub0; zu empfangen, und mit einem Streulichdetektor 74 gekoppelt ist, der so gelegen ist, daß er die Intensität von Licht Is, gestreut im rechten Winkel zum einfallenden Licht I&sub0; abtastet. Vorzugsweise ist die Lichtquelle 72 eine Quecksilberdampflampe, wie die 100 Watt Osram HBO 100 W/2 Bogenlampe. Die Lichtquelle emittiert viele verschiedene Wellenlängen, aber aus einer Studie der Gleichungen (1) und (2) ist zu entnehmen, daß eine einzelne bekannte Wellenlänge verwendet werden muß, um mathematisch zum Molekulargewicht zu kommen. Jede von zwei Wellenlangen ist bevorzugt. Diese sind 436,1 nm (grüne Farbe) oder 546,1 nm (grün-gelb). Diese beiden Wellenlängen liegen im Bereich der größten Empfindlichkeit und des geringsten Dunkelstromrauschens für den Streulichtdetektor 74. Vorzugsweise ist dieser Streulichtdetektor eine Photomultiplier (PMT), optimiert für den blau-grünen Bereich.
Eine alternative Ausführungsform der Lichtquelle könnte eine Xenonlampe oder eine Wolframlampe sein, aber eine Quecksilberdampflampe ist bevorzugt, aufgrund ihrer höheren Intensität. Höhere Intensität des einfallenden Lichts I&sub0;, auftreffend auf die Proteine in der Lösung, die durch die Strömungszelle fließen, ergibt eine größere Intensität für das großwinkelgestreute Licht (wie auch größere Gewichtskonzentration C für die Proteine in der Lösung). Da nur eine winzige Fraktion des einfallenden Lichts gestreut wird, ergeben höhere Intensitäten für das einfallende Licht aufgrund der höheren Intensität des gestreuten Lichts ein besseres Verhältnls von Signal zu Hintergrund. Der Ausgang einer Quecksilberdampflampe des vorgeschlagenen Typs beträgt ungefähr 20 Milliwatt. Xenonlampen ergeben üblicherweise nur über ein Achtel der Intensität des Ausgangslichts einer Quecksilberdampflampe, so daß die Verwendung einer Xenonlampe nicht optimal ist.
Die Lichtquelle 72 erzeugt Licht, das gefiltert werden muß, um Licht aller Frequenzen bis auf eine auszuschließen. Filter 76 erfüllt diese Funktion. In einer alternativen Ausführungsform kann ein einstellbarer Filter, wie ein Monochromator, verwendet werden, aber diese Einrichtungen sind teurer und voluminöser als notwendig. Ein preiswerterer monochromatischer Filter im blau-grünen Bereich ist bevorzugt, wenn ein blau-grün optimiertes PMT als Detektor 74 verwendet wird.
Das gefilterte Licht wird dann durch Optiken 78 auf ein Einlaßfenster 80 der Strömungszelle fokussiert. Im allgemeinen ist das Einlaßfenster von rechtwinkliger Form und ist von schwarzem Glas oder mit einer schwarzen Schicht beschichtetem Glas umgeben. Figur 6 ist eine Draufsicht des Einlaßfensters einer Strömungszelle. Das Einlaßfenster 80 ist an mindestens zwei Seiten von schwarzem oder schwarz beschichtetem Glas 82 und 84 umgeben. Die Optiken 78 fokussieren das Bild der Bogenlampe innerhalb der Begrenzungen des Einlaßfensters 80, um Streulicht zu minimieren.
Die interessierenden Proteine oder Teilchen 85 treten in die Strömungszelle aus Kanal 66 ein und fließen durch ein Streuvolumen 86 nach unten durch, das einfallendem Licht I&sub0; durch das Einlaßfenster 80 ausgesetzt ist.
Im allgemeinen muß große Sorgfalt aufgewendet werden, um jedes einfallende Licht von der Lichtquelle vom Auftreffen auf das PMT 74 abzuhalten und als gestreutes Licht von den Proteinen 85 aus dem Streuvolumen erkannt zu werden. Das bedeutet, daß ein durchkreuzender und sorgfältig kontrollierter Lichtweg (nicht gezeigt) oder Lichtleiter (alle des Standard-Fluorometer-Typ-Designs) verwendet wird, um Streuung zu minimieren. Die schwarzen Glasteile der Strömungszelle helfen ebenfalls, daß an Luft-Glas oder Glas-Lösungsmittel-Grenzflächen Streulicht daran gehindert wird, intern reflektiert zu werden und die Strömungszelle in der allgemeinen Richtung der PMT 74 zu verlassen, in der es als Hintergrundrauschen erkannt werden würde. Die schwarzen Glasteile der Strömungszelle sind in den Figuren 5 und 6 als schraffierter Bereich gezeigt. Zur Unterstützung der Verhinderung von Streuung können Lichtleiter in den Lichtwegen von der Lichtquelle 72 zu dem Einlaßfenster 80 und von einem Streulicht-Ausgangsfenster 90 zum PMT 74 verwendet werden. In diesen Ausführungsformen wird ein Indexanpassungszement verwendet, um die Lichtschalter mit den Einlaß- und Ausgangsfenstern zu verbinden, um Streulicht und/oder gebrochenes Licht an den Grenzflächen zu minimieren, an denen der Brechungsindex sich vom Index der Lichtleitfaser zum Index des Glases der Strömungszelle ändert.
Die Proteine 85 streuen das einfallende Licht I&sub0;, basierend auf ihrem Molekulargewicht (klassische Raleigh-Streuung). Ein geringer Teil dieses Lichts streut mit hohen Winkeln und tritt aus dem Ausgangsfenster 90 als Streulicht Is aus. Dieses Licht wird vom PMT 74 erkannt und ein Ausgangssignal, proportional zu seiner Intensität, wird auf Linie 94 ausgegeben. Außerdem gibt der Streulichtdetektor 70 ebenfalls ein Signal aus, das proportional zur Intensität des einfallenden Lichts I&sub0; auf Linie 96 ist. In einigen Ausführungsformen wird ein Einzelausgangssignal gleich zu Is/I&sub0; ausgegeben. Vorzugsweise wird die Intensität I&sub0; des einfallenden Lichts durch einen Detektor (nicht gezeigt) erkannt, der optisch so gekoppelt ist, um Licht zu "sehen", wenn es in das Einlaßfenster eindringt. Das kann z.B. durchgefuhrt werden unter Verwendung eines Strahlteilers (nicht gezeigt) in dem Lichtweg vom Filter zum Einlaßfenster, um einen Teil des einfallenden Lichts auf einen I&sub0;-Detektor (ebenfalls nicht gezeigt) zu reflektieren. Es ist bevorzugt, die Intensität I&sub0; nach dem Filtern des Lichts von der Quelle abzutasten, so daß I&sub0; ein wahrer Indikator nur des auf die zu streuenden Teilchen einfallenden Lichts ist und nicht die Gesamtintensität von allen Wellenlängen der Lichtquelle. In alternativen Ausführungsformen wird das PMT 74 gekühlt oder ist eine Photonenzähltyp-Vorrichtung.
Das Streulichtintensitätssignal Is auf Linie 94 und das einfallende Lichtintensitätssignal I&sub0; auf Linie 96 werden zu digitalen Signalen durch Analog-zu-Digital-Umwandler 98 und 100 umgewandelt.
Die CPU 64 berechnet dann das Molekulargewicht der streuenden Teilchen durch Korrelieren der Gewichtskonzentrationsdaten auf Linie 102 mit den I&sub0;- und Is-Daten auf den Linien 104 und 106. Diese Korrelation oder dieses In-Übereinstimmung-Bringen von Daten zieht die Zeitverzögerung der streuenden Teilchen, um von der Strömungszelle im UV-Detektor 58 zur Strömungszelle 68 zu wandern, in Betracht. Sind die Daten richtig korreliert, wird das Durchschnittsmolekulargewicht der streuenden Teilchen unter Verwendung der vorstehenden Gleichung (3) berechnet.
Gleichung (3) ist eine Vereinfachung der Gleichung (1) und ist wie folgt hergeleitet.
Die Beziehung zwischen der Intensität I&sub0; von zur Beleuchtung einer Probe verwendetem Licht, die Weglänge L des streuenden Volumens und die Menge an Licht It, die durch die Probe durchgeleitet wird, ist
wobei
&epsi; = der Exstinktionsindex;
C = die Konzentration der Probe;
τ = die Trübung der Probe, die eine Messung der Fähigkeit der Lösung ist, Licht zu streuen; und
l = die Weglänge des streuenden Volumens.
In Abwesenheit einer Absorption ist &epsi; = 0 und Gleichung (3) wird
Die Erhaltung von Energie erfordert, daß
(5) It = I&sub0; - Is,
d.h., daß die Intensität des durch die Lösung gehenden Lichts gleich ist zur Intensität des einfallenden Lichts minus der Intensität des Streulichts.
Da die Intensität Is des Streulichts relativ gering ist im Verhältnis zur einfallenden Lichtintensität, können (5) und (6) kombiniert und der Exponent in einer Taylor-Reihe erweitert werden und nur die ersten beiden Ausdrücke müssen aufrechterhalten werden. Das ergibt
(6) Is/I&sub0; = τl
Es ist möglich, die Trübung der Probe durch Messung von It und I&sub0; und unter Verwen dung der Gleichung (6) zu messen. Das wird eine "turbidimetrische" Messung bezeichnet. Wenn die Streulichtintensität gemessen und Gleichung (7) verwendet wird, wird das eine "nephelometrische" Messung genannt. In einer turbidimetrischen Messung muß man eine geringe Differenz zwischen zwei großen Zahlen (It und I&sub0;) messen. In nephelometrischen Messungen ist I&sub0; groß, während Is eine kleine Größe ist, aber eine, die gegen einen geringen Hintergrund gemessen wird. Nephelometrische Messungen sind deshalb üblicherweise viel empfindlicher und genauer und sind die nützlicheren der beiden Verfahren. Beide Verfahren sind Varianten der klassischen Lichtstreuungsmethode.
Üblicherweise wird die Streulichtintensität nicht bei allen Winkeln gemessen. Vielmehr wird nur eine Menge von Licht, gestreut in einigen festen Winkeln, bei einem Winkel relativ zum einfallenden Licht I&sub0; gemessen. Is und iΘ haben die folgende Beziehung
alle Winkel.
Umschreiben der Gleichung (7) unter Verwendung von Gleichung (8) ergibt
wobei
τΘ = die Fraktion der Trübung verantwortlich für das Licht gestreut im Winkel Θ.
In Analogie zum Gesetz von Beer für Absorption haben wir
wobei
C = die Gewichtskonzentration und
τΘsp die spezifische Trübung oder die "spezifische Rayleigh Konstante".
Die spezifische Trübung ist ein Wechselwirkungsquerschnitt (die Wahrscheinlichkeit, daß bestimmte Wechselwirkungen auftreten). Zur Durchführung dieser Erfindung wird die Streulichtintensität bei 90º gemessen, obwohl jeder andere Winkel ebenfalls verwendet werden könnte. Die spezifische Trübung in diesem Winkel wird mit τsp bezeichnet.
Die spezifische Trübung kann zu den molekularen Eigenschaften der Teilchen, die mit der Einfallstrahlung wechselwirken, in Beziehung gesetzt werden.
wobei die Ausdrücke wie zuvor für Gleichung (1) definiert sind, und die spezifische Trübung τΘsp proportional zu R/C oder Raleigh-Streuung geteilt durch die Gewichtskonzentration ist.
Wenn die spezifische Trübung τΘsp gemessen wurde, kann Gleichung (11) verwendet werden, um Mw zu erhalten, das Gewichtsmittel des Molekulargewichts der streuenden Teilchen. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichts der streuenden Teilchen Mw ist definiert als
wobei
Ci = die Gewichtskonzentration der i-ten Komponente der Lösung und
Mi = die Masse der i-ten Komponente der Lösung.
Die Gewichtskonzentration ist gleich der Konzentration ni mal dem Molekulargewicht
Gleichungen (12) und (13) zeigen, daß Mw schwer wiegt gegen die höheren Massen komponenten der Lösung, so daß τΘsp ebenso stark beeinflußt wird durch die massiveren Teilchen.
Die optische Konstante K in Gleichung (12) ist
wobei
n = der Brechungsindex der Lösung, in der die streuenden Teilchen enthal ten sind;
dn/dc = die Änderung des Brechungsindex der Lösung, wenn die Konzentration der Lösung geändert wird;
Na = die Avagadrosche Zahl, und
λ. = die Wellenlänge des einfallenden Lichts.
Die Abhängigkeit von K zur vierten Potenz von λ. ist gültig nur für Teilchen, deren Dimensionen geringer als λ./4 sind. Für größere Teilchen ist die Wellenlängenabhängigkeit eine komplizierte Funktion der Größe der streuenden Teilchen, aber im allgemeinen gilt, je größer das streuende Teilchen, um so kleiner ist die Potenzabhängigkeit.
P(Θ) ist ein Größenparameter, der Fachleute verwirrt hat. Für kleinere Teilchen, deren Größe kleiner ist als λ./4, ist
wobei
Rg = der Trägheitsradius der streuenden Teilchen, der im allgemeinen größenabhängig ist.
Wenn τΘsp in verschiedenen Streuwinkeln vorliegt, kann Gleichung (15) zur Bestimmung von Rg verwendet werden. Für annähernd globuläre Teilchen ist
wobei
R - der Radius der Kugel ist, der üblicherweise als Hydratationsradius oder Stoke-Radius der streuenden Teilchen angenommen werden kann.
Je kleiner der Streuwinkel Θ, um so schwacher ist die Abhängigkeit von P(Θ) zur Größe des streuenden Teilchens. Daher zeigen Flachwinkelphotometer, wie die LALL-Detektoren, keine starke Abhängigkeit der Trübung von der Größe, da sin Θ/2 etwa 0 bei kleinem Θ ist.
Es ist jedoch wichtig, daß unabhängig vom Streuwinkel Θ, P(Θ) etwa gleich 1 ist für streuende Teilchen mit einem Radius kleiner als λ./20. Ein Protein, dessen Radius λ./20 für sichtbares Licht (488 nm) ist, hat eine Masse von etwa 20 x 10&sup6; Dalton (1 Dalton ist gleich 1 Gramm pro Mol einer Substanz). Das größte Protein, das üblicherweise von biologischem Interesse ist, IgM, hat ein Molekulargewicht von 1 x 10&sup6; Dalton. Größere Proteine als dieses haben bisher keine klinische, therapeutische oder diagnostische Verwendung gefünden Daher ist für alle biologischen Proteine von Interesse P(Θ) etwa 1 bei jedem Streuwinkel, da der Trägheitsradius Rg sehr klein ist, basierend auf kleinen Größen dieser Proteine.
Man kann ebenfalls Annäherungswerte für P(Θ)&supmin;¹, basierend auf bekannten Beziehungen zwischen Mw und Rg für verschiedene Formen von Teilchen verwenden, wenn man wünscht, Großwinkelstreulichterkennung bei großen Teilchen zu verwenden. Zum Beispiel ist bekannt, daß für statistische Knäuelpolymere
(16) Mw proportional zu d Rg² ist,
wobei
d = ein Dichtefaktor, der in einem Handbuch mit Tabellen für statistische Knäuelpolymere nachgesehen werden kann.
Wenn bekannt ist, daß statistische Knäuelpolymere die einzigen Arten von Polymeren in der Strömungszelle sind, kann somit Mw/d für Rg² in Gleichung (15) substituiert werden und die umgeschriebene Gleichung (15) für P(Θ)&supmin;¹ in Gleichung (11) umgeschrieben werden, was zu einer quadratischen Gleichung führt, die Mw mit der Rayleigh-Streukonstante R oder der Trübung τΘsp in Beziehung setzt.
Für Proteine globulärer Form ist
(17) Mw proportional zu d mal Rg³.
In diesem Fall ist
das in Gleichung (11) eingesetzt und analytisch gelöst werden kann.
Weiterhin kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, die Begriffe in Gleichung (11) mit den Virialkoeffizienten aufrechtzuerhalten. Das kann durch sorgfältiges Messen von Is gegen die Konzentration C gemessen werden und Nachsehen auf kleine Abweichungen, hervorgerufen durch A&sub2;C usw. Meistens ist dies nicht notwendig.
Die vorstehende Gleichung (11) ist eine Potenzreihenentwicklung in Gewichtskonzentration mit Koeffizienten, die die Stärke der Intrateilchen-Wechselwirkungen widerspiegeln. Der Koeffizient erster Ordnung A&sub2; ist bekannt als der zweite Virialkoeffizient und ist proportional zum Volumen des streuenden Teilchens, innerhalb das kein anderes Teilchen eindringen kann, nämlich das ausgeschlossene Volumen. Für starke Lösungsmittel ist A&sub2; klein aber positiv. Nimmt die Lösungsmittelstärke ab, nähert sich A&sub2; Null und wird negativ, wenn die Teilchen beginnen, wechselzuwirken, d.h. zu aggregieren. Für die meisten Proteine in "physiologischen" Puffern (d.h. größer als 10 mm Salz und pH von etwa 7) ist A&sub2; etwa Null oder gering negativ. Infolge der relativ niedrigen Löslichkeit der meisten Proteine sind die Konzentrationen, bei denen Ausdrücke höherer Ordnung signifikant werden, unerreichbar während der Chromatographie. Für solche Teilchen oder Proteine, wie Proleukin IL-2 (eine Mischung von Proteinen und einem Tensid), muß der Ausdruck der ersten Ordnung von Gleichung (11) einbezogen werden. Jedoch, für die meisten biologischen Proteine kann jedoch Gleichung (11) vereinfacht werden zu
(19) τθ sp = KMw
Durch Ersetzen der Gleichung (10) für τΘsp kann Gleichung (19) umgeschrieben werden in Form von vorstehender Gleichung (2), die verwendet wird von der CPU 64, um das Gewichtsmittel des Molekulargewichts Mw der streuenden Teilchen zu berechnen. Der Wert von B variiert von einer Ausführungsform der Erfindung zu einer anderen, kann aber einfach gemessen werden für ein spezifisches System unter Verwendung von Toluol, um das System zu kalibrieren, da Toluol eine bekannte Trübung besitzt.
Jede Schaltung oder Vorrichtung, die die Berechnung von Gleichung (3) ausführen kann, ist ausreichend für die Durchführung der Erfindung. Tatsächlich können in den breiteren Aspekten entsprechend der Lehre der Erfindung die CPU 64 oder andere Berechnungsvorrichtungen weggelassen werden, da das Molekulargewicht Mw einfach von Hand berechnet werden kann aus der Streulichtintensität und der Konzentration.
In Figur 7 ist ein Flußdiagramm für ein übliches Programm zur Kontrolle der CPU 64 von Figur 5 gezeigt, um das Durchschnittsmolekulargewicht Mw der streuenden Teilchen in der Strömungszelle 68 zu berechnen. Ein übliches Programm zur Kontrolle der CPU 64 sammelt die Streulichtintensität und Konzentrations-C-Signale jede Sekunde, berechnet das Durchschnittsmolekulargewicht der Teilchen, was zu Daten von der zuletzt vorkommenden Probe oder einem beweglichen Durchschnitt der Probe führt, und gibt das Ergebnis aus. Ublicherweise ist das Programm zur Berechnung des Molekulargewichts eine Subroutine, die jede Sekunde von einem Hauptregelkreis nach Zeitabgabe eines internen Timers abgerufen wird. Jedoch kann das Programm auch als ein Hauptkreis strukturiert sein, der während jeder Probenperiode läuft.
Die Probenperiode hängt ab von der gewünschten Auflösung, gewünscht zur Lösung von Chromatogrammdaten, d.h. wieviele Peaks über ein Ein-Minuten-Intervall erwartet werden und wieviele Proben pro Peak gewünscht sind. Sie hängt auch von der Menge des Speichers und/oder der Festplattenkapazität ab, verfügbar für die CPU 64 zur Speicherung der Daten.
Der erste Schritt des Verfahrens ist symbolisiert durch Block 130. In diesem Schritt aktiviert die CPU den A/D-Konverter 62, um ihn dazu zu veranlassen, das analoge Signal auf Linie 60 zu einem digitalen Signal auf Linie 102 umzuwandeln, repräsentierend die Gewichtskonzentration C. Diese Daten werden dann gespeichert.
Als nächstes werden in Schritt 132 die A/Ds 98 und 100 aktiviert, um die analogen einfallenden Lichtsignale I&sub0; und die Streulichtsignale Is zu digitalen Daten umzuwandeln. Diese Daten werden dann gespeichert.
Schritt 134 repräsentiert das Verfahren der Normierung der Intensität des gestreuten Lichts Is zur Intensität des einfallenden Lichts 10. Das ist im wesentlichen der Prozeß der Teilung von Is durch I&sub0;, so daß jede Variation in der Intensität von I&sub0;, hervorgerufen durch Hintergrund, der dann zu Hintergrund in dem Streulicht Is übersetzt wird, ausgeschlossen ist.
Schritt 136 repräsentiert das Verfahren der Berechnung des Durchschnittsmolekulargewichts der streuenden Teilchen unter Verwendung der Gleichung (3) durch Teilung von Is durch das Produkt von B und C.
In Schritt 138 wird das in Schritt 136 berechnete Ergebnis ausgelassen und kann verwendet werden zum Anzeigen oder zur Kontrolle einer Sortierentscheidungsvorrichtung usw.
Der Entscheidungsschritt 140 und seine zwei Verzweigungen sind symbolisch für jeden Prozeß, der die Sammelrate kontrolliert.
In Figur 8 ist eine graphische Darstellung der Streulichtintensität gegen ein bekanntes Molekulargewicht gezeigt, das für die experimentelle Bestimmung des Wertes für B für ein bestimmtes optisches System nützlich ist. Um B zu bestimmen, werden biologische Proteine oder andere kleine Teilchen mit bekanntem Durchschnittsmolekulargewicht durch die Strömungszelle in einer bekannten Konzentration geleitet. Die Streulichtintensität wird dann für jedes Protein gemessen und als Is/C bei dem Wert des bekannten Durchschnittsmolekulargewichts aufgetragen. Das ist in Figur 8 für IgG und IgM mit bekannten Molekulargewichten durchgeführt worden. Die resultierende lineare Funktion definiert inhärent den Wert für B für das bestimmte optische System.
Die Strömungszelle in Figur 6 hat üblicherweise ein Volumen von 10 µl, eine Weglänge von 10 mm und kann aus weniger teurem Glas, z.B. BK7, hergestellt werden. Die teuren Quarzströmungszellen, üblicherweise verwendet in Fluorometem, müssen nicht verwendet werden, da in diesen fluorometrischen Vorrichtungen Quarz verwendet werden muß, um kurzwelliges Licht (200-280 nm) einzulassen, das für die Anregung von Fluoreszenz gebraucht wird. Üblicherweise schneidet BK7-artiges Glas Strahlung mit einer Wellenlänge kürzer als etwa 320 nm ab, so daß diese Glasart nicht in einem fluorometrischen Lichtdetektor verwendet werden kann.
Ein Überziehen der Ausgangsfenster- und Einlaßfensteröffnungen der Strömungszelle mit einer Indexanpassung MgF&sub2; oder einem vielschichtigen dielektrischen Antireflektionsüberzug würde das Signal verstärken und den Hintergrund oder das Streulicht beträchtlich vermindem. Das erzeugt eine bessere Übereinstimmung des Brechungsindex an der Luft-Glas-Grenzfläche, was Brechungskrümmung vermindert, die falsches Streulicht erzeugen kann.
Für die anspruchvollsten Anwendungen besteht die Strömungszelle 68 aus dem bekannten "Squeeze"-Aufbau, mit den antireflektionsbeschichteten inneren Flächen für die Glas-Wasser- oder Glas-Lösungsmittel-Grenzflächen. Solche Strömungszellen werden unter Verwendung von zwei flachen Platten aus Glas hergestellt, von denen jede eine Oberfläche, beschichtet durch chemische Bedampfüng mit einem geeigneten Antireflektionsbezug ist. Die beiden Platten werden dann zusammen "gesqueezed" (d.h. übereinandergelegt) mit einem Abdichtungsdistanzstück dazwischen, um die Zelle nach einem bekannten Verfahren zu bilden. Das Distanzstück hat ein darin gebildetes Einlaßloch und Ausgangsloch, um einen Durchfluß durch die Zelle zu ermöglichen. Da die meisten Lösungsmittel für Biopolymere, die überlicherweise für HPLC verwendet werden, z.B. Wasser, Acetonitril, Methanol, etwa den gleichen Brechungsindex besitzen, reduziert diese Beschichtung der innenliegenden Oberflächen der Zelle mit einem Index-Anpassungs-Material erheblich das Streulicht, das an den Grenzflächen gestreut wird.
Größere Bogenlichtquellen 72 können ebenfalls verwendet werden, wenn sie in einen Strichfokus innerhalb der Begrenzung des Einlaßfensters gebracht werden. Wird dies nicht gemacht, erhöht sich das Streulicht, welches größtenteils verantwortlich für das Hintergrundrauschen ist, welches eines der Probleme ist, das die Sensitivitat solch eines Detektors erniedrigt.
In der bevorzugten Ausführungsform ist der Filter 72 (und der Filter 142, falls verwendet) vorzugsweise ein Hg Strich-Interferenzfilter, weniger bevorzugt ein Monochromator, da dieser den Aufbau preiswerter und kleiner macht. Außerdem kann Filter 76 mit einem vertikalen Polarisierer verwendet werden, symbolisiert durch die gestrichelte Box 144. Nur vertikal polarisiertes Licht kann streuen. Horizontales Licht streut nicht Raleigh-gemäß, so daß Licht, falls es die Strömungszelle erreicht, Streulicht werden kann und zum Hintergrundrauschen beiträgt.
Standard-HPLC-Datensysteme, wie sie von P.E. Nelson hergestellt werden, können modifiziert werden, um die einfache mathematische Funktion von Gleichung (3) einzuschließen. Alternativ können sie modifiziert werden, um die kompliziertere Gleichung (11) in einigen Ausführungsformen oder Varianten für größere Partikel einzuschließen, von denen einiges vorher bekannt ist, und zu sammeln und Daten zu speichern und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts zu berechnen.
Das extrem kleine Volumen der Strömungszelle ist gewünscht, da es die Gestalt der Peaks besser beibehält. Wenn ein sehr schmaler Peak von einer LC-Säule eluiert und zu einer Strömungszelle über einen Mikrobarkanal geleitet wird, breitet sich der Peak durch Mischen mit den Inhalten der Strömungszelle aus, falls das Streuvolumen der Strömungszelle groß ist. Wird das Streuvolumen klein gehalten, minimiert dies das Ausbreitungsproblem.
In einigen Ausführungsformen der Maschinengattung, symbolisiert durch die Struktur von Figur 5, wird ein zweiter Filter im Streulichtweg verwendet. Diese Ausführungsformen sind symbolisiert durch den gestrichelten Strichfilter 1423 in dem Lichtweg zwischen dem Ausgangsfenster 90 und dem PMT 74. Dieser Filter ist auf die gleiche Wellenlänge wie der Filter 76 eingestellt, so daß kein Streulicht einer anderen Wellenlänge in das PMT gelangen kann. Das ist unterschiedlich von einem Fluorometer, in dem der Filter 76 auf die Wellenlänge des Anregungslichts eingestellt ist und der Filter 142 auf die andere Wellenlänge des emittierten fluoreszierenden Lichts eingestellt ist. Einige moderne Fluorometer erlauben nicht, daß beide Filter auf dieselbe Wellenlänge eingestellt werden.
Eine weitere Verminderung des Streulichts könnte erreicht werden in jeder der hier beschriebenen Ausführungsformen durch die Verwendung von integrierten Ortsfiltern.
In Figur 9 ist eine andere Ausführungsform für einen Großwinkelstreulicht-Detektor entsprechend der Lehre der Erfindung gezeigt. Die Ausführungsform von Figur 9 erlaubt den Gewichtskonzentrationen und Streulichtintensitätsdetektoren die gleiche Strömungszelle zu teilen. Die Pumpe 54, Probenreservoir 56, LC-Säule 52, Lichtquelle 72, PMT 74, Optiken 78, CPU 64 und die A/D-Konverter 98, 100 und 62 arbeiten alle auf die gleiche Weise, wie in der Ausführungsform von Figur 5 und sind Gegenstand der fünktional äquivalenten Substitutionen.
Die Ausführungsform von Figur 9 zieht Nutzen aus dem Prinzip der Gleichung (4) und aus der Eigenschaft von Monochromatoren, um Oberschwingungen durchzulassen. Üblicherweise wird die Gewichtskonzentration bestimmt unter Verwendung einer UV- Absorptionsmessung bei einer kurzen Wellenlänge, d.h. um 280 nm. Andererseits wird die Streulichtmessung normalerweise bei einer Wellenlänge durchgeführt, die etwa zweimal so lang ist, wie die Wellenlänge zur UV-Absorptionsmessung. Das erlaubt dem lichtstreuenden PMT, in seinem empfindlichsten Bereich zu arbeiten, d.h. um 560 nm. Diese beiden Wellenlängen können von der gleichen Quelle 72 erhalten werden durch Verwendung eines Monochromators 150, um das einfallende Licht zu filtern und einzustellen, damit es das 560 nm Licht passiert. Da 280 nm die zweite Oberlängenwelle von 560 nm ist, tritt Licht mit dieser Wellenlänge durch den Monochromator durch. Ein eventueller Polarisierer 152 filtert dann alles, aber nicht das vertikal polarisierte Licht bei 560 nm und 280 nm aus. Dieses Licht ist dann auf das Einlaßfenster 154 der Strömungszelle 156 durch die Optiken 78 durch einen Strahlteiler 154 fokussiert. Der Strahlteiler richtet einen Teil des einfallenden Lichts auf einen PMT 157, der als Detektor der Intensität I&sub0; des auf die Strömungszelle einfallenden Lichts dient.
Die Strömungszelle 156 hat üblicherweise die gleiche Struktur und Funktion wie die Strömungszelle 68, sie enthält jedoch zwei Ausgangsfenster statt einem. Das zweite Ausgangsfenster 158 ist so positioniert, daß nicht gestreutes Licht von den Teilchen in dem Streuvolumen der Strömungszelle durch das zweite Ausgangsfenster 158 durchgeleitet wird. Dieses nicht gestreute Licht wird im folgenden als das durchgelassene Licht It bezeichnet.
Das durchgelassene Licht It wird von einem Standard-Interferenzfilter oder anderen preiswerten Filtern gefiltert, um sämtliches Licht, außer dem 280 nm-Licht, das nicht von den streuenden Teilchen absorbiert wird, zu filtern. Die Intensität des gefilterten Lichts wird abgetastet durch das PMT 162 und in digitale Daten durch den A/D- Umwandler 62 umgewandelt. Die CPU 64 berechnet dann unter Verwendung der Gleichung (4) die Gewichtskonzentration der streuenden Teilchen. Das wird durchgeführt unter der Kontrolle von Software, die sehr ähnlich in der Struktur ist zu der, die in Figur 7 dargestellt ist, aber die die Schritte beinhaltet zum Sammeln und Speichern von Daten, bezogen auf die Intensität It des durchgelassenen Lichts und die Intensität I&sub0; des einfallenden Lichts und dann die Gewichtskonzentration C unter Verwendung der Gleichung (4) berechnet und die Konstanten für den Extinktionskoeffizienten und die Weglänge speichert. Die so berechnete Gewichtskonzentration wird dann für nachfolgende Verwendung zur Berechnung des Durchschnittsmolekulargewichts Mw gespeichert, in der Art, wie in dem Verfahren in Figur 7 dargestellt.
Das bei hohen Winkeln bei oder nahe 90º gestreute Licht tritt aus dem Ausgangsfenster 164 aus und wird durch einen Filter 166 gefiltert. Der Filter 166 entfernt alle Wellenlängen bis auf die Wellenlänge bei 560 nm. Das gefilterte Licht wird dann durch das PMT 74 erkannt und das sich ergebende Ausgangssignal wird zu einem digitalen Signal durch den A/D-Umwandler 100 umgewandelt.
Der A/D-Umwandler 98 wandelt einen Teil des einfallenden Lichts zu den I&sub0;-Intensitätsdaten um, verwendet von der CPU 64, um die durchgelassene Lichtintensität It und die Streulichtintensitätsdaten Is zu normieren.
Im allgemeinen kann die Gleichung (4) durch eine Taylor-Reihenentwicklung vereinfacht werden, beibehaltend nur den ersten der zwei Ausdrücke, um die Gewichtskonzentration zu berechnen, wie im Fall für die Streulichtexponentiale. In anderen Ausführungsformen kann der Exponent von Gleichung (4) unter Verwendung von It, I&sub0; und eines natürlichen Logarithmus, der in einer Tabelle nachgesehen werden kann, evaluiert werden. Das gleiche stimmt für die Exponentiale, die das Durchschnittsmolekulargewicht zur Streulichtintensität in Beziehung setzt.
Da der Extinktionsindex &epsi; in dem Exponenten von Gleichung (3) für alle biologischen Proteine von Interesse so klein ist, kann er ignoriert werden.
Der Vorteil der Ausführungsform von Figur 9 besteht darin, daß er eine Strömungszelle und die Notwendigkeit für die CPU 64 elminiert, die Gewichtskonzentrationsdaten von einer Strömungszelle anzupassen, die früher oder später als die Lichtstreuungsdaten von einer unterschiedlichen Strömungszelle erzeugt werden. Die beiden Strömungszellen von der Art der Ausführungsformen gemäß Figur 5 erzeugen die C- und Is-Daten für die gleichen Teilchen zu unterschiedlichen Zeiten aufgrund der Zeitverzögerung der Teilchen, die durch die Strömungszelle des UV-Detektors 58 durchwandern, um die Strömungszelle 68 zu erreichen. Das erfordert, daß der Computer 64 die C-Daten und Is- Daten für die gleichen Teilchen in Übereinstimmung bringt, selbst wenn diese beiden Datensätze zu unterschiedlichen Zeiten erzeugt wurden. Der Korrelationsprozeß ist in Schritt 136 in Figur 7 enthalten.
Das Verfahren und die Vorrichtung zum Auffinden der Gewichtskonzentration unter Verwendung der durchgelassenen Lichtintensität It, wie vorstehend beschrieben, arbeitet gut, wenn der Extinktionsindex für die Teilchen, die aus der LC-Säule kommen, bekannt ist. Der Extinktionsindex &epsi; ist eine intrinsische Eigenschaft eines Moleküls, der anzeigt, wieviel UV-Licht das Molek(il auf einer Gewichtsbasis oder, falls bekannt ist, daß die Teilchen alle vom gleichen Typ, aber von unterschiedlichen Konfigurationen dieses Typs sind, absorbieren wird. In der allgemeinsten Form, in der der Typ und die Masse der Teilchen, kommend aus der LC-Säule, nicht bekannt sind, ist es nicht möglich, den Extinktionsindex zu kennen. In solch einem Fall müssen die Gewichtskonzentrationsdaten in bekannter Weise abgeleitet werden unter Verwendung eines Brechungsindex- Detektors. Brechungsindex-Detektoren können sogar im Fall der Lösungsmittelgradien tenherstellung verwendet werden, wenn die Technik einer US-Patentanmeldung "Reference Flow Liquid Chromatography System With Stable Baseline" mit der Nr. 07/463,701 verwendet wird, die eine Teilanmeldung der Nummer 07/456,021 ist, die eine Continuationanmeldung der Nummer 07/155,592 ist.
In dem Fall, in dem alle gleichen Teilchen von einer LC-Säule, aber zu verschiedenen Zeiten eluieren aufgrund ihrer verschiedenen Konfigurationen und ihrer verschiedenen Größen, können die relativen Gewichtskonzentrationen, obgleich in verschiedenen Peaks, mittels eines UV-Detektors oder Fluorometers bestimmt werden, ohne den Extinktionsindex zu kennen. Das ist möglich, da die Extinktionsindices für alle der unterschiedlich großen Teilchen gleich sind. Somit sind die Gewichtskonzentrationen zu der durchgelassenen Lichtintensität durch die gleiche Funktion in Beziehung gesetzt, nämlich Gleichung (4), in der &epsi; für jeden Peak gleich ist. Diese Information kann zur Bestimmung des relativen Durchschnittsmolekulargewichts, verteilt über verschiedene Peaks, bestimmt werden, was analytisch nützlich ist zur Interpretation von Chromatogrammen in dieser Situation.
Verfahren entsprechend den Lehren der Erfindung beinhalten den Arbeitsvorgang der Ausführüngsformen von Figuren 5, 9, 10, 11 und 12.
Figur 10 ist ein Diagramm einer anderen Ausführungsform der Erfindung, in der die Trennvorrichtung eine bekannte Kapillarelektrophoresstruktur besitzt. Kapillarelektrophorese ist ein Verfahren, in dem geladene Proteine oder andere Moleküle entlang einer Kapillarröhre unter dem Einfluß eines elektrischen Potentials und mit einer Geschwindigkeit, vorgeschrieben durch ihre Ladung, wandern. Moleküle oder Proteine mit einer höheren Ladung wandern schneller, als Moleküle mit einer geringeren Ladung. Teilchen mit entgegengesetzter Ladung wandern in entgegengesetzten Richtungen. Die verschiedenen Geschwindigkeiten und Richtungen der Wanderung führen zu einer Trennung entlang der Länge der Kapillarröhre und unterschiedlichen Ahkunftszeiten an irgendeinem bestimmten Punkt entlang der Kapillarröhre.
Die Vorrichtung von Figur 10 umfaßt einen ersten Behälter 200 und einen zweiten Behälter 202, in denen die offenen Enden von einer Kapillarröhre 204 aus Quarz versenkt sind. Üblicherweise hat die Kapillare einen Innendurchmesser von 25-100 µM. Jeder der Container 200 und 202 enthält ein wäßriges Lösungsmittel mit einer geringen Leitfähigkeit. Die Probe wird in irgendeiner bekannten Art eingeführt, üblicherweise durch Eintauchen eines Endes der Kapillarröhre 204 in einen Behälter mit der Probe, so daß ein paar µl der Probe in das Ende der Kapillare eindringen. Die Kapillare wird mit dem leitfähigen Lösungsmittel mit irgendeiner bekannten Vorrichtung gefüllt (nicht gezeigt). Eine Spannungsquelle 206 mit Elektroden 208 und 210 im elektrischen Kontakt mit dem Lösungsmittel in den Behältern 200 und 202 wird verwendet, um Gleichstrom (D.C.) zwischen dem Lösungsmittel in Behälter 200 und dem Lösungsmittel in Behälter 202 anzulegen.
Das elektrische Feld zwischen den Behältern 200 und 202 bewirkt, daß die geladenen Analyten (Probenproteine oder andere Moleküle) sofort entlang der Kapillarröhre mit verschiedenen Geschwindigkeiten wandern. In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine Strömungszelle 212 der zuvor beschriebenen Art an eine Kapillare gekoppelt, so daß der Strom der wandernden Proteine oder anderer Moleküle durch die Strömungszelle 212 hindurchgeht.
Die Strömungszelle 212 ist optisch an eine Vorrichtung der Art gemäß Figur 9 gekoppelt. Die Streulichtdetektorvorrichtung (nicht gezeigt in Figur 10) arbeitet auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben, um das Durchschnittsmolekulargewicht der Proteine oder Moleküle zu bestimmen, wenn sie durch die Strömungszelle 212 hindurchwandern.
In einer anderen Ausführungsform dieser Kapillarelektrophoresetrenneinrichtung ist eine zweite Strömungszelle 214 (gezeigt als Schatten) an die Kapillare 204 gekoppelt, so daß die Proteine ebenfalls durch diese Strömungszelle wandern. Die Strömungszelle 214 ist Teil des Standard-UV-Detektors 58 in Figur 5 und die Strömungszelle 212 ist optisch gekoppelt mit einer Streulichtdetektorvorrichtung gemäß Figur 5 (nicht gezeigt in Figur 10). Diese Streulichtdetektorvorrichtung funktioniert, wie vorstehend beschrieben. Die normierte Streulichtintensität entwickelt durch die Streulichtvorrichtung, gekoppelt an Strömungszelle 212 und die Gewichtskonzentrationsdaten entwickelt durch den UV- Detektor verbunden mit Strömungszelle 214, werden verwendet, um das Durchschnittsmolekulargewicht, wie zuvor beschrieben, zu berechnen.
Das Durchschnittsmolekulargewicht der eluierten Moleküle, gekoppelt mit ihren Ahkunftszeiten, die auf ihre Ladung hindeuten, können verwendet werden zum Nachweis oder zur Indentifizierung dieser Teilchen. Diese Art von Trenntechnik eignet sich gut für diese Art von Streulichterkennung, aufgrund des kleinen Volumens, der hohen Analytenkonzentration, die zu höheren Streulichtintensitäten führt, und der Einfachheit einer Erkennung auf einer Säule (wahre Zeit) von sowohl der Absorption als auch Großwinkelstreulichtkonfigurationen.
In einigen Ausführungsformen, in denen eine transparente Kapillarröhre verwendet wird, können die Strömungszellen auf die Kapillarröhre verteilt werden und das einfallende Licht kann direkt die Kapillarröhre anstrahlen. Obwohl das zu einem höheren Hintergrund an Streulicht von der Röhre selbst führt, kann es dennoch funktionieren.
In Figur 11 ist eine andere Ausführungsform eines "Zwei-für-eins"-Instruments unter Verwendung einer Einzellichtquelle und einer einzelnen Strömungszelle gezeigt. In dieser Ausführungsform wird eine Lichtquelle 250 mit einem Breitbandausgangsspektrum verwendet, das mindestens 200-300 nm und 400-600 nm Wellenlänge beinhaltet. Das Ausgangslicht 252 wird durch einen Monochromator 254 gefiltert, um Wellenlängen für eine UV-Absorption und eine Raleigh-Streumessung übrigzulassen, vorzugsweise 280 nm und 560 nm, aber eventuell einige Wellenlängen zwischen 200-214 nm und 400-428 nm bei 256. Ein teilweise versilberter Spiegel reflektiert Teile des einfallenden Lichts auf einen Detektor 260 für das einfallende Licht. Dieser Detektor gibt ein I&sub0;-Signal zur CPU 262 ab. Eine Strömungszelle 264 läßt das meiste sowohl vom 280- und 560 nm-Licht zu einem Filter 266 durch. Dieser Filter blockiert das 560 nm-Licht und ein PMT erkennt die Intensität des 580 nm-Lichts. Streulicht bei einigen großen Winkeln wird durch einen Filter 270 gefiltert, um nur 560 nm-Licht durchzulassen, das von dem PMT 272 erkannt wird. PMT 272 gibt ein Signal Is, repräsentierend die Streulichtintensität, aus und PMT 268 gibt ein Signal C, repräsentierend die Gewichtskonzentration, aus. Die CPU 274 verarbeitet diese drei Signale I&sub0;, Is und C, um das Gewichtsmittel des Molekulargewichts, wie zuvor beschrieben, zu berechnen.
In Figur 12 ist eine kompliziertere "2-für-1"-Ausführungsform gezeigt. In dieser Ausführungsform erzeugt eine Einzelbreitbandquelle 280 Licht, das durch einen Strahlenteiler 282 in zwei Strahle geteilt wird. Der erste Strahl ist durch einen ersten Monochromator gefiltert, um nur eine Wellenlänge in dem Ausgangsstrahl 286 übrigzulassen, der geeignet ist für UV-Absorptionsmessungen durch die streuenden Teilchen in einer Strömungszelle 288. Ein zweiter Strahl 290 wird durch einen Spiegel 292 zu einem zweiten Monochromator 294 reflektiert. Der zweite Monochromator 294 filtert alle Wellenlängen, bis auf eine Wellenlänge, optimiert zur Streuung, aus. Üblicherweise wird diese Wellenlänge irgendwo in dem blau-grünen Spektrum bei oder nahe eines Punkts liegen, an dem das Produkt der charakteristischen Kurven für die Quelle 280 und des Streulicht detektors 296 ein Maximum hat. Die streuende Wellenlänge muß nicht eine Oberwellenlänge der Wellenlänge im Strahl 286 sein. Die charakteristischen Kurven, auf die vorstehend Bezug genommen ist, sind die Eigenschaften, die sich auf die Ausgangslichtintensität einer Quelle 280 bei verschiedenen Wellenlängen und die Wirksamkeit des Streulichtdetektors 296 beziehen.
Die ausgewählte Wellenlänge zum Streuen wird durch einen Spiegel 298 reflekiert und durch einen teilweise versilberten Spiegel 300 mit Strahl 286 wiedervereinigt.
Der vereinigte Strahl 302 hat einen Teil davon wegreflektiert zu einem I&sub0; einfallenden Lichtdetektor 304 durch einen teilweise versilberten Spiegel 306. Der Strahl 308 von einfallendem Licht wird dann an die Strömungszelle 288 angelegt. Streulicht und durchgelassenes Licht werden dann erkannt und das Gewichtsmittel des Molekulargewichts kann manuell oder elektronisch von den Ausgängen der Detektoren 304, 296 und 310 berechnet werden. Die Filter 312 und 314 stellen sicher, daß nur die richtigen Wellenlängen die Detektoren 296 bzw. 310 erreichen.
Der Vorteil der Ausführungsform von Figur 12 liegt darin, daß nur eine Einzellichtquelle verwendet wird, so daß Hintergrund von zwei unabhängigen Quellen mit nicht- synchronisierten statistischen Änderungen in ihren Ausgangsintensitäten ausgeschlossen werden. Weiterhin erlaubt die Verwendung von zwei Monochromatoren den UV- und Streuwellenlängen, daß sie getrennt eingestellt werden, um die UV-Absorptionsfunktion zur Bestimmung der Gewichtskonzentration und die Streufunktion zur Bestimmung von Mw zu optimieren.
Figur 13 zeigt ein Flußdiagramm eines erfindungsgemäßen Verfahrens für vielfache Strömungszellenausführungsformen. Schritt 350 ist die Erzeugung von einfallendem Licht und Schritt 352 repräsentiert den Prozeß der Filterung oder Einstellung dieses Lichts auf eine Wellenlänge, die zur Streuung, wie zuvor beschrieben, optimiert ist (in dem das Produkt der Quelle und der Detektor-charakteristischen Kurven ein Maximum hat). Dieser Schritt 352 kann mit einer Breitbandquelle und einem fixierten Filter oder einem eingestellten Filter, wie einem Monochromator, ausgeführt werden. Schritt 354 ist wahlweise und beinhaltet das Durchlassen von einfallendem Licht durch einen Polarisator, um nur vertikal polarisiertes Licht durchzulassen.
Schritt 356 symbolisiert das Verfahren zur Erkennung der einfallenden Lichtintensität I&sub0;. Vorzugsweise wird das auf der einfallenden Lichtseite der Strömungszelle durchgeführt, aber in den nicht "2-für-1"-Ausführungsformen kann es ebenso durch Erkennen der Intensität des Lichts, durchgeführt durch die Strömungszelle, verbunden mit dem Streulichtdetektor ausgeführt werden.
Schritt 358 repräsentiert den Schritt der Anstrahlung der Teilchen in Lösung. Das kann mittels einer Strömungszelle gekoppelt an dem Ausgang einer LC-Säule, einer Strömungszelle gekoppelt an ein Kapillarelektrophoreseröhrchen, einer stehenden Lösung in einer Strömungszelle oder jedem anderen transparenten Behälter ausgeführt werden (solange, wie Streulicht im wesentlichen vom Erreichen des Streulichtdetektors abgehalten wird) oder einfach unter Verwendung eines transparenten Kapillarelektrophoreseröhrchens.
Schritt 360 repräsentiert jedes bekannte Verfahren zur Erkennung der Gewichtskonzentration von Teilchen in Lösung. Üblicherweise wird dies mit einer getrennten Strömungszelle in einem UV-Absorptionsdetektor gekoppelt vor oder nach der streuenden Strömungszelle durchgeführt. Brechungsindexdetektoren oder Fluorometer können ebenfalls in einigen Fällen verwendet werden.
In Schritt 362 wird die Streulichtintensität bei einigen ausgewählten Winkeln zwischen 35º und 145º erkannt. Üblicherweise wird das mittels eines PMT durchgeführt, aber eine große Anzahl an Fotodioden kann in einigen Fällen ebenfalls verwendet werden.
In Schritt 364 wird die Streulichtintensität Is durch Teilen mit der einfallenden Lichtintensität I&sub0; normiert.
Schließlich wird das Gewichtsmittel der Molekularmasse Mw mit der Gleichung (2) in Schritt 366 berechnet.
In Figur 14 ist ein Flußdiagramm für ein Verfahren zur Erkennung von Mw unter Verwendung einer Einzellichtquelle und einer Einzelströmungszelle gezeigt. Schritt 370 reprasentiert das Verfahren der Erzeugung von Licht mittels einer Breitbandquelle, die mindestens einige Längenwellen, nutzlich zur Messung der UV-Absorption und einiger Wellenlängen, nützlich für die Streuung, abgibt.
Schritt 372 repräsentiert das Verfahren der Filterung oder der Einstellung, um nur zwei Wellenlängen auszuwählen und aus dem Licht von der Lichtquelle durchzulassen. Das kann mit einem Strahlenteiler und zwei getrennten fixierten Filtern oder Monochromatoren gemäß Figur 12 durchgeführt werden oder es kann mit einem Einzelmonochromator, wie in Figur 9 oder 11 gezeigt, durchgeführt werden. Im Fall eines Einzelmonochromators müssen die beiden Wellenlängen Oberlängenwellen voneinander sein. Wenn jedoch dieses Filtern oder Einstellen von den zwei Wellenlängen durchgeführt wird, muß eine zur Messung der UV-Absorption geeignet und eine muß zum Streuen geeignet sein. Vorzugsweise sind die beiden Frequenzen individuell einstellbar und die Streufrequenz ist einstellbar, um eine Wellenlänge zu erhalten, bei der das Produkt der Lampenausgangsintensität gegen die Wellenlängeneigenschaftskurve und die Streulichtdetektorwirk samkeit gegen die Wellenlängeneigenschaftskurve bei oder nahe einem Maximum ist. Als nächstes wird die Intensität I&sub0; des einfallenden Lichts im Schritt 374 durch irgendeine Einrichtung erkannt.
Schritt 376 repräsentiert das Anstrahlen von zwei Frequenzen auf die Teilchen von Interesse und kann mittels jeder der zuvor besprochenen Verfahren in Verbindung mit Schritt 358 des Verfahrens von Figur 13 durchgeführt werden.
Schritt 378 repräsentiert das Verfahren der Ausfilterung einer der Wellenlängen des durch die Lösung durchgelassenen Lichts. Die eliminierte Wellenlänge ist die Wellenlänge, die für die Streulichterkennung verwendet wird. Ein PMT wird üblicherweise zur Messung der UV-Absorption verwendet, wie angezeigt durch die Intensität des durchgelassenen Lichts wie symbolisiert in Schritt 380. Dieses Signal wird nach der Normierung unter Verwendung von I&sub0; verwendet, um C, die Gewichtskonzentration der Teilchen, zu berechnen.
Schritt 382 repräsentiert das Ausfiltern der für die UV-Absorptionsmessung von It verwendete Wellenlänge vom gestreuten Licht bei einem großen Winkel.
Schritt 390 repräsentiert die Erkennung der Intensität Is des Streulichts bei einem ausgewählten großen Winkel. Das wird üblicherweise unter Verwendung eines PMT bei 90º durchgeführt.
Schritt 392 ist die Normierung von Is durch Teilung mit I&sub0; und die Berechnung von Mw unter Verwendung von C und Gleichung (3).
Obwohl die Erfindung in bezug auf die hier beschriebenen bevorzugten und alternativen Ausführungsformen beschrieben ist, werden die Fachleute erkennen, daß andere alternative Ausführungsformen ebenfalls durchgeführt werden können, ohne vom Umfang der Ansprüche abzuweichen.

Claims

1. Eine Vorrichtung zur Erzeugung von Signalen, aus denen das Durchschnittsmolekulargewicht von Teilchen in Lösung berechnet werden kann, umfassend:

Einrichtungen (72, 76, 150) zur Erzeugung von Licht zum Anstrahlen der Teilchen in Lösung mit monochromatischem Licht und umfassend eine Lichtquelle (72), bestehend aus einer Lichtbogenlampe oder einer Wolframlampe,

Einrichtungen (74) zur Messung der Intensität des Lichts, das von den Teilchen gestreut wurde bei einem ausgewählten Winkel zwischen 35º und 145º, wahlweise etwa 90º, wobei die Streulichintensität gemessen wird relativ zu der Intensität des auf die Teilchen einfallenden Lichts und zur Ausgabe eines Signais, das die relative Streulichtintensität angibt, und

Einrichtungen (58, 162) zur Messung der Gewichtskonzentration der Teilchen in Lösung und zur Ausgabe eines Signals, das diese anzeigt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, des weiteren umfassend entweder:

(a) Berechnungseinrichtungen für den Empfang der Signale, die die Gewichtskonzentration und die relative Streulichtintensität anzeigen und zur Berechnung des Gewichtsmittels des Molekulargewichts der Teilchen unter Verwendung der Beziehung

wobei

K = eine optische Konstante, die unter anderem die Wellenlänge, den Brechungsindex der Lösung und die Veränderung des Brechungsindex der Lösung mit der Zeit in Beziehung zueinander setzt und die empirisch bestimmt werden kann für jedes ausgewählte System durch Verwendung von mindestens zwei Typen von Teilchen mit bekannten Gewichtsmitteln des Molekulargewichts, um das System zu kalibrieren,

R = die spezifische Raleigh-Konstante,

Mw = das Gewichtsmittel des Molekulargewichts der streuenden Teilchen,

P(Θ) = ein Größenparameter, der die Beziehung für die Effekte der mehrfach Intra- Teilchenstreuung korrigiert,

A&sub2; und A&sub3; = der zweite und dritte Virialkoeffizient, und

C = Gewichtskonzentration der streuenden Teilchen,

und wobei

in der

P(Θ)&supmin;¹ = der inverse Größenfaktor,

n = der Brechungsindex,

Rg = der Trägheitsradius der streuenden Teilchen,

Θ = der Streuwinkel zwischen dem einfallenden Licht und dem Streulicht, und

λ&sub0; = die Wellenlänge des einfallenden Lichts

und wobei Rg als annähernd null vernachlässigt werden kann für kleine Teilchen mit einer Größe kleiner als λ&sub0;/4 wie im wesentlichen alle interessierenden Bioproteine, und wobei für größere Teilchen, für die ausreichende Informationen bekannt sind, um in einer Tabelle die Beziehung zwischen Rg und Mw nachzuschauen, Mw berechnet werden kann durch Substitution für Rg in Gleichung (2) den dazu äquivalenten Ausdruck für Mw und Einsetzen der umformulierten Gleichung (2) in Gleichung (1) für P(Θ) und automatisches Auflösen nach Mw unter Verwendung eines Digitalcomputers (64),

oder

(b) des weiteren umfassend Berechnungseinrichtungen (64) zum Empfang der Signale (106, 104, 102), die proportional sind zur Streulichtintensität und zur Intensität des einfallenden Lichts und der Gewichtskonzentration, und für die Berechnung des durchschnittlichen Molekulargewichts der Teilchen unter Verwendung der Beziehung

Is/I&sub0; =BcMw

wobei

Is/I&sub0; = die Streulichtintensität bei einem hohen Winkel zwischen 35º bis 145º relativ zu der Intensität des einfallenden Lichts,

B = eine vorbestimmte optische Konstante, die experimentell für jedes bestimmte optische System bestimmt wurde durch Messung der Streulichtintensitäten für mindestens zwei Typen von Teilchen mit bekanntem Molekulargewicht, und

c = die Gewichtskonzentration der Teilchen in Lösung, und

Mw = das Gewichtsmittel des Molekulargewichts.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Einrichtung (74) zur Messung der Streulichtintensität der Teilchen ein Streulichtdetektor (74) ist, mit einem Band von maximaler Empfindlichkeit und mit einem Ausgang, an dem ein elektrisches Signal (94, 106) abgegeben wird, das proportional zur Streulichtintensität ist.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, des weiteren umfassend:

Einrichtungen (52) zur Trennung von Teilchen einer Probe, basierend auf beliebigen Eigenschaften wie Grtße, Molekulargewicht, etc., und zur Abgabe eines Lösungsstroms (66, 50) mit den darin enthaltenen getrennten Teilchen,

eine Strömungszelle (68, 156) zur Aufnahme des Stroms (66, 50) und mit einem Einlaßfenster (80, 154) zur Aufnahme von Licht aus der Lichtquelle (72), um den Strom (66, 50) anzustrahlen, und mit einem Ausgangsfenster (90, 164) durch das das Streulicht aus den Teilchen bei hohen Winkeln die Strömungszelle (68, 156) verläßt,

Einrichtungen (157) zur Aufnahme von mindestens einem Teil des Lichts aus der Lichtquelle (72), das in die Strömungszelle (68, 156) einfällt und zur Bestimmung der Intensität des Lichts und zur Abgabe eines dazu proportionalen elektrischen Signals (96, 104).

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Strömungszelle (68, 156) ein Streuvolumen (86), durch das die Teilchen fließen, von annähernd 10 Mikrolitern aufweist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Teilchengröße begrenzt ist, so daß sie gleich oder geringer als λ&sub0; ist, wobei λ&sub0; die Wellenlänge des einfallenden Lichts ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, des weiteren umfassend einen Polarisator (152), derart angeordnet, um alles Licht von den Teilchen fernzuhalten, das eine andere als eine vertikale Polarisation aufweist.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Einrichtung (72) zur Erzeugung des Lichts zum Anstrahlen der Teilchen in der Lösung mit monochromatischem Licht einen Filter (76, 150) umfaßt, um das Licht aus der Lichtquelle auf eine einzige bekannte Wellenlänge einzuschränken, die im wesentlichen länger ist als die Größe der Teilchen, wobei wahlweise das Filter (76, 150) alle Wellenlängen herausfiltert mit der Ausnahme der Wellenlänge, die derart angeordnet ist, um ein maximales Ausgangssignal des Streulichtdetektors (74) zu erzeugen.

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Lichtdetektor (74) ein Photomultiplier ist, wobei der Photomultiplier wahlweise gekühlt und/oder eine Photonen- Zählvorrichtung ist und vorzugsweise der Photomultiplier für blau-grüne Wellenlängen optimiert ist.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der Lichtdetektor (74) ein Photomultiplier ist mit einer Kennlinie, die die Größe des Ausgangssignals mit der Wellenlänge in Beziehung setzt und/oder wobei die Lichtquelle (72) eine Kennlinie von Ausgangslichtintensität gegen Wellenlänge hat.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei ein Filter bereitgestellt ist, das alle Wellenlängen herausfiltert mit der Ausnahme einer Wellenlänge bei oder nahe bei der Wellenlänge, bei der das Produkt der Kennlinie der Lichtquelle (72) und des Photomultipliers ein Maximum hat.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Lichtquelle (72) eine Quecksilber-Bogenlampe oder eine Xenon-Bogenlampe ist.

13. Ein Verfahren zur Bestimmung des durchschnittlichen Molekulargewichts von Teilchen in einer Lösung, umfassend:

Verwendung einer ersten Lichtquelle (72) bestehend aus einer Lichtbogenlampe oder einer Wolframlampe, um einfallendes Licht zu erzeugen, mit einer ersten Wellenlänge, ausgewählt, um bei einem Streulichtdetektor ein maximales Ausgangssignal zu erzeugen,

Führen des einfallenden Lichts auf eine Lösung mit den Teilchen,

Verwendung der ersten Lichtquelle (72) oder einer zweiten Lichtquelle (58), um einfallende Strahlung mit einer zweiten Wellenlänge zu erzeugen, die geeignet ist, um UV-Absorption zu messen,

Führen dieser einfallenden Strahlung bei dieser zweiten Wellenlänge zu einer Lösung, die die Teilchen enthält,

Messung der Streulichtintensität bei einem ausgewählten Winkel zwischen 35º und 145º bei der ersten Wellenlänge und der Intensität des einfallenden Lichts auf die Lösung bei der ersten Wellenlänge,

Messung der Intensität des Durchlichts bei der zweiten Wellenlänge, das durch die Lösung durchgelassen wurde und der Intensität des einfallenden Lichts bei der zweiten Wellenlänge, das auf die Lösung fällt,

Berechnung der Gewichtskonzentration der Teilchen unter Verwendung der Werte für die Intensität des einfallenden Lichts und des Durchlichts bei der zweiten Wellenlänge unter Verwendung einer vorbestimmten Beziehung,

Berechnung des Gewichtsmittels des Molekulargewichts der Teilchen in Lösung unter Verwendung der Werte für die Intensität des einfallenden Lichts und der Streulichtintensität bei der ersten Wellenlänge und des Wertes der berechneten Gewichtskonzentration der Teilchen unter Verwendung einer vorbestimmten Beziehung, die das Gewichtsmittel des Molekulargewichts und die Streulichtintensität in Beziehung zueinander setzt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, des weiteren umfassend:

zunächst Abtrennen der Teilchen in einem Lösungsmittelstrom (66, 50), wahlweise einschließlich des Schrittes des Durchlaufenlassens einer Lösung mit den Teilchen durch eine Flüssigchromatographiesäule (52) oder Abtrennen der Teilchen in einer Kapillar-Elektrophorese-Vorrichtung,

Durchleiten des Lösungsmittelstroms (66, 50) durch einen Detektor (58, 162), der geeignet ist zur Bestimmung der Gewichtskonzentration der Teilchen, Bestimmung der Gewichtskonzentration und Abgabe eines Signals (60, 102), das die Gewichtskonzentration anzeigt, Durchleiten des Lösungsmittelstroms (66, 50) durch eine Strömungszelle (68, 156),

Teilen der Streulichtintensität durch die Intensität des einfallenden Lichts,

Berechnung des durchschnittlichen Molekulargewichts gemäß der Beziehung

wie in Anspruch 2 definiert.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, des weiteren definiert durch ein oder mehrere spezifische Merkmale nach einem der Ansprüche 3 bis 12.