CH631016A5 - Dispositif de separation et de reaction pour analyse immunologique. - Google Patents

Description

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REVENDICATIONS

1. Dispositif de réaction et de séparation destiné à des analyses immunologiques automatiques et rapides en phase solide dans lequel des constituants sont mélangés, transportés et séparés par la force centrifuge, catactérisé en ce qu'il comprend 5 une colonne ouverte à ses deux extrémités, un moyen de retenue et de filtration placé dans la colonne et qui est imperméable aux solutions aqueuses dans la colonne et qui est imperméable aux solutions aqueuses lorsque la pression due à la force centrifuge, exercée par les soltuions sur ledit moyen ne dépasse pas une io limite données, supérieure à la pression due à la seule gravité, et devenant perméable à ces solutions lorsque ladite pression due à la force centrifuge depasse ladite limite, et une chambre de réaction et de séparation placée au-dessus du moyen de retenue et de filtration et contenant au moins une matière destinée à l'im- is mobilisation et à la séparation d'au moins un constituant d'un complexe antigène-anticorps.

2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que la colonne a une forme cylindrique et comporte une partie médiane de diamètre sensiblement uniforme, une partie inférieure 20 qui s'effile à un diamètre plus petit que celui de la partie médiane, et une partie supérieure qui a un diamètre supérieur à celui de la partie médiane, le moyen de retenue et de filtration étant placé dans la colonne en un point auquel la partie médiane se rétrécit et prend un diamètre plus faible. 25

3. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen de retenue et de filtration est sous forme d'un disque.

4. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que le disque est formé de polyéthylène poreux.

5. Dispositif selon la revendication 3, caractérisé en ce que 30 le disque a une porosité comprise entre 25 et 150 microns.

6. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite matière est présente dans la chambre de réaction et de séparation sous forme d'une poudre.

7. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que 35 ladite matière est présente dans la chambre de réaction et de séparation sous forme d'une pastille qui, lorsqu'elle est au contact d'une solution, gonfle et prend la configuration de la colonne.

8. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que 40 ladite matière est placée sur la paroi interne de la chambre de réaction et de séparation.

9. Utilisation du dispositif selon la revendication 1 pour l'analyse immunologique, caractérisée en ce que l'échantillon à analyser et au moins un réactif en solution aqueuse sont amenés 45 dans le dispositif, par son extrémité supérieure, sous l'effet d'une force centrifuge telle que la pression exercée sur le moyen de retenue et de filtration soit non supérieure à ladite limite donnée, le mélange de l'échantillon et du réactif est incubé sur . ladite matière, après quoi au moins un constituant du complexe 50 antigène-anticorps est séparé au moyen d'une élévation de la force centrifuge telle que la pression hydrostatique sur ledit moyen de retenue et de filtration dépasse ladite limite donnée.

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L'introduction de l'analyse radioimmunologique en 1959 par Yalow et Berson (Nature, 184,1648 (1959)) comme technique de marquage permettant un diagnostic, destinée à remplacer les analyses biologiques lentes alors utilisées, a révolutionné de nombreux domaines de la recherche et des analyses cliniques étant donné sa spécificité et son extrême sensibilité.

La technique d'analyse radioimmunologique repose sur l'aptitude d'un anticorps et d'un antigène spécifique à former un complexe réversible antigène-anticorps. L'analyse est réalisée par addition d'une quantité fixe d'un antigène marqué par un isotope radioactif à des échantillons qui contiennent un antisérum et des quantités connues d'antigène «témoin». Pendant l'incubation, l'antigène marqué et l'antigène non marqué entrent en compétition pour un nombre limité de sites de fixation sur l'anticorps. Après incubation, l'antigène lié à l'anticorps est séparé de l'antigène libre et le rapport des espèces libres et liées peut être porté sur une courbe de sensibilités en fonction de la dose. Un échantillon inconnu de sérum peut alors être analysé par la même opération et la concentration de l'antigène peut être déterminée par référence à la courbe témoin de sensibilités en fonction de la dose.

Il arrive fréquemment que les procédés classiques d'analyse radioimmunologique soient de mise en œuvre peu commode, prennent du temps et présentent des opérations introduisant des erreurs étant donné le nombre important d'opérations de manipulation à la pipette et dans des tubes à essai, la duplication des analyses, le long temps d'incubation et les séparations difficiles et peu efficaces.

On connaît déjà plusieurs dispositifs destinés à effectuer des analyeses à saturation. Ainsi, le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 918 909 décrit un dispositif qui comprend un organe tabulaire ouvert aux deux extrémités et contenant, à l'extrémité supérieure, un compartiment de réaction. Un filtre hydrophobe est placé à la base du compartiment de réaction et au-dessus de la chambre de séparation qui se trouve au-dessous. Lors de l'analyse, les réactifs sont mélangés et incubés dans la chambre supérieure puis transmis à la chambre inférieure dans le filtre par secouage ou application d'une différence de pressions entre les chambres supérieure et inférieure. Dans la chambre inférieure, l'agent de séparation sépare une substance radioactive liée à une espèce liante compétitive, à partir de sa forme non liée. Ce dispositif ne convient pas directement aux analyses immunologiques automatiques en phase solide et ne met pas en œuvre la force centrifuge. En outre, la réaction et la séparation sont réalisées dans des chambres séparées.

Les brevets des Etats-Unis d'Amérique n° 3 961 894 et 4 039 652 décrivent tous deux un procédé de détermination de substances présentes dans des échantillons fluides, mis en œuvre par un dispositif qui comporte une colonne ayant une matière poreuse insoluble avec des partenaires de la substance à analyser, sous une forme immobilisées.

Le dispositif est un corps cylindrique de configuration géométrique fixe et aboutissant à une première extrémité à un bout effilé. Dans la partie inférieure de la colonne, un disque de polyéthylène poreux porte la matière poreuse. Le brevet précité des Etats-Unis d'Amérique n° 4 039 652 indique que les caractéristiques d'écoulement de la phase solide sont de préférence telles que celle-ci a une propriété de retenue de fluide analogue à celle d'une éponge, sous l'action de la pesanteur. Le fluide retenu dans la matière peut alors être déplacé par addition d'une quantité supplémentaire de fluide au dispositif. Ainsi, lorsqu'une phase fluide est ajoutée à la phase solide et est retenue par celle-ci, les phases se trouvent en fait à l'état d'incubation jusqu'à ce qu'un autre fluide, par exemple un fluide tampon, soit ajouté et chasse le fluide retenu. Bien que ces dispositifs permettent la réalisation de l'incubation et de la séparation dans une seule chambre, ils ne mettent pas en œuvre un disque imperméable à l'eau ni des éléments agissant sous l'action de la force centrifuge.

Ainsi, le but de la présente invention est de fournir un dispositif de réaction et de séparation destiné à des analyses immunologiques automatiques et rapides en phase solide dans lequel des constituants sont mélangés, transportés et séparés par la force centrifuge. Le dispositif objet de l'invention est défini dans la revendication 1.

L'utilisation de ce dispositif pour l'analyse immunologique est définie dans la revendication 9.

D'autres particularités et avantages de l'invention ressorti-ront mieux de là description qui va suivre, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels:

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La figure 1 est une coupe d'un dispositif de réaction et de séparation selon l'invention ; et les figures 2A à 2E sont des coupes représentant la séquence de réaction, d'incubation et de séparation lors de l'utilisation du dispositif, placé dans un instrument du commerce destiné au traitement des matières liquides.

La figure 1 est une coupe d'un dispositif de réaction et de séparation selon l'invention. La colonne 10 peut être formée d'une matière inerte presque quelconque, par exemple de verre, de matière plastique ou analogue. Une matière avantageuse est le polystyrène qui est transparent et qui ne se casse pas facilement. La colonne 10 a une longueur d'environ 10 cm et un diamètre externe de corps d'environ 1 cm. Elle peut contenir environ 2,5 cm3 de liquide. Le bout 12 a un diamètre interne d'environ 1 mm, et le réservoir supérieur 14 a un diamètre externe d'environ 2 cm. Un bouchon 16 ferme la partie supérieure de la colonne. Un disque 18 de retenue constitue un filtre imperméable aux liquides à la pression atmosphérique et lorsque de faibles forces centrifuges sont appliquées, mais il est perméable aux liquides sous l'action des forces centrifuges élevées. La chambre 20 de réaction contient la matière incubée et le réactif sous forme immobilisée.

Les figures 2A à 2E sont des coupes représentant une colonne de réaction et de séparation 10, ayant un disque imperméable à l'eau 18, contenant une certaine quantité d'antisérum immobilisée dans une matière sèche 22. La colonne contenant le réactif est placée dans un tube à essai 24 qui est suspendu par son bord dans un siège sphérique 26 formé dans une bague 28 de matière plastique. Des échantillons de sérum et d'autres réactifs 30 sont placés dans les cavités 32 et 34 d'un disque 36 de transport qui est lui-même placé sur un plateau tournant d'un appareil «Centria» (appareil d'analyse immunologique vendu par Union Carbide Corporation), claveté automatiquement afin que chaque cavité soit alignée sur l'orifice de la colonne correspondante de séparation et de réaction. Un moteur est commandé, sie bien que, pour une accélération déterminée, la force centrifuge créée provoque le déplacement simultané de tous les échantillons et tous les réactifs vers la colonne de réaction et de séparation contenant le réactif immobilisé 22. Lorsque le réactif immobilisé est piégé dans une matière déshydratée telle qu'un Polyacrylamide, une réhydratation rapide a lieu simultanément à la réaction. Après un temps convenable d'incubation, le moteur accélère à une vitesse plus élevée, et un éluant convenable 38 est transmis et exerce une pression hydrostatique qui suffit à la transformation du filtre imperméable à l'eau qui est alors perméable. L'opération est réalisée par distribution d'un courant de liquide convenable, par exemple d'une solution tampon provenant d'un réservoir par l'intermédiaire d'une pompe d'é-luant non représentée, dans un conduit 40 et un dispositif de distribution dans les cavités 32 et 34 du disque de transport qui tourne rapidement. La pompe transmet un débit fixe d'éluant pendant un temps déterminé et la quantité totale d'éluant est automatiquement répartie par les cloisons du disque qui guident le fluide dans la colonne de réaction et de séparation. Tous les éléments 42 qui sont solubles dans l'eau et ne sont pas liés au réactif immobilisé passent facilement à travers le filtre et sont collectés dans les tubes à essai. Dans le cas où un réactif est radioactif, chaque tube peut être retiré de la bague de support et la radioactivité du contenu peut être mesurée. Les analyses selon l'invention, mettant en œuvre l'appareil «Centria» sont réalisées en 7 min. De cette manière, l'utilisateur peut effectuer des analyses cinétiques en phase solide (dans des conditions autres qu'à l'équilibre), alors que ces opérations sont extrêmement difficiles selon d'autres procédés.

Le dispositif selon l'invention, lorsqu'il est utilisé avec des instruments d'analyse mettant en œuvre la force centrifuge, permet l'extension des possibilités de l'appareil aux analyses enzy-

mo- et radio-immunologiques automatiques en phase solide et aux analyses immunologiques cinétiques.

Les dispositifs d'analyse à plusieurs postes mettant en œuvre un champ centrifuge sont disponibles depuis quelque temps et 5 permettent une microanalyse rapide de liquides très divers tels que les humeurs, notamment le sérum sanguin, les produits alimentaires et analogue. Ainsi, un tel instrument qui a été mis au point pour les analyses radioimmunologiques automatiques est l'appareil «Centria» commercialisé par Union Carbide Corpo-îo ration. Cet appareil présente plusieurs caractéristiques intéressantes pour la mise en œuvre des analyses immunologiques en solution. L'appareil comprend une pipette automatique qui distribue les échantillons et les réactifs, un module clé sous forme d'un appareil d'incubation et de séparation dans lequel la force 15 centrifuge est utilisée pour déclencher et interrompre les incubations et séparations multiples simultanées d'analyse radioimmunologique, et un ensemble formant compteur gamma et calculateur qui compte simultanément trois tubes et transforme les nombres en unités de concentration. Le brevet des Etat-Unis 20 d'Amérique n° 3 953 172 décrit plus en détail le fonctionnement et l'utilisation de cet appareil «Centria». Comme l'indique ce brevet, l'appareil met en œuvre des colonnes d'adsorption pour la séparation des constituants à analyser.

Comme indiqué précédemment, le dispositif de réaction et 25 de séparation selon l'invention est une colonne ayant un moyen de retenue et de filtration qui est imperméable à l'eau et qui peut contenir des réactifs tels que des anti-sérums, des enzymes, des immunosorbants, des matières d'échange d'ions et analogue sous forme immobilisée. Le contenu de la colonne peut être mis 30 au contact, par la force centrifuge ou par addition manuelle,

avec une phase aqueuse contenant des réactifs. Après une période convenable d'incubation, la force centrifuge est appliquée à la colonne et chasse la phase aqueuse dans le moyen de filtration car celui-ci est alors perméable. Cette transformation pro-35 voque la séparation de la phase insoluble dans l'eau et de la phase soluble, l'une des phases pouvant être ensuite collectée et analysée.

En pratique, le moyen de retenue et de filtration est sous forme d'un disque qui peut être préparé à partir de diverses 40 feuilles poreuses. La matière peut être le polyéthylène, le poly-propylène, le «Teflon» ou analogue. En outre, des matières minérales telles que le verre et une céramique peuvent également être utilisées. Dans des exemples, on utilise une feuille de polyéthylène ayant une épaisseur d'environ 1,65 mm et une po-45 rosité de 25 ± 3 microns. On peut utiliser des porosités comprises entre environ 20 et 150 microns et de préférence entre environ 25 et 40 microns. On découpe des disques de diamètre externe compris entre 7,87 et 8,03 mm dans la feuille, et on les place avec un outil convenable dans la partie inférieure du corps so cylindrique de la colonne.

Les colonnes elles-mêmes peuvent être formées d'une matière presque quelconque telle que le verre, une matière plastique ou analogue. Une matière avantageuse est le polystyrène qui est transparent, léger, durable et peut être utilisé efficace-55 ment le cas échéant pour l'immobilisation des antisérums, des enzymes, des ligands par affinité, par mise en œuvre de l'adsorp-tion physique ou de liaisons covalentes. Une colonne destinée à être utilisée avec l'appareil «Centria» a une longueur d'environ 10 cm et un diamètre externe du corps d'environ 1 cm. Elle peut 60 contenir 2,5 cm3 de liquide environ. Le bout a un diamètre externe d'environ 1 mm et le réservoir supérieur a un diamètre externe de 2 cm. D'autres colonnes peuvent être préparées rapidement avec une dimension plus faible ou plus grande que celle qu'on a indiquée.

65 Comme noté précédemment, le moyen de retenue et de filtration est imperméable aux solutions aqueuses à la pression atmosphérique. Il est aussi imperméable aux solutions aux faibles pressions dues au champ centrifuge. Ainsi, les échantillons

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et réaetivs peuvent être mélangés et transportés dans une co- miné, l'élution de l'enzyme, de la matière analysée non liée et de lonne par la force centrifuge sans passage de liquide à travers le la matière de marquage radioactive s'effectue. Dans une va-disque formant filtre. Ce n'est que lorsque la force centrifuge riante, lorsque l'enzyme protéolitique est le plus stable en solu-atteint une valeur convenable que le disque devient perméable. tion aqueuse, un traitement préalable peut être utilisé de façon Par exemple, on constate que, lorsque les dispositifs de réac- s satisfaisante par disposition des échantillons de sérum et d'en-tion et de séparation sont utilisés avec un disque de transport de zyme dans les cavités interne et externe du disque de transport, l'appareil «Centria» ayant un rayon de 13 cm, le disque du filtre Lorsque le moteur accélère, les réactifs se mélangent et sont est imperméable aux liquides à des vitesses inférieures ou égales transportés simultanément dans la colonne de réaction et de à 100 tr/min, mais devient perméable lors d'addition d'éluants, séparation dans laquelle a lieu l'incubation.

à des vitesses mainteneues à 200 tr/min et au-delà. La force io Le dispositif de réaction et de séparation selon l'invention centrifuge qui donne sa perméabilité au disque est évidemment convient parfaitement aux tests d'analyse radioimmunologique fonction de la vitesse de l'appareil et de la distance du dispositif de l'hormone de stimulation de la thyroïde, effectués avec la au centre de rotation. appareil «Centria». Ce test met en œuvre la réaction immunolo-

Une particularité originale du dispositif de réaction et de gique dans laquelle les molécules marquées et non marquées séparation selon l'invention est qu'il peut être utilisé suivant 15 d'hormone de stimulation de la thyroïde entrent en concurrence plusieurs modes utiles. Ainsi, le dispositif peut être utilisé sous pour la fixation sur des sites d'une molécule d'un anticorps spé-forme d'une chambre de réaction lorsqu'un ou plusieurs réactifs, cifique. L'appareil «Centria» met en çeuvre la force centrifuge par exemple des anticorps, des enzymes, des protéines, des li- pour le mélange des différents réactifs en même temps et après gands par affinité, des matières d'échange d'ions ou des cellules incubation pour la séparation de l'antigène lié et de l'antigène sont fixés à la paroi de la colonne. On peut aussi l'utiliser comme 20 libre, dans les colonnes contenant un second anticorps sur les chambre de réaction contenant un ou plusieurs réactifs immobi- supports en phase solide. Le disque ou autre moyen de retenue lisés dans une matière ou un support ou sur une telle matière ou placé au fond de la colonne a une porosité et une composition un tel support, notamment du Polyacrylamide, de la «Sepha- , telles que tout le fluide transporté reste dans la colonne et peut rose», de l'agarose, d'autres matières naturelles, des polymères être absorbé. Ce n'est que lorsque la force centrifuge dépasse synthétiques ou des matières minérales telles que le verre et les 25 celle qui est nécessaire au transport des fluides du disque que le céramiques. La matière de support peut être par exemple sous liquide sort de la colonne.

forme d'un gel déshydraté, d'une matière rigide, de perles ou de On considère maintenant des exemples d'utilisation du dis poudre. En outre, on peut l'utiliser comme chambre pour des positif.

réactions mettant en œuvre des microorganismes, des virus, des constituants du sang entier, des tissus et analogue. En outre, le 30 Exemple 1

dispositif est utile sous forme d'une chambre de réaction lorsque Cet exemple concerne une courbe témoin obtenue en milieu le mélange de deux ou plusieurs solutions provoque la formation aqueux d'antisérum à angiotensine I immobilisé dans un poly-d'une phase insoluble qui doit être ensuite filtrée. acrylamide.

Le dispositif selon l'invention peut être avantageusement On transporte une quantité d'antisérum à angiotensine I

utilisé pour des analyses immunologiques en phase solide de 35 piégé dans du Polyacrylamide qui suffit à la liaison d'environ faible et grande durées. Cependant, il est surtout avantageux 50% de l'antigène marqueur, dans des colonnes de polystyrène lorsque le temps de réaction est très court, c'est-à-dire infé- ayant à leur base des disques de polyéthylène imperméables à

rieure à 5 min, et en particulier lorsque deux phases doivent être l'eau. On introduit manuellement à la pipette dans la cavité séparées rapidement. Ce sont pour ces courts temps de réaction externe du disque de transport d'un appareil «Centria»

que les procédés manuels ne sont pas suffisamment rapides pour 40 100 mm3 d'angiotensine I-(125I) dilué dans un tampon de tris-que plusieurs échantillons puissent être traités. acétate (0,1 M, pH 7,4, contenant 0,1 % d'albumine de sérum

Le dispositif de réaction et de séparation selon l'invention bovin), suffisant pour donner un nombre de 20 000 par fraction peut être utilisé efficacement pour la mise en œuvre d'un traite- de 100 mm3. Des témoins d'angiotensine I contenant 100 à ment préalable enzymatique qui assure la libération de la ma- 0 ng/cm3 de tampon de tris-acétate sont préparés et 300 mm3 de tière par rapport à des protéines du sérum, avec simultanément « chaque concentration témoin sont introduits à la pipette en dou-une analyse immunologique. Un tel procédé peut être mis en ble dans des cavités externes convenables du disque de transœuvre de la manière suivante. Par exemple, le dispositif de réac- port. Les colonnes contenant l'antisérum piégé dans le sel sont tion et de séparation est chargé d'une partie d'antisérum piégé placées dans les tubes à essai et disposées dans le module d'incu-dans du Polyacrylamide déshydraté, ayant des pores suffisam- bation et de séparation de l'appareil «Centria» avec le disque de ment petits pour que, après hydratation, les enzymes ou pro- so transport. Une centrifugation de 15 s dans l'appareil provoque téines de poids moléculaire faible et moyen soient exclus. Une le transfert de 400 mm3 dans les colonnes.

quantité suffisante d'enzyme protéolitique qui permet la déna- Après incubation de 15 min, une centrifugation à grande turation ou l'hydrolyse d'une protéine du sérum qui est liée à la vitesse commence et on ajoute 4 cm3 de tampon de trisacétate matière analysée intéressante est mélangée à l'antisérum ana- par tube au disque de transport, afin que le marqueur non lié lysé. Les échantillons de sérum et des marqueurs radioactifs sont55 soit élué rapidement et simultanément des gels. La solution d'é-transportés par la force centrifuge dans le dispositif de réaction lution contenant l'angiotensine I-(125I) non lié est collectée dans et de séparation. Après hydratation de gel et solubilisation de des tubes placés sous chaque colonne et est comptée par le l'enzyme, deux opérations commencent: la libération de la ma- module de comptage gamma triple de l'appareil «Centria». Les tière analysée liée aux protéines, et sa diffusion et sa liaison à colonnes sont aussi comptées afin que la fraction liée soit déter-I'antisérum dans le gel de support. Après un temps prédéter- 60 minée.

B/T =

On calcule les résultats de la manière suivante: nombre dans la colonne (lié)

nombre dans la colonne (lié) + nombre élué (libre) % lié: B/T X 100%

_ % lié pour chaque témoin

% lié pour la concentration témoin de l'incubât de 0 ng/cm3

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On forme ainsi une courbe de sensibilités en fonction de la dose à partir des résultats et on porte la courbe sur papier semi-logarithmique. On détermine la liaison non spécifique de l'antigène au gel et à la colonne par piégeage de sérum normal de lapin dans le support de Polyacrylamide et par incubation et élution analogues. On observe une valeur inférieure à 4%

Exemple 2

Cet exemple concerne une analyse automatique de cortisol par mise en œuvre d'un traitement préalable par chauffage.

On prépare des témoins de cortisol par dilution initiale de cortisol dans de l'éthanol à 95% puis dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1 N (pH 7,4,0,5 % de «Tween» 20). On dilue alors ces témoins dans du sérum traité préalablement avec du charbon actif afin que le cortisol endogène soit supprimé. On dilue des échantillons cliniques avec les témoins à base de sérum dans une solution tampon de dénaturation (90% de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,4 contenant 0,05 % de «Tween» 20 et 10% de méthanol) et on chauffe à 60 °C pendant 30 min afin que la globuline liant le cortisol soit détruite.

Après traitement thermique préalable, les témoins et les échantillons sont placés à la pipette sur le disque de transport de l'appareil «Centria» avec du cortisol marqué radioactivement et une solution témoin (phosphate de sodium 0,1 M contenant 0,05 % de «Tween» 20 à pH 7,4) pour un volume total de 350 mm3. Le contenu du disque est transporté dans le cercle de tubes portant les colonnes contenant de l'antisérum à cortisol piégé dans du Polyacrylamide. Après incubation de 15 min, la fraction on liées du cortisol marqué est retirée par rinçage comme décrit précédemment avec 4 cm3 de tampon phosphate/ «Tween» par tube. Les colonnes et les tubes sont alors comptés par le compteur à trois tubes de l'appareil «Centria» et les résultats obtenus sont utilisés pour la formation d'une courbe de référence.

Les échantillons cliniques étudiés par mise en œuvre de ce procédé présentent une bonne corrélation avec les valeurs prévues, surtout lors de la comparaison avec des résultats obtenus par analyse en solution avec le même antisérum.

Exemple 3

Cet exemple concerne l'analyse automatique du cortisol par mise en œuvre d'enzyme protéolitique pour la destruction de globuline de fixation de cortisol.

L'essai est réalisé comme décrit dans l'exemple précédent, mis à part l'élimination du traitement thermique et du tampon de dénaturation. L'inactivation des globulines de liaison de cortisol a lieu dans les cavités du disque de transport lorsque 150 mm3 d'une solution de pepsine (4 mg/cm3 dans HCl 0,14 N, 4100 unités/mg), 50 mm3 d'un témoin de cortisol à base de sérum, 100 mm3 d'un composé de marquage et 50 mm3 de tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,4,0,05 % de «Tween» 20) subissent une incubation préalable pendant 5 min environ avant transport dans les colonnes contenant l'antisérum à cortisol piégé dans du Polyacrylamide.

Des sérums témoins analysés par cette technique donnent une bonne corrélation avec les valeurs prévues. Des études de récupération, en parallèle et de fixation de protéines dans les analyses donnent aussi d'excellents résultats.

Exemple 4

Cet exemple concerne l'analyse radioimmunologique par mise au point dans une colonne de réaction et de séparation d'une courbe témoin en solution aqueuse pour le cortisol.

Une colonne de polystyrène est munie d'une disque poreux semi-perméable de polyéthylène par introduction de 1 cm3 d'antisérum à cortisol dilué dans une solution tampon de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,4. Après 1 à 2 h d'incubation 5 avec la solution d'antisérum, la colonne est vidée d'antisérum non adsorbé par aspiration. On ajoute une solution saline normale (1,5 cm3) dans la colonne et on la retire immédiatement par aspiration. On répète l'opération de rinçage à la solution saline et on remplit alors la colonne d'une solution saline conte-îo nant de l'albumine de sérum bovin (0,5 %). Après une courte incubation avec la solution d'albumine de sérum bovin (10 à 30 min), on vide la colonne par aspiration et on la sèche à l'air. On peut utiliser la colonne ayant l'antisérum immobilisé sur sa paroi interne, immédiatement pour l'analyse du cortisol ou on peut la 15 conserver à l'état desséché à température ambiante et l'utiliser dans les deux à trois mois.

On forme une courbe témoin pour le cortisol soit manuellement, soit à l'aide des modules à pipette et de séparation et 20 d'incubation de l'appareil «Centria». On introduit alors à la pipette dans des cavités du disque de transport de l'appareil «Centria» des quantités normales connues de cortisol-(12SI) marqué et de solution tampon de phosphate de sodium 0,1 M (pH 7,4) jusqu'à 1,0 cm3 au total. Les colonnes revêtues d'anti-25 corps sont placées dans des tubes à essai puis disposées avec le disque de transport dans le module d'incubation et de séparation de l'appareil «Centria». Une centrifugation de 15 s provoque le transport des constituants de la réaction, correspondant à 1 cm3, dans les colonnes revêtues d'anticorps dans lesquelles 30 l'incubation statique est réalisée. Après 1 à 2 h, on fait subir une centrifugation aux colonnes avec addition de 200 cm3 par tube de solution tampon de phosphate de sodium 0,1 M pour le rinçage de la colonne et l'enlèvement du marqueur non lié. La solution tampon qui contient le marqueur non lié est collectée 35 dans les tubes supportant les colonnes. Le compteur gamma de l'appareil «Centria» est utilisé pour le contrôle du cortisol-(125I) lié dans les tubes. La liaison non spécifique du marqueur à la surface de la colonne du polystyrène est déterminée par élimination de l'incubation de l'antisérum et traitement d'une colonne 40 par l'albumine de sérum bovin uniquement.

Les résultats sont calculés comme indiqué précédemment. On porte les valeurs obtenues qui forment une courbe de référence indiquant le pourcentage lié en fonction de la concentration du cortisol dans chaque référence.

Exemple 5

Cet exemple concerne la séparation chromatographique par affinité de l'antisérum à cortisol des protéines du sérum. 50 On place une certaine quantité de cortisol lié par des liaisons covalentes à de la «Sepharose»-4-B dans une colonne de polystyrène ayant un disque de polyéthylène et disposée dans l'appareil d'incubation et de séparation «Centria». De l'antisérum brut à cortisol (100 mm3) dilué par 300 mm3 de solution tampon 55 de phosphate de sodium 0,1 M à pH 7,4 est ajouté à la colonne de réaction et de séparation contenant l'haptène immobilisé. Après un temps convenable, on fait subir une centrifugation à la colonne et une élution simultanée avec une solution tampon qui retire la fraction non liée. Les protéines du sérum et les consti-60 tuants non liés collectés dans les tubes portant les colonnes sont retirés. On place alors des tubes à essai propres et on répète l'opération, en remplaçant la solution tampon de phosphate par une solution acide ou chaotropique. Après élution centrifuge, l'antisérum à cortisol est récupéré dans les tubes à essai.

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1 feuille dessins