DE2908957C2

DE2908957C2 -

Info

Publication number: DE2908957C2
Application number: DE19792908957
Authority: DE
Inventors: Jean-Claude Nicolas; Anne-Marie Boussioux; Bernard Descomps; Andre Prof. Montpellier Fr Crastes De Paulet
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1978-03-09
Filing date: 1979-03-07
Publication date: 1990-05-17
Also published as: DE2908957A1; FR2419519B1; GB2017906B; GB2017906A; FR2419519A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E₁ und E₂ in biologischen Medien, insbesondere in Plasma und in Urin, wobei man eine gereinigte 17b-Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta in Gegenwart von NADP oder eines NADP- Analogen sowie einer spezifischen NADP-Dehydrogenase und eines NADPH-bildenden Substrates einsetzt.The invention relates to a method for the enzymatic determination of the estrogens E₁ and E₂ in biological media, in particular in plasma and in urine, wherein a purified 17 b -estradiol dehydrogenase from placenta in the presence of NADP or a NADP analogue and a specific NADP- Dehydrogenase and a NADPH-forming substrate.

Die genaue Kenntnis der Menge von Steroidhormonen, insbesondere der Menge Östron und Östradiol, die im Urin und im Plasma vorhanden sind, hat für den Kliniker, insbesondere für den Gynäkologen, eine wachsende Bedeutung bei der Feststellung einer sicheren Diagnose und bei der Erstellung einer wirksamen Therapie, insbesondere bei Ovarial-Insuffizienz, bei Störungen der Östrogen- Biosynthese, bei der Überwachung problematischer Schwangerschaften etc. Eine derartige Kenntnis macht es jedoch erforderlich, daß man über Techniken der Östrogen-Bestimmung verfügt, die spezifisch, genau und empfindlich, zuverlässig, reproduzierbar und relativ wenig kostspielig sind und durchgeführt werden können, ohne daß man von dem Techniker, der die Bestimmung durchführt, besondere Fähigkeiten und Geschicklichkeiten fordern muß.The exact knowledge of the amount of steroid hormones, in particular the amount of estrone and estradiol present in the urine and plasma for the clinician, especially for the gynecologist, a growing importance in determining a safe Diagnosis and when creating an effective therapy, especially with ovarian insufficiency, with disorders of the estrogen Biosynthesis, in monitoring problematic pregnancies etc. However, such knowledge requires that you have techniques of estrogen determination that are specific, accurate and sensitive, reliable, reproducible and are relatively inexpensive and can be carried out without the technician performing the determination special skills and abilities.

Im Laufe der letzten Jahre wurden mehrere Methoden zur Mikrobestimmung von Östrogenen vorgeschlagen, die den Forderungen der Kliniker entsprechen sollen. Die bislang am häufigsten verwendeten Methoden der Mikrobestimmung sind:Over the past few years, several methods of micro-determination have been developed proposed by estrogens who meet the demands of Clinicians are supposed to match. The most used so far Micro-determination methods are:

die Mikrobestimmung durch Fluoreszenz,
die radioimmunologische Bestimmung.micro determination by fluorescence,
the radioimmunological determination.

Die erstere, d. h. die Bestimmung durch Fluoreszenz, bestimmt die gesamten Phenole des Harnes, Östradiol, Östron und Östriol und umfaßt vier Stufen: eine Stufe der Hydrolyse der konjugierten Verbindungen; eine Stufe der Extraktion, welche eine kostspielige und langwierige Phase der Bestimmung ist und die Handhabung großer Mengen sehr reiner Lösungsmittel erfordert; eine Stufe der Entwicklung des Chromophors; und eine Stufe der Ablesung. Auf alle Fälle ist der Wert dieser Bestimmung begrenzt, da sie keine große Spezifität hat und deshalb durch die Mediziner nur mit der äußersten Vorsicht angewendet werden kann.The former, d. H. the determination by fluorescence, determines the total phenols of urine, estradiol, estrone and estriol and includes four stages: one stage of hydrolysis of the conjugated compounds; a stage of extraction which is an expensive one and lengthy phase of determination and handling requires large amounts of very pure solvents; a step the development of the chromophore; and a level of reading. In any case, the value of this provision is limited as it has no great specificity and therefore only by the doctors can be used with extreme caution.

Was den zweiten Typ der bislang vorgeschlagenen Bestimmung anbelangt, nämlich die radioimmunologische Bestimmung, obwohl sie viel genauer als die Bestimmung durch Fluoreszenz ist und die getrennte Bestimmung von Östradiol, Östron und Östriol im Plasma erlaubt, hat sie jedoch den Nachteil, daß sie teuer ist und die Verwendung von radioaktiven Isotopen erforderlich macht, wodurch ihre Verwendung auf Laboratorien beschränkt ist, welche eine geeignete, sehr kostspielige Einrichtung besitzen und aufgrund einer speziellen Vereinbarung mit dem Gesundheitsministerium dazu berechtigt sind.As for the second type of provision proposed so far, namely the radioimmunological determination, although it is much more accurate than the determination by fluorescence and the separate determination of estradiol, estrone and estriol in Permitted plasma, but it has the disadvantage that it is expensive and Requires use of radioactive isotopes, which their use is limited to laboratories that have a suitable, own very expensive facility and due to a special agreement with the Ministry of Health are entitled.

Methoden zur enzymatischen Bestimmung von Östrogenen sind übrigens in der Literatur beschrieben (M. HÄRKONEN, H. ADLERKREUZ, E. V. GROMAN, Journal of Steroid Biochemistry 1974 Vol. 5, Seiten 717-725), aber infolge ihrer Schwierigkeit können sie nicht klinisch verwendet werden. Diese Methoden beschreiben die Bestimmung von Östradiol und Östron mit Hilfe von 17β-Östradiol- Dehydrogenase aus der Placenta, welche mit NADP⁺ (Phospho- Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid, Coenzym der Dehydrogenase) bzw. NADPH verbunden ist, wobei das Östradiol von den anderen reaktiven Steroiden, die im Plasma vorhanden sind, durch Chromatographie über einer Aluminiumoxid-Kolonne gereinigt wird. Die enzymatische Dismutation zwischen NADP⁺ und NADPH wird gemäß der in der oben genannten Publikation beschriebenen Methode durchgeführt, indem man Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) und Glutamat-Dehydrogenase verwendet, wobei man eine Verstärkung von 10 000 erreicht; der enzymatische Kreislauf ist erforderlich, um das während der Reaktion gebildete NADPH zu messen, weil im Plasma der nicht-schwangeren Frau nur eine sehr geringe Konzentration an Östradiol vorhanden ist (1 nMol/l). Das gebildete 6-Phosphogluconat wird durch Fluorometrie unter Verwendung von 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase und NADP⁺ bestimmt. Es ist in dieser Publikation angegeben, daß die beschriebene Methode eine Nachweisempfindlichkeit von 25 fMol Steroid und eine Bestimmungsgenauigkeit von 14% gestattet und daß ihre Spezifität vergleichbar ist mit der radioimmunologischen Bestimmung. Doch weisen die Autoren der Publikation auf die Schwierigkeit der Methode hin, insbesondere beim enzymatischen Kreislauf, wodurch die Anwendung ihrer Methode bei Routineanalysen im Laboratorium verhindert wird.Incidentally, methods for the enzymatic determination of estrogens have been described in the literature (M. HÄRKONEN, H. ADLERKREUZ, EV GROMAN, Journal of Steroid Biochemistry 1974 Vol. 5, pages 717-725), but due to their difficulty they cannot be used clinically. These methods describe the determination of estradiol and estrone with the help of 17 β- estradiol dehydrogenase from the placenta, which is associated with NADP⁺ (phospho-nicotinamide adenine dinucleotide, coenzyme of dehydrogenase) or NADPH, the estradiol being from the other reactive steroids, which are present in the plasma, is purified by chromatography on an alumina column. The enzymatic dismutation between NADP⁺ and NADPH is carried out according to the method described in the above publication using glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) and glutamate dehydrogenase, achieving a gain of 10,000; the enzymatic cycle is required to measure the NADPH formed during the reaction because the plasma of the non-pregnant woman has a very low concentration of estradiol (1 nmol / l). The 6-phosphogluconate formed is determined by fluorometry using 6-phosphogluconate dehydrogenase and NADP⁺. It is stated in this publication that the method described allows a detection sensitivity of 25 fmol steroid and a determination accuracy of 14% and that its specificity is comparable to the radioimmunological determination. However, the authors of the publication point out the difficulty of the method, especially in the enzymatic cycle, which prevents the use of their method for routine analyzes in the laboratory.

Es wurde nun gefunden, daß die Schwierigkeit dieser Methode nicht der einzige Grund ist, um ihre Verwendung für die enzymatische Routinebestimmung im Laboratorium zu verhindern.It has now been found that the difficulty of this method is not the only reason is to use them for the enzymatic To prevent routine determination in the laboratory.

Wie ebenfalls aus dem Stand der Technik hervorgeht, ist es bekannt, daß 17β-Östradiol-Dehydrogenase (das Enzym ist nach der internationalen Klassifikation als E.C.1.1.1.62 bezeichnet) nicht nur eine Dehydrogenase-Wirkung hat (NAD⁺ → NADH; NAD⁺ = Nikotinamid- Adenin-Dinucleotid), sondern auch eine Transhydrogenase- Wirkung hat: in Gegenwart von NADPH (in geringer Menge) findet eine Übertragung und Bildung von NADH statt (wobei das Östrogen in oxidierter oder reduzierter Form an dieser Transhydrierungsreaktion teilnimmt).As is also apparent from the prior art, it is known that 17 β-estradiol dehydrogenase (the enzyme is referred to as the international classification EC1.1.1.62), not only a dehydrogenase effect (NAD⁺ → NADH, NAD ⁺ = nicotinamide adenine dinucleotide), but also has a transhydrogenase effect: in the presence of NADPH (in small amounts) there is transmission and formation of NADH (the estrogen taking part in this transhydrogenation reaction in oxidized or reduced form).

Der Zyklus der Bildung von NADP → NADPH in Gegenwart eines Enzyms wie Glucose-6-P-Dehydrogenase ist ebenfalls bekannt. Es genügt daher, wenn der folgende Zyklus gebildet wird (der im Schema 1 dargestellt ist), unter solchen Konzentrationsbedingungen der Cofaktoren, daß NADH in meßbaren Mengen entsteht, die proportional der Konzentration an Östradiol und Östron sind:The cycle of formation of NADP → NADPH in the presence of an enzyme such as glucose-6-P-dehydrogenase is also known. It is sufficient therefore, if the following cycle is formed (the one in the scheme 1), under such concentration conditions of the cofactors, that NADH arises in measurable amounts that are proportional the concentration of estradiol and estrone are:

Schema 1 Scheme 1

Diese Methode der enzymatischen Bestimmung der Gesamt-Östrogene Östron (E₁) + Östradiol (E₂) ist zwar viel einfacher als die tatsächlich verwendeten Bestimmungsmethoden und theoretisch sehr verlockend; leider ist sie in der Praxis jedoch nicht befriedigend, insbesondere hinsichtlich der Genauigkeit der erhaltenen Resultate: die Reaktionsgeschwindigkeit, die durch die Kinetik des Auftretens von NADH bestimmt wird, ist nämlich eine Funktion der Konzentration der Östrogene E₁ und E₂.This method of enzymatic determination of total estrogens Oestrone (E₁) + oestradiol (E₂) is much easier than that determination methods actually used and theoretically very much tempting; unfortunately in practice it is not satisfactory, especially with regard to the accuracy of the received Results: the rate of reaction by the kinetics the occurrence of NADH is a function the concentration of estrogens E₁ and E₂.

Nun ist die 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta mit zwei Arten von Verunreinigungen behaftet, welche die Genauigkeit der Bestimmung beträchtlich beeinflussen:Now the 17 β- estradiol dehydrogenase from placenta is contaminated with two types of impurities, which have a considerable influence on the accuracy of the determination:

sie enthält Steroide, insbesondere Östradiol, in nicht vernachlässigbaren Mengen, deren Anwensenheit die Resultate in umso größerem Ausmaß verfälscht als es nötig ist, die 17β- Östradiol-Dehydrogenase in relativ großen Mengen zu verwenden, wodurch in das Milieu eine umso größere Menge an Verunreinigungen eingebracht wird;
sie enthält als Verunreinigung auch andere nicht Östradiol-abhängige- Transhydrogenasen, deren Anwesenheit eine weitere Fehlerquelle darstellt.it contains steroids, in particular estradiol in non-negligible amounts whose Anwensenheit falsifies the results in all the more greater extent than it is necessary, the 17 β - estradiol dehydrogenase in relatively large quantities to be used, thereby in the milieu an even larger amount of impurities is introduced;
it also contains other non-estradiol-dependent transhydrogenases as impurities, the presence of which represents a further source of error.

Die Verfahren gemäß dem Stand der Technik weisen die Nachteile unzureichender Genauigkeit und Reproduzierbarkeit, ungenügender Spezifität und komplizierter Durchführungsweise auf.The methods according to the prior art have the disadvantages inadequate accuracy and reproducibility, inadequate Specificity and complicated implementation.

Demgegenüber liegt vorliegender Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E₁ und E₂ in biologischen Medien zu liefern, das einfach durchführbar ist und mit großer Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Spezifität funktioniert, welches den Anforderungen der Praxis besser entspricht, als die bislang bekannten Verfahren und insbesondere spezifisch, sehr genau, zuverlässig, wenig kostspielig, relativ einfach durchführbar ist und im Vergleich zu dem in der Literatur beschriebenen Verfahren zur enzymatischen Bestimmung nicht nur die nicht Östradiol-abhängigen Transhydrogenasen beseitigt, welche die 17β-Östradiol- Dehydrogenase aus Placenta begleiten, welche zur Reduktion von NAD in NADH eingesetzt wird, und auch eine totale Eliminierung des mit der 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta eingeschleppten Östradiols gewährleistet, so daß die enzymatische Bestimmung unter so genauen und zuverlässigen Bedingungen abläuft, wie sie im Stand der Technik nicht erreicht werden konnten.In contrast, the present invention has for its object to provide a method for the enzymatic determination of the estrogens E₁ and E₂ in biological media that is easy to carry out and works with great accuracy, reproducibility and specificity, which meets the requirements of practice better than the previously known Method and in particular specific, very accurate, reliable, inexpensive, relatively easy to carry out and, in comparison to the method for enzymatic determination described in the literature, not only eliminates the non-estradiol-dependent transhydrogenases which the 17 β- estradiol dehydrogenase from placenta accompanying, which is used for the reduction of NAD in NADH, and also ensures a total elimination of the estradiol introduced with the 17 β -estradiol dehydrogenase from placenta, so that the enzymatic determination takes place under as precise and reliable conditions as they could not be achieved in the prior art.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Verfahren der eingangs genannten Gattung dadurch gelöst, daß man eine 17β-Östradiol-Dehydrogenase aus Placenta verwendet, die von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit ist, und daß man in Gegenwart von NAD oder eines NAD-Analogen, welches durch das Enzym anerkannt wird, arbeitet. This object is achieved according to the invention in a process of the type mentioned at the outset by using a 17 β- estradiol dehydrogenase from placenta which is freed from steroids and contaminating non-estrogen-dependent transhydrogenases, and in the presence of NAD or an NAD -Analog, which is recognized by the enzyme, works.

Besondere Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind dadurch gekennzeichnet,
daß man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase aus der folgenden Gruppe wählt: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-5-1-13, 1-5-1-15), Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-42), Phosphogluconat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-144), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) (internationale Klassifikation 1-1-1-49), Lactaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1- 1-55), Benzaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-Aspartat-semi-Aldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-11), Glyoxylat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-17),
daß das NADPH-bildende Substrat G6P (Glucose-6-Phosphat) ist, falls das spezifische NADP-Dehydrogenase-Enzym G6PDH ist,
daß die Bestimmungsreaktion in einem Medium stattfindet, das aus einem Puffer mit einem pH-Wert in der Nähe von 7,4 besteht, wobei die Ionenstärke gleich oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers,
daß der Puffer außerdem 0,5 Promille bis 1% Protein ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen enthält, daß das dem Milieu zugesetzte Protein Serum-Albumin, insbesondere Rinder-Serum-Albumin ist.Particular embodiments of the method according to the invention are characterized in that
that one selects the specific enzyme NADP dehydrogenase from the following group: tetrahydrofolate dehydrogenase (international classification 1-5-1-13, 1-5-1-15), isocitrate dehydrogenase (international classification 1-1-42), Phosphogluconate dehydrogenase (international classification 1-1-1-144), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) (international classification 1-1-1-49), lactaldehyde dehydrogenase (international classification 1-1- 1-55 ), Benzaldehyde dehydrogenase (international classification 1-2-1-7), glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (international classification 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-aspartate semi-aldehyde -Dehydrogenase (international classification 1-2-1-11), glyoxylate dehydrogenase (international classification 1-2-1-17),
that the NADPH-forming substrate is G6P (glucose-6-phosphate) if the specific NADP dehydrogenase enzyme is G6PDH,
that the determination reaction takes place in a medium consisting of a buffer with a pH value in the vicinity of 7.4, the ionic strength being equal to or less than that of a 0.1 molar buffer,
that the buffer also contains 0.5 per mille to 1% protein without substantial affinity for estrogens, that the protein added to the environment is serum albumin, in particular bovine serum albumin.

Weitere besondere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet,
daß die Bestimmung in Gegenwart von NAD oder einem seiner Analogen durchgeführt wird, wie Acetyl-NAD oder Thio-NAD,
daß das NAD und NADPH-bildende Substrat im Überschuß vorhanden sind,
daß die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10^-3- bis 10^-4-molar ist, diejenige des NADP 10^-6- bis 10^-7- molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu NADP etwa 10^-3 ist,
daß das Reaktionsgemisch, welches die Reaktionskomponenten und die zu bestimmenden Substanzen enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25 bis 38°C inkubiert wird,
daß die Proben der biologischen Media, welche die zu bestimmenden Östrogene E₁ und E₂ enthalten, vor dem Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs- oder Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren unterworfen werden,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Plasma besteht, diese vorher einem an sich bekannten Extraktionsverfahren mit z. B. Äther unterworfen werden, worauf man mehrmals mit den geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem polaren Lösungsmittel und einem Puffer, dessen Ionenstärke praktisch gleich derjenigen eines 0,1 M-Puffers ist, löst, und der eine geringe Menge eines Proteins ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie 15 bis 25% eines Polyols enthält,
daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Urin besteht, dieses vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines die konjugierten Verbindungen hydrolysierenden Enzyms, wie z. B. "β-Glucuronidase" Pasteur, unterworfen wird. Other special embodiments are characterized in that
that the determination is carried out in the presence of NAD or one of its analogs, such as acetyl-NAD or thio-NAD,
that the NAD and NADPH-forming substrate are present in excess,
that the amount of NAD in the reaction medium is 10 ^-3 to 10 ^-4 molar, that of the NADP is 10 ^-6 to 10 ^-7 molar and the concentration ratio of NAD to NADP is about 10 ^-3 ,
that the reaction mixture, which contains the reaction components and the substances to be determined, is incubated before reading the optical density for 2 to 12 hours, preferably 3 to 9 hours, at a temperature of 20 to 40 ° C, preferably at 25 to 38 ° C ,
that the samples of the biological media containing the estrogens E 1 and E 2 to be determined are subjected to a preparation or extraction and / or purification process before the determination process,
that if the biological medium containing the estrogens to be determined consists of plasma, this previously a known extraction method with z. B. ether, whereupon it is washed several times with the appropriate solvents, evaporated and the last evaporation residue in a mixture of a polar solvent and a buffer, the ionic strength of which is practically equal to that of a 0.1 M buffer, and the one contains a small amount of a protein with no substantial affinity for estrogens and 15 to 25% of a polyol,
that if the biological medium containing the estrogens to be determined consists of urine, this beforehand a preparation process with the aid of an enzyme which hydrolyzes the conjugated compounds, such as, for. B. " β- Glucuronidase" Pasteur is subjected.

Beansprucht wird weiterhin eine anwendungsfertige Kombination zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur) das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10^-2-10^-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10^-6-10^{- 8} M,
Glucose-6-P: 10^-2-10^-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1% Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5.A ready-to-use combination for carrying out the method according to the invention is furthermore claimed, which is characterized in that
that it essentially contains the following predetermined and lyophilized components:
17, the enzyme β-estradiol dehydrogenase, which is freed from contaminating steroids and non-estrogen-dependent transhydrogenases, and is conserved in a suitable polyol, in particular glycerol,
an internal standard (which contains a known excess of estrogens),
a control (blanc),
an enzyme for the hydrolysis of the conjugated compounds contained in the urine (such as " β- glucuronidase" Pasteur) which was previously determined in function of the amount of the urine sample to be treated,
NAD: 10 ^-2 -10 ^-4 M,
Glucose-6-PDH: 0.1 IU / ml of the sample to be determined,
NADP: 10 ^-6 -10 ^{- 8} M,
Glucose-6-P: 10 ^-2 -10 ^-4 M,
BSA buffer (bovine serum albumin): 0.5 per thousand to 1% Tris HCl buffer 0.05 M, pH about 7.5.

Besondere Ausführungsformen sind dadurch gekennzeichnet,
daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Tris HCl-Puffer, 15 bis 25% Polyol, + 0,5 Promille bis 1% BSA (Puffer A) und etwa 0,5 ml Puffer A + 2 ×10^-3 M NAD, 2×10^-6 M NADP, 2×10^-3 M Glucose- 6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase/ml (Puffer B) besteht,
daß der innere Standard aus einem Gemisch des obigen Puffers B und des Puffers A, der 1600 Picogramm Östradiol/ml und 0,02 I.E. 17β-Östradiol-Dehydrogenase enthält, besteht. Special embodiments are characterized in that
that the control (blanc) from a mixture of Tris HCl buffer, 15 to 25% polyol, + 0.5 per mil to 1% BSA (buffer A) and about 0.5 ml of buffer A + 2 × 10 ^-3 M NAD , 2 × 10 ^-6 M NADP, 2 × 10 ^-3 M glucose-6-phosphate, 0.2 IU glucose-6-phosphate dehydrogenase / ml (buffer B),
that the internal standard from a mixture of the above buffer B and buffer A, 1600 picograms estradiol / ml and 0.02 IU 17 β-estradiol dehydrogenase comprises, consists.

Unter den Bedingungen des erfindungsgemäßen Verfahrens - im Gegensatz zu den klassischen enzymatischen Bestimmungen - verschwindet die zu bestimmende Substanz, im vorliegenden Falle die Östrogene E₁ und E₂, nicht; sie ist nicht der limitierende Faktor der Reaktionsgeschwindigkeit und die Menge des gebildeten NADH ist direkt proportional der Östrogen-Konzentration.In contrast to the conditions of the method according to the invention to the classic enzymatic determinations - disappears the substance to be determined, in this case the estrogens E₁ and E₂, not; it is not the limiting factor of the reaction rate and the amount of NADH formed is direct proportional to the estrogen concentration.

Es wurde gefunden, daß die absoluten und relativen Mengenverhältnisse des in das Milieu eingeführten NAD bzw. NADP beträchtlich zur Genauigkeit der Bestimmung beitragen, indem die Menge des vorhandenen NADP nicht die oben angegebenen Mengenverhältnisse überschreiten darf, da sonst die Aktivität des Enzyms 17β-Östradiol- Dehydrogenase behindert und deshalb die Resultate verfälscht werden.It has been found that the absolute and relative proportions of gas introduced into the milieu NAD or NADP contribute significantly to the accuracy of the determination by must not exceed the proportions indicated above, the amount of existing NADP, otherwise the activity of the enzyme 17 β-estradiol - Dehydrogenase is hindered and therefore the results are falsified.

Die Antriebskraft zu der gesamten Dosierung besteht nämlich in den Umwandlungen von E₁ und E₂ und dann von E₂ in E₁ (wie weiter oben im Schema 1 angegeben). Diese Umwandlungen führen in jedem Cyclus zur Bildung einer stöchiometrischen Menge NADH. Diese Umwandlungen verlaufen während der Inkubationszeit. So entsteht am Ende von x Cyclen, welche einer bestimmten Inkubationsdauer entsprechen, eine Menge NADH, die dem x-fachen der stöchiometrischen Menge des Substrats (E₁ und/oder E₂), im Milieu entspricht, welche Menge NADH dann gut feststellbar ist. The driving force for the total dosage is namely the conversions from E₁ and E₂ and then from E₂ to E₁ (as indicated above in Scheme 1). These conversions lead to the formation of a stoichiometric amount of NADH in each cycle. These conversions take place during the incubation period. Thus, at the end of x cycles, which correspond to a certain incubation period, an amount of NADH which corresponds to x times the stoichiometric amount of the substrate (E 1 and / or E 2) in the environment, which amount of NADH can then be easily determined.

Außer den oben genannten Ausführungsformen betrifft die Erfindung auch andere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.In addition to the above-mentioned embodiments, the invention relates to also other embodiments resulting from the following description emerge.

In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutert, ohne daß die Erfindung hierauf beschränkt werden soll.The process according to the invention is described in the following examples explained in more detail without the invention thereon should be restricted.

BeispieleExamples Beispiel 1Example 1 Extraktion und Reinigung der Östrogene des PlasmasExtraction and purification of the estrogens of the plasma

Man versetzt 3,5 ml Plasma mit 100 µl Natriumpyrophosphat- Puffer (0,1 M, pH 9). Der pH-Wert der Plasmaprobe beträgt dann 8,9.3.5 ml of plasma are mixed with 100 μl of sodium pyrophosphate Buffer (0.1 M, pH 9). The pH of the plasma sample is then 8.9.

Anschließend extrahiert man zwei Mal mit 3 ml Äther und der angereicherte Extrakt wird dann unter Stickstoff eingedampft und auf 2 ml konzentriert, dann zwei Mal mit 1 ml Natriumcarbonat (1 Promille) gewaschen. Dann wird der Äther zur Trockne abgedampft und der Trockenrückstand in 1 ml 2 M- Natronlauge aufgenommen. Die wäßrige Phase wird dann zwei Mal mit 2 ml Benzol/Heptan (2 : 1 V/V) gewaschen, dann mit 200 µl 10 M H₃PO₄ neutralisiert und zwei Mal mit 3 ml Äther extrahiert. Nach dem Abdampfen wird der Rückstand mit 100 µl Äthanol und 250 µl Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH 7,4) aufgenommen, der 1 Promille Rinder-Serumalbumin und 20% Glycerin enthält. Then extracted twice with 3 ml of ether and Enriched extract is then evaporated under nitrogen and concentrated to 2 ml, then twice with 1 ml sodium carbonate (1 per mille) washed. Then the ether becomes Dry evaporated and the dry residue in 1 ml of 2 M Sodium hydroxide solution added. The aqueous phase then becomes two Washed once with 2 ml benzene / heptane (2: 1 V / V), then with 200 µl 10 M H₃PO₄ neutralized and twice with 3 ml ether extracted. After evaporation, the residue with 100 ul Ethanol and 250 µl Tris-HCl buffer (0.1 M, pH 7.4) added, containing 1 per mille of bovine serum albumin and 20% glycerin.

Die Östrogenbestimmung wird mit 100 µl dieses Extrakts durchgeführt.The estrogen determination is carried out with 100 μl of this extract.

Bestimmung der ÖstrogeneDetermination of estrogens

Das Reaktionsmilieu besteht aus 1 ml Tris-HCl-Puffer (0,05 M, pH 7,4), der 5 Promille Serumalbumin, 5×10^-3 M Glucose-6-P, 5×10^-4 M NAD, 5×10^-7 M NADP, 0,1 IE Glucose-6-P-Dehydrogenase und 0,03 IE 17β-Östradiol-Dehydrogenase enthält. Die Östrogen- Konzentration des Extrakts beträgt 0,02 bis 2 pMol.The reaction medium consists of 1 ml Tris-HCl buffer (0.05 M, pH 7.4), the 5 per mille serum albumin, 5 × 10 ^-3 M glucose-6-P, 5 × 10 ^-4 M NAD, 5 × Contains 10 ^-7 M NADP, 0.1 IU glucose-6-P-dehydrogenase and 0.03 IU 17 β- estradiol dehydrogenase. The estrogen concentration of the extract is 0.02 to 2 pmoles.

Die Inkubationsdauer beträgt 6 bis 16 Stunden bei 25°C.The incubation period is 6 to 16 hours at 25 ° C.

Die Reaktionsgeschwindigkeit wird bei 340 nm mit Hilfe eines Spektralphotometers gemessen.The reaction rate is measured at 340 nm using a Spectrophotometer measured.

Die Adsorption (bei 340 nm) der verschiedenen Östrogen- Konzentrationen enthaltenden Lösungen wird am Ende der Inkubationsdauer gemessen. The adsorption (at 340 nm) of the various estrogen Solutions containing concentrations will end up the incubation period measured.

ResultateResults

Die optische Dichte bei 340 nm wird nach 6 bis 16 Stunden Reaktionsdauer bestimmt. Die beigefügte Abbildung zeigt die Kurve I für den Standard, erhalten mit Östradiolmengen zwischen 0,020 und 2 Picomol, das heißt, 5 bis 500 pg nach 6 Stunden Reaktionsdauer; die Kurve II gibt die optische Dichte wieder, die man bei den gleichen Mengen Östradiol nach 16 Stunden Inkubation erhält.The optical density at 340 nm becomes after 6 to 16 Hours of reaction time determined. The attached picture shows curve I for the standard obtained with amounts of estradiol between 0.020 and 2 picomoles, the means 5 to 500 pg after 6 hours of reaction time; the Curve II shows the optical density that one at the same amounts of estradiol after 16 hours of incubation receives.

Die Eichkurve verläuft in einem sehr großen Bereich linear. Sie deckt den Bereich der physiologisch auftretenden Konzentrationen, einschließlich derjenigen des nicht geschlechtsreifen Kindes und des Mannes, ab.The calibration curve runs in a very large area linear. It covers the area of physiologically occurring Concentrations, including those of the non-sexually mature child and the man.

Normalerweise ist bei den Bestimmungen durch die fluorometrischen Methoden, die derzeit im Stand der Technik durchgeführt werden, die Empfindlichkeit begrenzt durch das Ausmaß der Hintergrund-Fluoreszenz, welche durch den biologischen Extrakt beigetragen wird. Nach der erfindungsgemäßen Bestimmungsmethode ist es wegen der großen Verstärkung nicht nötig, die Ablesungen durch Fluoreszenz oder in einem sehr hohen Empfindlichkeitsbereich durchzuführen. Aus diesem Grunde ist die durch den biologischen Extrakt beigetragene Absorption vernachlässigbar, gegenüber den Absorptionen der Produkte der enzymatischen Reaktion.Usually the determinations are made through the fluorometric Methods currently performed in the prior art the sensitivity is limited by the Extent of background fluorescence, which is determined by the biological Extract is contributed. According to the invention Determination method is because of the large gain no need for fluorescence readings or in a very high sensitivity range. For this reason, the biological Extract contributed negligible, compared the absorptions of the products of the enzymatic reaction.

Beispiel 2Example 2 Bestimmung von Östradiol und Östron im UrinDetermination of estradiol and estrone in urine A - Vorbereitung der UrinprobenA - Preparation of urine samples

Die Entnahme wird mit vor dem Aufstehen entnommenem Urin durchgeführt. Man stellt 1 ml Urin auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7 ein, indem man 50 µl (0,1 M) Citratpuffer zusetzt. Diese Lösung wird mit einem Tropfen "β-Glucuronidase"-Pasteur 30 Minuten bei 37°C behandelt. Die Röhrchen werden dann abgekühlt und mit 1 ml Äthanol versetzt, die Mischung etwa 30 Minuten auf 24°C gehalten und dann bei 4000 g zentrifugiert. Der Überstand wird zur Hälfte mit Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), 1 Promille Rinder-Serumalbumin, 20% Glycerin verdünnt. Die Dosierung wird mit 100 µl dieses Extraks durchgeführt.The sample is taken with urine taken before getting up. 1 ml of urine is adjusted to a pH of 6.5 to 7 by adding 50 μl (0.1 M) of citrate buffer. This solution is treated with a drop of " β- glucuronidase" pasteurizer at 37 ° C for 30 minutes. The tubes are then cooled and 1 ml of ethanol is added, the mixture is kept at 24 ° C. for about 30 minutes and then centrifuged at 4000 g. Half of the supernatant is diluted with Tris-HCl buffer (pH 7.4), 1 per thousand bovine serum albumin, 20% glycerin. The dosage is carried out with 100 µl of this extract.

B - BestimmungB - determination

Man verwendet die folgenden Puffer:
Puffer A:
Tris HCl 0,1 M, pH 7,4, 20% Glycerin, 1 Promille BSA
Puffer B:
Puffer A + 2×10^-3 M NAD, 2×10^-6 M NADP, 2×10^-3 M
Glucose-6-Phosphat, 0,2 Einheiten pro ml Glucose- 6-Phosphat-Dehydrogenase;
Puffer C:
Puffer A + 1600 pg Östradiol pro ml.The following buffers are used:
Buffer A:
Tris HCl 0.1 M, pH 7.4, 20% glycerin, 1 per mille BSA
Buffer B:
Buffer A + 2 × 10 ^-3 M NAD, 2 × 10 ^-6 M NADP, 2 × 10 ^-3 M
Glucose-6-phosphate, 0.2 units per ml of glucose-6-phosphate dehydrogenase;
Buffer C:
Buffer A + 1600 pg estradiol per ml.

Für jede Probe verwendet man 3 Röhrchen, welche 100 µl der Urinverdünnung und die folgende Mengereaktionskomponenten enthalten:For each sample, 3 tubes are used, which are 100 µl of Urine thinning and the following amount reaction components contain:

Röhrchen 1:
Kontrolle = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B
Röhrchen 2:
Bestimmung = 0,5 ml Puffer A + 0,5 ml Puffer B + 0,025 IE β-Östradiol-Dehydrogenase
Röhrchen 3:
Überschuß = 0,5 ml Puffer B + 0,5 ml Puffer C + 0,25 IE 17β-Östradiol-Dehydrogenase.Tube 1:
Control = 0.5 ml buffer A + 0.5 ml buffer B
Tube 2:
Determination = 0.5 ml buffer A + 0.5 ml buffer B + 0.025 IU β- estradiol dehydrogenase
Tube 3:
Excess = 0.5 ml buffer B + 0.5 ml buffer C + 0.25 IU 17 β- estradiol dehydrogenase.

Die Röhrchen werden 4 bis 16 Stunden bei 37°C inkubiert. Die optische Dichte wird bei 349 nm nach dieser Inkubationsdauer bestimmt.The tubes are incubated for 4 to 16 hours at 37 ° C. The optical density is at 349 nm after this incubation period certainly.

C - Berechnung der Östrogen-KonzentrationenC - Calculation of estrogen concentrations

Die Konzentration der in den Proben enthaltenen Östrogene wird im Vergleich zu dem Absorptionswert des Überschusses mit Hilfe der folgenden Formel berechnetThe concentration of estrogens contained in the samples is compared to the absorption value of the excess calculated using the following formula

C: Östrogen-Konzentration im Urin oder Plasma (µg/Liter);
800: entspricht dem Östradiol-Überschuß in dem Röhrchen;
X: Volumen des entnommenen biologischen in Mikroliter. Im vorliegenden Beispiel ist es 1000 µl im Falle des Plasmas und 25 µl im Falle von Urin.C: estrogen concentration in urine or plasma (µg / liter);
800: corresponds to the excess of estradiol in the tube;
X: Volume of the withdrawn biological in microliters. In the present example it is 1000 µl in the case of plasma and 25 µl in the case of urine.

Beispiel 3Example 3 Spezifische Bestimmung von ÖstradiolSpecific determination of estradiol

Die spezifische Bestimmung von Östradiol kann durchgeführt werden unter der Voraussetzung, daß man vorher das Östron des Mediums mit Hydrazin reagieren läßt.The specific determination of estradiol can be carried out on the condition that one has previously the estrone of the medium can react with hydrazine.

Zu diesem Zweck läßt man 0,5 ml des biologischen Mediums (Plasma oder Urin mit Glucuronidase hydrolysiert) mit 100 µl einer wäßrigen Hydrazinlösung (5 M, mit HCl auf pH 7 bis 8 gebracht) 30 Minuten bei 37°C reagieren. Das Östradiol wid nach der vorher in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Methode bestimmt.For this purpose, 0.5 ml of the biological medium is left (Plasma or urine hydrolyzed with glucuronidase) with 100 µl an aqueous hydrazine solution (5 M, with HCl to pH 7 to 8 brought) react at 37 ° C for 30 minutes. The estradiol wid after that previously described in Examples 1 and 2 Method determined.

Aus der vorgehenden Beschreibung resultiert, daß unabhängig von den Ausführungsarten ein Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Östrogenen E₁ und E₂ erhalten wird, welches im Vergleich zu den bislang bekannten Bestimmungsmethoden wesentliche Vorteile besitzt, von denen einige schon vorher erwähnt wurden, insbesondere:From the foregoing description it follows that independently a method for the enzymatic determination of the execution types is obtained from estrogens E₁ and E₂, which in Compared to the previously known methods of determination Has advantages, some of which have been there before were mentioned, in particular:

- das Verfahren ist sehr wenig kostspielig hinsichtlich der Reaktionskomponenten und Materialien, wobei man nur ein Photometer im nahen U.V. benötigt.- The process is very little expensive in terms of Reaction components and materials, taking only one Photometer in the nearby U.V. needed.
- Man braucht keine Radioisotope.- You don't need radioisotopes.
- Das Verfahren ist leicht automatisierbar und direkt bei im Handel erhältlichen automatischen Systemen verwendbar.- The process is easy to automate and directly at im Commercially available automatic systems can be used.
- Von Vorteil ist ferner die große Stabilität der Reaktionskomponenten und Enzyme, die eine unerläßliche Voraussetzung einer Kommerzialisierung in großem Umfange ist.- The great stability of the reaction components is also advantageous and enzymes, which are an essential requirement commercialization is extensive.
- Das Verfahren kann in einem sehr breiten biologischen Bereich angewandt werden.- The process can be in a very wide biological range be applied.
- Es gibt keine Neben-Reaktion.- There is no side reaction.
- Das Verfahren hat eine sehr hohe Spezifität.- The method has a very high specificity.
- Es werden keine Enzyme zerstört.- No enzymes are destroyed.
- Das Verfahren ist einfach, zuverlässig, völlig reproduzierbar und sehr empfindlich.- The process is simple, reliable, completely reproducible and very sensitive.
- Man kann das Verfahren bei einer großen Anzahl biologischer Medien anwenden.- You can use the method with a large number of biological Apply media.
- Man kann das Verfahren bei biologischen Medien, wie zum Beispiel Urin, anwenden, ohne vorher die Östrogene extrahieren zu müssen oder indem man relativ einfache und schnelle Extraktions- oder Reinigungsmethoden anwendet.- The method can be used for biological media such as Example use urine without first extracting the estrogens to need or by being relatively simple and uses fast extraction or cleaning methods.

Wie aus dem Obigen ersichtlich wird, ist die Erfindung nicht auf die ausführlich beschriebenen Ausführungsformen beschränkt; sie umfaßt vielmehr alle Varianten, die dem Fachmann aufgrund der Beschreibung einfallen, ohne vom Rahmen der Erfindung abzuweichen.As can be seen from the above, the invention is not limited to the embodiments described in detail; rather, it encompasses all variants which are known to the person skilled in the art come up based on the description without going beyond the scope of the Deviate invention.

Claims

1. Verfahren zur enzymatischen Bestimmung der Östrogene E₁ und E₂ in biologischen Medien, insbesondere in Plasma und in Urin, wobei man eine gereinigte 17β- Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta in Gegenwart von NADP oder eines NADP-Analogen sowie einer spezifischen NADP-Dehydrogenase und eines NADPH- bildenden Substrates einsetzt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine 17b-Östradiol-Dehydrogenase aus Plazenta verwendet, die von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit ist, und daß man in Gegenwart von NAD oder eines NAD-Anlogen, welches durch das Enzym anerkannt wird, arbeitet.1. A method for the enzymatic determination of the estrogens E₁ and E₂ in biological media, in particular in plasma and in urine, wherein a purified 17β - estradiol dehydrogenase from placenta in the presence of NADP or a NADP analogue and a specific NADP dehydrogenase and of a NADPH-forming substrate, characterized in that a 17 b -estradiol dehydrogenase from placenta is used, which is freed from steroids and contaminating non-estrogen-dependent transhydrogenases, and in the presence of NAD or an NAD analogue, which recognized by the enzyme works.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das spezifische Enzym NADP-Dehydrogenase aus der folgenden Gruppe wählt: Tetrahydrofolat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-5-1-13, 1-5-1-15), Isocitrat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-42), Phosphogluconat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1-1-44), Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH) (internationale Klassifikation 1-1-1-49), Lactaldehyd- Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-1- 1-55), Benzaldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-7), Glyceraldehyd-Phosphat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-Aspartat-semi-Aldehyd-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-11), Glyoxylat-Dehydrogenase (internationale Klassifikation 1-2-1-17). 2. The method according to claim 1, characterized, that the specific enzyme NADP dehydrogenase from the following group chooses: tetrahydrofolate dehydrogenase (international classification 1-5-1-13, 1-5-1-15), Isocitrate dehydrogenase (international classification 1-1-1-42), phosphogluconate dehydrogenase (international Classification 1-1-1-44), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) (international classification 1-1-1-49), lactaldehyde Dehydrogenase (international classification 1-1- 1-55), benzaldehyde dehydrogenase (international classification 1-2-1-7), glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (international classification 1-2-1-9 (1-2-1-13)), L-aspartate semi-aldehyde dehydrogenase (international Classification 1-2-1-11), glyoxylate dehydrogenase (international Classification 1-2-1-17).

3. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das NADPH-bildende Substrat G6P (Glucose-6-Phosphat) ist, falls das spezifische NADP-Dehydrogenase-Enzym G6PDH ist.3. The method according to claims 1 and 2, characterized, that the NADPH-forming substrate G6P (glucose-6-phosphate) if the specific NADP dehydrogenase enzyme G6PDH is.

4. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmungsreaktion in einem Medium stattfindet, das aus einem Puffer mit einem pH-Wert in der Nähe von 7,4 besteht, wobei die Ionenstärke gleich oder geringer ist als die eines 0,1-molaren Puffers.4. The method according to claims 1 to 3, characterized, that the determination reaction takes place in a medium, that from a buffer with a pH in is close to 7.4 with the ionic strength equal or less than that of a 0.1 molar buffer.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer außerdem 0,5 Promille bis 1% Protein ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen enthält.5. The method according to claim 4, characterized, that the buffer also 0.5 parts per thousand to 1% protein contains no significant affinity for estrogens.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das dem Medium zugesetzte Protein Serum-Albumin, insbesondere Rinder-Serum-Albumin ist.6. The method according to claim 5, characterized, that the protein serum albumin added to the medium, especially bovine serum albumin.

7. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung in Gegenwart von Acetyl-NAD oder Thio-NAD durchgeführt wird.7. The method according to claims 1 to 6, characterized, that the determination in the presence of Acetyl-NAD or Thio-NAD is carried out.

8. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das NAD und NADPH-bildende Substrat im Überschuß vorhanden sind. 8. The method according to claims 1 to 7, characterized, that the NAD and NADPH-forming substrate in excess available.

9. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge NAD im Reaktionsmilieu 10^-3- bis 10^-4-molar ist, diejenige des NADP 10^-6- bis 10^-7- molar und das Konzentrationsverhältnis NAD zu NADP etwa 10⁺³ ist.9. The method according to claims 1 to 8, characterized in that the amount of NAD in the reaction medium is 10 ^-3 - to 10 ^-4 molar, that of the NADP 10 ^-6 - to 10 ^-7 - molar and the concentration ratio of NAD to NADP approximately Is 10 ⁺³ .

10. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsgemisch, welches die Reaktionskomponenten und die zu bestimmenden Substanzen enthält, vor dem Ablesen der optischen Dichte 2 bis 12 Stunden, vorzugsweise 3 bis 9 Stunden, bei einer Temperatur von 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25 bis 38°C inkubiert wird.10. The method according to claims 1 to 9, characterized, that the reaction mixture containing the reaction components and the substances to be determined contains, before reading the optical density 2 to 12 Hours, preferably 3 to 9 hours, at one Temperature of 20 to 40 ° C, preferably at 25 incubated up to 38 ° C.

11. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben der biologischen Medien, welche die zu bestimmenden Östrogene E₁ und E₂ enthalten, vor dem Bestimmungsverfahren einem Vorbereitungs- oder Extraktions- und/oder Reinigungsverfahren unterworfen werden.11. The method according to claims 1 to 10, characterized, that the samples of the biological media which the determining estrogens E₁ and E₂ contain before Determination method of a preparation or extraction and / or subjected to cleaning procedures will.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Plasma besteht, diese vorher einem an sich bekannten Extraktionsverfahren mit z. B. Äther unterworfen werden, worauf man mehrmals mit den geeigneten Lösungsmitteln wäscht, abdampft und den letzten Abdampfrückstand in einem Gemisch aus einem polaren Lösungsmittel und einem Puffer, dessen Ionenstärke praktisch gleich derjenigen eines 0,1 M-Puffers ist, löst, und der eine geringe Menge eines Proteins ohne wesentliche Affinität gegenüber Östrogenen sowie 15 bis 25% eines Polyols enthält. 12. The method according to claim 11, characterized, that if that contains the estrogens to be determined biological medium consists of plasma, this previously a known extraction method with z. B. Be subjected to ether, which is repeated several times with the suitable solvents, washes and evaporates last evaporation residue in a mixture of one polar solvent and a buffer whose ionic strength practically the same as that of a 0.1 M buffer is, and that releases a small amount of a protein with no substantial affinity for estrogens as well Contains 15 to 25% of a polyol.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß, falls das die zu bestimmenden Östrogene enthaltende biologische Medium aus Urin besteht, dieses vorher einem Vorbereitungsverfahren mit Hilfe eines die konjugierten Verbindungen hydrolysierenden Enzyms, wie z. B. "β-Glucuronidase" Pasteur, unterworfen wird.13. The method according to claim 12, characterized in that if the biological medium containing the estrogens to be determined consists of urine, this beforehand a preparation process with the aid of an enzyme which hydrolyzes the conjugated compounds, such as, for. B. " β- Glucuronidase" Pasteur is subjected.

14. Anwendungsfertige Kombination zur Durchführung des Verfahrens gemäß Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet,
daß sie im wesentlichen folgende vorher bestimmte und lyophilisierte Bestandteile enthält:
das Enzym 17β-Östradiol-Dehydrogenase, welches von Steroiden und verunreinigenden nicht Östrogen-abhängigen Transhydrogenasen befreit sowie in einem geeigneten Polyol konserviert ist, insbesondere Glycerin,
einen inneren Standard (der einen bekannten Überschuß an Östrogenen enthält),
eine Kontrolle (blanc),
ein Enzym für die Hydrolyse der im Urin enthaltenen konjugierten Verbindungen (wie "β-Glucuronidase" Pasteur), das vorher in Funktion zur Menge der zu behandelnden Urinprobe bestimmt wurde,
NAD: 10^-2-10^-4 M,
Glucose-6-PDH: 0,1 IE/ml der zu bestimmenden Probe,
NADP: 10^-6-10^-8 M,
Glucose-6-P: 10^-2-10^-4 M,
BSA-Puffer (Rinder-Serum-Albumin): 0,5 Promille bis 1%,
Tris HCl Puffer 0,05 M, pH-Wert etwa 7,5. 14. Ready-to-use combination for carrying out the method according to claims 1 to 13, characterized in that
that it essentially contains the following predetermined and lyophilized components:
17, the enzyme β-estradiol dehydrogenase, which is freed from contaminating steroids and non-estrogen-dependent transhydrogenases, and is conserved in a suitable polyol, in particular glycerol,
an internal standard (which contains a known excess of estrogens),
a control (blanc),
an enzyme for the hydrolysis of the conjugated compounds contained in the urine (such as " β- glucuronidase" Pasteur), which was previously determined in function of the amount of the urine sample to be treated,
NAD: 10 ^-2 -10 ^-4 M,
Glucose-6-PDH: 0.1 IU / ml of the sample to be determined,
NADP: 10 ^-6 -10 ^-8 M,
Glucose-6-P: 10 ^-2 -10 ^-4 M,
BSA buffer (bovine serum albumin): 0.5 per thousand to 1%,
Tris HCl buffer 0.05 M, pH about 7.5.

15. Kombination gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontrolle (blanc) aus einem Gemisch von Tris HCl-Puffer, 15 bis 25% Polyol, 0,5 Promille bis 1% BSA (Puffer A) und etwa 0,5 ml Puffer A mit 2 ×10^-3 M NAD, 2×10^-6 M NADP, 2×10^-3 M Glucose- 6-Phosphat, 0,2 I.E. Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase/ml (Puffer B) besteht.15. Combination according to claim 14, characterized in that the control (blanc) from a mixture of Tris HCl buffer, 15 to 25% polyol, 0.5 per mil to 1% BSA (buffer A) and about 0.5 ml of buffer A with 2 × 10 ^-3 M NAD, 2 × 10 ^-6 M NADP, 2 × 10 ^-3 M glucose-6-phosphate, 0.2 IU glucose-6-phosphate dehydrogenase / ml (buffer B).

16. Kombination gemäß Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß der innere Standard aus einem Gemisch des obigen Puffers B und des Puffers A, der 1600 Picogramm Östradiol/ml und 0,02 I.E. 17β-Östradiol- Dehydrogenase enthält, besteht.16. Combination according to claim 14 and 15, characterized in that the internal standard consists of a mixture of the above buffer B and buffer A, which contains 1600 picograms of estradiol / ml and 0.02 IU 17 β- estradiol dehydrogenase.