DE2637671A1

DE2637671A1 - Creatinin-desimidase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur quantitativen bestimmung von creatinin

Info

Publication number: DE2637671A1
Application number: DE19762637671
Authority: DE
Inventors: Osamu Terada; Takayuki Uwajima
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1975-08-28
Filing date: 1976-08-20
Publication date: 1977-03-10
Also published as: NO762825L; DE2637671B2; ES461550A1; DE2637671C3; NL7609184A; GB1515805A; SE436575B; ES450823A1; US4087329A; IT1069699B; CA1066211A; FR2322200A1; AU1702376A; FR2322200B1; SE8201497L; DK374676A; AU504596B2; SE7609154L

Description

"Creatinin-Desimidase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur quantitativen Bestimmung von Creatinin"

Priorität: 28. August 1975, Japan, Fr. 103473/75

11. September 1975, Japan, Hr. 109452/75

Die Erfindung betrifft die Creatinin-Desimidase, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur quantitativen Bestimmung von Creatinin.

Creatinin ist ein Stoffwechselabfallprodukt, das durch nichtenzymatisehe Entwässerung von Creatin gebildet wird. Creatin entsteht aus Creatinphosphorsäure, einer der Energiequellen für die Muskelkontraktion«„_A ,„ , _Λ -

110/ 1 1 1 B

Creatin wird in vivo nicht verwertet, sondern als Stoffwechselendprodukt mit dem Urin ausgeschieden.Creatinin tritt im Blut in einer Normalkonzentration von etwa 0,7 bis 1,5 mg/ 100 ml Serum auf. Die Creatinin-Bestimmung im Blut und im Urin ist ein wertvolles diagnostisches Hilfsmittel zur Erkennung von Nierenkrankheiten, wie akute und chronische Nephritis und andere Störungen, z. B. Obstruktion der Urethra, Quecksilbervergiftung und Nephrose.

Bisher wurde die quantitative Bestimmung von Creatinin kolorimetrisch unter Zuhilfenahme der Jaffe-Reaktion, bei der durch Umsetzung mit Picrinsäure im alkalischen Medium ein gefärbtes Produkt entsteht, durchgeführt. Diese kolorimetrische Bestimmung zeichnet .sich zwar durch ihre Einfachheit und Stabilität aus, hat jedoch andrerseits verschiedene Nachteile. Beispielsweise weist dieses Verfahren eine geringe Empfindlichkeit auf, so daß eine relativ große Serummenge erforderlich ist. Ferner ist die Umstetzung nicht spezifisch und wird durch verschiedene, im Blut vorhandene Stoffe beeinflußt, beispielsweise durch Verbindungen mit aktiven Methylengruppen, durch Proteine und durch Antibiotika. Zur Vermeidung dieser Nachteile war es bisher notwendig, diese Stoffe aus der Probe zu entfernen oder das Creatinin zu extrahieren. Somit sind umständliche Verfahrensschritte erforderlich, die insbesondere bei der Automatisierung der Bestimmung einen Nachteil darstellen.

7 0 9 810/1 1 15

2637571

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Enzym zur Verfügung zu stellen, mit dem die Creatininmenge in einer Probe im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren einfacher, genauer und rascher bestimmt werden kann.

Diese Aufgabe läßt sich mit Hilfe von Creatinin-Desimidase lösen, die die hydrolytische Zersetzung von Creatinin zu U-Methylhydantoin und Ammoniak katalysiert. Die gebildete Menge an N-Methylhydantoin oder Ammoniak wird dann bestimmt.

J. Szulmajster, J. Bacteriology, Bd. 75 (1958), Seite 633 und Biochimica Biophysica Acta, Bd. 3o (1958), Seite 154» berichten vom Auftreten von Creatinin-Desimidase (EC 3.5.4.21 in Mikroorganismenzellen von Clostridium'paraputrifieuni. Das Enzym ist an der Zersetzung von Creatinin beteiligt und katalysiert die hydrolytische Spaltung von Creatinin zu ΪΓ-Methylhydantoin und Ammoniak.

Mikroorganismen der Gattung Clostridium sind jedoch anaerob, so daß zur Herstellung dieses Enzyms lange Fermentationszeiten erforderlich sind und das Mikroorganismenwachstum und somit die Enzymausbeuten nur gering sind. Es war daher bis jetzt nicht möglich, die Herstellung von Creatinin-Desimidase im großtechnischen. Maßstab durchzuführen.

Es wurde auch berichtet, daß Stämme von aeroben Mikroorganismen der Gattung Pseudomonas eine Zersetzung von Creatinin bewirken

709810/1115

können. Jedoch sind bisher keine derartigen Mikroorganismen
bekannt¹, die in der Lage sind, ein Enzym zu bilden, das die
Hydrolyse von Creatinin zu N-Methylhydantoin und Ammoniak
katalysiert. Ferner ist es bisher nicht gelungen, ein spezielles Enzym, das die vorgenannte Reaktion katalysiert, zu isolieren.

Es wurde nun erfindungsgemäß festgestellt, daß Mikroorganismen der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium, Paeudomonas und Arthrobacter, bei Züchtung in einem Fährmedium beträchtliche Mengen an Creatinin-Desimidase in der Gärflüssigkeit und/oder innerhalb der Mikroorganismenzellen bilden.

Die erfindungsgemäß erhaltene Creatinin-Desimidase läßt sich gut für automatisierte, quantitative Creatininbestimmungen verwenden. Die Creatininmenge in einer Probe läßt sich leicht
und rasch bestimmen, indem man die Menge an IT-Methylhydantoin oder Ammoniak, die durch die katalytische Wirkung des Enzyms gebildet worden ist, mißt.

Erfindungsgemäß läßt sich Creatinin-Desimidase herstellen, indem man einen Mikroorganismus der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas oder Arthrobacter,der in der Lage ist Creatinin-Desimidase zu bilden, in einem Wahrmedium so lange züchtet, bis sich in der Gärflüssigkeit und/oder innerhalb der Mikroorganismenzellen Creatinin-Desimidase gebildet hat, und anschließend die Creatinin-Desimidase gewinnt.

709810/111B

2837671

Die Greatininmenge wird durch Umsetzung der auf diese Weise
hergestellten Creatinin-Desimidase mit einer creatininhaltigen Probe unter katalytischer Hydrolyse des Creatinine zu
N-Methylhydantoin und Ammoniak bestimmt. Die Menge an
ΐΓ-Methylhydantoin und/oder Ammoniak wird anschließend gemessen. Aus diesem Wert wird sodann die Creatininmenge in der Probe
errechnet.

Erfindungsgemäß wird durch Züchtung von Mikroorganismen der
Gattung Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas oder
Arthrobacter, die zur Bildung von Creatinin-Desimidase in der lage sind, in einem Mhrmedium, das entsprechende Kohlenstoff- und Stickstoffq_uellen, anorganische Materialien und andere
Nährstoffe enthält, Creatinin-Desimidase in der Gärflüssigkeit und/oder in den Mikroorganismenzellen gebildet. Dieses Enzym
wird anschließend gewonnen.

Beispiele für Mikroorganismen, die Creatinin-Desimidase bilden und somit im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind:

(1) Brevibacterium ammoniagenes KY 34-62

(2) Brevibacterium divaricatum KY 3810

(3) Corynebacterium lilium KY 3509

(4) Corynebacterium glutamicum KY 3801

(5) Pseudomonas ovalis KY 4651

(6) Pseudomonas cruciviae KY 3961

(7) Arthrobacter ureafaciens KY 3152

(8) Arthrobacter histidinolovorans KY 3158

709810/ 1115

2837671

Die mikrobiologischen Eigenschaften der vorerwähnten Spezies (1), (6) und (7) sind in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage, Seite 499, 114 bzw. 610 beschrieben. Die mikrobiologischen Eigenschaften der Spezies (2) finden sich in der Japanischen Patentveröffentlichung 20294/63 und die der Spezies (3) in der US-PS 3 087 863. Ferner sind die mikrobiologischen Eigenschaften der Spezies (4) in J. Gen. Appl. Microbiol., Bd. 13, (1967), Seite 279-301, die der Spezies (5) in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, Seite 222,und die der Spezies (8) in J. Biol. Chem., Bd. 209, (1954), Seite 829, beschrieben.

Die vorerwähnten Stämme sind beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tokyo, Japan, unter den Hinterlegungsnummern FERM-P 3207, 3208, 3209, 3210, 3211, 3212, 3213 bzw. 321.4 hinterlegt.

Ferner sind diese Stämme bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.Α., unter den Hinterlegungsnummern ATCC 31 169, 14 020, 15 990, 31 170, 31 171, 31 172, 7 562 bzw. 11 442 hinterlegt.

Zur Züchtung der erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können synthetische oder natürliche Medien verwendet werden, die Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, anorganische Materialien und andere Nährstoffe, die von dem Jeweiligen Stamm verwertet werden können, enthalten.

709810/1115

Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenhydrate, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Stärke, StärkehydrolysatflUssigkeit und Melassen, Zuckeralkohole, wie Glycerin, Sorbit und Mannit, organische Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure und Citronensäure, Alkohole, wie Methanol und Äthanol, Glykole, wie Ithylenglykolund Propylenglykol, Aminosäuren und Kohlenwasserstoffe, wie n-Hexadecan.

Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniak, anorganische und organische Ammoniumsalze, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumcarbonat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat,und Ammoniumacetat, Harnstoff, Aminosäuren und andere stickstoffhaltige Verbindungen sowie stickstoffhaltige organische Materialien, wie Pepton, NZ-Amin, Fleischextrakt, Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysat,Chrysalishydrolysat,, Fischmehl, digeriertes Fischmehl, entfettete Sojabohnen und das entsprechende digerierte Produkt.

Beispiele für anorganische Materialien sind Kaliumdihydrogen-' phosphat, Dikaliumhydrogenphosphat, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Mangansulfat, Eisen(II)-sulfat, Natriumchlorid und Galciumcarbonat.

Es wurde festgestellt, daß es sich bei der Creatinin-Desimidase um ein adaptives Enzym handelt. Infolgedessen läßt sich die

709810/1115

Ausbeute an. Creatinin-Desimidase beim erfindungsgemäßen Verfahren beträchtlich steigern, indem man Creatinin oder ein creatininhaltiges natürliches Material, wie Fischextrakt oder Rinderextrakt, dem Medium als Enzyminduktor zusetzt. Besonders gute Ergebnisse erhält man durch Zusatz von Creatinin in einer Menge von 0,05 bis 2 Prozent (Gewicht/Volumen) zum Medium.

Im allgemeinen wird die Züchtung bei Temperaturen von 15 bis 4O⁰C, vorzugsweise 28 bis 33°C, durchgeführt. Während der Züchtung wird ein pH-Wert von 6,0 bis 8,5, vorzugsweise 6,5 bis 8,5s aufrecht erhalten. Die Züchtung wird solange fortgesetzt, bis sich das Enzym gebildet hat und in der Gärflüssigkeit nachzuweisen ist. Im allgemeinen beträgt die Züchtungsdauer 20 bis 30 Stunden. Unter diesen Bedingungen reichert sich in der Gärflüssigkeit und/oder in den Mikroorganismenzellen eine beträchtliche Menge an Creatinin-Desimidase an.

Zur Gewinnung des Enzyms werden die Mikroorganismenzellen nach üblichen Verfahren unter Bildung eines Zellextrakts aufgebrochen, beispielsweise durch ültraschallzerkleinerung, Zermahlen, mechanischem Druck oder Autolyse. Die Extraktion der Creatinin-Desimidase aus der Gärflüssigkeit und dem Zellextrakt wird auf folgende Weise durchgeführt: Zunächst wird durch Zusatz von Salzen, wie Ammoniumsulfat oder Natriumsulfat, oder Lösungsmitteln, wie Aceton, Methanol, oder Äthanol, ein

709810/1 1 15

Niederschlag gebildet. Bei der Verwendung von Ammoniumsulfat wird der Anteil, der bei 4-Oprozentiger Ammoniumsulfatsättigung gelöst ist und bei TOprozentiger Sättigung ausfällt, gewonnen. Bei der Verwendung von Aceton wird der Anteil gewonnen, der bei einer 60prozentigen Acetonkonzentration ausfällt.

Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wird anschließend der Dialyse oder der Gelfiltration unterworfen, um das im Niederschlag enthaltene Salz oder !lösungsmittel zu. entfernen. Für die Dialyse wird eine entsprechende Dialysemembran, wie Cellophan (hauptsächlich aus regenerierter Cellulose bestehende Folie), Blasenmembran oder Collodiummembran, verwendet. Eine bevorzugte Dialyseflüssigkeit besteht aus 0,01 m Phosphatpuffer von pH-Wert 7,0. Für die Gelfiltration wird vorzugsweise Sephadex G-25 oder G-50 (dreidimensional vernetztes Dextran) zusammen mit 0,01 m Phosphatpuffer von pH-Wert 7_}0 verwendet.

Zur Entfernung der Nucleinsäuren aus der Membran wird eine wässrige Prοtaminiösung (mit einem Protamingehalt, der etwa 1/1O des Proteingehalts der Flüssigkeit innerhalb der Membran entspricht) tropfenweise unter führen zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird zur Bildung eines Niederschlags etwa 30 Minuten bei 0 bis 4 C stehen gelassen. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert (10 000 g, 20 min) und der Überstand wird gewonnen.

7 0 9 8 1 0 / 1 1 1 B

Anschließend wird der Überstand auf eine mit DEAE-ßellulose gepackte Säule, die vorher mit 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist, gegeben. Sodann wird die Säule zur Elution von unreinem Protein mit 0,01 m Phosphatpuffer versetzt. Die Elution wird unter Anwendung eines Konzentrationsgradienten durchgeführt, wobei zunächst 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 und am Schluß 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit 0,3 m FaCl verwendet wird. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen. Die Creatinin-Desimidase-Aktivität in den einzelnen Fraktionen wird auf die nachstehend beschriebene Weise gemessen. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt. Die vereinigte Lösung wird zur Bildung eines Niederschlags mit der doppelten Volumenmenge Aceton versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und der Dialyse unterworfen. Die im Innern der Membran befindliche Flüssigkeit wird gefriergetrocknet. Man erhält gereinigte Creatinin-Desimidase in Pulverform.

Die enzymatische Aktivität der Creatinin-Desimidase wird berechnet, nachdem man die bei Verwendung von Creatinin als Substrat gebildete und gemäß dem Indophenol-Verfahren bestimmte Ammoniakmenge ermittelt hat. Dazu werden beispielsweise 0,5 ml einer Iprozentigen wässrigen Creatinin-Hydrochlorid-Iösung, 0,5 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,5, 0,4 ml Wasser und 0,1 ml einer Enzymlösung vermischt und zehn Minuten bei 37°C inkubiert. Das Gemisch wird mit 1 ml Phenol-Lösung (hergestellt durch Lösen von 5,0 g Phenol und 25 mg

709810/ 1115

Nitroprussidnatrium in Wasser bei einem Gesamtvolumen von 500 ml) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird gerührt. Dieses Gemisch wird mit 1 ml einer alkalischen Natriumhypochloritlösung (hergestellt durch lösen von 2,5 g Natriumhydroxid in etwa 300 ml Wasser, Versetzen mit 1 j25 ml Natriumhypochlorit mit einem Gehalt an 10 Prozent wirksamem Chlor und Verdünnen des Gemisches auf ein Gesamtvolumen von 500 ml) versetzt. Das Gemisch wird gerührt und sodann 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Absorption bei 630 αιμ wird mit Hilfe eines photoelektrischen Colorimeters gemessen. Zur Kontrolle wird der gleiche Vorgang unter Verwendung einer Enzymlösung, die vorher 5 Minuten auf 100 G erwärmt worden ist, wiederholt. Die Absorption der Kontrollösung bei 630 mu wird von der Absorption der zu untersuchenden Lösung bei 630 mu abgezogen. Getrennt davon wird eine Eichkurve für die Ammoniak-Konzentration und die Absorption bei 630 mu hergestellt. Aus der Differenz der Absorptionswerte ergibt sich die Menge an gebildetem Ammoniak. Daraus laßt sich wiederum die enzymatische Aktivität der Probe berechnen.

Als 1 Einheit der enzymatischen Aktivität ist die Enzymmenge definiert, die bei 37°C und einem pH-Wert von 7,5 innerhalb einer Minute 1 ^uMoI Creatinin zersetzt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Creatinin-Desimidase zeigt eine, charakteristische Reaktion mit Creatinin und'katalysiert die Zersetzung von Creatinin zu N-Methyl-

709810/1115

hydantoin und Ammoniak. Das Enzym reagiert nicht mit Creatin, Creatininphosphorsäure, Harnstoff, Arginin, Glutaminsäure, Canavanin, Glutamin, Cytosin und Guanin. ■

Bei der Gelfiltration (vgl. Biochemical Journal, Bd. 96 (1965), Seite 595) unter Verwendung von Sephadex G-200 ergibt sich für die Creatinin-Desimidase ein Molekulargewicht von etwa 200 000.

Das pH-Optimum des Enzyms nach zehnminütiger Behandlung bei 37°C liegt bei 8. Bei einer dreißigminütigen Behandlung bei 30⁰C ist das Enzym im pH-Bereich von 4₉O bis 9,0 stabil. Das Temperaturoptimum für eine zehnminütige Umsetzung beim pH-Wert 8,0 liegt nahe 5O⁰C. Das Enzym erweist sich bei einer dreißigminütigen Behandlung beim pH-Wert 7,0 bis zu 50⁰C als stabil und verliert bei 55 C etwa 20 Prozent seiner Aktivität.

Die Wirkung des erfindungsgemäßen Enzyms wird durch Schwer-

Ol Ol I

metallionen, wie Cu , Hg und Ag und p-Chlormercuribenzoesäure in einer Konzentration von 1 millimolar gehemmt. Somit ist anzunehmen, daß eine SH-Gruppe an der Enzymwirkung beteiligt ist.

Die auf die vorstehende Weise erhaltene Creatinin-Desimidase ist insbesondere zur quantitativen Bestimmung von Creatinin geeignet. Dazu wird beispielsweise eine creatininhaltige Probe bei 30 bis 5O⁰C etwa 10 bis 30 min mit einem Phosphat-

709810/1115

puffer, der 0,1 bis 1,0 mg/ml Creatinin-Desimidase enthält, umgesetzt. Dabei wird das Greatinin zu K-Me thy !.hydantoin und Ammoniak hydrolysiert. Die Menge an gebildetem N-Methylhydantoin oder gebildetem Ammoniak wird gemessen.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet' sich zur Bestimmung der Oreatininmenge in beliebigen, creatininhaltigen Proben, insbesondere zur Creatininbestimmung in Blut und Urin. Bei der Creatininbestimmung im Blut wird eine Blutprobe bei 2 500 bis 3 000 U/min etwa 5 Minuten zentrifugiert. Das so erhaltene Serum wird für die Umsetzung verwendet. Bei der Creatininbestimmung im Urin kann Urin direkt oder nach Verdünnung mit Wasser auf eine geeignete Konzentration, im allgemeinen auf das 2- bis 5-fache verwendet werden.

Die Bestimmung der bei der Umsetzung gebildeten N-Methylhydantoinmenge wird gemäß dem Verfahren von Kirby und Berry durchgeführt; vgl. Paper and Paperelectrophoresis, Academic Press, New York, 1958, Seite 348. Bei diesem Verfahren wird ein alkalisches Ferricyanid-Nitroprussid-Reagens (hergestellt durch Vermischen von gleichen Mengen an jeweils 10prozentigen Losungen von Natriumhydroxid, Nitroprussidnatrium und Kaliumferricyanid und Verdünnen des Gemisches mit Wasser auf das 3-fache) zu einer Probe gegeben, die N-Methylhydantoin enthält. Das Gemisch wird zur Farbbildung eine bestimmte Zeit, im allgemeinen etwa 15 bis 30 Minuten, bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Menge an N-Methylhydantoin wird anschlie-

709810/1 1 15

-H-

ßend aufgrund einer Messung der optischen Dichte bei 500 ίαμ berechnet.

Me Bestimmung der bei dieser Umsetzung gebildeten Ammoniakmenge läßt sich nach beliebigen physikochemischen oder enzymatischen Verfahren durchführen. Beispiele für entsprechende physikochemische Verfahren sind die Titration,

das Kessler-Verfahren, das Mnhydrin-Verfahren, die Berthelot-Reaktion und die Phenosafranin-Reaktion.

Bei der Titration wird die Ammoniakmenge in der Probe durch Neutralisationstitration der Probenlösung mit einer standardisierten Säurelösung oder durch Rücktitration der Probe, in der das gebildete Ammoniak durch eine bestimmte Säuremenge gebunden ist, bestimmt; vgl. Biochem. Z., Bd. 152 (1924), Seite 1.

Gemäß dem Nessler-Verfahren wird eine ammoniakhaltige Probe mit Fessler-Reagens behandelt, wonach sich die Ammoniakmenge colorimetrisch bestimmen läßt; vgl. Standard Methods of Clinical Chemistry, Academic Press, Ή. Y., 1958, Bd. 2, Seite 186.

Beim Mnhydrin-Verfahren wird das gebildete Ammoniak mit Ninhydrin umgesetzt, worauf die Menge des Reaktionsprodukts colorimetrisch bestimmt wird; vgl. J. Lab. Clin. Med., Bd. (1957), Seite 779i

709810/1115

Bei der Berthelot-Reaktion wird das Ammoniak in der Probe mit Phenol-Reagens und alkalischem Natriumhypochlorit-Reagens umgesetzt. Die Ammoniakmenge wird hierauf colorimetisch bestimmt; vgl. Clin. Chimiea Acta,. Bd. 8 (1963), Seite 5.

Die Phenosafranin-Reaktion bedient sich der Tatsache, daß Phenosafranin (rotgefärbt) im Verhältnis zur Hypochloritmenge entfärbt wird. Bei diesem Verfahren wird die ammoniakhaltige Probe mit Hypochlorit umgesetzt. Das Gemisch wird sodann mit einer Safraninlösung versetzt, wobei eine zur restlichen Hypochloritkonzentration proportionale Entfärbung auftritt. Die Ammoniakmenge wird aufgrund der Absorption der Lösung mit dem restlichen Safranin berechnet; vgl. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., Bd. 93 (1956), Seite 589.

Bei einem entsprechenden enzymatischen Verfahren zur Bestimmung der Ammoniakmenge wird L-Glutamat-Dehydrogenase (EC 1.4.1.2, im folgenden als GLDH bezeichnet), eine FAD (Nicotinamid-adenin-dinucleotid)-Oxidoreduktase, verwendet. GLDH ist ein Enzym, das die Bildung von L-Glutaminsäure aus 2-Oxoglutarat und Ammoniak katalysiert. Im Absorptionsspektrum von NAD, das bei dieser Umsetzung als Coenzym wirkt, tritt bei 260 mu sowohl in der oxidierten Form als auch in der reduzierten Form ein Maximum auf. Die reduzierte Form von NAD zeigt ein weiteres Absorptionsmaximum bei 340 mu, die bei der oxidierten Form nicht auftritt. Somit kann die Absorption bei 340 mu zur quantitativen Bestimmung der reduzierten Form von

709810/1 1 15

NAD (NADHp) verwendet werden. Dabei läßt sich die Ammoniakmenge bestimmen, indem man das Ammoniak in der Probe mit 2-Oxoglutarat unter Verwendung von GLDH als Enzym und von NAD als Coenzym umsetzt und die Abnahme der Absorbtion im Reaktionsgemisch bei 340 mu mißt.

Die Creatininmenge im menschlichen Serum wird sowohl nach dem erfindungsgemäßen Verfahren als auch nach einem herkömmlichen Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle I zusammengestellt.

Die herkömmliche Bestimmung wird gemäß Genshi Kitamura, Jissen Rinsho Kagaku (Praxis der Therapeutischen Chemie), Ishiyaku Shuppan Kabushiki Kaisha, 1974, Seite 243 bis 255, durchgeführt.

Zur Bestimmung des Ammoniaks, der beim erfindungsgemäßen Verfahren entsteht, wird als typisches physikochemisches Verfahren eine modifizierte Version des Verfahrens von Okuda und Pujii (vgl. Saishin Igaku, Bd. 21 (1966), Seite 622) unter Anwendung der BertheIot-Reaktion, bzw. als enzymatisches Verfahren unter Verwendung von GIDH das Verfahren von A. Levitzki (vgl. Anal. Biochem., Bd. 33 (1970), Seite 335) angewendet. Zur Bestimmung der beim erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten N-Methylhydantoinmenge bedient man sich des Verfahrens von Kirby and Berry (Paper and Paperelectrophoresis, Seite 348).

709810/1115

Tabelle I

Greatinin-BeStimmung, Vergleich des erfingunsgemäßen Verfahrens mit einem herkömmlichen Verfahren

	Verfahren	modifi zierte Ver sion nach Okuda und Fuji!	• **Mittelwert der. bestimmten Crea- v tininmenge im gleichen Serum	Reproduzierbarkeit	Koeffizient der Abweichung	Bezeichnung der verwendeten Test packung
	Jissen Rinsho Kagaku, 1974, S. 243 - 255	unter Ver wendung des Enzyms GLDH	4,82 4,65	Standard abweichung	2,66 3,83	Kyokuto-Creatinin- Reagens (Produkt der Fa. Kyokuto Shiyaku Kabushiki Kaisha) Creatinin-Test ' Wako (Produkt der -¹ Fa. Wako Junyaku ~° Kabushiki Kaisha) '
herkömm- 1 i dies Verfahren	Verfah ren zur Bestim mung der Ammoni akmenge	Messung der Menge an gebildetem U- Methylhydantoin	3,60	0,13 0,16	1 ,20	Ammoniak-Test- Wako (Produkt der Fa. Wako Junyaku Kabushiki Kaisha)
erfin dungsge mäßes Verfahren	3,71	0,11	1,05	GIDH: Produkt der Fa. Oriental Chemicals Go.
	3,43	0,10	3,60	IS> *Reagens O5 «ο
0,28

* Reagens: hergestellt durch Vermischen gleicher Mengen an jeweils lOprozentigen Lösungen " ÜTatriumhydroxid, ITitroprussidnatrium und Kaliumferricyanid und Verdünnen des Ge misches mit Wasser auf das 3-fache

** Durchschnittswert aus zwanzig Bestimmungen der Creatininmenge im Serum.

Aus den in Tabelle I zusammengestellten Ergebnissen geht hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren bessere Ergebnisse bei gleichzeitiger verbesserter Reproduzierbarkeit liefert.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine Kultur von Brevibacterium ammoniagenes KY 3462, I¹EEM-P Nr. 3207, ATCC 31 169, wird in 10 Liter Nährmediurn, das sich in einem 30 Liter fassenden Glasfermenter befindet, überimpft. Das Mahrmedium enthält 2 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Creatinin-hydrochlorid, 0,1 g/dl K₂HPO^, 0,05 g/dl MgSO^- 7H₂O, 0,05 g/dl KCl und 0,1 g/dl Hefeextrakt und weist einen pH-Wert von 7,5 auf. Die Züchtung wird 24 Stunden unter Belüftung und unter Rühren bei 30⁰C durchgeführt. Anschließend werden 10 Liter der Gärflüssigkeit in einer kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge zentrifugiert. Dabei werden etwa 100 g Mikroorganismenzellen gewonnen. Die Zellen werden mit 5 Liter 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen und sodann in 2 Liter 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert. Die Suspension wird mit Dynomill (Produkt der Firma Willy A. Bachofen, Schweiz) behandelt, um die Zellen zu zermahlen. Nach dem Zermahlen wird das Produkt 20 Minuten bei 20 000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert. Bei der Ammoniumsulfatfällung erhält man aus dem Überstand bei 40-

0 9 8 10/1115

bis 70prozentiger Sättigung etwa 30 g Niederschlag. Die Aus-

beute in bezug auf die Aktivität an Creatinin-Desimidase im Niederschlag beträgt 80 Prozent. Die spezifische Aktivität ist auf das 3-fache erhöht. Der Niederschlag wird anschließend in 500 ml 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gelöst. Die Lösung wird 48 Stunden in einem Cellophän-Schlauch gegen 20 Liter 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 dialy- ' siert, wobei die Dialysefliissigkeit jeweils nach 12 Stunden gewechselt wird. Anschließend versetzt man zur Entfernung von Nucleinsäuren jeweils 1 Liter des Dialysats unter Rühren allmählich mit 100 ml einer 3prozentigen wässrigen Protaminlösung (Produkt der Firma Nakarai Kagaku Yakuhin Kabushiki Kaisha). Das erhaltene Gemisch wird zur Bildung eines Niederschlags 30 Minuten bei 0 bis 4 0 stehengelassen. Der auf diese Weise gebildete Niederschlag wird 20 Minuten bei 10 000 g abzentrifugiert. Die Ausbeute in bezug auf die im Überstand enthaltene Creatinin-Desimidase beträgt 90 Prozent und die spezifische Aktivität wird auf das 2-fache gesteigert. Der Überstand wird über eine mit 1 kg DEAE-Cellulose (Produkt der ; Firma Pharmacia Fine Chemicals, Schweden) gepackte Säule, die vorher mit 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 behandelt. worden ist, gegeben, um die Creatinin-Desimidase zu adsorbieren. Die Säule wird sodann mit 0,01 m vom Pohosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 gewaschen, um unreine Proteine zu entfernen. Anschließend wird die Säule mit Phosphatpuffer unter Anwendung eines Konzentrationsgradienten von 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 bis 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 mit einem Gehalt

709810/1 IIS'

an 0,3 m NaCl eluiert. Die Fraktionen mit einer Aktivität an Creatinin-Desimidase werden in einem einzigen Maximum eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Bildung eines Niederschlags mit der 2-fachen Volumenmenge Aceton versetzt. Der Niederschlag wird 20 Minuten bei 10 000 g abzentrifugiert und in 100 ml durch Ionenaustausch entmineralisiertem Y/asser gelöst. Die Lösung wird in einem Cellophan-Schlauch gegen 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-V/ert 7,0 dialysiert. Das Dialysat wird gefriergetrocknet.-Man erhält etwa 1 g gereinigte Creatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 2,5 Einheiten/mg. Die G-esamtausbeute in bezug auf die Aktivität an Creatinin-Desimidase beträgt 56 Prozent und die Steigerung der spezifischen Aktivität etwa das 60-fache.

Beispiel 2

Corynebacterium lilium KT 3509, FERM-P Nr. 3209, ATCC 15 990, wird in einem Nährmedium, das 3 ml/dl Bonito-Fleischextrakt (mit einem Gehalt an etwa 3,3 g/dl Creatinin) 0,5 g/dl Pepton und 0,5 g/dl G-luc'ose enthält und einen pH-Y/ert von 7,5 aufweist, gezüchtet. Die Züchtung wird auf die gleiche V/eise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Man erhält etwa 150 g Mikroorganismenzellen. Die Zellen werden gemäß Beispiel 1 extrahiert und gereinigt. Man erhält 1,5 g gereinigte Creatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 1,5 Einheiten/ mg. Die Ausbeute beträgt 55 Prozent.

7 0 9 8 10/1115

Beispiel 3

Pseudomonas ovalis KT 4651, I¹ERM-P Nr. 3211, ATCC 31 171 wird in einem Nährmedium gezüchtet, das 3 g/dl Fleischextrakt, 0,5 g/dl Pepton.und 0,3 g/dl Glucose enthält und einen pH-Wert τοη 7,5 aufweist. Die Züchtung wird gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Man erhält 180 g Mikroorganismenzellen, lach Extraktion und Reinigung gemäß Beispiel 1 erhält man 2 g gereinigte Creatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 1,0 Einheiten/mg. Die Ausbeute beträgt 57 Prozent.

Beispiel 4

Arthrobacter-ureafacisns KY 3152, FERM-P ITr. -3213, ATCC 7562 wird gemäß Beispiel 1 gezüchtet. Man erhält 150 g Mikroorganismenzellen. Nach Extraktion und Reinigung gemäß Beispiel 1 erhält man 0,5 g gereinigte Creatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 2,0 Einheiten/mg. Die Ausbeute beträgt 57 Prozent.

!Beispiel 5

Aus TO Liter Gärflüssigkeit, die durch Züchtung gemäß Beispiel 1 erhalten worden ist, werden durch kontinuierliche Zentrifugation 9,5 Liter Überstand gewonnen. Der überstand ergibt bei der Ammoniumsulfatfällung bei 40*- bis 70prozentiger Sättigung 5g Niederschlag. Die Ausbeute in bezug auf die im Niederschlag enthaltene Creatinin-Desimidase beträgt 80 Prozent. Die spezifische Aktivität i#fc auf das 3-faehe

gesteigert. Der Niederschlag wird in 100 ml 0,01 m Phosphatpuff er vom pH-Wert 7)0 gelöst. Die Lösung wird 48 Stunden in einem Cellophan-Schlauch gegen 20 Liter 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die Dialyseflüssigkeit wird jeweils nach 12 Stunden ausgewechselt. Anschließend werden 200 ml des Dialysats gemäß Beispiel 1 der Nukleinsäurefällung, Säulenchromatographiean DEAE-Cellulose, Acetonfällung und Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält etwa 120 mg gereinigte Creatinin-Desimidase mit einer-spezifischen Aktivität von 2,0 Einheiten/mg. Die Ausbeute beträgt 52 Prozent.

Beispiel 6

Die in Tabelle II angegebenen Stämme werden auf jeweils 50 ml eines ITährmediums der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 1, das sich in 500 ml^Sakaguchi-Kolben befindet, überimpft und. 24 Stunden unter Schütteln bei 30 C gezüchtet. Die Gärflüssigkeiten werden jeweils 20 Minuten bei 10 000 g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert und die Mikraorganisiaenaellen werden gewonnen. Jeweils O.,5 g der Zellen wenden mit 50 ml 0,01 m Phosphat puff er vom;pH-Wert 7,0 gewaschen und sodann in 10 al 0,01 ffl Phosphätpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendiert. Die Suspensionen werden jeweils 20 Minuten mit .Hilfe eines Ultraschallzerlcleinerers (Produkt der l?irma Kaijo Denki Kabushiki Kaisha) der Ultraschallbehandlung unterworfen und anschließend 20 Minuten bei 2® 000 g in einer Kühlzentrifuge behandelt. >Im iib erst and wird jeweils die Aktivität an Gfeätinin-BesimidaBe uiid idie ^Proteinkansentration gemessen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Stämme

Creatinin-Desimidase-Aktivität

Einheiten/mg Einheiten/mg Protein Zuchtmasse*

Brevibacterium ammoniagenes KY 3462

Brevibacterium divaricatum KY 3810 . -

Corynebacterium IiIium KY 3509

Corynebacterium glutamicum KY 3801

Pseudoiuonas ovaIis

KY 4651	ureafaciens

Pseudomonas cruciviae	histidinolovorans
KY 3961
Arthrobacter
KY 3152
Arthrobacter

KY.3158

0,042	0_;185
0_;012	0,093
0_;040	0,175
0,010	0,073
0,016	0,112
0,011	0,062
0_;025	0,120
0,020	0_?060

*Aktivität/mr Zuchtmasse (Gärflüssigkeit plus Zellen)

7 0 9 8 1 Q / i i 1 S. ■■:

Beispiel 7

20 μΙ Serum (Produkt der American Hospital Supply Corporation, Dade Division, V.St.A., im Handel unter der Bezeichnung Moni-trol I; mit einem Creatiningehalt von 1,1 mg/dl) und 20 jxl einer Standard-Creatininlösung (wässrige Creatininlösung mit einem Gehalt an 400 ^g/dl) werden zu einer Lösung gegeben, die aus 1,0 ml einer Enzymlösung (0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7₅5 mit einem Gehalt an 0,1 mg Creatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Einheiten/mg) und 1,0 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers vom pH-Wert 7₅5 besteht. Das erhaltene Gemisch wird 10 Minuten bei 37⁰C incubiert. Nach der Umsetzung wird 1 ml Phenol-Reagens (hergestellt durch Lösen von 5>0 g Phenol und 25 tag Uitroprussinatrium in Wasser bei einem Gesamtvolumen von 500 ml) und 1 ml alkalisches Fatriumhypochlorit-Reagens (hergestellt durch Lösen von 2,5 g Natriumhydroxid in etwa 300 ml Wasser, Versetzen mit 1,25 ml Matriumhypochlorit und Auffüllen des Gemisches mit Yfasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml) zu dem Gemisch gegeben. Anschließend läßt man zur Färbentwicklung 20 Minuten bei 37 C stehen. Diese Lösungen werden als Testlösungen verwendet.

Getrennt davon werden 20 μΐ Serum und 20 μΐ Creatinin-Standardlösung zu einer Lösung, die aus 1,0 ml Enzymlösung und 1,0 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 besteht, gegeben. Gleichzeitig, werden 1 ml Phenol-Reagens und 1 ml alkalisches Natriumhypochlorit-Reagens zugesetzt. Auf diese

709810/11-15

Weise erhaltene Gemische werden als Vergleichslösungen zur Ermittlung des Leerwerts verwendet.

Die optische Dichte der Testlösungen "bei 640 mu wird gegen die Vergleichslösungen gemessen. Durch Messung der Creatinin-Standardlösung läßt sich eine Eichkurve für die optische Dichte bei 640 nyu und die Creatininkonzentration aufstellen. Unter Zugrundelegung dieser Werte wird die Creatininkonzentration im Serum nach einer Messung der optischen Dichte des Serums bei 64P mju, berechnet.

Die Ergebnisse sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt. Aus Tabelle III ergeben sich die Werte für die Greatininmenge im Standardserum nach zehnmaliger, aufeinanderfolgender Bestimmung. Aus diesen Werten wird die Standardabweichung und der Variationskoeffizient berechnet.

In Tabelle IV sind die Ergebnisse einer, herköminlichen und der erfindungsgemäßen Creatininbestimmung an 20 Serumproben gegenüber gestellt;.

Tabelle	Versuch ITr.	III
1	ermittelte Greatininmenge . Γmg/dl)
2	1,00
3	1,07
4	1,01
5	1,09
6	1,00
7	0,98
8	1,02
9	1,00
10	1,05
Mittelwert	1,02
Standard abw ei ellung	1,02
Variationslcaeffizient	0,03
Z, 94

Probe

Serum 1· "2 3' 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

• 19 20

- 27 Tabelle IV

bestimmte Creatininmenge (mg/dl)

erfindungsgemäßes Verfahren nach Verfahren Jaffe

Mittelwert Korrelationskoeffizient: Ύ

(Yi)	(Xi)
1,09 ' ·	■1,50 ·
0,85	1,30
1;21	1,76
0,51	0,73
1,52	1,91
0,59	. 0,93
1,10	1,43
1,17	1,63
1,09	1,42
0,85	1,12
1,03	1,25
0,41	0,63
* 0,66	0,92
0,51	0,71
0,21	0,33
0,57	0_T88
0,58	0,79
1,60	2,01
l_r55	2,03
1₇46	1,85
Ϊ = 0,93	X = 1,26

₌ ε (Xi - X) (Yi - Y) _{= 0;99} A(Xi-X)² ε (Yi-Y)²

• Regression: Y = 0,81 X - 0,09

7 0 9 8 mO7 1 1 1 S

Beispiel 8

20 ^l Serum (Moni-trol i) und 20 jal Creatinin-Standardlösung (wässrige Lösung mit einem Creatiningehalt von 400 /ig/dl) werden zu 1,0. ml. Creatinin-Desimidase-Lösung (0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,1 mg Creatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Einheiten/mg) und 1,0 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 gegeben. Das erhaltene Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C inkubiert.

Sodann wird jeweils 1 ml 4 millimolares NADH (Produkt der Firma Merck & Co), 40 millimolares 2-Oxogluterat und 1 ml einer Lösung von L-Glutamat-Dehydrogenase (mit einem Gehalt an 0,1 mg L-Glutamat-Dehydrogenase mit einer spezifischen Aktivität von mindestens 90 Einheiten/mg; Produkt der Firma Oriental Yeast-Kabushiki Kaisha)zugesetzt. Das erhaltene Gemisch wird 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Absorptionsabnahme des Reaktionsgemisches bei 340 mu wird gemessen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen Y und TI zusammengestellt.

In Tabelle V sind die Werte für eine zehnmalige, aufeinanderfolgende Creatininbestimmung im Standardserum angegeben. Aus diesen Werten wird die Standardabweichung und der Yariationskoeffizäent berechnet.

In Tabelle YI sind die Ergebnisse einer herkömmlichen und der erfindungsgemäßen Creatininbestimmung in 20 Serumproben gegenübergestellt.

70981 0/1115

Tabelle V

ermittelte Creatininmenge

Versuch Wr. (mg/dl)

1 1.07

2 ν" 1,04

3 1,15

4 ' lj05

5 I₁ OB .6 1,11

7 . - . ■ 1,16

8 - 1,09 3 . · 1,12

l,J03

B tandar<i atew e ichung
Variat ionsfcoe f f iz ient

7-Q943 1O/ TIIS

Tabelle VI

Probe

bestimmte Creatininmenge (mg/dl)

erfindungsgemäßes Verfahren nach Verfahren Jaffe

Serum 1	1₇12	1.50
2	0,89	1,30
3	1,32	... 1,76
4	0_r59	0,73
5	1,55	1,91
6	Ό .,62 -	■ 0,93
7	1,15	1,43
8	*1,21	1,63
9	1,13	1,42
10	0_TB8	1,12
Ά1	1,18	1.25
12	. 0^,43	0 ,63
13	B_yS3	0,92
14	0,53	0,71
15	0,22	0,33 * *
16	0_T61	0,88
17	0,60	0,79
• 18	1,62	2,01
19	1,60	2,03
20	1,48	1,85
Mittelwert	T = 0,97	X = 1,26

Korrelationskoeffizient: _γ - 0,99 Regression·: Y= 0,83 X - 0,08

7 09 810/1T1S

2837671

Beispiel 9

20 μΐ Serum (Moni-trol I) und 20 μΐ C re at inin-Standardlösung (wässrige Lösung mit einem Creatiningehalt von 400/ig/dl) werden zu einer Lösung gegeben, die aus 1,0 ml einer Enzymlösung (0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt an 0,1 mg Greatinin-Desimidase mit einer spezifischen Aktivität von 0,1 Einheiten/mg) und 1,0 ml eines 0,1 m Phosphatpuffers vom pH-Wert 7,5 besteht. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37⁰C inkubiert.

Sodann wird das Reaktionsgemisch mit 1 ml eines alkalischen Ferricyanid-Nitroprussid-Reagens (hergestellt durch Vermischen γοη gleichen Mengen jeweils lOprozentiger Lösungen von Natriumhydroxid, Nitroprussidnatrium und Kaliumferricyanid und Verdünnen des Gemisches mit Wasser auf das 3-fache) versetzt, Das erhaltene Gemisoh wird zur Farbentwicklung 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und als Testlösung verwendet.

Getrennt davon werden 20 μΐ Serum und 20 μ.1 Creatinin-Standardlösung zu einer Lösung gegeben, die aus 1,0 ml Enzymlösung und 1,0 ml 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7»5 besteht. Dazu wird, gleichzeitig 1 ml alkalisches ferricyanid-Nitroprussid-Reagens gegeben. Auf diese Weise erhaltene Gemische werden als Vergleichslösungen zur Ermittlung der Leerwerte verwendet.

709810/1 115.

283787

Die optische Dichte der zu untersuchenden Lösungen wird bei 500 mu gegen die Vergleichslösungen gemessen. Durch Messung der Creatinin-Standardlösung läßt sich eine Eichkurve für die optische Dichte bei 500 ηιμ und die Creatininkonzentration aufstellen. Unter Zugrundelegung dieser Werte wird die Creatininkonzentration im Serum aus der Messung der optischen Dichte des Serums bei 500 mu berechnet. Die Ergebnisse sind in- den Tabellen VII und VIII zusammengestellt.

In Tabelle VII sind die Werte für eine zehnmalige, aufeinanderfolgende Creatininbestimmung im Standardserum angegeben. Aus diesen Werten wird die Standardabweichung und der Variationskoeffizient berechnet.

In Tabelle VIII sind die Ergebnisse der erfindungsgemäßen und einer herkömmlichen Creatininbestimmung in 20 Serumproben gegenübergestellt.

7 0 9 8 10/1115

Tabelle VII

Versuch Fr.

ermittelte Creatininmenge (mg/dl)

1	1,10
2	1^09
3	1.16
4	1,13
crt	1,17 .
6	1,15
7	1,09
8	• 1,11
9	1,13
10	1,12

Mittelwert Standardabweicnung Variat ionskoeffi zient

1,12 0,02 1,78

7 0 9 810/111

- 34 -Tabelle VIII

Probe

Serum 1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 bestimmte Creatininmenge (mg/dl)

erfindungsgemäßes Verfahren nach Verfahren Jaffe

CYi)	(XiJ
lj20	I₇ 50
I₇OO	1,30
1,39. -	1,76
0,61	0,73
1,62	1,91.
0,65	0,93
1,21	1,43
4,31	1,63
I₁ 18	1,42
0,90	l_r12
1,00	1,25
. Oj 48	0,63
0,71	0,92
0,57	0,71
0,27	0,33
0,59	0,88
0,63	0,79
Ij68	2,01
1,62.	2,03
I₁ 51	1,85

Mittelwert Y =1,07

Korrelationskoeffizient: γ = 0,99 Eegression: Y = 0,84 X - 0,05 X =1,26

7 0 9 8 1 0 / 1 1 1 E

Claims

Patentansprüche

1\ Verfahren zur Herstellung von Creatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege, dadurch ge-, kennzeichnet , daß man einen Creatinin-Desimidase bildenden Mikroorganismus der Gattungen Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas oder Arthrobacter in einem Nährmedium so lange züchtet, bis sich .Creatinin-Desimidase nachweisen läßt, und anschließend die Creatinin-Desimidase isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das Hährmedium mit Creatinin versetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , , dadurch gekennzeichnet , daß man die Züchtung 20 bis 30 Stunden bei einer Temperatur von 28 bis.33°C und einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus einen Stamm von Brevibaeterium ammoniagenes, Brevibaeterium divaricatum, Corynebacterium lilium, Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas ovalis, Pseudomonas cruciviae, Arthrobacter ureafaciens oder Arthrobacter histidinolovorans verwendet.

7 0 9 8 1 0 / 11 1 & ■
5. Verfahren nach Anspruch 4» dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganisinenstamm Brevibacterium ammoniagenes ATCC 31 169, Brevibacterium divaricatum ATCC 14 020, Corynebacterium lilium ATCC 15 990, Corynebacterium glutamicum ATCC 31 170, Pseudomonas ovalis ATCC 31 171, Pseudomonas cruciviae ATCC 31 172, Arthrobacter ureafaciens ATCC 7 562 und Arthrobacter histidinoloTorans ATCC 11 442 verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Creatinin-Desimidase isoliert, indem man die Mikroorganismenzellen unter Bildung eines Zellextrakts aufbricht und das Zellextrakt unter Gewinnung eines gereinigten Enzyms der Fällung, Adsorption und Desorption unterwirft.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man die Creatinin-Desimidase aus der Gärflüssigkeit durch Fällung, Adsorption und Desorption unter Gewinnung eines gereinigten Enzyms gewinnt .
8. Creatinin-Desimidase, dadurch gekennzeichnet , daß sie gemäß dem Verfahren von Anspruch 1 hergestellt worden ist.

709810/ 1115
9. Verwendung der gemäß Anspruch 1 hergestellten Creatinin-Desimidase zur quantitativen Bestimmung von Creatinin, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu bestimmende Probe mit einer Lösung von Creatinin-Desimidase so lange umsetzt, bis das Creatinin unter Bildung von Ammoniak und N-Methylhydantoin hydrolysiert ist, und anschließend die Menge an Ammoniak und/oder N-Methy!hydantoin mißt.
10. Verwendung nach Anspruch 9» dadurch gekennzeichnet , daß man die Umsetzung 10 bis 30 Minuten bei.etwa 30 bis 50⁰C durchführt.

.-■■". "^v *
11. Verwendung nach Anspruch 9> dadurch ge—

kennzeichnet , daß man die Bestimmung an Urin durchführte ;■
12. Verwendung nach Anspruch 9₅ dadurch' g e -

k e η η ze i c.h η e t , daß man die Bestimmung an Blutserum durchführt.

709810/1115