JPS58206966A - 同時較正不均質イムノアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、被検体を含有する疑いのある試料中の該被検
体を定量づるための１ｉｉｔ及び該被検体の定日法に関
する。

試料中の被検体の存在を検知し且つ測定するため新規で
簡単且つ迅速な技術を開発することには、連続して四味
がもたれている。この被検体は広い種類の物質、例えば
桑剤、天然産の生理学的化合物、汚染物、化学薬品、不
純物などのいずれかである。寥りの場合、特にある種の
生理学的に活性な物質の場合には、測定の速度が！Ｉ要
である。他の状態においては、簡便さか主に考慮される
。

広い用途かに見されている１つの簡便で迅速な技法は、
一般に試料中に浸し、続いて元々の試料中の被検体の量
に蟇つく信号を光しせしめることのできる固体棒又はフ
ィルムを含んでなる［浸漬棒（旧ｐ　５ｔｉｃｋ　）　
Ｊ法である。固体表面に結合した化合物の信号、例えば
吸光、反射又は螢光を測定するには多くの装置がある。

また捧浸漬法は、取り扱い、移動、分離な・どが簡便で
ある。

そのような技法は、簡便であるけれど、現像時間、温度
、干渉因子、試薬安定性及び観測される信号分−に影−
しつる他の条件に対して非常に敏感である。１２測され
た信号を！ｌＩ卓物と比較する定！ｌｉ分析の場合には
、試験条件を注意深く制御して帰１蓼物の条件を適合さ
せることが必要である。しかしながら、そのような「息
深い一す御は、浸漬悼沫の簡便さを減じ、分析を行なう
時間及び費用を増加させ、結果の不安定性を増巾する。

更に試料中の干渉因子の存在及び試薬の不安定性は最大
の注意を払ってさえも克服することか回能である。

それ故に、試料中の被検体の正確な検知を与え且つ現一
時間、濁度、Ｍ科中の干渉因子、試薬の安定性などに封
して非常に敏感で−ない新規な分析、　法を開光するこ
とが望ましい。

種々の固定化試薬及び異なる種類の試験片を用いること
と関連ダる特許は、米国特許第３９９３４５１号、第４
０３８４８５号、第４０４６５１４８、ｌ＠４１２９４
１７Ｍ、ｆ＃！４１３３６３９Ｍ及び第４１６０００８
＠：及び強国公開特許第２６３６２４４号を含む。結合
した及び結合してない抗原の分離を含む輛々の方法を開
示する特許は、米国特許第Ｒ１３，２９１６９号、第３
９４９０６４号、第３９８４５３３号、！＠３９８５８
６７Ｎ、第４０２０１５１号、ＩＩＩＩ鴫４０３９６５
２＠、第４０６７９５９月、第４１０８９７２号、第４
１４５４０６号及び第４１６８１４６号を含む。

９一 本光明では、被検体を含有する疑いのある試料中のｗｉ
検体の存在を定ｌｌ１１するための４ｉ！及び方法がＭ
！供される。この方法及び装置は、測定及び較正表面と
して言及される第１及び第２表面を含む。

この各々は望ましくは少くとも１つの触媒及び１つのＩ
！ｌを有する信号発生系を含む。双方の系は実質的に同
一であり且つ信号発生系の少くとも１つの共通員を含む
。

測定表面は特異的に結合する対複合体の生成手段による
共役体（Ｃ０ＩＩｊｌｌ（ｌａｔｅ　）の表面への結合
を含み、一方共役体は特異的結合対の１員に結合プる信
号発生系の員（ｒｓｐｓ員」）を含んでなる。

表面に結合する共役体の農は分析媒体中の被検体の醋に
関係する。

較正表向は、共有結合的に又は非共有結合的に、−接に
ヌは特異的結合！−１練合惇の生成をｆＦ　して表面に
結合・づるＳ＄ＩＳ員を＠りる。この場合、特異的結合
対は測定表面の結合対と異なる。

各表面における信号光生化合物の皺を比較すれ　１０− ば、被検体の辺が較正表面から発生する信号で示される
予じめ決めた娼より多いか、少ないかを決定することが
できる。

本発明によれは、少くとも２つの異なる表面を液体分析
媒体中へ一緒に導入づることによって被検体を含有する
疑いのある＃Ｘｎ中の被検体を定量するための方法と装
置が提供される。この時１つの表面は測定表面と呼ばれ
、他の表面は較正表面として言及される。分析は望まし
くは少くとも１つの触媒、普通Ｍ衆、及び少くとも１つ
の基質を有する信＠発生系の使用を含む。

信号を増巾させるためには、被検体のその同族結合装置
への各結合事象（ｅＶｅｌｌｔ　）に灼して複数の信号
封止事象の存在することが望ましい。この複数は動的及
び静的系の結果として存在していてよい。動的系では、
触媒、普通酵素から使用され、信号発生系は少くとも１
？６の基質、普通補舒糸を含む。この場合、Ｕ糸又Ｉｔ
″基質のいずれかは特異的結合装置に結合しでいてよい
。基質がサイクルできない場合、１通複数のｌ貿分子が
中心（ｈｕｂ）に結合して単一の結合４Ｉ象に関して複
数の基質分子を提供するであろう。

他に、検知しうる信号を中心に与える非触媒的分子を複
数で結合さけることができる。そのような分子は普通分
光学的に検知できるであろう。光を吸収ケる染料はいく
つかの場合に有用であるかも知れないけれど、蛍光及び
化学発光を、通常存在づる装置でより正確に測定しう−
る信号を封止ずるものとして使用する。

！１１１３員の共役体及び特異的結合対液合体を通して
測定表面に結合する特異的結合対置として存在４る５Ｉ
ＩＳ員の量は、媒体中に存在する被検体の雛に関係する
。分析中に較正表面に結合するｓｐｓ員の鋤は少くとし
１つ、普通１つの予じめ決められた被検体の淵ｌｉに対
して、有利な範囲の信号ωを与えるようなものであろう
。較正表面にお１ノるｓｐｓ員は、試料を含む分析溶液
へ浸す前に或いは分析中に共有又は非共有結合の結果と
して存在しうる。但し非触媒的ｓｐｓ員の場合には、結
合は非共有的であり、引き続いて分析溶液へ浸される。

本方法及び装Ｕは、各個々の試験を１テなっている際に
１分析系の較正を同時に行なう。１ａ＠光生糸は、＠知
しうる信号の２つの表面での琵１と関連し、観測される
信号に影智する多くの条件に関して同一の条件に供され
る。従って検知しつるｔ８号の、条件の変化、試料の内
因的物質なとによる変動は、２つの表面での・検知しつ
る信号発生に串打的に彩管し、較正表面の信号劇は測定
表面の１６号量の評価に対する４１Ｉｉ準として役立ち
うる。

本発明は、それぞれ検知しうる生成物を生成する信号光
主系を用いる２つの表面を使用することに依存する。測
定表面に結合するｓｐｓ　餞の量は媒体中の被検体の量
に関係する。　狛で信号を封止ずる検知しうる生成物の
生成は渕ｉ表面に灼プるｓｐｓ員の量に直接関係するで
あろう。対照的に較正表面に灼して結合するｓｐｓ員の
量は媒体中の被検体の量にだけ依存しないであろうし、
普通それ１３− に無関係である。較正表面に対して存在するｓｐｓ員の
組は、較正表面に予じめ結合してない峙てさえ、１１通
分析媒体中の被検体の煽に無関係であるであろう。

５ｉｎｓ員分子か１度表面に結合プると゛、２つの表面
での信号に生糸は同一の環境に供され、従って較正表面
で−のＩ！知しうる信号の発生は媒体中の被検体の１１
度の定性的又は定量的分析に幻づる基準として使用ザる
ことができる。多くの部分に対し、肉眼での分析の場合
、較正表面は特異的ＩＡ度を分ｖ′ｉ１ｊ′るために使
用されなく、むしろ意図する被検体が予じめ決められた
量より多い開て存在するか父は存在しないかを決′定す
るために使用されよう。

分゛°析を行なる場合には、多くの測定手順及び組合し
′か使用でき、２つの表面に結合づる物質を変化さ：ｔ
！ることかできる。２つの表面と関係して、２つよりも
多い表面を使用する、即ら測定及び較正表面の１方又は
両方が装置中に複数で存在していてもよいということを
理解すべきである。

１４− 較正表面は非触媒的糸を除いてＳｐａ　＠が表＠Ｉ＼最
初に結合することを含み、この時予じめ決められた鮭の
触媒が表面に結合する。他に、特異的結合対間は５ＩＩ
Ｓ員に結合する較正表面に使用でき或いはｓｐｓ員に枯
含した特異的結合対置に使用しつる。そのような特異的
結合対員は、被検体の、被検体に同族の特異的結合対間
への結合に含まれる決定点（ｄａｔｅｒａ＋ｉ＋＋ａｎ
ｔ　５ｉｔｅ）以外の決定点に結合する。

測定及び較正表面ＩＪ、いずれかの簡便な材ＩＩからｌ
ｌ１ｌ造でき、いずれか簡便な構造を有することかでき
る。但しその表面は分析中にその構造全体性を実質的に
保持していることができる。２つの表面は、両表面にお
１プるｓｐｓ員が実質的に同一の具合の環境条件に呼応
していることを補償するために同一の環境条件に供され
るように、通常並置される。

ある被検体又はある状態に即用しうる種々の信号発生系
が使用できる。各々の場合、信号［系１５− はＶＡ知しつる信号を与えつる少くとも１つの機能体、
望ましくは少くとも１つの触媒、普通少くとも１つの１
９１、及び触＠　ｓｐｓとの少くとし１つの基質を含有
するであろう。この場合、５ＩＩＳ員は特異的結合対間
に結合して少くとも測定表面に結合する共役体を生１２
プるであろうし、測定表面及び較正表面の双方に結合し
ていてもよい。

２つの表面を含む装置は、被検体及び共役体が測定表面
に且つ適当としては較正表面に結合する機会を有してい
た１つ又はそれ以上の溶液と一緒（こ接触せしめられよ
う。触媒系の場合、必要（こりして２つの表面は信号発
生系に対して必要な基質及び共因子を有づる試薬溶液中
へ導入される。しかし八からある状態においては、例え
ば２つの触媒を用いる場合には、信＠発生系のタベてを
、単一の分析媒体中において試料と一緒に組合せる口と
ができる。予じめ決めた時間の後、表面を現像溶液から
取り出し、測定表面及び較正表面上の検知しつる信号を
比較する。

１６− 今や本発明を更に詳細に記述しよう。しかしながら、本
に明を詳細に記述する前に、多べの術紬を定義する。

ｌ− 被検体一配位体であってよ゛いモノー叉はポリ−エビト
ビツク＜　ｅｐ＋ｔＯｐｉｃｌ　、普通抗原父はイーｊ
＠体である測定すべき化合物又は組成物。この化合物の
単数又は複数は少くとも１つの共通の１ビトピック点又
は決定点或い１ｊ受体き分けあう。

特異的結合対（［ｍｉｐ　Ｊ　＞−分子の一７’ｉ　／
Ｊｉ　１１！！の分子の特別な空間的及び極性組織に特
典的に結合するｆｉＲｌｊＸを表面又は空洞中に有する
２つの異なった分子。特異的結合対の員は配位体及び受
体く抗配位体）として言及される。これらは普通免疫学
的対であるが他の特異的結合対例えばじオチンーアビジ
ン、ホルモン−ホルモン受体などは免疫学、１対ではな
い。同族体の又は補足の基質は配位体りび受体であり、
一方向順のｌ！買はある状態において区別された、例え
ば襟謙をつけた配位体又ＩＪ１７− 受１本のいずれかである。

配位体−受体か天然に存在する又は製造できる＃線化合
物。

受体（抗配位体）−分子の特別な空間及び極性組織、即
°ちエビトビツク点又は決定点を認識しつる化合物又は
組成物。受体の例は天然に存在する受体例えばヂロキシ
を結合するクロプリン、抗体。

ＮＩＦａｔ）フラグメント、レクチン、核酸などを含む
。

配位体同族体−受体に対して同族体配位体と競合するこ
とのできる修飾された配位体。この修飾（ｊ配位体同族
体を他・の分子に結合するための手段をｌ！！供する。

配位体同族体は普通１つより多い水系を、゛−配配位的
同族体中心又は標識に連結する結合で澁換することによ
って配位体と異なるであろうかご己れを必ずしも必要と
しな（・。

＋１す（配位体同族体）−透通中心咳に列して一緒に共
有結合する増数の配位体又は配位体同族体。

中心＋＆　ＩＪ鯖過通複数官能基例えばヒドロキシ、ア
　１８− ミノ、メルカプト、エチレン基などを枯台点として有す
る多官能性の、通常崖合体の物質である。

この中心核は普通水溶性又は少くとも分散性であり、普
通少くとも約３５０００ダルトンてあり、一般に約６０
００００タルトンを越えないであろう。中心核の例は、
多糖類、ポリペ７チト、例えば蛋白質、ＩＬイオン交換
樹脂などを含む。

表面−測定及び較正表面は、それぞれ非分散性であり、
普通共通の支持体上に存在して少くとし約５０μＩｌｌ
！、一般にそれ以上、しばしば少くとも約１１Ｉ１１、
特に約Ｑ、５ｃａ＋２以下の表面積か存在し、且つ水に
不溶であって、所望の信号量を与えるｌｉｐ及び検知し
うる信号発生化合物の結合にとって必要な性質を提供す
るいずれかの物質であってよい。望ましくは表面はゼラ
チン性、透過性吸湿性、多孔性であり、或いは一般に全
容積と比較して実質的な空陣容鋤を、有（るチャンネル
又（よ□　　、 同等物であってよい相い又′１よ不規則な構造をｆ！ダ
るであろう。検知しうる信号発生化合物の性質に依存し
て、表面は吸収性又は非吸収性であり、好ましくは弱い
吸収性又は非吸収性である。表面は透明又は不透明であ
り、申−の物質又は複数の物質、混合物又は積＠物であ
ってよい。多樟類の物質及び形態が使用できる。表面は
分析の条件下にその全−性を実質的に保持することがで
き、従つ′Ｃ表面に結合する物質は表面に拘束されたま
まで、溶液中へ拡散しない。測定及び較正表面の双方の
土地の構造は実質的に同一であることが望ましい。

触媒−枯白一５ｉｐ−１１ｉｐに共役した触媒、普通酵
素。＠媒は信号発生系の１員であり、ｎ＋ｉｐは特別な
工９！！舶序に応じて測定表面に結合プるように選択さ
れる。

健号封止系（［ｓｐｓ　Ｊ　）−信号に生糸は触媒又は
非Ｍ媒的、好ましくは触媒的であり、更に好ましく　Ｉ
Ｊ酵糸触媒を有しうる；望ましくは、一方のＭ県の生成
物が他のｌｉＩ県のＪ１賀である２つの酵素が使用され
る；更ピ触媒的悄号封止系には、少くとも１つの基賀、
適当なものとして？１１酵素が包含されよう。信号光生
糸は、媒体中に存在する被検定の鰻に関連した検知しろ
るシグナルを測定表面で発し、一方較正表面において少
くとも１つの配位体−受体対、例えば配位体及び天然受
体又は抗体、酵素及びＭ賀又は酵素を含む。償号発生糸
（Ｊ、全体で又は部分的に、表面に結合し且つ検知しう
る信号を発（る［信号発生化合物ｊによって検知しうる
信号を較正表面で発する。較正表面における検知しうる
信号の麺は被検体の量に関係なく、少くとも１つの因子
に依存する。信号光生糸１こ包含されうる他の物質は、
少くとも２つのｉＩ累が使用される場合螢光体に対する
光、化学発光番こ対ダる反応物及び中間体生成物に対す
る捕捉剤である。

簡略化して、信号光生糸の員は［ｓｐｓ員２として言及
されるであろう。ｓｐｓ員は基質という術語が補酵素を
含む場合、螢光体、化学光光体、Ｍ衆又は！１賀であっ
てよい。

２ｌ− １ＩＡ終分析媒体は、反応物又は反応物の組合せ物の予
Ｕめの各々の添加及び項五、表面の水性媒体からの除去
及び１つ又はそれ以上の反応物を有する異なる水性媒体
への移行を含む予じめの分離、或い１ｊこれらの組合せ
物の結果のものであってよい。

本ｈｔは結合していないｅｌ識した共役体を、１方叉は
双りの表面に１ｌ複合体を通して結合したものから分離
する必要がないけれど、多くの工程においては、結合し
てない触媒か実質的に存在しない現噸剤溶液が使用され
るであろう。分析に含まれる神々の媒体は、測定及び較
正「表面」を限定する液相及び同相からなる。

分析を１１なう場合には、表面を水性媒体中においｔ試
料と、信号発生系と及び補助物質と、同時に又は段階的
に接触させて表向と関連した検知しうる信号を碍る。測
定表面での検知しつる信号はその表面に結合した４１ｍ
された共役体の船を関連し、これが試料中の被検体の鱒
に相当する。信号光生糸の性質及び所望の信号の・検知
法に依存して、２２− 表面を分析媒体中で読むことかでき、或いは分析媒体か
ら分離して読むことができる。

分析を行なう場合には、普通水性媒体が使用されよう。

他の極性溶媒、１１１通アルコール、Ｊ−テ・ルなどを
含めて炭本数１〜６、更に普通１−４のＭ素化有機溶媒
も含有ぜしめうる。普通これらの共溶媒は約４０　ｋ　
１１　％以ト、更に約２０全嬶％以下で存在するであろ
う。

媒体に対するＥＩＨは普通的４〜１１、史に普通には約
５〜１０、好ましくは約６．５〜９．５の範囲にあるで
あろう。ｐＨは信号発生系を最適１ヒしつつ、受体によ
る特異的結合のかなりの朧を帷持しうるように選択され
る。いくつかの場合にはこれらの２つの考慮すべき点の
間で妥協か行なわれよう。所・望のｐＨを達成し、その
１１Ｈを分析中に維持するために種々の緩衝剤が使用で
きる。緩衝剤の例はホウＳ塩、ｖＡ酸塩、′炭酸塩、ト
リス、バルビツルなどを含む。用いる特別なａｉ衝削は
本光明にとって厳密でないが、個々の分析においである
ｍ　ＩＪ剤は他のものより好適なこともある。

分析を行なうＩ；めには、適度な１ｍ度が通常使用され
る。測定期間中の一定ｉＬ［は一般に必要でないが、急
速で大きい変動は望ましくない。分析の）昌度は一般に
約１０−５０℃、更に普通には約１５へ、４５°Ｃであ
る。

分析しうる被検体のｉ１度は一般に約１０→〜１０−Ｉ
ｓ　ｈｌ、更に普通には約１０−６〜１０−１３　Ｎ−
１にあるであろう。分析が定性的、半定量的又は定量的
であるかどうかに依存して、用いる検知り法及び問題の
被検体のａｌｌｌは通常的の試薬のＩ＋負を決定するで
あろう。

帰々の試薬の濃度は、用いる工程手順、被検体のヒ゛賀
、表面に結合したｍ　ｉ　１＋及び触媒に結合した１ｐ
、要求される分析ｆ１度などに依存して広く変化する。

いくつかの場合にはｍｉｐの一方及び他方を大過剰で使
用し、τ方他の工程では分析の感度、１゛ を翔ｉｐの比における変化に呼応させるであろう。

本発明の較正された分析を１１なう場合、測定及び較正
表面の双方は試料及び信＠発生系と同時に接触させるこ
とが必要である。また両表面は、媒体中の局所的変化に
基因するかも知れない相違を最小にするために互いに近
くに位ばさせることが望ましい。便宜上、これは両表面
を共通の捧又は支持体上に配置させることにょっ−て達
成しうる。

しかしながら、本光明の方法を実施する場合、表面を共
通の支持体上に配置１ｆ　することか必要ではなくて、
表面を信号に生糸の種々の成分中に浸し、これを同時に
且つ同一の長さの時間で取りた（ということだけが必要
である。さもなければ表面は分析の性能にＲ影響を及ぼ
さずに独立に取り扱ってもよい。

表面に対する共通の支持体は、従来法の捧浸漬で使用さ
れる如き捧又はプラスチックフィルムが簡便である。そ
のような浸漬する棒の正確な性質及び寸法は厳密でなく
、分析系の他の因子、代表的には神々の試薬容器の寸法
と適合するように選択される。両表面は長い浸漬棒の１
端に位置し、２５− それを比較的少量の、典型的には１００μｍ〜２１の試
料中に容易に浸ツことのできることが望ましい。表面を
互いに隣って位置させれば、＃ｌ終決定を行なうための
表面の肉眼による比較を容易にする。表面は垂直に又は
水平に位置していてよい。

すでに示したように、一方又は双方の、複数の測定表面
及び攪数の較正表面を含めて２つより多い表面を使用す
ることができる。例えば、複数の１１１ＩＩ体を同時に
分析することができ及び２・′又は複数の較正表面を、
異なる被検体に対する測定表面の各々と関連した異なる
較正表面或いは更に定鳳的結県を与えるために配置して
もよい。

１つヌＩＪそれ以上の溶液を用いる種々の工程手順が用
゛いられる。溶液との接触は撹拌又は接触を含む。Ｉ保
温工程も含むが、これは一般に約０．５分〜１１Ｍ間、
更に普通には約２分〜３０分間で変わりつる。

工程手順は、信＠封止系並びに被検体９性賀、及び経済
性、効率及び＃ａ度の考慮と共に変化する２６− であろう。信号発生系の試薬は別々の溶液として与えて
もよく或いは溶解して非共役的に表面に結合して試料溶
液中へ拡散させてもよい。

信号発生系の試薬を別々に与える場合には、試薬のすべ
てを試料と一緒にりることかでき：或いは１つ又は複数
のＳ　ｌ）Ｓ員を試料と一緒にし、次いで信号発生系の
残りの員を含む第２の溶液と一緒にしてもよい。例えは
、酔県−！Ｆｌ謙−１ｐは試料溶液と一緒にすることが
できる。このとき基質及びいずれかの補酵素は試Ｉｔ溶
液及び現像剤溶液として言及される第２の溶液或いは第
２の溶液として添加されるすべての残りのＳｐＳ員の間
に分布する。他にｓｐｓ員は非共役的に溶解して表面に
結合し、試料溶液との接触時に試料溶液中へ急速に溶解
しうる。

複数の溶液を用いる場合には、表面を溶液から溶液へ移
行させるであろう。普通中間の洗浄工程蒐 μ偶光的な特異的結合を除去するために必要とされない
であろう。

本丸間の方法及び系は検知しうる信号をにする標識を用
いることにより、被検体のいずれかの分析に関して使用
しつる。競争的及び非競争的工程手噛が使用しうる；被
検体及びｓｐｓで欅識した被検定は測定表面上において
同族体１１１ｉ　ｐに灼して競合し或いはそれらは連続
的に結合するかもしれない。或いは？！１検体が複数の
結合点を有する場合、イれＩＪ測定表面に結合したｍ１
ｐ及び５ｐｓ−僚識一−用】のｍ　ｉ　１間の嬌かけと
して役立らうる。表面上の及びｓｐｓ共役体に含まれる
罎々の１０並びに表面が接触りる溶液の数及び信号光主
系の員を変えることにより、所望の定鴻性のＰｉ！度、
使用者の為混、及び存在する装置に依存して工程手順を
広く変分ることができる。更１こ同一のｆ４慮のいくつ
かヌ＜ｉすへては較正表面の性質及びｓｐｓ員が較正表
面１″−結合している様子に彰１１づるであろう。

信＠発生系は非触媒的又は触媒的であってよい。

非触媒的系は中心□又は粒子に結合した偉号封止像謙、
例えば螢光体又は化学発光体を複数で含み、単一結合の
場合に単一結合から比較的大きい信号を得るこができる
。１１６！検体の性質に従って選択される１ｐは中心又
は粒子に結合して存在するであろう。付着体の被検体の
場合、付着体（抗付咎体）に対する抗体は測定表面に結
合されていてよい。

次いでこの測定表面を試料溶液に浸す、、ｉ１１検体（
Ｊ結合点の部分に結合し、これを満す。この時粉子−付
曽体共役体は残りの存在する抗付ｗ体点に結合する。他
に、粒子−付着体共役体は試料溶液と一緒になり、測定
表面に存在する結合点に対して被検体と競合してよい。

触媒系は１ｐに結合した基質上の触媒を含んでいてもよ
い。基質が１ｐに結合している場合には、通常中心（ｈ
ｕｔ＞）が非触媒系におけるように多層で、複数の基質
及び１種又はそれ以上の１ｐと共に使用されよう。！１
′Ｒの１つが補ＩＩ素である場きには、補酵素を、２つ
の醇県系を用０ることによって再循環してよい。この場
合、結果は単一の補酵素の存在のために複数の信号光中
化合物の生産２９− をもたら１．これらの系は文献に詳細に報告されている
。基質を循環しないときには、基質は普通螢光体に刑す
る前駆体であるであろうし或いは化学光光をもたらそう
。

ｔｍ　ｉ　ｐにＭ合した単一の触媒、普通酵素を含む触
媒系において、触媒−結合−１ｐ及び被検体は。

触媒−結合−１ｐが測定表面において同時に又は連続し
て同族体１ｐに対して競争するような競合球式で用いる
ことができる。即ち被ＩＩ体を含有する試料を、触媒−
結合−Ｉｌｌｉｐと組合せて表面と接触させてしよく、
或いは続いて触媒−結合−１ｐ゛と接触させることがで
きる。前者の場合、触媒−結合−ｍ１１）は比較的限ら
れた量で存在し、測定表面に存在する１ｐ結合点に対し
て被検体と直接競合プ乞。後者の場合、触媒−結合−１
ｐは、被検体の測定表面への結合後に残存する結合点を
満し、それ故に前者の状態におけるよりも大過重りの、
問題の被検体のｉ１１度で存在することができ、る。１
１）か測定表面に結合鎖る十分な時間の後、表面を、。

３０− 表面に結合し且つ検知しうる信号を与えるであろう生成
物に帰せられる化合物を含む、共因子を包含した過当な
！！！賞と接触させてよい。

他の具体例においては、特に少くとも１つの酵素を有す
る触媒の組合せ物が使用される。この場合、触媒の１つ
は他の触媒のｌ！賀である生＠物を生成する。これは特
に２つの酵素の場合、それが試薬溶液の必要数及び　又
は洗浄必要条件を雌牛にし且つ表面における信号発生化
合物を急速に生成するという点で好適な具体例である。

この具体例において、測定表面はｍｉｐばかりでなく、
２つの酵素の１つ、好ましくは系の第一の酵素を含む。

ＷＩ素−結合−ｍｉｐは好ましくは系の第２の酵素であ
る。第１のｉＩ′１ｇの生成物は第２の酵素に対して必
須の基質であり、従って信号光生糸に必要な→々の基質
及び共因子は水性媒体中における予備熟成反応に関して
関係することなしに第２の酵素と１１ 一緒にしてよい。第１の酵素の基質は、表面と相合わさ
った時にだけ繰返して１２の酵素の基質て助；ホしたよ
うな同様の工程順序も使用しうるが、触媒−樟１ａｋ−
ｍｉｐを含有する溶液から分離した基Ｍ溶液を用いるこ
との所望性は大賀的に減ぜられる。好適な工程手順は、
信＠発生系のりへての員を試料に添加し；次いで得られ
た溶液に表面を導入し；表面において検知しうる信号の
変化を与えるのに十分な時間に亘って反応を起こさせ；
そし′（表面を取り出し、次いで表面の各々における検
知しうる信号量を媒体中の被検体の量の尺度としＣ比較
する、ことを含む。

他に、最初に試料を被検体と接触させ、次いで酵素−結
合−１１）を！ｉ貿及び共因子と同時に又は連続口で添
加してもよい。前述したよう１に、過剰の酵素−結合−
１ｐは競争状態で使用することができる。この時、被検
体は最初に表面上のその捕捉ｍ　ｉ　ｐに結合する。被
検体か矯か１ノとして役立つさ 場合には、特に異なるモノクロプルな抗１体（ｍＯ−ｎ
ｏｃｌｏ＋＋ａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　）を酵素−結合
−Ｉｌｌｉｐに対比される如く表面においＩ使用する場
合には、６９本−結合−ｍｉｐを被検体と同時に或いは
被検体に連続して添加するかどうかと関係なく、過剰量
の酵素−結合−１ｐを使用してもよい。基質及び共因子
の′ａ度は好ましく（ま酵素の繰返し速度に関して限界
因子となるほど大賀的に過剰量で存在するであろう。即
ち、それは酵素に対するミバエリス定数を越えるであろ
う。

較正表面は、所望の感度及び較正表面と測定表面との間
で平行化される因子数に依存して変化し−よう　。

較正表面は、少くとも１つ、好ましくは２つの結合事象
、即ち同族体１ｐ又は酵素−！１賀（補酵素を含む）の
結合を含む結合事象において測定表面に平行であろう。

非触媒的信号発生系の場合、１ｐ測測定面に結合した１
ｐと異なって、較正表面に結合しよう。望ましくは、較
正表面に結合した１ｐは測定表面に結合した１いと同様
の性貢のものであり、２つの表面は付着体、抗原又は受
体３３− を適当なものとして有するであろう。

触媒的１８号光封止の場合、較正表面はｍｉｐを含む必
要がない。最も藺申な触媒的較正表面は表面（こ共有的
に又は非共有的に結合した触媒であり、この時触媒的活
性が予しめ決められた飴で付与される。即ら、分析測定
中、触媒は測定表面に結合しＩ；触媒と同一の外来の因
子及び条件に較正表面上で供される。即ら、濃度条件、
試薬安定性、外来の非特異的な干渉物、並びに特異的干
渉物、条件及び、閥喰の局所的変動、などはすべてが２
つの表面において同様に、検知しつる生成物の生成に影
Ｗダる′てあろう。従って信号発生化合物の生成におけ
る変動の主な原因は測定表面及び較正表面にあ゛いて平
行的に影響されよう。

平行的関係は、較正表面一トでｍ１複合体を形成さＵる
ことによっても更に高めることができる。

これは種々の方法で達成できる。１つの方法は、１［活
性に重大なほど影響しないｒｌｊ素−媒に対づる受体を
ト」与することである。ｌｌＩ素−結合−ｍ　ｉ　ｐ３
４− が問題の被検体のＳ度範囲において測定表面に結合する
量よりも実質的に過剰量である場合、較正表面に結合す
る酵素の量は実質的に一定になるであろう。・しかしな
がら、ＨＩＡのその受体、特に抗体に対する結合は、被
検体のその同族体１しに灼する結合と同欅の真白に彰％
１されよう。

１ｐを、触媒に結合した被検体と興なる共役させること
によって更に平１テにすることができる。

配位体液検体の場合、興なる配位体を触媒に活きさせる
ことができる。このとき、そのような異なる又は第２の
配位体は被検体と同一の触媒分子に或いは興なる触媒分
子に結合していてもよい。２つの配位体が同一の触媒に
結合している場合には、触媒−結合−１ｐに対して測定
表面及び較正表面間で競合が起きよう。触媒−結合−５
ｉｐが実質的過剰量で存在する場合、較正表面に結合す
る触螺−結合−１ｐの門は被検体の１１度によって重大
なほど影響されない。いくつかの事例において、触媒−
結合−１ｐは限られた量で、即ら測定表面及び較正表面
の双方に存在する全結合白よりも実質的過剰量でなくて
存在していてよい。較正表重置こＭ合する触媒の鎧は被
検体の濃度と共に変化しよう。さもな番プれば、較正表
面に結合した触媒の量における唯一の変動は、１ｐ複合
体の生成に影響する条件の変動の結果としてであろう。

非触媒的ｓｐｓ員又は基質１ｌｌｌ＃Ｉｋを用いる場合
、中心又は粒子に結合した２つの配位体く被検体及び較
止配位体）を有していてもよい。即ち共役体のａ度（こ
依存して、２つの配位体が同一の又は異なる共役体上に
存在する及び両配位体か同一の共役体上にあるとき共役
体か限られた農で父は実質的な過剰量て存在するという
競争的又は非競争的様式が使用しうる。ここに実質的な
過剰量とは、共役体ｊ＞　ｍ度が分析中に重大なほど変
化しないことを廊味する。

通常、較正表面は、分析媒体中の被検体の量に実質的依
存しないで信号を発する。較正表面に結合した成分を適
当に選択することにより、予じめ決められた１１１！１
［量を与える検知しうるｔｆ！５号か付与される。測定
表面からの検知しつる信号は、測定表面での検知しうる
信号の発生と同一の具合におおよその影響を受けるであ
ろう。従って較正表面で観察される検知しうる信号は被
検体の一定の１度層を規定しよう。

被検体の量を決定する場合には、測定及び較正表面その
信号量を比較し、その対比を予しめ決められた量以上の
被検体の存在を支持するものとして使用することができ
る。他に、測定表面での信号量を較正表面での信号量で
削ることによって半定量的又は窓層的に分析することが
できる。この方法では、分析媒体の信ｌｉ４に生に及は
す非待、興的影響が実質的に消去される。

５ＩＩＳ員−結合−１ｐにおける一１ｐが受体である場
合には、ｓｐｓ員−結合一受体の受体部分上の抗原点に
結合舊る較正表面上に受体を付与する更なる機会を持つ
ことができる。表面上の受体が抗体であ場合には、抗体
の便宜的な決定点に結合して３７− いてよい抗（抗体）を用いることができる。この方法で
は、Ｓ　ｐ　Ｇ員−結合−ａ＋　ｉ　ｐの１１Ｊは測定
表面に結合した捕捉１ｐに結合づる際の受体として且つ
較正表面に結合した捕捉１ｐに結合する際の高配位体と
して作用しうる。

多くの場合、本発明の装置の使用者はできるだ番ノ少な
い測定とできるだけ少ない移行（ｔｒａｎｓｆｅｒ　）
とをｉＪ能にづるこ吉か望ましいであろう。即ち、本方
法は、試料の測定もさることながら、すべてではないが
殆んどの試薬の測定を可能にしよう。

第２に、効率を高め且つ誤差の入り込む余地を減するば
かりでなく、試験のための全峙間を減するために、移行
操作の数ができる限り少ないことが望まＬい。

最も簡単な工程では、すｔくての試薬を表面に供給し“
或いは適当な処方物、簡便には凍結乾燥した粉末処方物
中で一緒にする。

試薬を例えば含浸、カプセル化、水庵性接看剤などによ
る接着などによって表面に供給する場合、＝３８− ＠胃は試料溶液中に１くことだけが必要である。

測定及び較正表面は、溶液の速度が非常に速い限りにお
いて同一の効果に供される。

凍結乾燥した粉末処方物は、試料を含有プる測定量の水
性媒体中に溶解せしめられる。溶液か均一になる十分な
時間の後、表面−を試料溶液中ｌ＼導入する。非触媒的
信号発生系に対しては、１ｐを適当に選択することによ
り、１回だけ表面を浸イ幽すればよい。触媒的系の場合
には、信Ｊｉ８発生系か２つの酵素を含み、一方の酵素
が他の酵素の１賛である生成物を生成するという単一の
処方物を使用することができる。第１の！Ｉ素が測定表
面及び較正表面の双方に結合している場合には、予めの
熟成反応と関係なしに第２のＳ素を！Ｉ１１のｉＩ索に
対する基質と組合せることができる。その理由は。

第１の酵素が第２の酵素に対して必要な！１賛を生成す
るまで反応が起こらないからである。

・；１− （３枠発生系に１つだけの触媒を用いる場合には、溶液
の−・）ｉが触媒に対する基質を有し１［つ池の溶液が
触媒−結合−＋５ｉｐｌ有する少くとも２つの溶液を用
いて、表面を２つの溶液と別／Ｊに接触させるか、或い
は触媒−結合一輸１１１を表面に溶解的に結合させ、単
・の基質を含む試薬溶液を使用する。

信号発生化合物は、観察される信号の増減と関係する。

信号発生化合物は触媒によって発生する場会表山に優先
的に結合し、そして肉眼的に検知しうる或いは反射光計
又は蛍光ａ１により検知しうる（ｄ号をりえる。信号発
生化合物は通常それが生成される媒体中に実質的に不溶
であり、また触媒ＩＬＪ物に直接的に又は間接的に由来
するであろう。

４ｇ　Ｉ３．発生化合物が表面に結合した触媒により表
面にぼって生成すれば、４ｄ号発生化合物の表面への結
合に由来する全信号発生化合物の溶液からの割合が最小
になるであろう。

多くの状態において、捕捉剤が望ましい。例えば２つの
酵素を信号発生系に用いる場合、第Ｊの酵素に対する捕
捉剤をバルク溶液に用いれば、バルク媒体中での１ｄ号
発生化合物の生成は更ｉこ減することができる。また信
号発生化合物をバルク媒体中において結合しない酵素−
結合−＋ｉｉｐの存在ドに生成せしめる場合には、信号
発生化合物に月する捕捉剤がバルク媒体中に有用である
。池に、溶媒中の酵素を選択的に１；活性化するが、表
面に結合した酵素に対しては実質的に不活性である酵素
禁止剤を用いてもよい。これは粒子に結合した禁止剤の
、表面に結合した酵素の結合点への接近を禁止する大き
い有孔粒子に結合しているり逆鉤禁止剤又は自滅禁止剤
を用いることによって達成することができる。

多くの場合、信号発生化合物は表面において信号を高め
るであろう。しかしながら、表面において信号を減する
可能性もある。例えば表面が蛍光性である場合、表面の
蛍光を減する消光剤を生成させることができる。池に、
異なる染料の表面１への沈殿時に観察される色が変化す
るある染料で４１− 着色した表面を使用してもよい。池に、＠１の酵素が１
ｄ号発生化合物を生成し１１つ第２の酵素が信号発生化
合物を破ｉＪＩする或いは必須の中間体を破壊するとい
う酵素の組合せを用いてもよい。例えばグルコース・オ
キシダーゼ及び西洋ワサビのベルオキシグーゼを表面に
用い、カララーゼをｍｉｐに結合させる場合、表面に結
合するカタラーゼが多（なればなるほど、生成する染料
が少なくなる。

即ち第３の酵素が酵素−結合−＋＋＋ｉｌ＋として存在
する、二とにより、表面に結合する酵素・結合−ｍｉＩ
＋の祉は信号発生化合物の観察される生成を減すること
と関連しよう。

定ｍ分析のためには、較正表面１ユの信号量に関連する
如き測定表面りでの信号量の比を明確にするとよＣ・。

即ち（４枠発生化合物の生成の開始から１．１枠発生化
合物の更なる生成の終ｆに至る特定の朝間を設定するこ
とにより、測定表面及び較正表面からの１ｄ号の比を、
被検体の量を定量化するための標準値に関連づけること
ができる。信号発生−４２＝ 化合物が一定の速度で生成する場合には、測定表面及び
補正表面の両方において信号の十分な変化が起こる限り
において時間は厳密な因子でないが、信号の変化が表面
において最早や観察されなくなる程時間を艮くはしない
。即柑比は時間、温度及び内因的１−渉物に月しで比較
的鈍感な結果をしたらす。池に、２つの補正表面を用い
る場合、これらの表面における信号の比は時間の測定の
代り：：使用することができる。

次のものは、単一の酵素及び組合せ酵素を用いることに
よる２つのに程順序の例である。被検体は配位体であり
、２つの表面は異なる配位体に月する受体を有する。こ
の時第２の配***は較正配位体として言及される。酵素
は被検体同族及び較正配位体の両ノｊと共役する。試料
を得、これを予じめ決められた容量−タ水性緩衝媒体に
溶解する。

酵素−結合−ジ配位体（被検体及び較正配位体）、安定
剤、賦形剤、及び随時緩衝剤を含む凍結乾燥した混合物
を試料に添加して、被検体及び酵素−結合−ジ配泣体を
含有する溶液を、測定表面において受体に対して被検体
と競争するのに十分な量であるが、依然限られた程度で
較正表面に結合する量で付与する。２つの表面を同時に
溶液中に導入し、埋にｈ：なった時間に亘って放置する
。これによって被検体は測定表面に結合し、酵素−結合
−ジ配位子は分析媒体中の被検体の量に関連して測定表
面及び較正表面間に分布する。

結合のための十分な時間、一般に約１〜１０分の後、２
つの表面を分析媒体から分離し、現像溶液中へ導入する
。１分な信号発生化合物が表面上　　　　　′に生成す
る適度の時間の後、表面を取り出し、２つの表面上での
信号を肉眼で比較する。較正表面における＋ｎｉｐの量
を適当に選択することにより、較正表面からの信号が例
えば測定表面からの信号よりも大きい、例えば暗′いな
らば、被検体が干しめ決められた鼠以下で存在するとい
うことがわがる。２つの表面からのシグナルを測定し、
次いで比を決定することにより、この比を存在する被検
体の実際の量を指示する標準物に対して対比することが
できる。従って肉眼的観察によって半定量的結果を得る
ことができ、また定量的結果を望むならば２つの表面に
おける信号を注意深く測定し且つ標準物と比較すること
により定量的結果が得られる。

次の工程順序では、酵素の組合せ物が使用され、信号発
生化合物の生成のために、１回の処方と試料及び試薬溶
液の表面との１回の接触を必要とする。過去の順序と比
較する目的で、この場合には２つの（酵素−結合一配合
体）を用い、同一の酵素と２つの異なる付着体、即ち被
検体である付着体及び較正付着体として言及される他の
付着体とを使用する。測定表面は被検体付着体に対する
抗体を有し、一方較正表面は較正付着体に対する抗体を
有するであろう。２つの付着体は交叉反応すべきでない
けれど、それは各々の結合複合体の生成が条件及び内因
的物質における変動に対して同様に影響されるように、
望ましくは性質が同様である４５− べきである。較正表面ｌ二の受体は、分析媒体中の被検
体の量に依存しないで信号発生化合物を生成する干しめ
決められた鼠で存在する。表面は受体の池に、酵素−結
合一配位体の酵素に対重る基質である生成物を生成する
第１の酵素も対比しうる鼠で有しよう。

工程順序を例示する。２つの酵素−結合一配位体は各々
の測定及び較正表面」二において受体に対して競争しな
い。それ故に、較ＩＥ表面に結合する酵素−結合一較正
配位体の量は媒体中の被検体の量の関数でないであろう
。（酵素−結合一配位体）は表面に結合した酵素の生成
物の不存在下に分析媒体に対し、て替えられた基質と反
応しないであろうが呟すべての試薬を単一の処方で一緒
にで外１次いで二Ｋを試料と組合せることができる。測
定表面−Ｌにおいてｍｉｐに対し、被検体と競争する酵
素−結合一配位体は、媒体中に存在する被検体の量と関
連して測定、表面に結合する酵素−結合一配位体の量を
変化させるために限られた量で存在する。前述した４６
一 ように、処方物は（酵素−緒合一配位体）及び基質の他
にｌ７１Ｌ衝剤、安定剤、賦形剤などを含んでいてよい
。

処方物を最初に水性媒体に溶解して試薬を適当な濃度で
有する溶液とすることができる。予しめ決めた容量の溶
液の一部分を採取し、試料を溶液中へ秤り入れる。第１
の酵素は酵素反応の進行に必須である。表面を溶液中に
導入し、信号発生化合物が表面で生成するのに十分な時
間をかけ、この時点において表面を取り出し、表面を肉
眼的に観察するか、或いは適当な装置によって信号発生
量を定量する。

較正表面の信号量は被検体濃度に無関係であるから、測
定表面における信号量が較正表面における信号量よりも
小さい場合、被検体は干しめ決められた量よりも多量で
存在すると言うことができる。他に、測定表面及び較正
表面の信号蓋の比を：： 用い且つこれらを公知の量の一検体を用いて調製した標
準物に対して比べることにより、試料中に存在する被検
体の鼠を定量化することかで外る。

本発明の適用と関連する種々の技術に関する記述に対し
ては、米国特許第４，２９９，９１６号の第７〜１６欄
を参照のこと。この記述は本明細占に参考文献として引
用される。

通常では好適でない更なる別の具体例は、各々がｍｉｌ
＋に結合し且つ各々が分析媒体中に存在する被検体の鼠
に比例して測定表面に結合する酵素の組合せ物を使用克
ることである。次いで同一の酵素組合せ物を、最初に或
いは＋ｎ　ｉ　ＩＴ複合体の結合を介して較正表面に結
合させる。この時ｍｉｐは２つの酵素の各々に対する受
体となりうる。或いは２つの酵素に対して共通の配位体
を用いることにより酵素部会せ物を結合させてもよい。

但しこの場合には酵素分子は被検体が結合する同一の又
は異なる酵素分子であってよい。

Ｌ料 １、′ 本分析に用いる成分は、被検体、測定及び較正表面、信
号発生系及び適当なものとしてポリ（配位体同族体）又
は多価の受体である。信号発生系は少くとも１つの触媒
−結合・ａ＋ｉｐ及び触媒に対する基質である溶質を含
む。信号発生系はしばしば更なる負を含む。

蓋検蔦 本発明の配位体肢検体はモノエピトビツク又はポリエビ
トビツクであることが特色である。ポリエピトビツクな
配位体肢検体は普通ポ１バ７ミ／酸）、即ちポリペプチ
ド及び蛋白質、多糖類、核酸、及びこれらの組合せ物で
ある。そのような組合せ物はバクテリヤ、ビールス、ク
ロモシーム、遺伝子、ミドコンドリヤ、核、細胞膜など
を含む。

被検体の正確な性質及びその多くの例はＬｉＬｍａ−ｎ
らの米１国特許第４．２９９．９１６号、特に第１６〜
２３欄に開示されている。この開示は本明細書に参考文
献として引用される。

ｌ淀汲１数１１画 ｍｉｐ及び／触媒を固定化して測定表面及び較正表面と
するための下地の表面は広く変えることが４９− できる。一般に下地の構造は、両表面に対して同一であ
り、信号発生系を強く吸着しないで分析の妨害を最小に
するように選択される。表面の下地構造は異なる形体を
とり、異なる組成を有することができ、組成物の混合物
又は積層物或いはこれらの組合せであってよい。表面に
対して選択される材料は、信号発生化合物の不溶化或い
は表面に結合した池の化合物の複合体化反応又は相互作
用によって信号発生化合物と相互作用できて、信号発生
化合物を生成し、破壊し又はそれと相互作用しなければ
ならない。

表面は種々の型及び形を取っていてよく、使用及び一定
法に依存して種々の寸法をとることができる。、表面の
例は、平形、凹形又は凸形であってよいパッド、円板又
は細片であってよい。厚さは厳密でなく一般に約０．１
〜２關であるが、便宜的な寸法又は池の寸法であってよ
い。典型的には、表面は共通の貝、例えば棒、管、キ、
ヤビラリー、繊維、ス）　ＩＪツブ、円板、平板、キュ
ベラ）　（ｃｕｖ−５０− ｅＬＬｅ）などに支持されるが、本発明は各表面を別々
のＩｌｌ？戒的支詩的支持体上することも意図している
。表面は支持体の合体部分を形成し又は支持体からはり
トリしていてもよく、典型的には支持体−Ｌに或いは支
持体から空間を置き且つ２つ又はそれ以上のスペーサー
で支持させて層を適用する。

表面は典型的には有孔である。系の性質に依存して種々
の孔径が使用される。表面は多官能性であり或いは１ｌ
ｉｐの共有結合を可能にするために並びに信号発生系の
一部を形成する池の化合物の結合を可能にするために多
官能性化することができる。表面め正確な性質は、本明
細書に参考文献として引用されるＬｉＬｍａｎらの米国
特許第４．２９９゜９１６号に議論されている。

ｍｉｐの表面材料への結合による測定及び較正表面の生
成は通常文献に示されている十分公知の扶Ｎｉｔ’アｑ
？、）ｖ、。＊＊＊、’　Ｍｔ４ｒ　Ｉ　ｃｈｉｒ。Ｃ
ｈｉｂａＬａ着、“ＩｍｍｏＬ＋１ｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚ
ｙａ＋ｅｓ″、Ｈａ、１ｓｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７Ｂ　）及びＣｕａｔｒｅｃａ
ｓｅｓ％Ｊ−［３ｉｏｌ　・Ｉｔｅｍ、、２４５．３０
５９（１９７０）。

天然及び合成の、及びその組合せであってよい多種類の
有機及び黒磯重合体が固体表面に対する材料として使用
しうる。重合体の例は、ポリエチレン、ポリプロピレン
、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタ
クリレート、ポ１バエチレンテレ７タレート）、レーヨ
ン、ナイロン、ポリ（ビニル１チレート）、シリコーン
、ポリホルムアミド、セルロース、酢酸セルロース、ニ
トロセルロースなどを含む。使用しうる他の材料は、紙
、ガラス、セラミックス、金属、非金属、半導体材料、
セルメット、シリケートなどを含む、更にデルを形成す
る物質、例えば蛋白質例えばゼラチン、リポポリサッカ
ライド、シリケート、７〃ロース；及Ｊポリアクリル７
ミド又はいくつかの水性相を形成する重合体、例えばデ
キストラン、ボリア（ ルキレングリコール（フルきレンの炭素１ｋ　２〜３）
又は表面活性剤、例えば両性化合物例えばリン脂質、跣
鎖（炭素数１２〜２４）フルキル７ンモニウム塩なども
含有させうる。

１号１生１ 信号発生系は非触媒的又は触媒的であり、各々の場合各
ａ＋ｉｐ結合事象に対して信号量を増巾する。

非触媒的系において、増巾ば中心（ｈｕｂ）又は粒子に
結合した信号発生官能基を複数で有しせしめる結果起こ
る。中心又は粒子がｍｉｐ結合を通して表面に結合する
と外、多数の信号発生官能基も結合されるようになる。

従って一定の増巾比が存在する。

用いる通常の官能基体は蛍光体及び化学発光体或いはそ
の前駆体である。その化合物の例は前述の米国特許に見
出すことができる。

中心又は粒子はいずれか簡単な有機又は無機核、例えば
ラテックス粒子、ガラスなどであってよい。

これらも文献に良く記述されている９粒子の寸法は一般
に直径が約１０〜１００μで変化しよう。

触媒的信号発生系は、普通には信号発生化合物である化
合物を生成するが、いくつかの場合には５３− 表面に結合した他の化合物と反応して信号発生化合物を
生成し、高性能化し又は分解してもよい。

酸素的及び非酵素的触媒の双方を使用しうるけれど、普
通触媒的信号発生系には少くとも１つの酵素触媒が使用
されるであろう。１つの触媒だけが存在する場合、この
触媒は複合体形成によって測定表面に結合するためにｌ
ｌ１ｉｐに兵役する。触媒の池に、測定表面において検
知しうる信号の変化をもたらす変形を受ける溶質が存在
しなければならない。

多くの場合、触媒−結合−ＩＩｌｉｐによって接触され
た変形に由来する生成物は信号発生化合物であるであう
う。それ故に、１つの触媒だけ、普通酵素が存在する場
合には、信号発生系は触媒−結合−ｍｉｐ及υその基質
を含有しよう。いくつかの場合には表面に［カプラー１
を結合させることが望ましく、触媒生成物は「カプラー
」化合物と反応して信号発生化合物を生成する。

好ましくは、２つの触媒、例えば酵素及び非酵５４− 素触媒の組合せ或いは一方の生成物が他方の基質である
という点で２つの触媒が相互に関係している２つの酵素
が使用される。この系においては、触媒によって接触さ
れる連続的な変化を受ける１つの溶質又は基質だけが必
要であり、検知しうる信号の生成に包含される化合物が
一生成する。しかしながら、多くの場合、通常には系に
おいて第１の酵素に対する基質及び信号の生成に含まれ
る化合物に対する前駆体として役立つ、通常信号を与え
る化合物を与える第２の化合物が存在するであろう、即
ち第１の酵素の生成物は信号発生化合物に対する前駆体
と反応して信号発生化合物を与える。

殆んどの場合、包含される反応は加水分解又はレドック
ス反応である。加水分解の場合、２つの酵素による工程
が不溶性染料生成物を与えるのに必要とされる酵素的に
ｉ化しやすい結合で連結された水に溶解する化合物での
染料の置換はこの種の系の例である６対比して、レドッ
クス反応の場合には、第１の酵素が第２の酵素に対する
必須の基質を生成することができ、この時第２の酵素は
第１の酵素の生成物と染料曲部体との開の反応を接触す
る。

酵素反応は、他の酵素の基質である生成物に対する溶質
の改変成いは酵素基質として役立つ溶質の実質的な部分
を含まない化合物の生成を含んでいてよい。第１の状態
はアルカリ性ホスファターゼがグルコースに触媒的に加
水分解されるグルコース−６−ホスフェートが例であり
、この時グルコースはグルコースオキシダーゼに対する
基質である。第２の状態は、信号発生化合物と酵素的に
反応して信号発生剤を生成する過酸化水素を与えるグル
コースオキシダーゼによって酸化されたグルコＬスによ
り例示しうる。

組合せ触媒は酵素を非酵素的触媒と共に含むことがで終
る。酵素は非酵素的触媒によって接触されろ反応を受け
る反応を生成することができ、或いは非酵素的触媒は酵
素に対する基質（補酵素を含む）を生成しうる０例えば
メルドラ青（Ｍｅｌｄｏｌａｂｌｕｅ）はＮＡＤ及びヒ
ドロキノンのＮＡＤ）（への転化を接触することができ
、これが長鎖アルデヒドの存在下にＦＭＮオキシドレダ
クターゼ及びバクテリヤ・ルシフェラーゼと反応して光
を発する。

本発明で使用しうる多種類の非酵素的触媒は、１９７９
年７月１　ｔｌ　Ｂ付けの米国特許第４．１６＋１゜６
４５号に見出される。この特許の関連部分は本明細書に
参考文献として引用される。非酵素的触媒は１電子径行
で反応する第１の化合物及び２電子径行で反応する第２
の化合物反応物として用いる。この時２つの反応物は触
媒の不存在下において起こったとしてもゆっくりしか互
いに反応することができない。

表面において信号発生化物を付与するためには、種々の
酵素の組合せが使用しうる。特にヒドロラーゼの組合せ
は不溶な信号発生剤を生成するため用いることができる
。他にヒドロラーゼ及びオキシドリグクターゼの組合せ
も信号発生化合物を与５７− えることができる、まｔこオキシＹリグクターゼの組合
せは不溶な信号発生化合物を生成するため１こ使用しう
る０次の表は表面にお−・て信号発生化合物を優先的に
生成するために使用いる種々の組合せの例である。ｆ通
Ｉｉ＋７述したように、表面において触媒を適当に選択
することにより、多数の試薬が単一の処方法で一緒にす
ることができる。

次の表において第１の酵素は表面に結合されることが第
２の酵素を輸；ｐに結合されることが意図され、特別は
場合にはその位置を保持することが望ましい。

５８− 第１表 相互関係をもつ２つの酵素系 第１の酵素　　　　第２の酵素　　　　　溶　質　　　
　　　信号発生ドース　　　　　す７トール染料 オキシダーゼ　　ペルオキシダーゼ ２　ウリカーゼ　　　西洋ワサビ　　　　ウレート　　
　　Ｏ−ジアニシジン染料 ペルオキシダーゼ １　グルコース　　　ミクロペルオキシ　β−Ｄ−グル
コ　ピスートルイソン架科 オキシダーゼ　　ダーゼ　　　　　　−ス４、エステラ
ーゼ　　β−グルクロニダ　２．２−ビス　　３′　、
３”−ジ（３′　−クロル　クロルーフエノ ーゼ　　　　　　　＋　４　／　−グルタ　−ルフタレ
ン゛　ロニロキシフエ ′　沖ル）　−フタリ ド コリン クロライドニス チル 反　　応 １、ガラクトース十〇、→Ｄ−ガラクトノ−δ−ラクト
ン＋ｕ、０゜ｚ　　Ｍ、０．＋４−Ｃ’１−１−ナフト
ール→染料１、　ウレート十〇、→アラントイン十Ｍ、
　ｕ。

２、　　Ｉｆ、０．＋　　ｏ−ソアニシジン→染料１、
　グルコース十〇、→Ｄ−ダルコノ−δ−ラクトン＋Ｍ
、　０゜２　Ｈ重Ｏ８＋ビス−トルイジン→柔料ロルー
４′−ダルクロニロキシフェニル）　−フタリド２２．
２−ビス＜、３’１“−クロル−４・−グルタ・＝・キ
シフェニル）　−フタリド→３′　、３“−ジクロルフ
ェノールフタレン 第１表（つづき） １１．１□−１−−１−１≠□□−１語２８１１１．．
−−÷−−命第ｌの＃素　第２の師素　　　浴　貴　　
　　信号発生５　アルカリ性　ペルオキシ　　４−Ｃ１
−４−Ｃ’ｌ−１ホスフアタ　ダーゼ　　　　ｌ−ナフ
チ　　−ナフトールーゼ　　　　　　　　　　　ルホス
フエ　　染料−ト ６　へ４ソキナ　グルコース　　　　　　　　　ヨード
ニド−ローゼ　　　　−６−ホス　　グルコース　　ト
リフェニルフェート　　　　　　　　　　ホルマザ／デ
ヒドロゲ ナーゼ ７　アルカリ性　β−ガラク　　０′　−（β　　４−
アルキルホス７アタ　トシダーゼ　　−Ｄ−ガラ　　ウ
ンペリフエーゼ　　　　　　　　　　　クトシジル　　
ロン−６′−ホ スフエート） ４−アルキ ル９ンペリ フエロン 反　　応 １、４−Ｃ”１−１−す７テルホスノエート→４−Ｃ’
１−１−ナフトールｚ　　４−Ｃ１−１−ナフトール−
染料１、　　ｙ、＋１／コース＋ＡＴＰ→グルコース−
６−ホスフェート２　グルコース−６−ホスフェート十
ＮＡＩＪＰ−！Ｖ、４ＤＰＩｉフエ１７／メトプルツエ
ート＋ＩＷＡＥＨ＋）リフェニルテトラゾリウムクロラ
イド→ホルマザン １、　０”　　−（β−Ｄ−ガラクトシジルー６′−ホ
スフェ−）＞４−’アハキルウンヘリフエロン→０１　
−　（β−Ｄ−ガラクトシジル）４−フルキルウンペ７
　リフエロン ２、　０’　　−（β−Ｄ−ガラクトシジル）　４−ア
ル今ルウ／ペリフエロン→４−アルキルウンペリフエロ
ン 全く明らかなことであるが、上述の染料は適当な溶解性
の必要条件を有する或いは本発明に対して適当な溶解性
の必要条件を有するように改良することができる他の染
料で代替しうる。更に、高局在化した染料濃度により、
染料は急速に表面に結合するということを理解すべきで
ある。更に、バルク溶液から表面へ拡散する染料の増加
量は表面上に沈殿する染料の量に重大なほど影響しない
であろう。染料の性質に依存して、染料による光の吸収
或いは蛍光ならば光の発生が測定しうる。

信号発生化合物を製造するための酵素生成物への化学反
応の代りに、酵素生成物の環境は信号発生化合物を生成
するために、表面へ結合する時に選択的に改変すること
ができる。例えばエステル又はエーテルを加水分解して
電荷に敏感な染料の不溶性の無色形を表面において生成
することができる。表面における局所的な電荷は表面に
荷電基を有しせしめることによってバルク溶液と実質的
に異なるようにしうる。プロトンの濃度に敏感で結合し
た生成物から観察される信号はバルク溶液又は液相にお
ける生成物のそれと非常に異なる。

溶質が不溶性の消光生成物を生成する場合には、蛍光体
消光剤対も使用しうる。

捕勘釣杯料 本分析には、種々の補助的材料がしばしば使用される。

特に、分析媒体には酵素基質、共因子、活性化剤、捕捉
剤、禁止剤などが包含せしめうる。

更に、緩衝剤並びに安定剤も通常には存在しよう。しば
しばこれらの添加剤の他に、更なる蛋白質例えばフルブ
ミン或いは表面活性剤、特に非イオＸ性表面活性剤例え
ばポリアル斗レンゲリコールなイども包含せしめうる。

ヌ１０Ｌ釆 次の実施例は例示するものであって、制限するものでな
い。

すべてのパーセント及び部は断わらない限り重量による
ものとする。但し液体の混合物に対しては容量部による
ものとする６溶媒を指定しない場合には、それは水であ
る。すべての温度は断らない限りセラ氏である。次の略
号が使用される：ＣＭＭ−−−０３カルボキシメチルモ
ルヒネ：ＨＲＰ−−−西洋ワサビペルオキシグーゼ；Ｎ
Ｈ８−−−Ｎ−ヒドロキシサクシニミド；ＥＤＣＩ−−
−Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ツメチルアミノプロピル）
カルボジイミド；ＤＭＦ−−−Ｎ、Ｎ’−ジメチルホル
ムアミド；ＴＨＦ−−−テトラヒドロ７ラン；ＢＳＡ−
ｍ−子牛の血清アルブミン；Ｇ　Ｏ−Ａ　Ｍ　Ｉ　Ｎ　
Ｅ−一一グルフース・オキシダーゼ−アミン；Ｔｖｉｆ
ｏｎ　ＱＳ　４４−−−７ニオン性表面活性剤（Ｒｏｌ
＋ｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ社）；ＮａＡＺ−−−ナトリウ
ムアジド：ＭＯＰＳ−−−３−Ｎ−モル７オリノプロハ
ンスルホン酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ＋ｎ）：ＣＤ　Ｉ−
弓、１′−カルボニルジイミダゾール。

実施例−１ 試（／ｕ　）君１Ｃｏｋ造 次の実験は次のようにバルクで製造した紙支持体に結合
させた抗モルヒネを使用した。Ｗｌ＋ａｔｍａロ６３− １Ｃ紙（１６フイートＸ１０．６３インチ）を、隣ろ紙
の層を分離して試薬を浸透せしめる２つのスクリーンを
用いて直径１インチの糸巻きに巻き−〕けた。得られた
カートリッジを反応器−二挿入し、そこでそれを夜通し
真空下に凍結乾燥した。ＣＩ’）１（８５１１、Ｐｏ１
ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ロツＹ番号１２０８７、カタログ
番号１５７５０）をシ′クロメタン２゜５Ｌに溶解した
。この溶液を遠心ポンプにより約４Ｌ／分の流速で２時
間反応器中を再循環させた。

次いで紙をジクロルメタン（２，５Ｌ）で３回洗浄し、
窒素（約７Ｌ／分）で３時間乾燥し、室温で夜通し転装
した。

モノにヒネに対する抗体（０，２ｍｇ；／ｍｌ）及びＧ
Ｏ−ＡＭ　Ｉ−Ｎ　Ｅ（０，１ｍｓ／ｍｌ）の燐酸塩緩
衝剤（２，８Ｌ）生石合物を、２４℃で４時間、約２Ｌ
／分で反応器中を再循環させた。次いで紙を燐酸塩緩衝
剤（４Ｌ）で４回洗浄し、スフローズ（１５％）及びＢ
ＳＡ（２１１１８／＋１１１）を含有する溶液２．５Ｌ
で安定化させた。過剰の流体を窒素（４０ｐｓｉで１分
間、６４− ８０ｐｓｉで１５秒間）で除去した０次いで紙を８９゜
５時間窒素流（２５０ｍｌ／分）下に真空乾燥した。

次のようにＨＲＰを用いて２巻きの濾紙を製造した： ＷｂａＬｍａｎ　Ｉ　Ｃ紙（１２フイートＸ１ｌ）、６
３インチ）の第１のロールを隣る層を分離する１対の針
金のスクリーンを用いて直径２インチの糸巻きに巻きつ
けた。Ｗｌ＋ａＬ−８１０Ｃ紙（１６フイート×１１．
１　、６３インチ）の第２のロールを、これも隣る層を
１対の針金のスクリーンを用いて分離して直径１インチ
の糸巻きつけた。第１のロールを第１の反応器中に置き
、第２のロールを第２の反応器中に置いた。そして両ａ
−ル（窒素を流して水分を除去しながら夜通し真空下）
こ乾燥した。

ＣＤ　Ｉ（１７１）ｇ）をジクロルメタン５　、　ｌ）
　Ｌに溶解し、これをシリーズに連結された反応器中を
４Ｌ　／　５′Ｐ’Ｃ″再循環した。次いで紙をジクロ
ルメタン４．５Ｌで３回洗浄し、次いで窒素（６Ｌ／分
）で３時間及び２００ｓ＋ｌ／分で夜通し乾燥した。

第２の反応器からの紙を、１．（１ＭＮａＯＨで１）８
６．９４に調節した燐酸緩衝剤中のＩＩＲＩ’に月する
抗体（２９，５６μｓ、／＋ｌ）、非免疫性のひつじの
１８Ｇ（２２μｓ／＋１）及びＱＳ４４（２％、ｗ、／
ｖ）の混合物で処理した。この混合物を攪拌しながら夜
通し保温した。この溶液に（ｉｏ−ＡＭＩ　Ｎ　ト：（
’、＋００ｍｇ）（製造法は下記を参照）をＮａＡＺと
共に添加した。最終の容量は２．５Ｌに等しかった。に
０−アミンの最終濃度は０　、２　ｍｇ／分であった。

この溶液を第２の反応器を通して５時間（２Ｌ／分）再
循環した。次いで反応器を燐酸塩緩衝剤（４Ｌ）で４回
洗浄し、スフローズ（１５％）及びＢＳＡ　（２ｋｇ／
饋１）の２．５Ｌで安定化させた。過剰の流体を加圧下
に除去し、１紙を窒素流（２，５Ｌ／分）下に真空乾燥
した。

グＩｖコース・オキシダーゼ（Ｓｏｇｍａ、　Ｅ、Ｃ，
１゜１．３．４）を、３０ｐｓｉ以下の圧力においてＡ
ａ＋１ｃｏｎＩ’　Ｍ　１１）の膜を用いて、３６０鋤
１から６０論Ｉに濃縮した。このグルコース・オキシダ
ーゼを４℃下に水４Ｌに対して２回透析し、濾過した。

これは分光学的に３２ａ＋ｇ／輪１の濃度を有すること
がわかった。このグルコース◆オキシダーゼ溶液５１．
５＋１に０．２Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム５．．１５ｍ１
を嫡々に添加し、反応を２５分間起こさせた。生成物を
、ＤＮＡ、Ｓの２ＩＩＩＭ酢酸ナトリウムを用いる５ｅ
−ｐｌ＋ａｄｅｘ　Ｇ　−５０の２，５Ｘ６０ｃ＋ｏの
カラムクロマトグラフイーで処理し、グルコース・オキ
シダーゼの主ピークを集めてアルデヒド誘導体を含有す
る溶液９１．５ｍｌを得た。この溶液に、ＤＨ９，５の
ｔ）、２Ｍ炭酸ナトリウム中３Ｍエチレンジアミン６餉
１を滴々に添加し、反応を３時間進行させた。

次いでこの混合物に１０ａ＋Ｂ／ｍｌの水素化ホウ素ナ
トリウム約３．９＋ａｌを添加し、混合物を夜通し保温
し、次いでクロマトグラフィーにかけて水素化ホウ素ナ
トリウムを除去した。

ｎ例−」− ６７− モルヒ　のＨＲＰへの 反応７９スフ中において、ＣＭＭ（３５，９輸ｇ）、Ｎ
Ｈ８（１２，６５ｍｇ）及びＥＰＣＩ（２１，１２１）
をＤＭＦ（１，ｌ＋ａｌ）中で一緒にした。次いで混合
物を窒素で７ラツシユし、室温で夜通し攪拌してＣＭＭ
の活性化エステルを製造した。炭酸塩緩衝剤（ｐＨ９，
５）２１飴１中ＨＲＰオキシアミン（１，９＋＋＋ｇ／
ｍ１）（製造法は下記参照）の混合物に、反応混合物を
４℃に維持しながら、活性化エステルを１０８ｍで増量
で１．５時間に亘り、ＣＭＭ：ＩＩＲＰ＝５０：１のモ
ル比終点まで添加した。次いで反応混合物をＧ　５０５
ｅｐｈａｄｅｘの２Ｘ３０ｃｍのカラムに適用し、０．
１Ｍ燐酸塩、０．２Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，０緩衝剤で
流出させ、蛋白質を監視した。

次いで蛋白質画分を集めた。

ｐＨ４，５の緩衝剤の酢酸す）　リウム５ｍＭ中１０ｍ
ｇ、／＋１ＨＲＰの５−１に０．２Ｍヨウ素酸ナトリウ
ム５０１を添加し、混合物を３０分間攪拌し、次いでＧ
　−５０Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘのカラムクロマトグラ６８
− フィーにかけ、ｐｌ（４，５の２顛Ｍ酢酸ナトリウム４
１衝剤で流出させた。蛋白質画分を２９ｍ１まで集め、
混合物を４℃まで冷却し、ｐＨ９、５の０．５Ｍ炭酸塩
４１ｆｌｉ剤中の、４℃の０．２Ｍ２．２’−オキシ−
ビス−エチルアミン２．９ｍｌを添加した。この混合物
のｒ＋、Ｈを、添加されるＩＮ水素化ホウ素ナトリウム
−水溶液で９．５に調節し、混合物を３゜５時間反応さ
せ、Ｓ　ｅｌ＋ｌ＋ａｄｅｘ　Ｇ　−５０のカラムクロ
マトグラフィーにかけた。

Ｉｆ　ＲＰ　４１）　ＯＩＩ＋ｇ及び２．２′−オキシ
−ビス−エチルアミン３．５ｇを用いて上記工程を繰返
した。元のアミンと約４つの更なるアミ７基を有する改
変アミンとの間で酵素活性の重大な変化は観察されなか
った。

ｎ泗−」。

、没債捧ぬ製造 分析に用いるために、実施例１の抗モルヒネ紙及び実施
例２の抗ＩＩ　ｌ＜　１’紙に１／４インチの円板の孔
をあけた。次いで円板をプラスチック製の棒の一端に並
行して接着し、浸漬棒とした。

０．１Ｍ燐酸塩緩衝剤、０．２Ｍ　ＮａＣ１（２＋ｎｌ
、ｐＨ７，（１）の標準溶液に、デュプリケー）　（ｄ
ｕｌ山Ｃ−ａｔｅ）中０．１（）０．３００及び１００
０　ｎｇ／　＋ｎＩのモルヒネを添加した。実施例４に
おける如く製造した浸漬棒を各溶液に室温で１分間浸し
た。洗浄せずに、浸漬棒をそれぞれ現像剤溶液２ｍ１ｌ
ｌｌこ置き、５秒間振とうし、９分間保温した。この現
像剤はＭＯＰＳ（５０ｍＭ％ｐＨ，６，８）、ＢＳＡ（
２＋ｎｇ／ｍ１）、４−ＣＩ−１−す７トール（０，２
＋ｇ／ｍｌ）及び実施例３で製造したＨ　ＲＰ−モルヒ
ネ共役体（２００ｎｇ／ｍｌ）を含有した。９分間保温
した後、浸漬棒を紋り出し、着色した紙の円板をＭａｃ
ＢｅＬｈシリーズ１５００反射分光光度計で読んだ。こ
の結果を第１表に示す。ここにＲＣは較正円板の反射に
関し、ｉ（Ｍはモルヒネの円板の反射に関するものであ
る。ＲＣ及びＲＭをＭａｃＢｅＬＩ＋の反射分光７２− 結果は較正円板の示す反射度が試験試料のモルヒネの濃
度に独立であり、一方モルヒネ円板の反射度がモルヒネ
の濃度が増大するにつれて減少するるとを示す。測定及
び較正円板からの２つの値の比を用いることにより、モ
ルヒネの定量化のための標準曲線ができた。

一曲１ モルヒネ及び燐酸塩緩衝剤の標準溶液を、各濃度におい
て全体で４０の試料に対し８つのレプリカを製造する以
外、実施例５におけるように製造した。浸漬棒を試験試
料の各々中に１分間浸し、次いで表示する時間の現像剤
溶液（実施例５）中に置いた。結果を第２表に要約する
。

７３− Ｃ ［モルヒネ）　　　　５　　１４．１；１１．９　　　
−０　　　　　　　　７　　　１４．７ｉ１５．７　　
　　−１０　　　１７．８；２０．７　　　　−１５　
　　２４．３：２４．８　　　　−１０　　　　　　　
　５　　　１４．９Ｈ１１，７−７１６，４ｉ１６．９
　　　　− １０　　　２０．１：２０．０　　　　−１５　　　２
５．５ｉ２５．Ｏ− ３０５９，９ｉ１１．？　　　　　− ７１６，７ｉ１６．９　　　　− １０　　　２１．０７２０．７　　　　−１５　　　２
４．１ｉ２５．４　　　　−１００　　　　　　　　６
　　　１１．２；１０．９　　　　−７　　　１６．９
；１６．１　　　　　−１０　　　１８．１；１９．９
　　　　−１５　　　２４．７ｉ２６．３　　　　−３
ｏｏ　　　　　　　　５　　　１１．６；１１．１　　
　１１．８？　　　　１４．８；１４．８　　　１（Ｌ
ｌｌｏ　　　　１９．４；２０．７　　　１９．９１５
　　２４．５ｉ２５．２　　　２５．０＊各時間におけ
るすべてのＲｃの平均 第２表 平均 ９．５ｉ　　９．２　　　　９．４　　　　０．７９１
１０；１１３　　　１Ｌ７　　　　０．７８１ａ４；ｔ
ｓ、ｓ　　　　１５．５　　　　０．７？２１．５：２
α９　　　２１．２　　　　０・８４７．７ｒ　　７．
６　　　　７．６　　　　０．６４１０、ｏｉｌＯ，７
１０，３０，６４ １＆２；１５．２　　　１４．２　　　　０．７１１＆
Ｊ１９．３　　　１＆６　　　　　α７４５、ｌｉ　　
ａ８　　　　　ｆＬｏ　　　　　０．５１９．３ｉ　　
＆４　　　　９．４　　　　０．５８”　ｉ　１　！１
　　　１１．０　　　　０．５５１５、Ｊ１４７　　　
１４９　　　　０．６０ｍ１　５．５　　　　　＆４　
　　　　α４６ａ、２Ｈ！Ｌ６　　　　鴫＆４　　　　
α４６６．９ｉ　　ａｓ　　　　　６．９　　　　　α
４３９．３寡　＆３　　　　９．３　　　　０．４７１
１．９寡ｌα０　　　１０．９　　　　　α４４衷！４
＃−ヱ 盾災性 各々異なる供給者からの尿の１６の試料をそれぞれ２…
１の・１−ノの部分に分割した。次いで各試料の２つの
部分にモルヒネを最終濃度３００　ｎｇ／ｍｌまで添加
した。浸漬棒（実施例４）を各部分に入れ、１う１間保
温した。次いで浸漬棒を取り出し、実施例５における如
く製造した現像剤溶液（２＋＋＋Ｉ）中に入れた。各浸
漬棒を９′Ｉｚ間現像し、結果を第３表に示す。

７５− ７６− 失格例−一旦 現像溶液中ｐ↓！−Ｂ、喝４匹−１庫洪役体（ｒ４１糺
ｒ変え杢；上の影１ 最初の溶液がＨＩ＜　１″−モルヒネ共役体を含有する
以外実施例５における如く２つの現像剤溶液を製造した
：濃度１５０’ｎｇ／ｍｌ、及び第２の溶液３１１１１
ｎ８／ｍｌ。

結果を第４表に示す。

７７− 結果は、本力法及び装置が定性的にも定量的にも媒体中
の被検体の存在を決定するための簡単で精度のよい方法
をりえる、ことを示す。非常に高められた分析の精度は
、信号をりえ珪つ被検体濃度に依存した表面の１ｄ号の
発生と同一の影響及び変動に洪される較正表面を用いる
ことによって得られる。即ち、ｔしめ決めた量以上の被
検体の存在を肉眼的に決定ｒることができ、或いは表面
の各７７からの信号量の比を用いることにより観察され
た結果を、公知の鼠の被検体で得られた比に関して１Ｌ
つ１ｄ号鼠の比の変化を濃度変化と共にグラフにして、
定置化する二とができる。

本り法及び装置は競争的蛋白質結合分析を用いることに
関して多くの利点を提供する。採作は簡単で、迅速であ
り、比較的熟練してない入間でも行なう、−とができる
。更に本ノＪ法は工程が少なく、被検体試料の測定以外
の誤差が測定表面及び較正表面に同様に影響するという
点で安全係数が組込まれている。従って誤差は効果的に
相殺される。

本発明を明確に理解する目的て゛例示及び実施例によっ
ていくらか詳細に記述してトたけｒしど、そのある種の
変化及び改変は特許請求の範囲内で実施しうろことは明
らかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被検体が配位体及び受体（「抗配位体」）からなる
   特異的結合体（ｒｌｌｌｉｐＪ　）の１員である場合に
   、その被検体の試料中における存在を決定する際に、 標識した１ｐ、信号光生糸及び測定第１表面を使用し、
   但しｍｉｐ　＠合体の形成の結果として該第１表面に結
   合する棉胤したｍｉｐの量かＢ分析媒体中の被検体の層
   と関連し、 該測定表面及び該試料を水性分析媒体中で一緒にし且つ
   同時に又は連続的に、該分析媒体中の被検体の量に関連
   したある愚の信号発生化合物を該第１表面において与え
   る少くとも該１１［議した１ｐを含む該信号発生系の員
   と、該測定表面を一緒にする工程を含んでなる、　゛ 該被検体の分析法において、 同ＦＡｍ　ｉ　ｐ又はＭ京−基質結合を含む少くとも１
   つの配位体−受体結合の結果として該信号光生化白１カ
   からある信号量を与える較正第２表面を該分析媒体中に
   有し、これによって該第２表面における佑＠対該第１表
   面における信号の比か非特異的因子と実質的に無関係ｔ
   こ該試料中の被検体の邑を限定する、ことを特数とする
   被検体の分析法。 ２、該＃＠識したｍｉｐが凌数の化学発光体又は螢光体
   分子に少くとも１つのｍ　ｉ　ｌ）が結合する中心核を
   ｈする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、増数の蛍光体分子か該中心核に結合づる特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 ４、被検体か配位陣没６受陣（Ｕ抗配位体」）からなる
   ゛°持異的結合対＋「ｍｉｌ＋Ｊ）の１員である場合に
   、その被検体の試）４中における存在を決定する際に ｍ　ｉ　１＋に結合した触媒（１−触媒一結合−ｍｉｐ
   　Ｊ　）を含む少くとも１つの触媒及びＩｌ＋　ｉ　ｇ
   含有の測定第１表面に結合した触媒によって接触的に転
   化される溶質を用いて、該第１表面に結合する触媒−結
   合−１ｐの鑑に比例して該第１表面に検知しつる信号の
   変化を生成せしめ、そして該第１表面の該試料及び該触
   媒−結合−１ｐとの接触により、該試料中の被検体のａ
   ｔこ比例して該触媒−結合−１ｐを該第１表面に結合さ
   せる１、 方法であって、 該触媒が、該Ｗ！４１表面に結合した該触媒の湯に対す
   る実質的に予じめ決定した比を与える量で結合している
   較正第２表面を該分析媒体中に有し、これによって咳！
   ＠２表面における信号対該第１表面における３信号の比
   が非特異的因子と実質的に無関係に該試料中の被検体の
   量を限定する、ことを特徴とする被検体の分析法。 ５、該触媒が酵素である特許請求の範囲第４項記載の方
   法。 ６、触媒が該Ｍ２表面に直接結合している特許請求の範
   囲第４項記載の方法− □、・　　“ ７、　ｌ１体がｓｉｐ複合体の形成□によって該接触中
   にの方法。 ８、該１占号光生系が触媒として２罎の酵素を含み、但
   し１つの醇衆の生成物が他の酵素の基質であり、またＭ
   県の１つが該接触に先立って該第１及び第２表面の各々
   に結合する特許請求の範囲第４．５．６又は７項記載の
   いずれかの方法。 ９、該溶質がＭ系触媒反応を受けて該表面に結合する不
   溶性の染料を生成づる染料助駆体である特ｌｌ′ｌ′ｌ
   ！＃１求の範囲第４項記載の方法。 １０、該触媒−結合−１ｐか酵素−結合一抗配位体であ
   る特許請求の範囲第９項記載の方法。 １１、該触媒−結合−１ｐが酵素−結台−配位体である
   ゛特許請求の範囲第９項記載の方法。 １２、、’被検体が配位体及び受Ｉ＊（「抗配位体Ｊ）
   からなる特異的結合対（ｒｍｔｐ　Ｊ　）の１員である
   場合に、その被検体の試料中における存在を決定する際
   、 １１１に結合した１つの酵素を含む少くとも２（垂の酵
   素及び該酵素の１つが１ｐを含む測定第１ｆ！面に結合
   する該酵素の１つによって接触的に不溶性染料に変形さ
   れる）８質染１１１前駆体を有する信号発生系を使用し
   、但し該不溶性染料が被検体の崩に比例して該第１表面
   に検知しうる信号をに１しまた該第１表面における該１
   ｐ−が１ｐ冶８体形成を通して酵素−結合−ｏ＋ｉｐの
   該納１表面への結合を与え、またｌｌｉ第１表面の該試
   料及び該酵素−結合−１１）との接触かＰｉｌｌｔｔ料
   中の被検体の量に比例して該酵素−結合−１ｐの該Ｗ４
   １表面への結合をもたらす、該被検体の分析法であって
   、該接触中、該第１表面に結合する醇累−結合一１ｐの
   量に対して実質的に予じめ決められた比を与える量で、
   該ＩＬｊ！Ｉｉ−枯合−１ｐの結合が１ｐ複合体の形成
   を通して結合する較止第２表面を該第１表面に隣接して
   有し、これによ−）Ｃ該第２表面における信号対該第１
   表面における信号の比が非特異的因子と実質的に無関係
   に該試料中の被検体の湯を制限する、 ５− ことを特徴とする被検体の分析法。 １３、抗ＵＳ受体が該第２表面に予じめ決められた膳で
   結合している特許請求の範囲第１２２項記載方法。 １４、配位体１ｓ検休以外の第２配位体が該酵素−結合
   −１１）の該Ｓ衆に結合し、また抗（第２配位体）受体
   が該第２表面に結合している特許請求の範囲Ｗ４１２項
   記載の方法。 １５、　ＢＡＷ４２ｊｉｉ！ｔ＆体カ酵衆−１合一＋ｎ
   ｉＤ　ＬＸ外（７）ｌｌ１ｍ分子に共役している特許請
   求の範囲Ｗ４１４項記載の方法。 １６、該第２１ｉｉ！位体が該ｖＩ酵素−結合ｎ＋　ｉ
   　ｐと同一の酵皐分子に共役している特許請求の範囲第
   １４４項記載゛の方法。 １７、、’支持体、多孔質材料の測定第１表面；該第１
   表置の近１角の多孔質材料の較正Ｍ２表面；該第１表面
   に非拡散的に結合した特異的結合対置；及び該第２表面
   に非拡散的に結合したｌＩｌ木又１．ｔ　ｍ　ｉ　ｐの
   少くとも１つ、を含むことを特徴とする内部較正６− 式の診断装置。 １８．該ｘｉ及び第２表面の双方が該表面に非拡散的に
   結合した同一酵素を有する特許請求の範囲第１７項記載
   の１Ｌ １９、特許請求の範囲第１８項記載の装置と射亀−枯台
   −ａ＋ｉｐ　４ｉ：含んでなり、該表面に結合したｍ　
   ｉ　（＋及び践醇素−結合−１ｐの１ｐが同一であるが
   、同族であるか又は同−配位体の異なる結合点に約して
   双方とも結合している、診断分析に使用プるためのキラ
   １−０