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Verfahren zur semiquantitativen Messung der
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Farbintensität oder Trübung flüssiger Lösungen Bei üblichen colorimetrischen
Messungen bestimmt man die Farbintensität, d. h. die Lichtabsorptionsfähigkeit aus
der Formel
wobei 10 der Lichtintensität vor dem Durchgang durch die Lösung und I die Lichtintensität
nach dem Durchgang durch die Lösung entspricht. Die Trübung wird auch als Absorptionsgrad
angegeben. Da der Absorptionsgrad A nach dem Beer'schen-Gesetz im allgemeinen der
Konzentration der lichtabsorbierenden Substanz proportional ist, lassen sich gefärbte
Substanzen oder Trübungen mit der gleichen Genauigkeit bestimmen, mit der sich die
Lichtintensitäten I und 10 messen lassen. In vielen Fällen ist jedoch eine exakte
Messung der Färbung oder Trübung und somit eine Messung der Lichtintensitäten nicht
erforderlich. Es genügt vielmehr
die Feststellung, daß die Lösung
eine Färbung oder Trübung hat, die einen bestimmten Grenz- oder Schwellenwert überschreitet,
oder daß die Färbung oder Trübung einer Lösung mindestens um einen bestimmten Betrag
größer oder kleiner geworden ist. Dies gilt für viele Messungen von immunologischen
Reaktionen, bei denen eine Trübung entsteht oder eine bestimmte anfänglich vorhandene
Trübung geringer wird oder eine bestimmte Färbung auftritt oder wieder verschwindet.
Für diese Messungen benötigt man im allgemeinen Verdünnungsserien, beispielsweise
entsprechend dem Faktor 2 abgestufte Serien. Dabei wird dann das Ergebnis als diejenige
Verdünnung angegeben, bei der eine bestimmte Trübung oder Färbung feststellbar ist,
wenn man die Lösungen vor einem gleichmäßig beleuchteten Hintergrund betrachtet.
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Für bestimmte Genauigkeiten oder Reproduzierbarkeiten erfordert ein
solches "Meßverfahren" einen äußerst erfahrenen Laboranten. Auch ist dieses "Meßverfahren",
wenn es sich um viele Proben handelt, für die Augen äußerst ermüdend. Es besteht
somit ein Bedarf dafür, dieses Meßverfahren so zu automatisieren, daß man mit einer
bestimmten Vorrichtung die Verstärkung oder Verminderung einer Färbung oder Trübung
messen kann.
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Da die Färbungs- oder Trübungsgrößen zwischen benachbarten Verdünnungen
gerade an den Stellen erheblich voneinander abweichen, an denen sich das Auftreten
oder Verschwinden einer Färbung oder Trübung feststellen läßt, ist es möglich, ein
fotometrisches Verfahren zu schaffen, das diese speziellen Anderungen erfaßt.
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Das beschriebene Verfahren basiert auf dem Prinzip, daß ein bestimmter
Absorptionsbereich von beispielsweise 0 bis 1,0 in zehn gleichgroße Stufen unterteilt
wird, mit in diesem speziellen Falle jeweils 0,100 Absorptionseinheiten. Dies kann
durch Konstruktion eines Fotometers geschehen, welches in Ubereinstimmung mit der
entsprechenden Bereichsstufe, in die die gemessene Absorption fällt, die gemessene
Absorption in Form einer einstelligen Zahl (0....9) wiedergibt. Man kann aber auch
ein normales Fotometer mit einem Minicomputer so programmieren, daß das Programm
die erfaßte Absorption in einer entsprechenden Stufe ortet und nur die Zahl dieser
speziellen Stufe als Ergebnis zur Anzeige bringt.
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Das Verfahren liefert den Absorptionswert eines jeden Proberöhrchens
der verwendeten Verdünnungsserien, welche beispielsweise aus acht Proberöhrchen
(mit beispielsweise
Verdünnungen 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64,
1:128, 1:256)bestehen, in der Form einer einstelligen Zahl, um dann aus diesen acht
Zahlen eine achtstellige Zahl zu bilden, die an der Digitalanzeige des Gerätes erscheint
oder auf Papier ausgedruckt wird, wenn das Gerät mit einem Drucker versehen ist.
Das Ergebnis kann dabei beispielsweise die folgende Form haben: Probe 1 9 9 8 6
3 2 2 2 Probe 2 9 9 9 9 7 3 2 2 usw.
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Bei der Probe 1 wird die Absorption bereits bei der dritten Verdünnung
(im obigen Beispiel 1:8) geringer.
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Bei der Probe 2 geschieht dies bei der fünften Verdünnung (1:32).
Wenn die untersuchte Reaktion bei Verminderung der Absorption als positiv zu betrachten
ist, sind die Verdünnungen 1:4 und 1:16 die letzten, bei denen noch keine Reaktion
aufgetreten ist. Wenn andererseits als positive Reaktion eine Vergrößerung der Absorption
zugrunde zu legen ist, geben die Verdünnungen Nr. 6 (1:64) und Nr. 7 (1:128) die
erforderlichen Werte.
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Eine grafische Darstellung der obigen Ablesungen zeigt die beigefügte
Zeichnung.
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Verglichen mit rein okulären Bestimmungen ergeben sich erfindungsgemäß
zahlreiche Vorteile bezüglich einer Genauigkeitserhöhung solcher Analyseverfahren:
1. Es läßt sich ein Fotometer verwenden mit einer Lichtwellenlänge, die für die
Erfassung einer bestimmten Farbe besonders geeignet ist; hierdurch wird das Verfahren
empfindlicher.
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2. Die Empfindlichkeit des Verfahrens läßt sich steuern, indem man
den für das verwendete Verfahren besonders geeigneten Absorptionsbereich und auch
die Abstufung auswählt.
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3. Die mit einem Fotometer durchgeführte Messung ist präziser als
die visuell durchgeführte. Hierdurch erhöht sich die Genauigkeit und auch die Reproduzierbarkeit
des Verfahrens.
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4. Da eine mit einem Fotometer durchgeführte Messung genauer ist,
kann man das Verdünnungsverhältnis in der Verdünnungsserie verkleinern und damit
die Empfindlichkeit des eigentlichen Verfahrens vergrößern.
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5. Bei mit Druckerausgang versehenen Geräten können die von einer
Probe hergestellten Verdünnungen seriell ausgedruckt werden. In diesem Falle ist
die Anzahl der Verdünnungen nicht durch die Anzahl der Fotometerkanäle beschränkt.
Die Größe der Verdünnungsserien kann somit willkürlich gewählt werden. Die Absorptionswerte
verschiedener Verdünnungen einer Probe werden nun in vertikalen Spalten ausgedruckt.
Die Grenz- oder Schwellenwerte werden wie vorstehend angegeben bestimmt.
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Ein dem vorstehend beschriebenen ähnliches Programm wurde zur Auswertung
der Messungen von Antistreptolysetitern (AST) für das FP-9-Fotometer der Firma Finnpipette
Ky aufgestellt. Der Zweck dieser AST-Messungen ist die Erfassung der Hämolyse(=Zerstörung)-Hemmung
zugesetzter Erythrocyten. Bei dgüblichen visuellen Auswertung der Ergebnisse verwendet
man die größte Verdünnung, in der noch keine Hämolyse auftritt. Im allgemeinen beobachtet
man während des Ausfällens der in der Proberöhrchen-Lösung vorhandenen Erythrocyten
die das Auftreten der Hämolyse anzeigende Farbe der Flüssigkeit. Wenn sich die Flüssigkeit
rötet, liegt eine Hämolyse vor; bleibt die Flüssigkeit farblos, hat noch keine Hämolyse
stattgefunden.
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Das für das FP-9-Fotometer entwickelte Verfahren und das zu diesem
Zweck erstellte Programm für einenHewlett-Packard-Computer vereinfacht im Vergleich
mit konventionellen Verfahren die Messung der durch die Erythrocyten verursachten
Trübung. Der Trübungswert wird mit Hilfe der vorerwähnten Skala als Ziffer 0 9 angezeigt.
Wenn keine Hämolyse stattgefunden hat, ist die Trübung der Lösung groß, so daß große
Werte angzeigt werden. Sobald jedoch ein Teil der Erythrocyten hämolysiert wird,
vermindert sich die Trübung, so daß es zu kleineren Werten kommt. Da die durch Erythrocyten
erzeugte Trübung wesentlich größere Absorptionswerte gibt als das von den Erythrocyten
bei der Hämolyse freigesetzte Hämoglobin, vermindert sich der angezeigte Wert sehr
schnell bei stärker einsetzender Hämolyse.
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Das Programm ist so ausgebildet, daß der Absorptionsbereich (in diesem
speziellen Beispiel 0 1,0), welcher in zehn Stufen unterteilt ist, sich innerhalb
bestimmter Grenzen frei wählen läßt. Somit kann man das Programm auf verschiedene
Verfahren einstellen, wenn bei diesen die zu messenden Absorptionswerte unterschiedlich
groß sind.
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Es sei noch erwähnt, daß die Messung der durch Erythrocyten verursachten
Trübung, die der Ausgangspunkt für das entwickelte erfindungsgemäße Verfahren war,
nur dann voll verläßlich ist, wenn man mit einem Fotometer arbeitet, dessen Licht
in vertikaler Richtung durch die Lösung hindurchgeht. In diesem Falle entsteht durch
die andauernde Ausfällung der Erythrocyten kein Fehler im Gegensatz zu einer Anordnung,
bei der das Licht die Lösung in horizontaler Richtung durchquert.
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Somit kann hier das Verfahren mit Erfolg nur mit dem FP-9-Fotometer
der Finnpipette Ky eingesetzt werden.
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Verständlicherweise läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch
mit konventionellen Geräten durchführen, die mit horizontalem Lichtpfad messen,
wenn kleine Fehler zulässig sind oder die Bedingungen derart konstant gehalten werden,
daß kein Fehlereffekt zu erwarten ist.
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Bei einem Vergleich des vorstehend beschriebenen Verfahrens mit einem
konventionellen Verfahren, bei dem die Hämolyse visuell erfaßt wird, konnte festgestellt
werden, daß beide Verfahren in mehr als 96 5o' der Fälle (n = 60) identische Ergebnisse
liefern.
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In diesem Zusammenhange sei erwähnt, daß die vorstehend beschriebenen
Verfahren und Meßprinzipien für alle Bestimmungen
geeignet sind,
bei denen man Verdünnungsserien verwendet und bei denen das Auftreten oder Verschwinden
einer Färbung oder Trfil-)ung erfaßt wird.
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Die mei.«,-ten serologischen und imlilunologischen Bestimmungen fallen
in diese Kategorie. Ferner gibt es auch verschiedenste Bestimmungen, bei denen eine
aualitative Erfassung einer Färbung oder Trübung ausreichend ist, ohne daß man auch
nur semiquantitative Messungen mit Verdiinnungsserien benötigt. Das beschriebene
Verfahren ist auch für solche qualitativen Messungen geeignet und ist dabei genauer,
da man einen bestimmten Grenz- oder Schwellenwert für ein positives Ergebnis,der
von Messung zu Messung konstant bleibt, vorgeben kann.
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Solche Meßverfahren sind u. a. auch enzym-immunologische Verfahren
(EIA). Einige von diesen Meßverfahren sind qualitativ, so daß es nur um ein positives
oder negatives Ergebnis geht. Andere Meßverfahren sind wiederum quantitativ und
es muß bei ihnen die Intensität der auftretenden Färbung gemessen werden. Auch in
diesen Fällen werden die Messungen an Verdünnungsserien vorgenommen. Obwohl das
vorstehend beschriebene Verfahren den Absorptionswert nur mit der Genauigkeit einer
Ziffer angibt, entsteht durch die Auswertung
der von allen Verdiinnungen
der Serie erhaltenen Information eine Genauigkeit, die zehnmal größer ist.
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Mit Hilfe eines geeigneten Programmes ist es bei Auswertung aller
vierte einer Serie möglich, mit wesentlich größerer Genauigkeit den Punkt zu bestimmen,
an dem die Reaktion das halbe Maximum erreicht. In der Zeichnung läßt sich für Probe
1 diese genannte Konzentration als zwischen den Verdünnungen 4 und 5 (etwa 1:20)
und für die Probe 2 als zwischen den Verdünnungen 5 und 6 (etwa 1:40) liegend erfassen.
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Schließlich sei noch erwähnt, daß es bei vielen konventionellen colorimetrischen
Messungen sinnlos ist, eine zu hohe fotometrische Genauigkeit zu fordern. In solchen
Fällen kann eine auf dem vorstehend beschriebenen Prinzip basierende Vorrichtung
Verwendung finden, die relativ einfach aufgebaut, billig und trotzdem ausreichend
genau ist. Hier sei als Beispiel die Blut-Zucker-Bestimmung erwähnt, bei der in
den meisten Fällen eine Genauigkeit von 1 mM ausreichend ist.
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Das beschriebene Verfahren ermöglicht auch automatische oder halbautomatische
Messungen, wenn geeignete Geräte vorhanden sind. Ein solches Gerät ist das FP-9-Fotometer
der Firma Finnpipette Ky. Das beschriebene Verfahren kann auch
mit
manuell oder mehr oder weniger automatisch stufenweise oder kontinuierlich arbeitenden
Ein- oder Nehr-Kanal-Meßgeräten durchgefiihrt werden. Bei dem beschriebenen Verfahren
kann man je nach den speziellen Anforderungen den Absorptionsbereich in beliebig
vsie gleichgroße Stufen unterteilen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber besonders
vorteilhaft, wenn man den Absorptionsbereich in zwei bis zehn gleiche Stufen unterteilt.
Ist der Absorptionsbereich in zwei Stufen unterteilt, repräsentiert die eine Stufe
ein positives und die andere Stufe ein negatives Ergebnis. Werden mehr als zwei
Stufen verwendet, enthält das Ergebnis eine quantitative Information.