DE2839131A1 - Fluid soln. colour intensity or opacity measurement - by passing light beam through samples and determining extinction region - Google Patents

Abstract

A method of measuring the colour intensity a opacity of fluid solns. enables semi-quantitative photometric measurement and is applicable to calorimetric fluid measurement. By eliminating subjective factors the accuracy is improved and hence the degree of automisation of measurement. A measurement light beam passes perpendicularly through the sample. An extinction region beginning at O is divided into a number of equal intervals corresp. to the number of test tubes, pref. between 2 and 10. Each sample is analysed to determine its extinction value range.

Description

Verfahren zur semiquantitativen Messung der Method for the semiquantitative measurement of the

Farbintensität oder Trübung flüssiger Lösungen Bei üblichen colorimetrischen Messungen bestimmt man die Farbintensität, d. h. die Lichtabsorptionsfähigkeit aus der Formel wobei 10 der Lichtintensität vor dem Durchgang durch die Lösung und I die Lichtintensität nach dem Durchgang durch die Lösung entspricht. Die Trübung wird auch als Absorptionsgrad angegeben. Da der Absorptionsgrad A nach dem Beer'schen-Gesetz im allgemeinen der Konzentration der lichtabsorbierenden Substanz proportional ist, lassen sich gefärbte Substanzen oder Trübungen mit der gleichen Genauigkeit bestimmen, mit der sich die Lichtintensitäten I und 10 messen lassen. In vielen Fällen ist jedoch eine exakte Messung der Färbung oder Trübung und somit eine Messung der Lichtintensitäten nicht erforderlich. Es genügt vielmehr die Feststellung, daß die Lösung eine Färbung oder Trübung hat, die einen bestimmten Grenz- oder Schwellenwert überschreitet, oder daß die Färbung oder Trübung einer Lösung mindestens um einen bestimmten Betrag größer oder kleiner geworden ist. Dies gilt für viele Messungen von immunologischen Reaktionen, bei denen eine Trübung entsteht oder eine bestimmte anfänglich vorhandene Trübung geringer wird oder eine bestimmte Färbung auftritt oder wieder verschwindet. Für diese Messungen benötigt man im allgemeinen Verdünnungsserien, beispielsweise entsprechend dem Faktor 2 abgestufte Serien. Dabei wird dann das Ergebnis als diejenige Verdünnung angegeben, bei der eine bestimmte Trübung oder Färbung feststellbar ist, wenn man die Lösungen vor einem gleichmäßig beleuchteten Hintergrund betrachtet.Color intensity or turbidity of liquid solutions In conventional colorimetric measurements, the color intensity, ie the light absorption capacity, is determined from the formula where 10 corresponds to the light intensity before passage through the solution and I corresponds to the light intensity after passage through the solution. The turbidity is also given as the degree of absorption. Since the degree of absorption A according to Beer's law is generally proportional to the concentration of the light-absorbing substance, colored substances or turbidity can be determined with the same accuracy with which the light intensities I and 10 can be measured. In many cases, however, an exact measurement of the coloration or turbidity and thus a measurement of the light intensities is not necessary. Rather, it is sufficient to state that the solution has a coloration or turbidity which exceeds a certain limit or threshold value, or that the coloration or turbidity of a solution has increased or decreased by at least a certain amount. This applies to many measurements of immunological reactions in which a turbidity develops or a certain initially existing turbidity decreases or a certain color appears or disappears again. For these measurements, one generally needs dilution series, for example series graded according to a factor of 2. The result is then given as the dilution at which a certain turbidity or color can be determined when the solutions are viewed against a uniformly illuminated background.

Für bestimmte Genauigkeiten oder Reproduzierbarkeiten erfordert ein solches "Meßverfahren" einen äußerst erfahrenen Laboranten. Auch ist dieses "Meßverfahren", wenn es sich um viele Proben handelt, für die Augen äußerst ermüdend. Es besteht somit ein Bedarf dafür, dieses Meßverfahren so zu automatisieren, daß man mit einer bestimmten Vorrichtung die Verstärkung oder Verminderung einer Färbung oder Trübung messen kann.For certain accuracies or reproducibilities, a such a "measuring process" requires an extremely experienced laboratory technician. This "measuring method" is also if there are many samples, extremely tiring for the eyes. It exists thus a need to automate this measurement process so that one can use a certain device increases or decreases coloration or haze can measure.

Da die Färbungs- oder Trübungsgrößen zwischen benachbarten Verdünnungen gerade an den Stellen erheblich voneinander abweichen, an denen sich das Auftreten oder Verschwinden einer Färbung oder Trübung feststellen läßt, ist es möglich, ein fotometrisches Verfahren zu schaffen, das diese speziellen Anderungen erfaßt.As the color or turbidity sizes between adjacent dilutions deviate significantly from each other precisely at the points where the occurrence occurs or disappearance of a discoloration or cloudiness, it is possible to detect a to create a photometric process that will detect these particular changes.

Das beschriebene Verfahren basiert auf dem Prinzip, daß ein bestimmter Absorptionsbereich von beispielsweise 0 bis 1,0 in zehn gleichgroße Stufen unterteilt wird, mit in diesem speziellen Falle jeweils 0,100 Absorptionseinheiten. Dies kann durch Konstruktion eines Fotometers geschehen, welches in Ubereinstimmung mit der entsprechenden Bereichsstufe, in die die gemessene Absorption fällt, die gemessene Absorption in Form einer einstelligen Zahl (0....9) wiedergibt. Man kann aber auch ein normales Fotometer mit einem Minicomputer so programmieren, daß das Programm die erfaßte Absorption in einer entsprechenden Stufe ortet und nur die Zahl dieser speziellen Stufe als Ergebnis zur Anzeige bringt.The method described is based on the principle that a certain Absorption range from, for example, 0 to 1.0 divided into ten equal levels becomes, with in this special case 0.100 absorption units each. This can done by construction of a photometer, which in accordance with the corresponding range level in which the measured absorption falls, the measured Represents absorption in the form of a one-digit number (0 .... 9). But you can too program a normal photometer with a minicomputer so that the program locates the detected absorption in a corresponding level and only the number of these special stage as a result.

Das Verfahren liefert den Absorptionswert eines jeden Proberöhrchens der verwendeten Verdünnungsserien, welche beispielsweise aus acht Proberöhrchen (mit beispielsweise Verdünnungen 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256)bestehen, in der Form einer einstelligen Zahl, um dann aus diesen acht Zahlen eine achtstellige Zahl zu bilden, die an der Digitalanzeige des Gerätes erscheint oder auf Papier ausgedruckt wird, wenn das Gerät mit einem Drucker versehen ist. Das Ergebnis kann dabei beispielsweise die folgende Form haben: Probe 1 9 9 8 6 3 2 2 2 Probe 2 9 9 9 9 7 3 2 2 usw.The procedure gives the absorbance value of each sample tube the dilution series used, which for example consist of eight sample tubes (with for example Dilutions 1: 2, 1: 4, 1: 8, 1:16, 1:32, 1:64, 1: 128, 1: 256) consist, in the form of a one-digit number, followed by these eight Numbers to form an eight-digit number that appears on the digital display of the device or printed out on paper if the device is equipped with a printer. The result can have the following form, for example: Sample 1 9 9 8 6 3 2 2 2 sample 2 9 9 9 9 7 3 2 2 etc.

Bei der Probe 1 wird die Absorption bereits bei der dritten Verdünnung (im obigen Beispiel 1:8) geringer.In the case of sample 1, the absorption is already at the third dilution (in the above example 1: 8) less.

Bei der Probe 2 geschieht dies bei der fünften Verdünnung (1:32). Wenn die untersuchte Reaktion bei Verminderung der Absorption als positiv zu betrachten ist, sind die Verdünnungen 1:4 und 1:16 die letzten, bei denen noch keine Reaktion aufgetreten ist. Wenn andererseits als positive Reaktion eine Vergrößerung der Absorption zugrunde zu legen ist, geben die Verdünnungen Nr. 6 (1:64) und Nr. 7 (1:128) die erforderlichen Werte.For sample 2, this happens at the fifth dilution (1:32). If the reaction under investigation is to be regarded as positive when the absorption is reduced the dilutions 1: 4 and 1:16 are the last ones at which there is still no reaction occured. On the other hand, if the positive response is an increase in absorption is to be taken as a basis, the dilutions No. 6 (1:64) and No. 7 (1: 128) give the required values.

Eine grafische Darstellung der obigen Ablesungen zeigt die beigefügte Zeichnung.A graphical representation of the above readings is shown in the attached Drawing.

Verglichen mit rein okulären Bestimmungen ergeben sich erfindungsgemäß zahlreiche Vorteile bezüglich einer Genauigkeitserhöhung solcher Analyseverfahren: 1. Es läßt sich ein Fotometer verwenden mit einer Lichtwellenlänge, die für die Erfassung einer bestimmten Farbe besonders geeignet ist; hierdurch wird das Verfahren empfindlicher.Compared with purely ocular determinations, this results according to the invention numerous advantages in terms of increasing the accuracy of such analysis methods: 1. A photometer can be used with a light wavelength suitable for the Detection of a particular color is particularly suitable; this will make the procedure more sensitive.

2. Die Empfindlichkeit des Verfahrens läßt sich steuern, indem man den für das verwendete Verfahren besonders geeigneten Absorptionsbereich und auch die Abstufung auswählt.2. The sensitivity of the process can be controlled by the absorption range particularly suitable for the process used and also selects the gradation.

3. Die mit einem Fotometer durchgeführte Messung ist präziser als die visuell durchgeführte. Hierdurch erhöht sich die Genauigkeit und auch die Reproduzierbarkeit des Verfahrens.3. The measurement made with a photometer is more precise than the visually performed. This increases the accuracy and also the reproducibility of the procedure.

4. Da eine mit einem Fotometer durchgeführte Messung genauer ist, kann man das Verdünnungsverhältnis in der Verdünnungsserie verkleinern und damit die Empfindlichkeit des eigentlichen Verfahrens vergrößern.4. Since a measurement made with a photometer is more accurate, one can reduce the dilution ratio in the dilution series and thus increase the sensitivity of the actual procedure.

5. Bei mit Druckerausgang versehenen Geräten können die von einer Probe hergestellten Verdünnungen seriell ausgedruckt werden. In diesem Falle ist die Anzahl der Verdünnungen nicht durch die Anzahl der Fotometerkanäle beschränkt. Die Größe der Verdünnungsserien kann somit willkürlich gewählt werden. Die Absorptionswerte verschiedener Verdünnungen einer Probe werden nun in vertikalen Spalten ausgedruckt. Die Grenz- oder Schwellenwerte werden wie vorstehend angegeben bestimmt.5. In the case of devices with a printer output, those of a Sample prepared dilutions can be printed out serially. In this case it is the number of dilutions is not limited by the number of photometer channels. The size of the dilution series can thus be chosen arbitrarily. The absorption values different dilutions of a sample are now printed out in vertical columns. The limit or threshold values are determined as indicated above.

Ein dem vorstehend beschriebenen ähnliches Programm wurde zur Auswertung der Messungen von Antistreptolysetitern (AST) für das FP-9-Fotometer der Firma Finnpipette Ky aufgestellt. Der Zweck dieser AST-Messungen ist die Erfassung der Hämolyse(=Zerstörung)-Hemmung zugesetzter Erythrocyten. Bei dgüblichen visuellen Auswertung der Ergebnisse verwendet man die größte Verdünnung, in der noch keine Hämolyse auftritt. Im allgemeinen beobachtet man während des Ausfällens der in der Proberöhrchen-Lösung vorhandenen Erythrocyten die das Auftreten der Hämolyse anzeigende Farbe der Flüssigkeit. Wenn sich die Flüssigkeit rötet, liegt eine Hämolyse vor; bleibt die Flüssigkeit farblos, hat noch keine Hämolyse stattgefunden.A program similar to that described above was used for evaluation of the measurements of anti-streptolysis titers (AST) for the FP-9 photometer from Finnpipette Ky erected. The purpose of these AST measurements is to detect hemolysis (= destruction) inhibition added erythrocytes. Used for the usual visual evaluation of the results the greatest dilution in which hemolysis does not yet occur. Generally observed during the precipitation of the erythrocytes present in the sample tube solution the color of the fluid, indicating the occurrence of hemolysis. When the liquid reddened, there is hemolysis; If the liquid remains colorless, there is still no hemolysis took place.

Das für das FP-9-Fotometer entwickelte Verfahren und das zu diesem Zweck erstellte Programm für einenHewlett-Packard-Computer vereinfacht im Vergleich mit konventionellen Verfahren die Messung der durch die Erythrocyten verursachten Trübung. Der Trübungswert wird mit Hilfe der vorerwähnten Skala als Ziffer 0 9 angezeigt. Wenn keine Hämolyse stattgefunden hat, ist die Trübung der Lösung groß, so daß große Werte angzeigt werden. Sobald jedoch ein Teil der Erythrocyten hämolysiert wird, vermindert sich die Trübung, so daß es zu kleineren Werten kommt. Da die durch Erythrocyten erzeugte Trübung wesentlich größere Absorptionswerte gibt als das von den Erythrocyten bei der Hämolyse freigesetzte Hämoglobin, vermindert sich der angezeigte Wert sehr schnell bei stärker einsetzender Hämolyse.The procedure developed for and associated with the FP-9 photometer Purpose-built program for a Hewlett-Packard computer is simplified in comparison with conventional methods the measurement of those caused by the erythrocytes Cloudiness. The turbidity value is displayed as the number 0 9 with the aid of the aforementioned scale. If hemolysis has not taken place, the turbidity of the solution is great, so that great Values are displayed. However, as soon as part of the erythrocytes is hemolyzed, the turbidity decreases, so that the values are smaller. Because the by erythrocytes generated turbidity gives significantly greater absorption values than that of the erythrocytes hemoglobin released during hemolysis, the displayed value is greatly reduced fast with the onset of more severe hemolysis.

Das Programm ist so ausgebildet, daß der Absorptionsbereich (in diesem speziellen Beispiel 0 1,0), welcher in zehn Stufen unterteilt ist, sich innerhalb bestimmter Grenzen frei wählen läßt. Somit kann man das Programm auf verschiedene Verfahren einstellen, wenn bei diesen die zu messenden Absorptionswerte unterschiedlich groß sind.The program is designed so that the absorption range (in this special example 0 1.0), which is divided into ten levels, within certain limits can be freely chosen. So you can use the program on different Stop the procedure if the absorption values to be measured differ in these are great.

Es sei noch erwähnt, daß die Messung der durch Erythrocyten verursachten Trübung, die der Ausgangspunkt für das entwickelte erfindungsgemäße Verfahren war, nur dann voll verläßlich ist, wenn man mit einem Fotometer arbeitet, dessen Licht in vertikaler Richtung durch die Lösung hindurchgeht. In diesem Falle entsteht durch die andauernde Ausfällung der Erythrocyten kein Fehler im Gegensatz zu einer Anordnung, bei der das Licht die Lösung in horizontaler Richtung durchquert.It should also be mentioned that the measurement of the caused by erythrocytes Turbidity, which was the starting point for the developed method according to the invention, is only fully reliable if one works with a photometer whose light passes through the solution in the vertical direction. In this case arises through the persistent precipitation of the erythrocytes is not an error in contrast to an arrangement, in which the light crosses the solution in a horizontal direction.

Somit kann hier das Verfahren mit Erfolg nur mit dem FP-9-Fotometer der Finnpipette Ky eingesetzt werden.Thus, the procedure can only be successful with the FP-9 photometer the Finnpipette Ky.

Verständlicherweise läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit konventionellen Geräten durchführen, die mit horizontalem Lichtpfad messen, wenn kleine Fehler zulässig sind oder die Bedingungen derart konstant gehalten werden, daß kein Fehlereffekt zu erwarten ist.Understandably, the method according to the invention can also be used perform with conventional devices that measure with a horizontal light path, if small errors are permissible or the conditions are kept so constant, that no error effect is to be expected.

Bei einem Vergleich des vorstehend beschriebenen Verfahrens mit einem konventionellen Verfahren, bei dem die Hämolyse visuell erfaßt wird, konnte festgestellt werden, daß beide Verfahren in mehr als 96 5o' der Fälle (n = 60) identische Ergebnisse liefern.When comparing the method described above with a conventional methods, in which the hemolysis is recorded visually, could be determined It will be found that both methods produce identical results in more than 96 50 'of cases (n = 60) deliver.

In diesem Zusammenhange sei erwähnt, daß die vorstehend beschriebenen Verfahren und Meßprinzipien für alle Bestimmungen geeignet sind, bei denen man Verdünnungsserien verwendet und bei denen das Auftreten oder Verschwinden einer Färbung oder Trfil-)ung erfaßt wird.In this context it should be mentioned that the above-described Procedures and measuring principles for all determinations are suitable, in which one uses dilution series and in which the appearance or disappearance a coloration or Trfil-) ung is detected.

Die mei.«,-ten serologischen und imlilunologischen Bestimmungen fallen in diese Kategorie. Ferner gibt es auch verschiedenste Bestimmungen, bei denen eine aualitative Erfassung einer Färbung oder Trübung ausreichend ist, ohne daß man auch nur semiquantitative Messungen mit Verdiinnungsserien benötigt. Das beschriebene Verfahren ist auch für solche qualitativen Messungen geeignet und ist dabei genauer, da man einen bestimmten Grenz- oder Schwellenwert für ein positives Ergebnis,der von Messung zu Messung konstant bleibt, vorgeben kann.Most serological and immunological determinations fall in this category. There are also various provisions in which one aualitative detection of a coloration or cloudiness is sufficient without one also only semiquantitative measurements with dilution series are required. The described The method is also suitable for such qualitative measurements and is more precise, because you have a certain limit or threshold for a positive result, the remains constant from measurement to measurement.

Solche Meßverfahren sind u. a. auch enzym-immunologische Verfahren (EIA). Einige von diesen Meßverfahren sind qualitativ, so daß es nur um ein positives oder negatives Ergebnis geht. Andere Meßverfahren sind wiederum quantitativ und es muß bei ihnen die Intensität der auftretenden Färbung gemessen werden. Auch in diesen Fällen werden die Messungen an Verdünnungsserien vorgenommen. Obwohl das vorstehend beschriebene Verfahren den Absorptionswert nur mit der Genauigkeit einer Ziffer angibt, entsteht durch die Auswertung der von allen Verdiinnungen der Serie erhaltenen Information eine Genauigkeit, die zehnmal größer ist.Such measuring methods are inter alia. also enzyme-immunological methods (EIA). Some of these measurement methods are qualitative, so it is only a positive one or negative result goes. Other measurement methods are again quantitative and the intensity of the color that occurs must be measured in them. Also in In these cases the measurements are carried out on dilution series. Though that method described above the absorption value only with the accuracy of a Number indicates, arises from the evaluation that of all thinnings of the series obtained an accuracy ten times greater.

Mit Hilfe eines geeigneten Programmes ist es bei Auswertung aller vierte einer Serie möglich, mit wesentlich größerer Genauigkeit den Punkt zu bestimmen, an dem die Reaktion das halbe Maximum erreicht. In der Zeichnung läßt sich für Probe 1 diese genannte Konzentration als zwischen den Verdünnungen 4 und 5 (etwa 1:20) und für die Probe 2 als zwischen den Verdünnungen 5 und 6 (etwa 1:40) liegend erfassen.With the help of a suitable program it is with the evaluation of all fourth in a series possible to determine the point with much greater accuracy, at which the reaction reaches half the maximum. In the drawing can be used for sample 1 this stated concentration as between dilutions 4 and 5 (about 1:20) and for sample 2 to be between dilutions 5 and 6 (about 1:40).

Schließlich sei noch erwähnt, daß es bei vielen konventionellen colorimetrischen Messungen sinnlos ist, eine zu hohe fotometrische Genauigkeit zu fordern. In solchen Fällen kann eine auf dem vorstehend beschriebenen Prinzip basierende Vorrichtung Verwendung finden, die relativ einfach aufgebaut, billig und trotzdem ausreichend genau ist. Hier sei als Beispiel die Blut-Zucker-Bestimmung erwähnt, bei der in den meisten Fällen eine Genauigkeit von 1 mM ausreichend ist.Finally, it should be mentioned that many conventional colorimetric Measurements is pointless to require a photometric accuracy that is too high. In such A device based on the principle described above can be used Find uses that are relatively simple, cheap and still sufficient is accurate. The blood sugar determination for which in an accuracy of 1 mM is sufficient in most cases.

Das beschriebene Verfahren ermöglicht auch automatische oder halbautomatische Messungen, wenn geeignete Geräte vorhanden sind. Ein solches Gerät ist das FP-9-Fotometer der Firma Finnpipette Ky. Das beschriebene Verfahren kann auch mit manuell oder mehr oder weniger automatisch stufenweise oder kontinuierlich arbeitenden Ein- oder Nehr-Kanal-Meßgeräten durchgefiihrt werden. Bei dem beschriebenen Verfahren kann man je nach den speziellen Anforderungen den Absorptionsbereich in beliebig vsie gleichgroße Stufen unterteilen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist aber besonders vorteilhaft, wenn man den Absorptionsbereich in zwei bis zehn gleiche Stufen unterteilt. Ist der Absorptionsbereich in zwei Stufen unterteilt, repräsentiert die eine Stufe ein positives und die andere Stufe ein negatives Ergebnis. Werden mehr als zwei Stufen verwendet, enthält das Ergebnis eine quantitative Information.The method described also enables automatic or semi-automatic ones Measurements if suitable equipment is available. One such device is the FP-9 photometer from Finnpipette Ky. The method described can also with manually or more or less automatically in stages or continuously Single or multi-channel measuring devices can be carried out. With the method described depending on the special requirements, the absorption range can be changed as desired v divide them into equal stages. However, the method according to the invention is special advantageous if the absorption range is divided into two to ten equal levels. If the absorption range is divided into two levels, one level represents one level one positive and the other a negative result. Will be more than two If steps are used, the result contains quantitative information.

Claims (1)

Patentanspruch Verfahren zur fotometrischen semiquantitativen Messung der stetigen oder sich ändernden Farbintensität oder Trübung von Lösungen mittels eines vorzugsweise vertikal durch die zu bestimmende Probe hindurchfallenden Meßlichtstrahles unter Verwendung von Verdünnungsserien, dadurch gekennzeichnet, daß ein ausgewählter, bei Null beginnender, beispielsweise 0 - 1,0 entsprechend der vorzugsweise zwei bis zehn betragenden Anzahl der Proberöhrchen der Verdünnungsserie in gleichgroße Stufen unterteilt wird, daß nacheinander die speziellen jeder der Proben der Verdünnungsserie zugeordneten Absorptionsstufen fotometrisch bestimmt werden und daß die Ergebnisse an den einzelnen Proben der Verdünnungsserie mit der Stufe bezeichnet werden, die dem Absorptionswert zugeordnet ist, wobei beispielsweise ein einstelliger Code (0....9) für die Stufen verwendet wird. Claim method for photometric semiquantitative measurement the steady or changing color intensity or turbidity of solutions by means of a measuring light beam preferably falling vertically through the sample to be determined using dilution series, characterized in that a selected, starting at zero, for example 0-1.0 corresponding to the preferably two up to ten corresponding number of sample tubes of the dilution series in the same size Steps are subdivided that one after the other the specific each of the samples of the dilution series assigned absorption levels are determined photometrically and that the results on the individual samples of the dilution series are marked with the level which is assigned to the absorption value, for example a one-digit code (0 .... 9) is used for the stages.