DE2431323A1

DE2431323A1 - Verfahren zur analyse und zur bestimmung der konzentration von komponenten eines substanzgemisches und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2431323A1
Application number: DE2431323A
Authority: DE
Inventors: Wilson Ralston
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1973-07-02
Filing date: 1974-06-29
Publication date: 1975-01-30
Also published as: GB1452197A; US3881992A

Description

Wilson Ralston, 99 Prospect Street, Stamford, Conn. (USA)

Verfahren zur Analyse und zur Bestimmung der Konzentration von Komponenten eines Substanzgemisches und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse und zur Bestimmung der Konzentration von Komponenten eines Substanzgemisches aus der Reaktionsgeschwindigkeit einer ausgelösten chemischen Reaktion und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren und die Vorrichtung sind insbesondere zur Durchführung analytischer und klinischer Messungen geeignet.

Bei einer bekannten analytischen und klinischen Messtechnik, die als optische Messmethode bezeichnet wird, wird die An-

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oder Abwesenheit einer Substanz bzw. Komponente in einem Substanzgemisch dadurch bestimmt, dass man eine Reaktion in dem Substanzgemisch bewirkt und die Geschwindigkeit der Änderung einer optischen Eigenschaft des Substanzgemisches in dem Zeitraum misst, in dem die Reaktion abläuft. Die Reaktion kann beispielsweise dadurch ausgelöst werden, dass man ein Reagens dem Substanζgemisch beimischt oder indem man das Substanzgemisch erhitzt.' Die Änderung der optischen Eigenschaft des Substanzgemisches wird mittels eines Lichtstrahls bestimmt, der während der Reaktion auf das Substanzgemisch gerichtet wird. Gemessen werden beispielsweise Änderungen der Durchlässigkeit, der Absorption oder der Streuung des Lichtes, die durch das Substanzgemisch bewirkt werden. Die Grosse der Änderung der optischen Eigenschaft ist im allgemeinen kennzeichnend für die Konzentration einer Substanz bzw. einer Komponente des Substanzgemisches. Die Geschwindigkeit, mit der die Grosse der optischen Eigenschaft sich während des Reaktionsablaufes ändert, ist ebenfalls wichtig, da man mit ihr eine zusätzliche, bezeichnende, analytische oder diagnostische Information erhält. Aus verschiedenen Gründen sind die bisher üblichen Bestimmungen der Geschwindigkeit, mit der sich die optische Eigenschaft ändert, relativ ungenau oder führen nicht zu Resultaten, die über die gesamte Reaktionszeit eine Auslage gestatten.

Die Grenzen der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit können besser durch die beispielhafte Beschreibung eines klinischen

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Instrumentes aufgezeichnet werden, mit dem Enzyme zu untersuchen sind. Es ist bekannt, dass Enzyme Proteine sind, die spezifische katalytische Funktionen ausüben und die in jeder Zelle des menschlichen Körpers vorhanden sind. Normalerweise werden die Aktivitäten der vielen Enzyme im Körper dadurch auf einem relativ konstanten Niveau gehalten, dass Gleichgewicht zwischen Enzymsynthese und Enzymverfall herrscht. Im Blutserum sind die Aktivitäten dieser Enzyme relativ gering und ändern sich nur innerhalb relativ eng benachbarter Grenzen. Ein Anwachsen der Enzymaktivität über den normalen Wert zeigt eine Zellschädigung an und kann als -wichtiges Mittel für die Diagnose von Krankheiten verschiedener Körperorgane benützt werden.

Die Enzymkonzentration im Blutserum ist normalerweise relativ gering und ist im allgemeinen Messungen durch herkömmliche Proteinbestimmungsmethoden nicht zugänglich. Stattdessen kann die katalytische Funktion durch eine Messung der Geschwindigkeit bestimmt werden, mit der die katalytische Reaktion abläuft. Eine typische durch Enzyme katalysierte Reaktion ist die Oxidation oder Reduktion des Coenzyms NAD.

L-Lactrat + NAD NADH + Pyruvat

NAD ist die oxidierte Form und absorbiert Licht sehr stark bei einer Wellenlänge von 340 nm. Das Enzym LDH katalysiert die Reduktion des NAD, die zum NADH, der reduzierten Form führt, die bei 340 nm farblos ist. Die Grosse einer optischen

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Eigenschaft, beispielsweise der Absorption von Licht bei einer Wellenlänge von 340 nm ist daher kennzeichnend für die Konzentration von NAD und die Geschwindigkeit der Absorptionsänderung zeigt die Geschwindigkeit der Umwandlung von NAD in NADH an. Diese Umwandlung ist innerhalb bestimmter Grenzen proportional zur Menge des Katalysators, nämlich des Enzyms (LDH), die sich im Substanzgemisch befindet. Neben der Tatsache, dass sie proportional zur vorhandenen Enzymmenge ist, ist die Reaktionsgeschwindigkeit auch abhängig von der Menge des Substrats, das nicht umgewandelt wird. Das bedeutet, dass mit fortschreitender Reaktion die Menge der umzuwandelnden Substanz kontinuierlich abnimmt und daher auch die Reaktionsgeschwindigkeit kleiner wird. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist ausserdem noch abhängig vom pH-Wert der Lösung und von ihrer Temperatur. Die Temperaturempfindlichkeit der Reaktionsgeschwindigkeit beträgt ungefähr 10 % pro ⁰C und eine Vorrichtung, mit der die Reaktionsgeschwindigkeit genau zu messen ist, sollte mit einer Temperaturhalterung versehen sein, mit der eine reproduzierbare, konstante Umgebungstemperatur zu erzeugen und zu halten ist.

Zwei Verfahren zum Messen des Niveaus der Enzymaktivität sind bekannt. Das gewöhnlich verwendete Verfahren wird mit "Endpunkt "-Verfahren bezeichnet. Bei diesem Verfahren wird die Absorption des Substanzgeiaisches bzw. seine Extinktion gemessen, bevor die chemische Reaktion eingeleitet und nachdem die Reaktion im v/esentlichen beendet ist. Die Differenz der Ex-

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tinktionen, die vor und nach der Reaktion gemessen wurden, ist proportional zur Menge des vorhandenen Enzyms. Dieses Verfahren besitzt den Vorteil, dass die Messung äusserst einfach ist. Man benötigt jedoch eine relativ lange Zeitspanne, bis die Reaktion praktisch beendet ist und ausserdem tritt eine relativ hohe Fehlrate in der Messung auf, die aus chemischen Störungen resultiert.

Das zweite Verfahren wird mit "kinetisches" Verfahren bezeichnet. Es besitzt den Vorteil, dass es in chemischer Sicht spezifischer und relativ frei von chemischen Störungen ist. Mit ihm können die Messungen auch schneller durchgeführt werden, da es nicht erforderlich ist, dass bei diesem Messverfahren das Ende der Reaktion abgewartet wird. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch darin zu sehen, dass die Messung sehr kleiner Änderungen der Extinktion erforderlich ist,, was einen hohen Grad elektrischer und mechanischer Stabilität während der Messung erfordert.

Vorrichtungen, mit denen momentan das kinetische Messverfahren durchgeführt wird, besitzen im allgemeinen ein Photometer zur Messung der Extinktion, mit dem man ein Äusgangssignal erhält, das an ein Anzeigegerät, beispielsweise einen Schreiber, gelegt wird. Die Reaktion wird ausgelöst und die zeitliche Abhängigkeit der Extinktion der Probe wird über eine Zeitspanne von einigen Minuten aufgezeichnet. Nachdem diese Aufzeichnung beendet ist, wird mit einera Lineal eine Tangente an die aufge-

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zeichnete Kurve in dem Kurventeil gelegt, der dem Beginn der Reaktion entspricht. Aus der so bestimmten, anfänglichen Neigung der gemessenen Kurve wird die anfängliche Reaktionsgeschwindigkeit berechnet und mit einem konstanten Faktor multipliziert, um ein Resultat in Einheiten der Enzyrareaktion zu erhalten.

Bei einem anderen Vorrichtungstyp mit dem man das kinetische Messverfahren durchführen kann, werden zwei Extinktionsmessungen zu verschiedenen Zeiten während einer Reaktion ausgeführt und die Extinktionsneigung berechnet. Die Reaktionsgeschwindigkeit erhält man dann aus der Berechnung des Verhältnisses der Extinktionsänderung zu dem Zeitintervall. Das erhaltene Resultat wird dann mit einem digitalen Ausgangsmessgerät oder einem Druckwerk angezeigt. Beide Verfahren zur Durchführung der kinetischen Prüfung sind nachteilig, da bei ihnen die Extinktionsänderung über ein relativ langes Zeitintervall bestimmt wird und daher Fehlern ausgesetzt ist, die aus Krümmungen in der über der Zeit aufgetragenen Extinktionskurve herrühren. Dies tritt besonders dann ein, wenn man Proben analysiert, die eine hohe Aktivität besitzen. Die zweite der oben angeführten Vorrichtungen lässt sich ausserdem dann nur mit Schwierigkeiten anwenden, wenn eine chemische Verzögerungsphase vorhanden ist und man am Ende dieser Verzögerungsphase ist. Man erhält daher häufig fehlerhafte Messwertausgaben.

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Um daher eine Mengenbestimmung der Enzyme, die eine Reaktion katalysieren mit relativ hoher Genauigkeit zu erhalten, ist es erforderlich, die Geschwindigkeit, mit der sich die Absoiption ändert, unmittelbar nach dem Ende einer Verzögerungsphase zu messen und die Messung in einer Zeitspanne auszuführen, die relativ kurz im Vergleich zum Zeitintervall ist, das für die Vollendung der Reaktion erforderlich ist. Es ist richtig, dass der Messwert der Geschwindigkeit der Absorptionsänderung so nahe, wie es praktisch möglich ist, an der ursprünglichen Änderungsgeschwindigkeit liegt, die man gerade nach Beendigung der Verzögerungsphase erhält, da die Reaktionsgeschwindigkeit auch von der Menge der vorhandenen Substanzen abhängt und daher bei ablaufender Reaktion mit Abnahme der Substanz eine Abnahme der Geschwindigkeit einhergeht, auch wenn die Mängel des vorhandenen Enzyms im wesentlichen konstant bleiben. Es ist ausserdem wünschenswert, die Grosse der Extinkti ons änderung im Verlauf der Reaktion anzuzeigen, da dies eine weitere Information bezüglich einer falschen Ablesung ergibt, die aus der Krümmung der über der Zeit aufgetragenen Extinktionskurve, aus einer Verzögerungsphase und aus Störungen oder Rauschen erfolgt, die durch Teilchen oder durch Fibrinogen, d. h. durch Teilchen, die durch Blutgerinnung entstehen, erzeugt werden, die im Serum enthalten sind. Es ist jedoch die Überwachung der Geschwindigkeit der Extinktionsänderung wesentlichen Rauschstörungen ausgesetzt.

Es besteht die Aufgabe, ein Verfahren und eine Vorrichtung der eingangs genannten Art so auszugestalten, dass man mit ihm

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nit hoher Genauigkeit und Wiederholbarkeit die Reaktionsgeschwindigkeit messen und zur Anzeige bringen kann, mit der eine Reaktion abläuft.

Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe dadurch gelöst, dass eine Änderung einer optischen Eigenschaft des Substanzgeiaisches festgestellt und ein elektrisches Signal erzeugt wird, das zur zeitlichen Änderung der optischen Eigenschaft proportional ist, und dass das elektrische Signal einer visuellen Anzeigevorrichtung zugeführt und damit eine kontinuierliche visuelle Anzeige der Grosse der Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit während des Ablaufs der Reaktion erhalten wird.

Mit dem erfindungsgemässen Verfahren wird dem Benutzer eine Messung der Reaktionsgeschwindigkeit in dem Seitpunkt ermöglicht, in dem die Reaktion beginnt und er erhält ausserdem eine kontinuierliche und direkte überwachung der Probenaktivität. Die Reaktionsgeschwindigkeit wird daher während des Reaktionsablaufes in einem Zeitpunkt gemessen, in dem die Geschwindigkeit sehr genau ist und eine Falschmessung der Probenaktivität visuell berichtigt xy-erden kann, die aus einer Verzögerungsphase, der Extinktionskrümmung, oder von Teilchen oder Fibrinogin herrührt, die im Serum enthalten sind und die ein Rauschen erzeugen.

Vorzugsweise insbesondere zur Analyse eines Enzyms wird ein Reagens mit einem Substanzgemisch vermischt und eine chemische

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Reaktion bewirkt, wobei während der Reaktion ein Lichtstrahl auf das,Substanzgemisch gerichtet wird und die durch das Substanzgemisch bewirkte Absorption des Lichtes bestimmt und ein erstes elektrisches Signal erzeugt wird, das der Absorption proportional ist, wobei ein zweites elektrisches Signal erzeugt wird, das im wesentlichen dem ersten Differentialquotienten des ersten elektrischen Signals proportional ist, wobei das zweite elektrische Signal fortlaufend über ein vorgegebenes Zeitintervall geraittelt wird, um ein zufällig auftretendes Rauschen zu unterdrücken, und wobei das zweite elektrische Signal einer Anzeigevorrichtung zugeführt und eine kontinuierliche, visuelle Anzeige erzeugt wird, die die Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit repräsentiert.

Bei einer vorteilhaften Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist eine Lichtquelle angeordnet, deren Licht auf das Substanzgemisch zu richten ist, wobei mit lichtempfindlichen Elementen das vom Substanzgemisch gestreute oder reflektierte oder das das Substanzgemisch durchdringende Licht zu empfangen und ein erstes elektrisches Signal zu erzeugen ist, das zur Absorption durch das Substanzgemisch proportional ist, wobei mit einer Differentiationsstufe ein zweites elektrisches Signal zu erzeugen ist, das im wesentlichen proportional zur Grosse der Änderung des ersten Signals ist, wobei mit einer analog arbeitenden Filterstufe die Amplitude des zweiten Signals über ein vorgegebenes Zeitintervall zu mitteln ist und wobei eine visuelle Anzeigevorrichtung angeordnet ist, der das zweite

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elektrische Signal über Schaltraittel zuzuführen ist, um wenigstens während eines Hauptteils der Reaktion eine kontinuierliche Anzeige zu erzeugen, die die Änderung der Reaktionsgeschwxndigkeit der Reaktion repräsentiert. Es können Schaltstufen zur Ausgleichung der Ladung von mit Blitzstrom behaftteten kapazitiven Elementen der Filter- und Differentiationsstufe vorgesehen sein, mit denen auf Anfangsbedingungen einzustellen ist, die der Reaktionsgeschwindigkeit null entsprechen und es kann die Anzeige der Absorption bzw. Extinktion und der Reaktionsgeschwindigkeit gleichzeitig erfolgen.

Mit dieser Vorrichtung erhält man ein Instrument für analytische und klinische Untersuchungen, mit dem ein visueller Schutz gegen bzw. eine visuelle Unterscheidung falscher Messwerte der Probenaktivität möglich ist, die aus Rauschen resultieren, die von Teilchen oder von Fibrinogin erzeugt v/erden, die im Serum enthalten sind. Mit der Vorrichtung kann die Probenaktivität währenddes gesamten Verlaufs der Reaktion angezeigt werden und man erhält gleichzeitig eine kontinuierliche Anzeige des ersten zeitlichen Differentialquotienten der Probenaktivität. Mit der Vorrichtung kann eine Messung der Reaktionsgeschwindigkeit in einem relativ kurzen Zeitintervall unmittelbar nach dem Ende einer Verzögerungsphase und bevor die Krümmung der Extinktionskurve merklich wird, durchgeführt werden. Die Vorrichtung besitzt eine hohe Empfindlichkeit und eine grosse Reproduzierbarkeit. Man erhält mit ihr gleichzeitig Ausgangssignale, die die Extinktion und den ersten zeitlichen Differentialquotienten der Extinktion repräsentieren. Die Vorrichtung für analyti-

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sehe oder klinische Untersuchungen besitzt Mittel zur Unterdrückung elektrischen Rauschens, womit eine kontinuierliche Messung und eine Anzeige des zeitabhängigen Signals möglich ist. Die Vorrichtung besitzt eine Filterstufe, mit der das Rauschen des Signals ausgemittelt werden kann, das den ersten Differentialquotienten repräsentiert und diese Filterstufe besitzt eine relativ lineare Ladungscharakteristik, mit der die Zeit zu verkleinern ist, die für den Abgleich des Messwertes bei einer gegebenen Grosse des Rauschausgleiches nötig ist. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemässen Vorrichtung ist, dass sie Rückstellmittel besitzt, mit der die mit Blindwiderstand behafteten kapazitiven Elemente der Filter- und Differentiationsstufe auf eine Ladung abgeglichen werden können, die einer Null-Anzeige am Anzeigegerät entspricht.

Im folgenden wird die erfindungsgemässe Vorrichtung beispielhaft anhand der Figuren 1 bis 4 näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1 ein Blockschaltbild einer erfindungsgemässen Vorrichtung ;■

Figur 2 ein detailliertes Schaltbild eines Teils der Vorrichtung nach Figur 1;

Figur 3 a und 3 b Diagramme, die die Extinktionskurve und die Grosse der Extinktionsänderung bei einer Enzymanalyse darstellen, die mit einer Vorrichtung gemäss Figur 1 durchgeführt \mrds; · ·

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Figur 4 eine Erapfindlichkeitskurve des Filters zur Rauschunterdrückung, das in der Vorrichtung nach Figur 1 enthalten ist.

Mit dem erfindüngsgemässen Verfahren und der Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens wird eine klinische Analyse ermöglicht, bei der ein Reagens mit einem Substanzgemisch vermischt und eine chemische Reaktion des Substanzgemisches bewirkt wird. Ein Lichtstrahl wird auf das Substanzgemisch während der Reaktion gerichtet. Es wird ein erstes elektrisches Signal erzeugt, das der Absorption des Lichtes durch das Substanzgemisch proportional ist. Ein zweites elektrisches Signal ist im wesentlichen proportional zun ersten Differentialquotienten des ersten Signals. Das zweite Signal wird über eine vorgegebene Zeitspanne kontinuierlich gemittelt. Es wird einer. Anzeigevorrichtung zugeführt, um eine kontinuierliche, sichtbare Anzeige eines Messwertes zu erzeugen, der die Reaktionsgeschwindigkeit repräsentiert.

Figur 1 zeigt eine Vorrichtung, die ein Photometer zur Messung und Anzeige der Extinktionsänderung einer zu untersuchenden Probe enthält. Im Ausführungsbeispiel wird eine Vorrichtung beschrieben, mit der eine Enzymanalyse durchzuführen ist. Es ist offensichtlich, dass das erfindungsgemässe Verfahren und die Vorrichtung zu seiner Durchführung auch zu jeder anderen Analyse eingesetzt werden kann. Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch mit anderen Vorrichtungen durchgeführt werden, die Enzymmessungen durch Fluoreszenzbestimmung oder ITebelitiessung durch-.

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führen. Es kann auch eine andere Enzym-Untersuchungstechnik, beispielsweise eine immunologische Reaktion für Drogenanalysen benutzt werden, bei der man Enzyme zur Markierung oder Etikettierung benutzt. Das Photometer der Figur 1 weist eine Lichtquelle 10 auf, die eine Leuchtstofflampe besitzt, die ultraviolettes Licht abstrahlt. Die Lichtquelle 10 ist so angeordnet, dass ein Lichtstrahl über einen Messweg 12 und ein anderer Lichtstrahl über einen Referenzweg 14 projiziert wird. Ein Interferenzfilter 16 ist im Weg der Lichtstrahlen angeordnet. Mit ihm wird für den Mess- und den Referenzweg Licht einer vorgegebenen Wellenlänge ausgefiltert. Das Interferenzfilter 16 kann, falls eine Enzymanalyse durchgeführt werden soll, eine Wellenlänge von ungefähr 340 nm für das durchgelassene Licht aufweisen. Der Lichtstrahl des Messweges 12 trifft auf eine durchsichtige Messzelle 18, in der eine Küvette oder ein Probenrohr angeordnet ist, das aus Glas oder einem anderen lichtdurchlässigen Material besteht. Die Küvette enthält ein Substanzgemisch, das eine chemische Reaktion vollzieht. Bas Subs tan ζ gemisch kann beispielsxieise die Komponenten enthalten, die sich auf der linken Seite der Reaktionsgleichung der Snzymanalyse befinden, die früher angeführt wurde. Mit einer Linse 20 wird das Licht, das die Zelle 18 durchdringt, auf den Photodetektor 22 fokussiert. Der Photodetektor 22 . erzeugt ein Ausgangssignal e , dessen Amplitude proportional zur Intensität des Lichtes ist, das. er empfängt. Mit einer weiteren Linse 24 wird das Licht, das den Referenzweg durchstrahlt, auf einen Phötodetektor 26 fokussiert. Der Photodetektor 26 erzeugt ein Ausgangssignal e das proportional ' '

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zur Intensität den Lichtes der Lichtquelle 10 ist. Die Ausgangssignale der Photodetektoren 22 und 26 werden einer Schaltstufe 28 zugeführt, die verstärkende Schaltkreise enthält und die ein Ausgangssignal e erzeugt, das proportional zum log. ^e_/^e _n ist. Bekanntermassen ist diese Grosse proportional zur Extinktion des Lichtes in der Messzelle 18. Das Extinktionssignal e wird einer Aufzeichnungsvorrichtung 30 zugeführt, die einen Schreiber enthält. Mit dieser Aufzeichnungsvorrichtung 30 wird eine aufgezeichnete visuelle Anzeige der Änderungen der Amplitude des Extinktionssignals e für

eine gewisse Zeitspanne erhalten. Die Extinktionskurve ist in Figur 3 a mit 32 bezeichnet. Diese Kurve illustriert eine chemische Messung, mit der die katalytische Wirkung eines Enzyms erfasst wird. Das Sxtinktionssignal e wird weiterhin über einen Verstärker 36 und einen Schalter 38 einem anzeigenden Messgerät 34 zugeführt. In dem Messgerät 34 wird die Grosse des Signals e anaezeigt und damit bei fortschreitender Reaktion die Änderungen in der Grosse der optischen Eigenschaft, beispielsweise der Extinktion. Der Extinktionssignal-Verstärker enthält einen Amplitudenbereichswähler, mit dein nan einen vollen Skalenausschläg des Messgerätes 34 für verschiedene Amplitudenbereiche des Extinktionssignals erzeugen kann.

Erfindungsgemäss sind Schaltstufen vorgesehen, mit denen man den ersten Differentialquotienten des Extinktionssignals e er-

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zeugt und eine kontinuierliche Anzeige dieses Signals während

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eines wesentlichen Teils der Reaktion erhält. Die Differentiation des Signals e erfolgt mittels eines Rauschfilters.

Cl

das im wesentlichen Eingangsrauschsignalkomponenten unterdrückt. Das Rauschfilter enthält ein aktives Filter, das das

Einoangssignal e über ein bestimmtes Zeitintervall mittelt ~* a

und das zu einer relativ linearen zeitlichen Aufladung führt, die während der Messung nur ein kleines "Endstück¹¹ mit sich führt. Diese Eigenschaft wird im einzelnen im Zusammenhang mit der Figur 4 näher erläutert. Die Filter- und Differentiationsstufe wird in Figur 1 mit dem Bezugszeichen 40 bezeichnet. Mit ihr erhält man ein zweites elektrisches Signal bzw. ein Differentiationssignal e_or, das dem Messgerät 34 über den Schalter 38 und einen Verstärker 42 zugeführt wird. Das Differentiationssignal e wird auch der Aufzeichnungsvorrichtung 30 zugeführt, die den Schreiber enthält, um eine permanente Aufzeichnung der Änderungen des Differentiationssignals über die gesamte Reaktionsperiode zu erhalten. Mit einem Startschalter 43 lässt sich die Ladung der kapazitiven, mit Blindwiderstand behafteten Elemente der Filter- und Differentiationsstufe vor Beginn der Reaktion auf einen Wert abgleichen, der der Reaktionsgeschv/indigkeit null entspricht. Der Verstärker 42 enthalt einen Differentiationssignalraessbereichswähler, mit dem man einen vollen Skalenausschlag des Messgerätes für verschiedene Amplitudenbereiche des Eingangssignals e einstellen kann. Mit dem Schalter 38 kann wahlweise das verstärkte üxtinktionssignal e oder das verstärkte

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Differentiationcsignal e an das Messgerät 34 gelegt werden, um diese Grossen wahlweise kontinuierlich anzuzeigen. Selbst-

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verständlich kann ein zweites Anzeigemessgerät vorgesehen sein und das Extinktionssignal und das Differentiationssignal können gleichzeitig und kontinuierlich mit beiden Messgeräten während des Reaktionsverlaufes angezeigt werden. Die Kurve 72 von Figur 3 b zeigt den typischen Verlauf des Differentiationssignals über der Seit für eine Enzymreaktion.

Bei einer typischen, schnellen kinetischen Analyse von Transaminase, Lactat-Dehydrogenase und anderen Enzymen, die kinetisch bei 340 nm geraessen werden, bestimmt man eingangs aus bereits vorhandenen Kenntnissen, ob die Extinktion bei fortschreitender Reaktion mit der Zeit zu- oder abnimmt. Der Schalter 38 wird so betätigt, dass das Differentiationssignal am Messgerät liegt und der Differentiationssignalmessbereichswähler und der Extinktionsmessbereichswähler werden so eingestellt, dass man einen vollen Skalenausschlag für die Signalgrössen erhält, die bei der speziellen Reaktion auftreten .-Eine bestimmte Menge Reagenz wird in eine Küvette eingebracht, die anschliessend für zwei bis fünf Minuten in einen Vorwärmerofen gegeben wird, um eine vorgegebene Temperatur, beispielsweise 37 C, einzustellen. Sine bestimmte Menge der Probe, beispielsweise ein Serum, wird anschliessend in die Küvette gebracht und durch Rühren mit dem Reagens vermischt. Nach einer Vorüberlegung über die zu erwartende Reaktion v/ird die Kessküvette wieder für einen Zeitraum in den Vorwärmeofen gegeben, der der Verzögerungsphase bzw. der Verzögerungsperiode entspricht. Die Verzögerungsperiode repräsentiert ein Zeitinter-

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vail, in dem eine anfängliche Verzögerung der Reaktion zwischen den Komponenten vorhanden ist. Dieses Zeitintervall ist in den Figuren 3 a und 3 b durch" die Zeit t -t, gegeben. Unmittelbar vor dem Zeitpunkt t, wird die Küvette in die Messzelle 18 eingebracht. Falls es erforderlich ist, die gesamte Reaktion, einschliesslich der Verzögerungsphase, zu beobachten, kann raan die Messküvette auch in die Messzelle 18 im Lichtweg 12 unmittelbar nach dem Verrühren und Mischen der Komponenten einbringen. Anschliessend wird der Startschalter 43 betätigt, um die elektrischen Bedingungen der Schaltelenente der Filter- und Differentiationsstufe vor Beginn der Reaktion zu normieren. Eine kontinuierliche Anzeige der Grosse der Extinktionsänderung erhält man mit dem Messgerät 34, während der Schreiber eine visuell sichtbare Aufzeichnung der Extinktion und der Reaktionsgeschwindigkeit durchführt. Die Extinktion ist durch die Kurve■ 32 der Figur 3 a und die Reaktionsgeschwindigkeit durch die Kurve 44 der Figur 3 b illustriert.

Der grösste Ausschlag des Messgerätes 34, das in internationalen Einheiten (I.U.) kalibriert ist, ist eine genaue Anzeige der Grosse der Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit. Dieser Ausschlag entspricht dein Abschnitt m=0 der Kurve 44 in Figur 3 b. Die kontinuierlich angezeigte zeitliche Änderung, die in Figur 3 b illustriert ist, ist eine äusserst wertvolle Hilfe für die Interpretation der Ereignisse, die während der Reaktion auftreten. Beispielsweise ist wegen der Abreicherung des Substrats während der durch das Enzym katalysierten Reaktion die wichtigste -und verlässlichste Anzeige der Änderungsgeschwin-

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digkeit der Extinktion am Anfang der Reaktion gegeben. Es ist jedoch der Figur 3 a zu entnehmen, dass der Zeitpunkt leicht versäumt werden kann, in dem die Verzögerungsphase beendet ist und die Reaktion beginnt. Der Kurve der Figur 3 b ist zu entnehmen, dass andererseits der Beginn der Reaktionsphase leicht mit der ersten Ableitung dieser Funktion bestimmt werden kann. Es ist der Zeitpunkt, in den die Neigung m der Kurve 44 gleich null wird. Auch der Zeitpunkt, in dem das gesamte Substrat im wesentlichen abgereichert und die Reaktion effektiv beendet ist, kann ebenfalls nur ungenau lediglich aus der Extinktionskurve der Figur 3 a entnommen werden. Die Kurve der Figur 3 b ergibt den Beginn dieser Reaktionsphase ebenfalls sehr genau. Mit der kontinuierlichen Anzeige der ersten Ableitung der Extinktion erhält man daher ein klares Bild über die ablaufenden Ereignisse, beispielsweise über den Beginn und das Ende der Reaktion. Man erhält damit eine Hilfe, um chemische Störungen zu identifizieren und ihnen ein entsprechendes Gewicht beizumessen.

Die Schaltstufen zur Verarbeitung des Ausgangssignals e des

Verstärkers 28 und insbesondere die Filter- und Differentiationsstufe der Figur 1 sind im Detail in Figur 2 gezeigt. Dabei sind Elemente in den Figuren 1 und 2, die die gleiche Funktion erfüllen, mit den gleichen Bezugszeichen versehen. Das Signal e wird einer Filter- und Differentiationsstufe zugeführt, die mit dem gestrichelten Rechteck 40 in Figur 2 gezeigt ist. Das Rauschfilter enthält ein aktives Filter,

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das geeignet ist, das Rauschen über ein Zeitintervall auszugleichen, bevor es einen ersten, genauen Scheitelausschlag hervorruft. Die effektive Ausgleichszeit des Filters und seine Frequenzcharakteristik sind Faktoren, die das Rauschniveau bestimmen und die auch die Zeit bestimmen, die nötig ist, bevor die Aktivität der Probe abgelesen werden kann. Dies wiederum bestimmt den "Durchgang" oder die Geschwindigkeit, mit der die Probe gemessen werden kann. Daraus folgt, dass ein Filter wünschenswert wäre, das ein möglichst geringes "Endstück" für eine gegebene effektive Ausgleichszeit besitzt. Ein relativ einfaches Filter zum Unterdrücken des Rauschens bzw. von Störungen enthält ein mit Widerstand und Kondensator versehenes RC-netzwerk, das als Integrator ausgebildet ist. Die effektive Ausgleichszeit dieser Anordnung ist weitgehend durch die anfängliche Aufladegeschwindigkeit bestimmt. Obgleich das kapazitive Element dieses Filtertyps ungefähr 63 % seiner Entladung während der Periode mit einer Zeitkonstante T erhält, nimmt das "Endstück" eine relativ lange Zeitspanne ein, wobei unter "Endstück" der Teil der RC-Ladekurve verstanden wird, in dem das kapazitive Element im wesentlichen die restlichen 37 % der Entladung enthält. Beispielsweise ein einfaches RC-Filter erster Ordnung benötigt ungefähr 4,6 T, um sich bis auf ungefähr 1 % seiner Entladung zu nähern. Das "Endstück" benötigt dann ungefähr 3,6 T. Beim Routinegebrauch eines klinischen Instrumentes ist es erforderlich, genaue Werte so bald wie möglich zu erhalten. Da die Eigenschaften von RC-Filterstufen so ausgexiählt werden können, dass man eine relativ schnelle Aufladung erhält, kann diese Forderung nur dadurch erfüllt

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v/erden, dass man das Zeitintervall verkürzt, über das das Rauschen geiriittelt wird. Dies führt zu einem Anwachsen des Rauschens. Die Filterstufe der Figuren 1 und 2 enthält ein aktives Filter höherer Ordnung, das so ausgebildet ist, dass es das "Endstück" verkleinert, während es gleichzeitig das Unterdrücken des Rauschens verbessert. Dies wird teilweise dadurch erreicht, dass man den Dämpfungsfaktor des Filters auf einen Wert einstellt, der ungefähr bei 0,85 bis 0,90 liegt. Diese Dämpfung ist geringfügig zu klein und erzeugt ein Überschwingen im Ansprechvermögen, das kleiner als 1 % ist. Die Filterstufe enthält Feldeffekttransistoren 50 und 52 und einen rückgekoppelten Verstärker 54, der als Summierverstärker für den Strom wirkt. Die Filterstufe besitzt ausserdem noch die Widerstände 58 und 60 und die Kondensatoren 64 und 68. Die Rückkoppelung des Verstärkers 54 wird mit dem Widerstand 66 erreicht. Zur kapazitiven Rückkoppelung ist der Kondensator 68 vorgesehen, der eine Verkleinerung des "Endstückes" beim Aufladen dadurch bewirkt, dass er den gesamten Dämpfungsfaktor der Filterstufe unter die kritische Dämpfung absenkt. Damit wird die Ansprechsempfindlichkeit dieser Filter- und Dxfferentxationsstufe gegenüber einem rampenförmigen Eingangssignal, wie die Kurve 70 der Figur 4 zeigt, im Vergleich zu der Empfindlichkeit gesteigert, die ein einfaches RC-Filternetzwerk und Dxfferentxationsstufe besitzt, und die mit der Kurve 72 in Figur 4 charakterisiert ist. Der Startschalter, der in Figur 2 gezeigt ist, enthält einen Kippschalter, der betätigt wird, um eine Ausgangsladung für die Kondensatoren

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64 und 68 einzustellen, bevor die Reaktion beginnt.

Die Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit der Enzymreaktion kann mit dem Messgerät 34 in internationalen Einheiten angezeigt werden. Diese internationalen Einheiten sind definiert als dA/dt χ F, worin F ein vorgegebener Faktor oder eine Konstante ist. Die Rückführung des stromsummierenden bzw. integrierenden Verstärkers enthält einen veränderbaren Widerstand 74, mit dem das Instrument in internationalen Einheiten kalibriert werden kann. Das Differentiationssignal bzw. Geschwindigkeitssignal e das durch die Filter- und Differentiationsstufe 40 erzeugt wird, xvird dem Verstärker 42 zugeführt, der einen ersten invertierenden Verstärker 76 und einen zxieiten invertierenden Verstärker 78 besitzt. Mit Schaltern 80 und 82 kann der Verstärkungsgrad des Verstärkers 36 für die Extinktion und des Verstärkers 42 eingestellt v/erden. Der Schalter 38 ist in Figur 2 in der Schalteranordnung eingeschlossen, die durch die Schalter 80 und 82 gebildet ist. Ausserdem kann mit den Schaltern 80 und 82 ein Shunt an das Anzeigegerät 84 des Messgerätes 34 gelegt werden.

Es wurde eine verbesserte Vorrichtung beschrieben, mit der man vorteilhaft auf optischem Weg eine kontinuierliche Anzeige der Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit in einer klinischen Anwendung erhalten kann. Dies erleichtert die Durchführung und die Interpretation einer Analyse wesentlich. Zusätzlich wurde eine verbesserte Schaltstufe beschrieben,

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die das Rauschen ausgleicht und filtert. Diese Schaltstufe verkleinert die Zeitspanne, bis zu der man eine genaue Messung erhalten kann, während man gleichzeitig einen hohen Grad von Rauschunterdrückung beibehält. Dies verbessert beispielsweise die Bildung der ersten Ableitung des Extinktionssignals und vergrössert den "Durchgang" der Vorrichtung wesentlich.

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Claims

Patent(Schutz)-Ansprüche

1. Verfahren zur Analyse und zur Bestimmung der Konzentration von Komponenten eines Substanzgeraisches aus der Reaktionsgeschwindigkeit einer ausgelösten chemischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, dass eine Änderung einer optischen Eigenschaft des Substanzgemisches festgestellt und ein elektrisches Signal (e ) erzeugt wird, das zur zeitlichen Änderung der optischen Eigenschaft proportional ist, und dass das elektrische Signal einer visuellen Anzeigevorrichtung (30, 34) zugeführt und damit eine kontinuierliche visuelle Anzeige der Grosse der Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit während des Ablaufs der Reaktion erhalten wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung der Änderung der optischen Eigenschaft ein Lichtstrahl (12) auf das Substanzgemisch gerichtet und Änderungen der Intensität des Lichtes bestimmt werden, das das Substanzgemisch durchstrahlt oder von ihn gestreut wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzeige kontinuierlich während eines Hauptteils der Reaktion erfolgt.

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4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Substanzgemisch zu analysierende Enzyme enthält, dass die ausgelöste Reaktion eine anfängliche Verzögerungsphase, eine Reaktionsphase und eine abschliessende Erschöpfungsphase besitzt und dass die visuelle Anzeige kontinuierlich während der Reaktionsphase erfolgt.

5. Verfahren zur Analyse eines Enzyms nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Reagens mit einem Substanzgemisch vermischt und eine chemische Reaktion bewirkt wird, dass während der Reaktion ein Lichtstrahl (12) auf das Substanzgemisch gerichtet wird, dass die durch das Substanzgemisch bewirkte Absorption des Lichtes bestimmt und ein erstes elektrisches Signal (e ) erzeugt wird, das der Absorption proportional ist, dass ein zweites elektrisches Signal (e ) erzeugt v/ird, das im'wesentlichen dem ersten Differentialquotienten des ersten elektrischen Signales proportional ist, dass das zweite elektrische Signal fortlaufend über ein vorgegebenes Zeitintervall gemittelt wird, um ein zufällig auftretendes Rauschen zu unterdrücken, dass die mit Blindwiderstand behafteten Elemente (64, 68, 60, 66) einer Filter- und Differentiationsstufe (40) auf Anfangsbedingungen abgeglichen werden, die einsr Reaktionsgeschwindigkeit null entsprechen^und dass das zweite Signal einer Anzeigevorrichtung (30, 34) zugeführt und eine kontinuierliche, visuelle Anzeige erzeugt wird, die die Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit repräsentiert.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite elektrische Signal (e ) durch eine elektronische Schaltstufe (40) erzeugt und gemittelt wird, die mit Blindwiderstand behaftete Elemente (64, 68, 60, 66) besitzt,, die bei Beginn der Analyse auf Anfangsbedingungen abgeglichen werden, die einer Reaktionsgeschwindigkeit null entsprechen.

7. Vorrichtung zur Anzeige der Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit einer chemischen Reaktion eines Substanzgeraisches gemäss einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Lichtquelle (10) angeordnet ist, deren Licht (12) auf das Substanzgemische zu richten ist, dass mit lichtempfindlichen Elementen (22) von dem Substanzgemisch ausgehendes Licht zu empfangen und ein erstes elektrisches Signal (e ) zu erzeugen ist, das einer

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optischen Eigenschaft des Substanzgemisches proportional ist, dass mit einer Differentiationsstufe (40) ein zweites elektrisches Signal (e ) zu erzeugen ist, das im wesentlichen proportional zur Grosse der Änderung des ersten elektrischen Signals ist, dass mit einer elektrischen Filterstufe (40) die Amplitude des zweiten Signals über ein vorgegebenes Zeitintervall zu mitteln ist und dass eine visuelle Anzeigevorrichtung (30, 34) angeordnet ist, der das zweite elektrische Signal über Schaltmittel (38) zuzuführen ist, um wenigstens während eines Teils der Reaktion

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eine kontinuierliche Anzeige zu erzeugen, die die Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit der Reaktion repräsentiert.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterstufe (40) ein aktives Filter hoher Ordnung des Analogtyps ist, das nahe der kritischen Dämpfung arbeitet.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterstufe (40) Widerstände (58, 66) und Kondensatoren (64, 66) besitzt, dass mit Schaltmitteln (28) ein Eingangssignal an die Filterstufe zu legen ist, das Änderungen optischer Eigenschaften des Substanzgemisches repräsentiert, dass mit der Filterstufe ein differenziertes und gefiltertes Signal (e ) zu erzeugen ist, dass die Filterstufe Verstärkerstufen (44) auf v/eist, die ein summierendes Netzwerk und einen Verstärker in Kaskadenschaltung besitzen, wobei über einen mit Blindwiderstand behafteten Rückkoppelzweig (66) der Ausgang des Verstärkers zu dem summierenden Netzwerk rückgekoppelt ist, dass an das summierende Netzwerk das differenzierte, gefiltere Signal zu führen ist, um es mit dem rückgekoppelten Signal zusammenzufassen,und dass Schaltstufen (43) vorgesehen sind, mit denen die Ladung kapazitiver Elemente auf eine Grosse zurückzuführen ist, die einer Reaktionsgeschwindigkeit null entspricht.

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10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Filterstufe (40) einen ersten Kondensator (64) und Schaltmittel (43) enthält, mit denen dem Kondensator vor Auslösung der Reaktion eine Ladung aufzuprägen ist, die den Anfangsbedingungen entspricht.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Kondensator (64) als differenzierendes

" Element der Pilterstufe (40) geschaltet ist, dass ein zweites kapazitives Element (68) angeordnet ist, .das den mit Blindwiderstand behafteten Ruckkoppelungszweig als Filterelement enthält, und dass Schaltmittel (43) vorgesehen sind, mit denen den kapazitiven Elementen vor Auslösung der Reaktion eine Ladung aufzuprägen ist, die den Anfangsbedingungen entspricht.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Differentiationsstufe (40) einen Verstärker (54) enthält und dass die Schaltstufen mit diesem Verstärker verbunden sind, um ein Gegenkoppelungssignal zu bewirken, mit dem ein Strom in den Schaltstufen auszulösen ist, der die Ladung des filternden zweiten und des differenzierenden ersten Kondensators (64, 66) so einstellt, dass das Ausgangssignal als Anfangsbedingung einer Reaktionsgeschwindigkeit null entspricht.

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